SU1074408A3

SU1074408A3 - Способ получени 3-0/ @ - @ -глукуронпиранозил/-со сапогенола

Info

Publication number: SU1074408A3
Application number: SU792745040A
Authority: SU
Inventors: Синохара Масанао; Накано Есимаса; Каисе Хироцугу; Изава Такетоси; Миязаки Васеи
Original assignee: Оцука Фармасьютикал К.О.,Лтд (Фирма)
Priority date: 1978-03-31
Filing date: 1979-03-30
Publication date: 1984-02-15
Also published as: ZA791061B; ES487982A0; IT1126812B; ATA236079A; GB2020290B; FR2421179B1; IT7948551A0; DK162102B; NL7902449A; SE7902866L; ES8102148A1; JPS54130551A; SU1190989A3; DK126679A; NO790994L; AR227624A1; CH640868A5; FI67559C; BE875105A; AT369426B

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0 {B -DгаУКУРОНПИРАНОЗИЛ )-с6 САПОГЕВОЛА В формулы -OR СООН о т л и ч а ю ц и и с тем, что микроорганизм Stachybotrys sp. щтсшм Т-791 выращивают в -аэробных услови х в п тательной сре«е, содержащей источники азота и углерода, минеральные соли в следы микроэлементов/ ПРИ РН 3,5-11,5 и температуре 15г-38 С с после(Д юпе1м выделеиием целевого продукта из культуральной и при необходимости перевод т в соль.

Description

1

4ii 4;

О 00

Изобретение оуноситс к KHMHIJOфармацевтической прокышленности и . касаетс производства терапевтических средств, которые могут быть использованы в медицине при аутоиммунных и равматических заболевани х .

Предложенный способ новый, в патентной и научно-.технической литературе-не описан.

Целью изобретени вл етс получение 3-0 (р-О-глукуронпиранозил)со сапогенола Bfc

Способ получени 3-0. (p-D-глукуронпиранозил )-са сапогенола В общей формулы .

-ОН

заключаетс в том, что микроорганизм Stachybotrys sp. штамм Т-791 выращивают в аэробных услови х в питательной среде, содержащей источники азота и углерода, минеральные соли и следы микроэлементов, при рН 3,511 ,5 и температуре 15-38°С с последующим выделением целевого продукта из культуральной среды и при необходимости перевод т в соль.

Штамм Stachybotrys sp. Т-791 дл получени предложенного соединени бал вьвделен из почвы в Tokushima City, Tokushiraa, Japan.

Штамм Stachybotrys sp. T-791 хранитс в научно-исследовательском институте ферментации Agency of Industrial Science and Technology, Japan (N 8-1 Inaga Higashi Schome, Chiba-shi, Japan, под депозитным номером FSRm-p 3803, a также в Американском собрании типов культур 12301 Park lawn Drive Rockville, Maryland 20852 - под номером АТСС 20513).

Культуральные признаки.

Солодовый экстракт агара.

Рост быстрый и неравномерный. Субстратный мицелий от рыжевато-коричневого до темно-коричневого. Колони плоска , образование конидий хорошее. Цвет гиф от светло-коричневого до рыжевато-коричневого, наблюдаютс капельки жидкости, котора вьвдел етс . Растворимый пигмент не продуцируетс .

Картофельна глюкозна среда. Рост очень быстрый и при выращивании при в течение 30 дней колони достигает размера 70 мм. Периферическа часть колонии выт нута древовидно, наблюдаютс прикрепленные к субстрату белые гифы. Видно большое количество мелких капелек жидкости. Субстратный мицелий светло-желтый . Растворимый пигмент не образуетс .

Агарова среда Чапека.

Рост колонии слабый.

Синтетическа слизиста агарова среда. :

Рост колонии слабый.

Агарова среда на овс ной муке.

Рост колонии очень хороший . Колони тонка и плоска . Образование гиф обильное от начальной стадии выращивани , конидии образуютс также быстро. Цвет колонии измен етс от белого до темно-коричневого в процессе культивировани . Большое, количество жидких капелек по вл етс на гйфе1х. Растворилйлй пигмент не образуетс .

Морфологические свойства.

Фиалофоры просто разветвлены и сто т пр мо. Фиалофорные окончани слегка уто.71щены в виде розги. Однако утолщение незначительно. Эти штаммы имеют гифы шириной 4,0 - 4,5 микрон, что несколько превышает ширину фиалрфор. Фиалофоры, которые пр мо ответвл ютс с опорными клетками от вегетативных, или от воздушных гиф, имеют от двух до трех перегородок и размеры 40-80-3,0-3,5 микон . Клеточна стенка фиалофор не мeJjкoигoльчaтa , а гладка . От трех до шести фиалид отход т от утолщенной части окончаний фиалофор. Кроме того, сферические и имеющие форму сплюснутых шариков Фиалофоры одной клетки, имеющие мелкоигольчатый выступ и размеры 4,3-5,2 3,0-4,2 микрон, посто нно образуютс безипетально от окончани фиалид, формируетс цепочка конидий от 24 до 70 штук. Фиалида имеет обратную булавовидную форму и размеры 6,9-10, З, 5-4,7 микрон. Фиал Офоры и фиалиа бесцветны, а фиалида окрашена в цвет от кофейного до черного.

Физиологические свойства.

Stachybotrys sp. T-791 вл етс аэробным штаммом.

Услови выращивани : рН 3,5-11,5, темп 15-38с. Оптимум роста: рН 4,99 ,5, температура 20-30С.

Получают 3-0 (3-О-глукуронпиранозил ) - со сапогенол В следующим образом .

Сначала штамм Stachybotrys sp. T-791 выращивают в питательной среде , содержащей обычные источники питани и добавки. В качестве питательного субстрата обычно используютс источники азота, например соева мука, соевое масло, экстракт от замачивани зерновых, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, толокно. м сной экстракт, гидролизовэнный казеин, соли аммони и нитраты. Под ход щими источниками углерода вл ютс глюкоза, глицеролмальтоза, кра мал, лактоз,а, сахароза и меласса. Добавки к культуральной среде жат такие вещества как карбонат кальци , хлорид кальци ,сульфат ма ни и фосфорнук) кцслот. Если необходимо , то культуральна среда может содержать очень маленькие добав ки солей металлов, таких как железо , медь, магний и цинк. Выращивание провод т в обычной водной среде содержащей упом нутый субстрат, с, использованием поверхностного или глубинного культивировани с аэраци ей и перемешиванием. Предпочтительно глубинное вьфащивание с аэрацией и перемешиванием. Культивирование провод т при 15 - 38°С, предпочтительно при 2032°С , в течение 3-7 дней в услови х обычной аэр|ации и при поддержа нии культуральной среды 3,5 11 ,5, предпочтительно 4-,5 - 9,5, По завершении выращивани полученное вещест во выдел ют из питател нйй среды различными известньлш .методами . Вьшелени€ может быть осуществлено , например, методом, использующим различи в растворимости продуктами и примес ми, или методом, использующим различие в адсорбционной способности и средстве с ойачныки абсорбентами, такикм как активированный уголь ХАД-2 силикагель , ионообменные смолы, сефадекс и т.п., или методом, использующим различи в коэффициенте распределени между двум жидкими фаза ми, и Сочетанием таких методов. Соединение может быть получено в виде солей с различными фармгщевтически приемлемыми основани ми. Соединени могут бытв использоваиы .как терапевтические средства .при нефритах, В этом случае они могут быть в виде фармацевтических составов и вместе с обычными фармацевтически приемлемыми носител ми. Подход щими носител ми, которые могут быть использованы, вл ютс , на пвимер, разбавители или наполнител наполнители дл увеличени объема, св зующие и смачивающие агенты, дез .интеграторы, поверхностно-активные вацестда и смазки, котор е обычно примен ютс дл приготовлени таких лекарств, в зависимости от дозированной форки. Различные дозированные форьы терапевтических агентов дл лечен и « нефритов можно выбрать в соответств с цел ми лечени . Дозированными формами, которые могут быть использованы , вл ютс таблетки, пилюли. порошки, жидкие препараты, суспензии , эмульсии, гранулы, капсулы, суппозитории и препараты дл инъекции (растворы, эмульсии, суспензии и тому подобное). При приготовлении фармацевтического состава, содержащего соединени согласно изобретению и в качестве активного ингредиента, ю форме таблеток может быть использован широкий спектр носителей, известных в данной области. Подход щими носител ми , вл ютс лактоза, белый сахар , хлористый натрий, глюкоза, мочевина , крахмал, углекислый кальций, каоли.н, кристаллическа целлюлоза, кремниева кислота, св зующие, такие как вода, этанол, пропанол, простой сироп, глюкоза, раствор крахмала , раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза , метйлцеллюлоза, фосфат кали и поливинилпирроллидон, дезинтеграторы , такие как сухой крахмал , альгинат натри , порошок агара, порошок ламинарии, кислый карбонат натри , карбсжат кальци , твин, лаурилсульфат натри , моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал и лактоза , ингибиторы дезинтеграции, такие как белый сахар, глицериловый эфир, стеариновой кислоты, масло какао и гидрогенизированные масла, промоторы абсоцзбции, такие как че.твертичные основани аммони и лаурил;сульфат натри , увлажнители, такие как глицерин и крахмал, адсорбенты , такие как крахмал, лактоза каолин, бентонит и кколлиодна кремниева кислота и смазки, такие как очищенный тальк, соли стеариновой кислоты, порошок борной кислоты, мак- роголь и твердый полиэтиленгликоль. При прессовании фармацевтического состава в Форме пилюли могут быть использованы самые разнообразные обычные известные носители. Подход щими носител ми вл ютс , глюкоза, лактоза, крахмал, масло какао, твердеющие растительные масла, каолин, тальк, св зующие, такие как порошок аравийской камеди, порошок трагаканта , желатин и этанол и дезинтеграторы , такие как ламинари -и агар. Таблетки при желании могут быть покрыты одним, двум и более сло ми например покрытые сахаром таблетки, с желатиновым покрытием, пленочным покрытием и таблетки с покрытием, растворимым в кишечнике. При прессовании фармацевтического состава в суппозитории могут быть использованы разнообразные носители, известные в технике. Подход щими носител ми вл ютс полиэтиленгликоль, масло какао, высшие спирты, эФиры высших спиртов, желатин и полусинтётические глицериды. Если фармацевтический состав гот в т .в форме препарата дл инъекции, то полученный раствор и суспензию стерилизуют, они должны быть изотоническими , по отношению к Крови, Пр приготовлении фармацевтического сос тава в форме раствора или суспензии могут быть использованы все известные разбавители, Подход щими разбавител ми вл ютс вода, этиловый спирт, пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, сорбит полиоксиэтилена и эфиры сорбитана. Хлористый натрий, глюкоза или глице рол могут быть введены в терапевтический препарат дл лечени нефрита в количестве, достаточном дл получени изотонического раствора. Тера певтический препарат может содержат вспомогательные средства дл раство рени , буферы, болеутол ющие агенты и противостарители и что также возможно , крас щие агенты, ароматичес кие, вкусовые, освежающие и другие вещества. Количество соединени , вводимого в качестве активного ингредиента в фармацевтический состав препарата дл .лечени нефрита, не лимитируетс и может варьироватьс в широких пределах. Подход щим терапевтически эффективным количеством соединени обычно вл етс 1-70 вес.%, предпочтительно 5-50 в-ес.% от всего состава. Антикомплементарный агент/ напри мер при лечении нефрита, в лечебный препарат мйжет вводитьс различными пут ми, приемлемыми в зависи-мости от формы лекарственного препарата . Например, таблетки, пиллюли , жидкие препараты, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы ввод т через рот. Препараты дл Инъекции ввод т внутривенно, либо один, либо вместе с вспомогательными агентами, обычными в таких случа х, например с глюкозой и аминокислотами. Кроме того, если необходимо, лекарственный препарат может быть введен внутримышечно , подкожно, внутрибрюшинно внутрикожно. Суппозитории ввод т интраректально . Дозу препарата при лечении нефрита выбирают в зависимости от цели ле чени , симптоматики и т.п. Обычно примен ют дозу соединени 0,520 мг/кг веса тела в день. Соединени обладают антикомплемен тарной активностью и используютс в качестве лечебных средств при аутоиммунных заболевани х, болезн х koллaгeнa и ревматических заболевани х . Фармакологические испытани . Испытываемые соединени . А 3-0-(р-П-глукуронпиранозил)-со сапогенол В. В Глицирризин (соединение дл сравнени ) « Антикомплементарна активность. АНтикомплементарную активность определ ют следующим образом. В пробирку загружают по 0,5 мл водной дисперсии каждого из испытываемых соединений, по 0,5 мл сенсибилизированных эритроцитов „(СЭ) , пЕ)и этом культура содержит 1 10°клеток/1 мл п тикратно разбавленного буферного раствора веронала, содержащего изотонический елатин (этот п тикратно разбавленный раствор дл краткости назван ЖВБ) и по 0,5 мл комплемента сыворотки (комплемент морских свинок), разбавленного 150 раз ЖВБ. смесь вцдерживают при в течение 60 мин. Затем к Ней добавл ют 5 мл лед ного физиологического раствора и центрифугируют. Спектральна поглотительна способность отдельного верхнего сло определ етс при ОП 413, измер етс степень ингибировани гемолиза сенсибизированных эритроцитов испытываекими соединени ми. Значение ингибирующей гемолиз активности (у/мл), измеренное описанным методом, показано в табл. 1 дл каждого испытываемого соединени . Остра токсичность. Остра токсичность (ЗЩ мг/кг ве-; са) испытываемых соединений была определена на мышах при внутрибрюшинном введении соединени А и при внутривенном введении соединени В. Полученные результаты показаны в табл. 1. Более 300 Более 300 ЬОО-1000 Пример. В 500 мл колбу За kyguchi загружают 100 мл культуральной среды и штамм Stachybotrys sp. Т-791 культивируют при 25°С, рН 5,5 в течение 4 дней при встр хивании . Культуральна среда содержит , % Глицерол0,5 . Крахмал1,0 Сахароза0,2 Порошок сои0,5 Пентон 0,1 Экстракт солода0, 2 Сульфат магни. 0,3 Сол на кислота0,05 30-литровый ферментационный сосуд загружают 20 л культуральной среда указанного состава и полученнуй- в колбе культуру выращивают в культуральной среде при в течение 5 дней при перемешивании со скоростью 300 оборотов, .в минуту и скорости аэрации 1 литр на литр культуральной среды в минуту. Полученный .куль- 10 туральный бульон центрифугируют сО скоростью 8000 обсчотов в минуту дл удалени микробных клеток, а рН поверхностного сло устанавливают 1 кс нценТ рированной сол ной кис- 15 лот.ой. Полученные про ципитаты собирают центрифугированием и экстрагиР5ПОТ . метанолом. Как видно из табл. 1, значение сотрой токсичности (ЛДдо) соеди в- 20 ни позвол ет применить его в качестве лечебного препарата. Фракцию метанола адсорбируют на колонке с активированным углем (500 мл) после ее упаривани при по- с миженном давлении. Колонку элюируют всщньш 30%-ным раствором ацетона, а затем водным 50%-ным раствором ацетона . Фракцию 50%-ного водного раство- ра ацетона собирают и упаривают до- суха в вакууме. Остаток адсорбируют 0 на колонке силикагел и про вл ют смесью хлороформа и ацетона (в объемном отношении 2 : 1 и 1:1) в качестве ;п(рдвижной фазы. С другой стороны фракцию, содержащую 3-0 ф-о-глуку- 35 ронпиранозил)-со сапогенол В, соот-г вехствующую фракции, имеющей значение ,38, полученной тонкослойной хроматографией на силикагеле . Kiesel Yel 254 с использованием 40 смеси хлороформа метанола и воды (в объемном отнодении 65:35:8) в качестве элюирующего раствора, собирают и концентрируют досуха при пониженном давлении. Концентрат сно- 45 ва адсорбируют на колонке силикагел и элюируют смесью хлороформа с .ацетоном лоочередно {в объемных отношени х 2i2 и 111) и фракцию, сорт- : ветствукицую описанной, отбирают и концентрируют досуха. Кристаллизацией остатка из смеси хлороформа с ацетоном (в объемном отношении 1:1) получают 46 мг 3-0 (р-О-глукуронпиранозил )-со сепогенола В. Т.пл. 231-232 (с разложением). 55 П р и м е р 2. Берут следующие количества, мг: . ко во на дл ют ко до ва су ;м ла Пр зи ко I ав см зат обы дл таб ТСров таб луч со не Натриева соль соединени 500 Глюкоза250 Дистиллированна вода дл инъекции до общего объема5 мл Натриевую соль соединени и глюу раствор ют в дистилированной е дл инъекций в 5 мл ампуле. Воздух замен ют азотом, ампулу ревают при 12lc в течение 15 мин стерилизации раствсфа и получапригодный дл инъекций препарат. П РИМ ер 3. Берут следукщие ичества, мг: Соединение сох ласно изобретению75 0 Полусинтетиче.ское глнцерйдное основание дл ойцего веса2000 Соединение, согласно .изобретению авл ют к прлусинтетическрму осноию глицерида, смешивают их и пендируют при . Продукт ааают в форму и Рставл ют дл РХдени -в естественных услови х. дукт вынимают и дРлучают суппоорий , П р и м е р 4. Берут следующие ичества, г: Соединение согласно изобретению150 Авицел (коммерческре название пррдукта, выпускаемого Asahl Kasei Kubashiki Kaisha )40 Крахмал зерновых культур30 Стеарат магни . 2 ТС-5 (коммерчеркое название оксипррпилметилцеллюлозы )10 Полиэтиленгликоль 3 Касторовое масло 40 Метанол40 Соединение согласно изобретению, цел, крахмал и стеарат магни шивают и раствор ют в порошок, ем табЛеттируют с использованием чного сахарного порошка (пудры) получени покрыти . Полученные летки покрывают составсж из 5, полиэтиленгликол 6000, кастоого масла и метанола и получают летки с пленочным покрытием. Предложенный способ позвРл ет поить 3-0 Ср-О-глукуронпиранозил)сапогенрл , используемый в медицив качестве лечебного препарата.

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0 ГЛУКУРОНПИРАНОЗИЛ )-СОЯСАПОГЕЯОЛА В формулы микроорганизм Stachybotrys sp. штамм Т-791 выращивают в -аэробных успениях в питательной среде, содержащей .источники азота и углерода, минеральные соли и следы микроэлементов, при pH 3,5-11,5 и температуре 15-38°С с последующим выделением целевого продукта из культуральной среды и при необходимости переводят в соль.

_mBU <_m 1074408 А