SE434269B - 3-0-(beta-d-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol b och forfarande for framstellning derav - Google Patents

Description

7902866-3 Ett annat syfte med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande för framställning av ett sojasapogenolderivat och salter därav som har hög antikomplementverkan.

Föreliggande uppfinning avser ett nytt sojasapogenol-derivat representerat av följande formel (I): (I) Uppfinningen avser även farmaceutiskt godtagbara salter av sojasapogenol-derivatet med formeln (I) ovan, som erhålles genom omsättning av sojasapogenol-derivatet med lämpliga basiska föreningar.

Uppfinningen avser även förfaranden för framställning av soja- § sapogenol-derivatet med formeln (I) ovan såsom beskrives i detalj nedan. 7902866-8 Fig. l är ett mikrofotografi av Stachybotrys sp. T-791.

Föreningarna enligt föreliggande uppfinning kan användas för att lindra eller förhindra patologiska reaktioner som kräver verkan av ett komplement och vid terapeutisk behandling av immunologiska sjukdomar, såsom reumatoid artrit, systemisk lupus erythematosus, glomerulonefrit, autoallergisk hemolytisk anemi, blodplättsjukdomar, vaskulit, etc. Föreningen enligt uppfinningen kan även användas vid terapeutisk behandling av icke-immunologiska sjukdomar, såsom paroxysmal nattlig hemo- globinuri, ärftligt angioneurotiskt ödem och inflammatoriska tillstånd framkallade av inverkan av bakteriella eller lyso- somala enzymer på lämpliga komplementkomponenter som t.ex. inflammation efter koronarocklusion. De kan även vara använd- bara vid behandling av transplantationsavstötningar och som blodkultur- och transportmedier.

På senare år har omfattande forskning lagts ned på teoretisk analys av komplementsystemet och dess effekter på människor och djur, och för närvarande är det allmänt erkänt att när vissa föreningar har antikomplementverkan, så kan de uppvisa terapeutiska verkningar på olika symtom som beskrivits ovan.

Exempelvis anger US-PS 4.021.544 följande: "Uttrycket 'komplement' avser en komplex grupp av proteiner i kroppsvätskor som, genom att de arbetar tillsammans med antikroppar eller andra faktorer, spelar en viktig roll som förmedlare av immuna, allergiska, immunokemiska och/eller immunopatologiska reaktioner. De reaktioner, i vilka ett kom- plement deltager, äger rum i blodserum eller i andra kropps- vätskor och anses följaktligen vara humorala reaktioner." 7902866-8 "Med avseende på humant blod finns det för närvarande mer än ll proteiner i komplementsystemet. Dessa komplementproteiner betecknas med bokstaven C och med nummer: Cl, C2, C3 osv. upp till C9. Komplementproteinet Cl är i själva verket ett aggregat av underenheter betecknade Clq, Clr och Cls. De nummer som tilldelats komplementproteinerna återspeglar den sekvens, i vilken de blir verksamma, med undantag av komplementproteinet C4, som reagerar efter Cl och före C2. Siffertilldelningarna för proteinerna i komplementsystemet gjordes innan reaktions- sekvensen var helt känd. En mer detaljerad diskussion av kom- plementsystemet och dess roll i kroppsprocesserna kan åter- finnas i t.ex. Bull. World Health Org., 59, 935-938 (1968), Scientific American, 222, (nr. 5), 54-66 (1973), Medical World News, ll oktober 1974, sid. 53-58, 64-66, Harvey Lectures, 66, 75-104 (1972), The New England Journal of Medicine, 2§1, 489-495, 545-549, 592-596, 642-646 (1972), The John Hopkins Med. J., låå, 57-74 (1971) och Federation Proceeding, åå, l34- l37 (l973)." "Komplementsystemet kan-anses bestå av tre undersystem: (l) en igenkänningsenhet (Clq) som möjliggör att det kan förenas med antikroppsmolekyler som upptäckt en främmande inkräktare; (2) en aktiveringsenhet (Clr, Cls, C2, C4, C3), som iordning- ställer ett centrum på det angränsande membranet; och (3) en angreppsenhet (C5, C6, C7, C8 och C9) som åstadkommer ett hål i membranet. Membranangreppsenheten är icke-specifik; den för- stör inkräktare enbart på grund av att den alstras i deras när- het. För att minska skadegörelse på värdens egna celler i så ~ stor utsträckning som möjligt måste dess verkan begränsas i tiden. Denna begränsning åstadkommas dels av det spontana sönderfallet av aktiverat komplement och dels av inverkan av inhibitorer och destruktiva enzymer. Komplementkontrollen är emellertid inte perfekt, och det finns tillfällen när värdens celler tillfogas skada. Immunitet är därför ett tvâeggat svärd." 'ïf "Aktivering av komplementsystemet påskyndar även blodets lev- 'fL?ring. Denna verkan âstadkommes genom komplement-förmedlad Å)k¿frigöring av en koaguleringsfaktor ur blodplättar. Det biolo- 7902866-8 giskt vcrksamma komplementfragmentet och komplexen kan bli in- begripna i reaktioner som skadar värdcellerna, och dessa pato- gena reaktioner kan resultera i utveckling av immun-komplexa sjukdomar. Exempelvis skadar komplementet vid vissa former av nefrit njurens basala membran, vilket resulterar i utläckning av protein från blodet till urinen. Sjukdomen disseminerad lupus erythematosus tillhör denna kategori; dess symtom innefattar nefrit, inälvsskador och hudutslag. Behandling av difteri eller stelkramp med injektion av stora mängder antitoxin resulterar ibland i serumsjukdom, en immunkomplex sjukdom. Reumatoid artrit innebär också immunkomplex. Liksom disseminerad lupus erythemato- sus är den en autoimmun sjukdom, där sjukdomssymtomen förorsakas av patologiska effekter på immunsystemet i värdens vävnader.

Sammanfattningsvis har komplementsystemet visats vara förbundet med inflammation, koagulering, fibrinolys, antikropp-antigen- reaktioner och andra metaboliska processer." “I närvaro av antikropp-antigen-komplex är komplementproteinerna invecklade i en serie reaktioner, som kan leda till irreversibel membranskada, om de uppträder i närheten av biologiska membran.

Medan komplementet utgör en del av kroppens försvarsmekanism mot infektion resulterar det således även i inflammation och vävnadsskada vid den immunopatologiska processen. Naturen hos vissa av komplementproteinerna, förslag beträffande sättet för komplementbindning till biologiska membran och det sätt på vil- ket komplementet åstadkommer membranskada diskuteras i Annual Review in Biochemistry, gå, 389 (l969)." "Det har rapporterats att de kända komplementinhibitorerna, epsilon-aminokapronsyra, suramin-natrium och tranexamsyra, med framgång har använts vid behandling av ärftligt angio- neurotiskt ödem, ett sjukdomstillstånd som är följden av en nedärvd brist av eller bristande funktion hos seruminhibitorn för den aktiverade första komponenten i komplementet (Cl-inhi- bitor), The New England Journal of Medicine, gåå, 808-812 (l972); Allergol; Et. Immunipath; II, l63-168 (l974); J. Allergy Clin.

Immunol, äâ, nr. 5, 298-302 (l974); och Annals of Internal Medicine, åí, 580-593 (l976)." 7902866-8 6 3-0-(ß-L-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B erhållet enligt föreliggande uppfinning uppvisar kraftig anti-komplementverkan.

Föreningen enligt uppfinningen förväntas därför hämma överdriven aktivering av komplement vid sådana sjukdomar som kallas "immun- komplexa sjukdomar" eller "autoimmuna sjukdomar", t.ex. nefrit, reumatiska sjukdomar, systemisk lupus erythematosus, etc., och vara verksamma för profylax och terapi av sådana sjukdomar.

Föreningarna enligt uppfinningen kan framställas på olika sätt.

Exempelvis kan den förening enligt uppfinningen som representeras av formeln (I) enkelt isoleras och renas genom att man utsätter känt saponinhaltigt växtmaterial, såsom sojaböna, som innehåller föreningar med en 3-0-(ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol- komponent som delstruktur för kemiska behandlingar eventuellt tillsammans med fysikaliska behandlingar. Exempelvis kan den förening som representeras av formeln (I) framställas genom att man först separerar sojasaponin B från sojabönor och sedan be- handlar denna förening i enlighet med det nedan beskrivna reak- tionsschemat I.

Separationen av sojasaponin B kan utföras med användning av kända separationsförfaranden och medel. Exempel på lämpliga kemiska behandlingar innefattar hydrolys, alkoholys, företring, acylering, etc. Exempel på lämpliga fysikaliska behandlingar innefattar lösningsmedelsextraktion, lösningsmedelsutspädning, vätskekromatografi, gaskromatografi, omkristallisation, etc.

Mer speciellt kan den förening som representeras av formeln (I) framställas genom att man utsätter sojasaponin B (II), som er- hållits i enlighet med förfarandet enligt Kitagawa et al [Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa och Ichiro Yoshioka, Chem. Pharm.

Bull., gg, sid. 1339 (1974), Ibid., gg, sid. 121 (l976)] för alkoholys med en lägre alkohol, såsom metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, pentanol, hexanol, etc., i närvaro av en syra så att 3-0-(6-O-alkyl~ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B [formeln (III)] bildas och därefter hydrolyserar den senare (reaktionsschema I). Uttrycket “sojasaponin B" som det här an- 7902866-s vändas dvser en blandning av sojasapøniner I, II och III, som innehåller sojasapogenol B som en aglykon såsom beskrivits i de ovannämnda litteraturhänvisningarna.

Reaktionsschema I Sojasaponin B (II) I Alkoholys \.-" h \¿=-011 I Ûßïí r . v , (III) I \ ä í'\\/ < W f,/\\Q/. å Coor: I v.

H o 0- ' F_ -v "å / .L \| -' cxæqozz .C ÜÅ 1- f-l g I H IH i” H0 ou t u _ u å 1 i Hydrolys (deesterifiering) L~..._.------~1 + (1) 7902866-8 'I formeln (III) ovan betecknar R en lägre alkylgrupp med l-6 kolatomer.

Olika syror som vanligtvis användes vid alkoholys kan användas vid alkoholysen av sojasaponin B (II). Lämpliga exempel på sådana syror innefattar halogenväten, såsom klorväte, bromväte, fetc., starka oorganiska syror, såsom svavelsyra, salpetersyra, etc., starka organiska syror, såsom triklorättiksyra, trifluor- ättiksyra, etc., Lewis-syror, såsom aluminiumklorid, bortri- íluorid, titantetraklorid, titantetrabromid, etc.

Alkoholysen kan företrädesvis utföras vid rumstemperatur till i5o°c, särskilt cirka'5o-1oo°c, under cirka 1-6 timmar.

Sättet att isolera de föreningar som representeras av formeln (III) från reaktionsblandningen är inte speciellt begränsat och olika kända metoder som utnyttjar de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos de bildade substanserna inkl. sådana som användes vid separation av sojasaponin B kan användas. Lämpliga exempel på sådana metoder innefattar ett sätt att utnyttja skillnaderna i löslighet mellan produkterna och föroreningar, ett sätt att utnyttja skillnaderna i adsorptionsförmåga och affinitet för vanliga adsorbermedel såsom aktiverat kol, XAD-2, kiselgel, jonbytarhartser, Sephadex , etc., ett sätt att ut- nyttja skillnaderna i fördelningskoefficient mellan två vätske~ faser och en kombination av sådana metoder. Exempelvis blandas alkoholysatet med vatten, så att fällningar bildas, vilka under- kastas kiselgelkromatografi och elueras stegvis med eluerings- medel, t.ex. en blandning av kloroform och etanol för isolering av föreningen med formeln (I).

Hydrolysen av den förening som representeras av formeln (III) kan vanligtvis utföras i ett inert lösningsmedel i närvaro av en katalysator under betingelser som konventionellt användes vid hydrolys av estrar. Sedvanliga katalysatorer kan användas vid denna reaktion. Lämpliga exempel på katalysatorer som kan användas innefattar mineralsyror, såsom saltsyra, svavelsyra, salpetersyra, etc., oorganiska basiska föreningar, såsom natrium- 7902866~8 hydroxiu, kaliumhydroxid, natriumkarbonat, natriumvätekarbonat, kaliumkarbonat, kaliumvätekarbonat, etc. Oorganiska basiska före- ningar är att föredraga såsom katalysator.

Alla sedvanliga inerta lösningsmedel kan användas vid den ovan angivna reaktionen. Lämpliga exempel på inerta lösningsmedel innefattar vatten, lägre alkoholer, såsom metanol, etanol, propa- nol, etc., etrar, såsom dioxan, tetrahydrofuran, etc., dimetyl- sulfoxid, dimetylformamid, etc., eller en blandning därav. Hydro- lysreaktionen kan företrädesvis utföras vid rumstemperatur till 150%, särskilt so-iiooc, under cirka i tili' cirka s timmar.

Föreningen enligt föreliggande uppfinning som representeras av formeln (I) kan isoleras ur produkter från partiell hydrolys av sojasaponin B (II), varvid hydrolysen utföres i vatten eller en blandning av vatten och ett eller flera av de ovan beskrivna lösningsmedlen i närvaro av halogenväten såsom klorväte, brom- väte, etc., starka oorganiska syror, såsom svavelsyra, salpeter- syra, etc., eller starka organiska syror, sâsom triklorättik- syra, trifluorättiksyra, etc. Uttrycket "partiell hydrolys" som användes häri avser hydrolys vid vilken ingen spjälkning av aglykonen i saponin B-utgångsmaterialet äger rum.

Isoleringen av föreningen enligt uppfinningen ur det partiella hydrolysatet kan utföras med användning av de ovan beskrivna isoleringsmetoderna. Exempelvis underkastas det partiella hydro- lysatet, efter extraktion med n-butanol för eliminering av vattenlösliga komponenter, kromatografi på kiselqelkolonn för separation i respektive komponenter, och den fraktion som mot- svarar 3-O-(ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B underkastas kristallisation ur ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. en blandning av kloroform och aceton (lzl per volym). Den partiella hydro- lysen kan vanligtvis utföras vid rumstemperatur till l50°C, före- trädesvis 50-llO°C, under cirka l till cirka 6 timmar.

Alternativt kan den förening enligt uppfinningen som represen- teras av formeln (I) framställas med användning av mikroorganismer som nyligen isolerats av föreliggande uppfinnare. dvøozses-s Mikroorganismen kommer att beskrivas mer detaljerat nedan.

I. Plats för förekomst Denna stam har isolerats ur jorden vid Tokushima City, Toku- shima, Japan.

II. Karakteristika på olika kulturmedier Kulturkarakteristika för denna stam på olika medier baserade på visuella och mikroskopiska observationer (fig. l) är följande: A Visuell observation l) Maltextraktagar-medium Tillväxten är snabb och oregelbunden. Färgen hos koloniens bak- sida är gulbrun (Tan, 3ie) till mörkbrun (Dk Brown, 3pn). Kolo- nien är platt, och konidiebildningen är god. Hyfernas färg är ljusbrun (Biscuit, Zec) till gulbrun (Tan, 3ie) och vätskedrop- par som utsöndras observeras. Inget lösligt pigment bildas. 2) Potatisglukos-medium Tillväxten är mycket snabb, och genom odling vid 27°C i 30 dagar når kolonistorleken upp till 70 mm. Den perifera delen av kolo- nien sprider sig dendritiskt, och vidhäftade vita hyfer obser- veras. Ett stort antal vätskedroppar är närvarande. Knappast någon sporbildning observeras. Färgen hos koloniens baksida är ljust bärnstensfärgad (Lt Amber, 3ie). Inget lösligt pigment bildas. 3) "Czapek's Dox Agar Medium" Tillväxten är dålig. 4) Syntetiskt Mucor-agarmedium Tillväxten är dålig.

) Havremjölsagarmedium Tillväxten är mycket god, så att petriskålen täckes på två veckor. Kolonien är tunn och platt. Bildningen av hyfer är riklig från odlingens initialstadium, och konidiebildningen är också snabb. Färgen hos kolonien ändras från vit till mörk- 7902866-8 ll brun (Dk Brown, 3on) allteftersom odlingen fortskrider. Stora mängder VätSk@åIOppar uppträder på hyferna. Inget lösligt pigment bildas.

III. Morfologiska egenskaper Följande framgår av fig. l. Fialoforerna förgrenas enkelt och står upprätt. Fialofortopparna buktar ut något i stavform.

Emellertid är inte utbuktningen så stor som observeras vid typstammarna av Stachybotrys echinata IFO 7525 och 8856. Denna stam visar en hyfbredd på 4,0 till 4,5 u, vilket är något större än fialoforen. De fialoforer som förgrenas uppåtstående med fotceller från vegetativa hyfer eller lufthyfer har två till tre septa och har en storlek på 40-80 x 3,0-3,5 u. Cellväggen hos fialoforen är inte taggig utan jämn.

Tre till sex fialider bildar den utbuktande delen av fialo- forernas toppar. Vidare bildas sfäriska till nästan klotformiga fialosporer hos en cell med taggigt utskott och en storlek på 4,3-5,2 x 3,0-4,2 u kontinuerligt basipetalt vid fialidtopparna, och en kedja på 24-70 konidier bildas. Fialiden har klubbliknande form och en storlek på 6,9-10,7 x 3,5-4,7 u. Fialoforerna och fialiden är färglösa, och fialiden har kaffefärgad (Coffee, 3pn) till svart färg.

Taxonomisk status för föreliggande stam med de ovan angivna mikrobiologiska egenskaperna har undersökts av G.L. Barron, The Genera of Hyphomycetes from Soil, The Williams & Wilkins Company, Baltimore (1968), J.C. Gilman, A Manual of Soil Fungi, The Iowa State University Press, Ames, Iowa (l97l) och J.A. von Arx, The Genera of Fungi Sporelating in Pure Culture, Verlag von J. Cremer 3301 Lehre (1970). Enligt Saccardos taxo- nomiska system tillhör föreliggande stam klassen Hyphomycetes, familjen Dematiaceae och släktet Stachybotrys. Med andra ord överensstämmer egenskaperna hos föreliggande stam, som känne- tecknas av frånvaro av ascocarper och andra sexuella fortplant- ningsorgan, bildning av mörkbruna fialosporer ur fialid och samling av de erhållna fialosporerna i halvoirkelform vid toppändarna av fialiden, väl med egenskaperna hos släktet Sta- chybotrys. 7902366-e _ I 12 De olika kännetecknen för föreliggande stam har identifierats med hänvisning till de ovan beskrivna undersökningsmanualerna, och litteraturreferenser, såsom G.R. Bisby, Trans. Brit. Mycol.

Soc., gå, 133-143 (1943), R.K. Zuck, Mycologia, §§, 69-76 (1946), G.L. Barron, Can. J. Bot., 32, 153-157 (1961) och i jämförelse med de typstammar som bevarats vid Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO).

Som resultat härav befanns föreliggande stam tillhöra släktet Stachybotrys (släktet Memnoniella). Föreliggande stam uppvisar icke ascocarper eller andra sexuella fortplantningsorgan och mörkbruna fialosporer bildas kontinuerligt från fialiden. Långa kedjor av sporer bildas. Egenskaperna för föreliggande stam T-791 överensstämmer med dem för släktet Stachybotrys (släktet Memno- niella).

De olika egenskaperna för föreliggande stam har undersökts med hjälp av de ovan nämnda undersökningsmanualerna och litteratur- hänvisningarna såsom R.K. Zuck, Mycologia, âå, 69-76 (1946) och G. Smith, Trans. Brit. Mycol. Soc., gå, 387-394 (1962) och jämförts med de typstammar som bevaras vid IFO. Som resultat härav har det bedömts att, eftersom fialosporer bildas konti- nuerligt och basipetalt från fialid, stammen T-791 tillhör Memnoniella echinata benämnd av Höhnel. Pâ grund av redogörelserna av R.K. Zuck och G. Smith ovan ansågs stammen T-791 vara en stam analog med.Stachybotrys echinata. Följaktligen jämfördes aan med sfachybotrys echinata :Fo 7525 och 121078856.

Morfologiskt observeras inte taggliknande utskott specifika för de båda stammarna på cellväggarna av fialoforerna hos före- liggande stam T-791. Hos typstammarna buktar vidare fialofor- topparna ut 2 till 3 gånger fialoforernas hyfbredd, men ingen markerad utbuktning observeras vid föreliggande stam. Vidare uppvisar de båda typstammarna god tillväxt på olika kultur- medier, särskilt på potatisglukosagarmedium, och bildar cirku- lära, något upphöjda kolonier, och hyfer vidhäftar i stor ut- sträckning. Vidare observeras markant konidiebildning. Däremot uppvisar föreliggande stam dendritisk oregelbunden tillväxt 7902866-8 13 såsom angivits ovan, och dålig hyfbildning och dålig konidie- bildning observeras. På grund av de ovan angivna mikrobiologiska skillnaderna har föreliggande stam ansetts tillhöra en ny stam, och benämnts Stachybotrys sp. T-791.

Angivandet av färgerna ovan och i det följande är i enlighet med den metod som beskrives i Color Harmony Manual, Container Corporation of America (1958).

IV. Fysiologiska egenskaper _ Stachybotrys sp. T-791 är en aerob stam och har följande fysio- logiska egenskaper.

Stachybotrys sp. T-791 på temperatur Tillväxtbetingelser: 3,5-ll,5 15-38°C optimala ti11växtbetinge1ser= 4 , 5-9 , 5 2o-3o°c Prov av den nya stammen, Stachybotrys sp. T-791, har deponerats vid Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (vid No. 8-l, Inage Higashi 5-chome, Chiba- shi, Chiba, Japan) under deponeringsnumret FERM-P No. 3803 och även deponerats vid American Type Culture Collection (l230l Parklawn Drive Rockville, Maryland, USA 20852) under deponerings- numret ATCC 20513.

Specifikt åstadkommas framställningen av föreningen enligt före- liggande uppfinning genom den mikroorganism av släktet Stachy- botrys som beskrives ovan, på följande sätt: Mikroorganismerna odlas först i ett medium innehållande vanliga näringskällor och tillsatser. Kvävekällor som vanligtvis användes som odlingssubstrat innefattar t.ex. sojabönpulver, sojabönolja, majsstöpsvätska, jästextrakt, torkad jäst, havremjöl, kött- extrakt, hydrolyserat kasein, ammoniumsalter och nitratsalter.

Exempel på lämpliga kolkällor är glukos, glycerol, maltos, stärkelse, laktos, sackaros och melass. Exempel på tillsatser till kulturmediet innefattar oorganiska salter, såsom kalcium- karbonat, natriumklorid, magnesiumsulfat och fosforsyra. Vid 7902866-8 _ 14 behov kan kulturmediet dessutom innehålla små mängder av salter av metaller som järn, koppar, mangan och zink. Odling kan ut- föras i ett vanligt vattenhaltigt medium, som innehåller det ovan angivna substratet, med användning av ytodlingsteknik eller submers odlingsteknik med luftning och omröring. Submers odling med luftning och omröring är att föredraga. Odlingen kan med fördel utföras vid en temperatur av l5-38°C, företrädesvis 20- 32°C, under en period av vanligtvis 3-7 dagar under sedvanliga luftningsbetingelser, varvid kulturmediets pH-värde hålles vid 3,5-ll,5, företrädesvis 4,5-9,5.

Efter odlingen utvinnes den producerade substansen ur odlings- buljongen. Utvinningsmetoden är inte speciellt begränsad, och olika kända metoder som utnyttjar de fysikalisk-kemiska egen- skaperna hos de bildade substanserna kan användas. Utvinning kan exempelvis åstadkommas genom en metod som utnyttjar skill- naderna i löslighet mellan produkterna och föroreningar, en metod som utnyttjar skillnaderna i adsorptionsförmåga och affinitet för vanliga adsorbermedel, såsom aktiverat kol, XAD-2, kiselgel, jonbytarhartser, Sephadex , etc., en metod som utnyttjar skill- naderna i fördelningskoefficient mellan två vätskefaser, och en kombination av sådana metoder.

Den sålunda framställda föreningen enligt uppfinningen kan bilda salter med olika farmaceutiskt godtagbara basiska föreningar.

Givetvis innefattas sådana salter inom ramen för uppfinningen.

Lämpliga exempel på basiska föreningar som kan användas för bildning av de ovan angivna salterna innefattar oorganiska basiska föreningar, t.ex. natriumhydroxid, kaliumhydroxid, aluminiumhydroxid, natriumkarbonat, kaliumkarbonat, natriumväte- karbonat, etc., och organiska basiska föreningar, t.ex. piperazin, morfolin, piperidin, etylamin, dimetylamin, trietylamin, etc.

Föreningarna enligt uppfinningen kan användas som behandlings- medel för nefrit, och beredes vid användning för detta ändamål till farmaceutiska kompositioner tillsammans med sedvanliga farmaceutiskt godtagbara bärare. Lämpliga bärare som kan användas 7902866-8 är t.ex. spädningsmedel eller excipienter, såsom fyllmedel, utdrygn¿ngsmede1, bindemedel, vätmedel, sönderdelningsmedel, ytaktiva medel och smörjmedel som vanligtvis användes för be- redning av sådana läkemedel beroende på doseringsformen.

Olika doseringsformer av de terapeutiska medlen som nefritbehand- lingsmedel kan väljas i enlighet med syftet med terapin. Typiska doseringsformer som kan användas är tabletter, piller, pulver, flytande beredningar, suspensioner, emulsioner, granuler, kapslar, suppositorier, och injicerbara beredningar (lösningar, emulsioner, suspensioner, etc.).

Den mängd av föreningen enligt uppfinningen som verksam bestånds- del som skall införlivas i en farmaceutisk komposition användbar som nefritbehandlingsmedel är inte speciellt begränsad, och kan variera över ett stort område. En lämplig terapeutish;verksam mängd av föreningen enligt uppfinningen är vanligtvis l-70 vikt- procent, företrädesvis 5-50 viktprocent, baserat på hela komposi- tionen.

Det finns ingen speciell begränsning vad gäller sättet att an- vända det terapeutiska medlet som antikomplementmedel, såsom nefritbehandlingsmedel, och det terapeutiska medlet kan admini- vøozsssfs 16 streras på lämpliga vägar för de speciella formerna av det terapeutiska medlet. Exempelvis administreras tabletter, piller, flytande beredningar, suspensioner, emulsioner, granuler och kaps- lar oralt. De injicerbara beredningarna administreras intravenöst, antingen separat eller tillsammans med sedvanliga hjälpmedel, såsom glukos och aminosyror. Vidare kan det terapeutiska medlet efter behov administreras intramuskulärt, intrakutant, subkutant, eller intraperitonealt. Suppositorier administreras intrarektalt.

Dosen av nefritbehandlingsmedlet väljes lämpligen enligt använd- ningsändamålet, symtomen, etc. Vanligtvis är en dos av föreningen enligt uppfinningen cirka 0,5 till 20 mg/kg kroppsvikt per dag.

Föreningarna enligt uppfinningen har antikomplementverkningar och kan användas även såsom terapeutiska medel för autoimmuna sjukdomar, kollagena sjukdomar och reumatiska sjukdomar.

Resultat av försök avseende de farmakologiska effekterna av föreningarna enligt uppfinningen visas nedan.

Farmakologiska test l. Testade föreningar A. 3-0-(P-D-glukuronopyranosyl)~sojasapogenol B (uppfinningen) B. Glycyrrizin (jämförelse) 2. Antikomplementverkan Antikomplementverkan för testföreningarna ovan mättes och fastställdes med den testmetod som beskrives i Meneki Kagaku (Immuno-Chemistry), Yuichi Yamamura et al., Ed. Asakura Shoten, Tokyo, Japan (l973), sid. 830-834. Mer specifikt satsades ett provrör med 0,5 ml vattenhaltig dispersion av var och en av testföreningarnâ, 0,5 ml sensibiliserade erytrocyter (EA) inne- hållande 1 x 10 celler/ml, l ml av en 5-faldigt utspädd lös- ning av en Veronal-buffertlösning, innehållande isotoniskt gela- tin (denna 5-faldigt spädda lösning benämnes förkortat GVB++), och 0,5 ml komplementserum (marsvinkomplement) spätt:l5O gånger med GVB++. Blandningen hölls vid 37°C 60 minuter..Därefter till- sattes 5 ml av en iskall fysiologisk saltlösning ochwblandningen centrifugerades. Absorbansen för den separerade supernatanten 7902866-8 17 mättes vid 0D4l3, och den utsträckning i vilken testföreningen inhiberade hemolysen av de sensibiliserade erytrocyterna bestämdes.

Det värde för 50%-ig hemolyshämningsverkan (Y/ml) som uppmättes med den ovan angivna metoden visas i tabell I nedan för varje testförening. 3. Akut toxicitet Den akuta toxiciteten (LDBO mg/kg) för testföreningarna bestämdes på möss genom intraperitoneal administrering vid förening A och intravenös administrering vid förening B.

De erhållna resultaten visas i tabell I nedan: Tabell I Testförening Antikomplementverkan Akut toxicitet (v/ml) LDSO (mg/kg) A 5 över 300 B ' 500-1.000 över 300 Som framgår av de i tabell I visade resultaten är det akuta toxicitetsvärdet (LDSO) för föreningen enligt uppfinningen av en storleksordning som gör det möjligt att använda den som terapeutiskt medel. 4. Terapeutisk verkan på nefrit av nefrotoxin-typ Rätt-nefrotoxin (förkortat “NT") erhölls såsom beskrives nedan.

Råttnjurbark homogeniserades med en lika stor mängd fysiologisk saltlösning. Den homogeniserade blandningen blandades med “Freund's complete adjuvant" (en produkt från Difco Company) i ett volym- förhållande av l:l. 2 ml av den erhållna blandningen injicerades intramuskulärt i en kanin (kroppsvikt 3.100 g) för immunisering av kaninen. En och en halv månad senare togs blod från kaninens hjärta och serum erhölls. Det erhållna serumet inaktiverades vid 56°C i 30 minuter, utsaltades sedan med en 40%-ig"mättad~ vattenlösning av ammoniumsulfat och fraktionerades; Y-giobulin~ (IgG)-fraktionen uppsamlades för erhållande av NT. 7902866-8 18 Den terapeutiska utvärderingen utfördes med användning av Wistar- råttor av hankön med en kroppsvikt på l50-160 g med tre försöks- djur för varje testförening. Testföreningen administrerades intra- peritonealt en gång var 24:e timme i 7 dagar. En timme efter ' administreringen av testföreningen den tredje dagen tillfördes NT. NT injicerades intravenöst i en mängd av l ml i en svansven hos varje råtta; Fysiologisk saltlösning användes såsom kontroll.

Proteinurinivån (total mängd avsöndrad till urinen under en 24-timmarsperiod) uppmättes med användning av turbidometri, var- vid man använde bovinserumalbumin som kontroll med hjälp av sulfosalicylsyra.

De erhållna resultaten visas i tabell II nedan.

Tabell II Proteinurinivå (mg/dag) Dagrnr. l .4. l l9.

Kontroll l 14 l7 22 32 2 20 25 27 37 3 12 19 20 31 _ Medeltal 15 20 23 33 Förening enligt l 1,9 1,2 0,9 7 *äâpíär/líiggšš* 2 s , 3 2 ,9 1 , 8 13 ~ 3 2,5 2,7 l,l Medeltal 3,2 2,3 1,3 9,7 Dagnumret ovan är räknat från tiden för administrering av test- föreningen som var en timme före tillförseln av NT.

Proteinurinivån hos en frisk råtta är 0,5 till 5 mg/dag.

När proteinurinivån överstiger detta område, särskilt när pro- teinurinivån är mer än 10 mg/dag, kan man med säkerhet säga att nefrit har uppträtt. Som framgår av resultaten,i,tabell II uppträdde nefrit i kontrollomgângen, och vid föreningarna enligt föreliggande uppfinning är proteinurimängden från tiden för administreringen av NT till 10 dagar efter administreringen väsent- 7902866-8 19 ligen densamma som för en frisk råtta. Således kan man se att administrering av föreningarna enligt uppfinningen hämmar primära och sekundära immunreaktioner.

. Terapeutiska verkningar på nefrit av Heymann-typ Wistar-råttor av hankön med en kroppsvikt pâ 180-200 g användes vid testet. Râttnjurebark extraherades och homogeniserades med en lika stor volymmängd fysiologisk saltlösning. Homogenatet centrifugerades vid 1.500 G i en timme. Den överstående vätskan renades i enlighet med metoden enligt T.S. Edgington et al., Journal of Experimental Medicine, lgl, 555 (1968), och blandades med "Freund's complete adjuvant 37 Ra" (en produkt från Difco Company) i ett volymförhållande av 0,4:l. Den erhållna blandningen injicerades intraperitonealt i isologa råttor i en mängd av 0,5 ml per råtta. Därefter administrerades samma mängd av bland- ningen varannan vecka tills proteinurinivån översteg 100 mg/dag.

(Denna period var ungefär 6-8 veckor.) Var och en av testföreningarna administrerades intraperitonealt till de råttor som angripits av Heymann-typ-nefrit (med en kropps- vikt av 300-35O g) en gång per dag i 7 dagar, varefter protein- urimängden (mg/dag) uppmättes på samma sätt som beskrivits ovan.

Fysiologisk saltlösning användes såsom kontroll. De erhållna resultaten visas i tabell III nedan. 17902866-8 ggpeii 111 Proteinurinivå (mg/dag) Dag nr.

Före admini- strering l 4 7 14 21 Kentreii 1 132 127 135 126 135 114 2 121 105 121 109 103 105 3 135 ' 117 137 132 121 109 Medei- 129 116 131 122 119 109 tal Förening 11 117 89 - 42 27 53 8 enligt upPfin_ 2 129 127 75 39 _ 17 13 ningeng ~ 3 123 - 119 58 18 9 (3 mg/kr°PPnede1~ 123 112_ ss .2s 3 tal 2-3 veckor efter försökets början ökade råttornas kroppsvikter till 400-500 g, och normala proteinurinivåer förmodas vara -15 mg/dag. Som framgår av resultaten i tabell III kan före- ningarna enligt föreliggande uppfinning bota nefrit av Heymann- typ.

För att belysa föreliggande uppfinning mer i detalj beskrives i de följande exemplen framställningen av de föreningar enligt uppfinningen som representeras av den allmänna formeln (I) och salter därav, och framställningen av nefritbehandlingsmedel, som innehåller föreningarna enligt uppfinningen med den allmänna formeln (I) och salter därav som verksam beståndsdel, beskrives i de följande referensexemplen. d *Exempel l. l(a) Sojasaponin B (500 mg) löstes i 30 ml metanol. Efter till- "sats av 1,5 ml l5N svavelsyra återloppskokades lösningen i 3,5 * timmar. Kallt vatten sattes till reaktionsblandningen för bild- lning av fällningar, som uppsamlades och tvättades tillräckligt imed vatten. Fällningarna adsorberades på en kiselgelkolonn och ' eiueredee med en förändrad kiereferm-etenoiebiendning 120=1 f(volvmÅ 200 ml; l0:l (volym) 150 ml; 5:1 (volym) 200 ml; och 7902866-8 21 2:1 (volynd 200 ml], varvid man fick 71 mg 3-O-(6-O-metyl-B- -D~glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B.

Den sålunda erhållna föreningen löstes i 2 ml metanol, och 2 ml av en lN vattenhaltig Na0H-lösning sattes till lösningen följt av återloppskokning i två timmar. Sedan reaktionsblandningen blandats med kallt vatten och pH-värdet justerats till cirka l med lN vattenhaltig HCl-lösning extraherades den med n-butanol. n-Butanol-fraktionen koncentrerades till torrhet vid reducerat tryck. Kristallisation av återstoden ur en blandning av kloro- form-aceton (l:l per volym) gav 50 mg 3-O-(P-D-glukuronopyra- nosyl)-sojasapogencl B. smä1tpunkt= 231-232°c (sanderaelning) Elementaranalys för C36H58O9: Beräknat (%): C 68,11 H 9,21 Funnet (%): C 67,85 H 9,08 Kiselgel-tunnskiktskromatografi med användning av "Kiesel Gel F254" (ett handelsnamn för en produkt från Merck Co.) l. Kloroform-metanol-vatten (65:35:8 per volym) Rf = 0,38 2. Isopropanol-2N vattenhaltig ammoniaklösning (l00:l5 per volym) Rf = 0,21.

Löslighet: Mycket löslig i metanol, etanol, n-propanol, n-buta- nol, vattenhaltig alkalilösning, pyridin, dimetylsulfoxid och dimetylformamid; löslig i aceton, etylacetat och metyletylketon; och svårlöslig i bensen, kloroform, dietyleter, n-hexan och petroleumeter. (b) Sojasaponin B (500 mg) löstes i 30 ml etanol mättad med klorväte och lösningen återloppskokades i 3 timmar. Kallt vat- ten sattes till reaktionsblandningen för bildning av fällningar som uppsamlades och tvättades med vatten. Fällningarna renades sedan genom kiselgelkolonn-kromatografi [elueringsmedelz kloro- form-etanol (20:l, l0:l, 5:1 och 2:1 per volym)] varvid man fick 75 mg 3-0-(6-O-etyl-Q-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B.

Den sålunda erhållna föreningen blandades med 2.ml_etanol,och 2 ml lN vattenhaltig KOH-lösning och blandningen återloppskoka~~ des 2 timmar. Reaktionsblandningen blandades med kallt vatten och pH-värdet justerades till cirka l med lN vattenhaltig Hcl- 7902866-8 22 lösning toljt av extraktion med n-butanol. n-Butanol-fraktionen koncentrerades till torrhet under reducerat tryck och kristalli- sation av återstoden ur en blandning av kloroform-aceton (lzl per volym) gav 45 mg 3-0-(ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B. smä1tpunkt= 231-232°c (sönderdelning).

Exemgel 2.

Sojasaponin B (1 g) löstes i 70 ml destillerat vatten och lös- ningen blandades med 5 ml l5N vattenhaltig svavelsyra-lösning följt av återloppskokning 1 2,5 timmar. Reaktiofisblandningen extraherades med n~butanol. n-Butanol-fraktionen koncentrerades till torrhet under reducerat tryck. Återstoden adsorberades på en kiselgelkolcnn och eluerades med en blandning av kloroform- etanol (20:l, lO:l, 5:1 och 2:1 per volym), varvid man fick g350 mg 3-0-(ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B. smä1tpunkt= 231-232°c (sönaerae1ning>.

Exemgel 3.

En 500 ml-Sakaguchi-kolv satsades med lOO ml av ett kulturmedium med följande sammansättning, och Stachybotrys sp. T-791 odlades vid 25°C och ett pH-värde av 5,5 i 4 dagar under skakning.

Glycerol 0,5 % Stärkelse _ 1,0 % Sackaros 0,2 % Sojabönpulver 0,5 % Pepton _ 0,1 % Maltextrakt 0,2 % Mgso4 0,3 % HCl 0,05 % En 30-liters krukfermentor satsades med 20 liter av ett kultur- medium med sammansättningen ovan och en kolv med den erhållna ympkulturen odlades i kulturmediet vid 28 C'i 5 dagar under om- röring vid 300 varv/min. vid en luftningshastighetfav l liter/ liter av kulturmediet/minut. Den erhållna kulturbuljongen centri- fugerades vid en hastighet av 8000 varv/min. för eliminering av mikrobiella celler, och pH-värdet för den överstående vätskan, justerades till cirka l med koncentrerad saltsyra. De erhållna 7902866-8 23 fällningarna uppsamlades genom centrifugering och extraherades med metanol. Metanolfraktionen adsorberades på en kolonn av aktiverat kol (500 ml) sedan den koncentrerats under reducerat tryck. Kolonnen eluerades med en vattenhaltig 30%-ig acetonlös- ning och sedan med en vattenhaltig 50%-ig aoetonlösning. Frak- tionen av vattenhaltig 50%-ig acetonlösning uppsamlades och koncentrerades till torrhet under reducerat tryck. Återstoden adsorberades på en kiselgelkolonn och eluerades med användning av en blandning av kloroform och aceton (2:l och l:l per volym) som elueringsmedel. Å andra sidan uppsamlades en fraktion inne- hållande 3-0-(B-D~glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B [motsvarande fraktionen med Rf-värdet 0,38, som erhölls genom att underkasta “Kiesel Gel F 54" (ett handelsnamn för en produkt från Merck Co.) tunnskiktskromatografi med användning av en blandning av kloro- form-metanol-vatten (65:35:8 per volym) som elueringslösning] och koncentrerades till torrhet under reducerat tryck. Koncen- tratet adsorberades åter på en kiselgelkolonn och eluerades med en förändrad kloroformraceton-blandning (2:l och l:l per volym) och fraktionen motsvarande den ovan beskrivna uppsamlades följt av koncentrering till torrhet. Kristallisation av återstoden ur en blandning av kloroform-aceton (l:l per volym) gav 46 mg 3-0- -(ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B. smä1tpunkt= z31-232°c (sönaeraelninq) .

JÄMFöRANDE FöRsöK.

Farmakologisk testning. l. Testade föreningar A. 3-0-(ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B.

B. 3-0-[ä-L-ramnopyranosyl(l-å2)-ß-D-ga1aktopyranosy1~ (1-92)-fl~D-glukuronopyranosylj-sojasapogenol B.

C. 3-O-ßä-L-ramnopyranosyl(l->2)-arL-arabinopyranosyl- (1-+2)-ß-D-glukuronopyranosyl]-sojasapogenol B. 79028 66-8 24 2. Pntikomplementär aktivitet De ovannämnda testföreningarnas antikomplementära aktivitet bestämdes och bekräftades enligt den testmetod, som beskrives i Meneki Kagaku (Immuno-Chemistry), Yuichi Yamamura et al.,* Ed., sid. 830-834, Asakura Shoten, Tokio, Japan (l973).

Närmare bestämt beskickades ett provrör med 0,5 ml av en dispersion i vatten av var och en av testföreningarna, 0,5 ml sensiterade erytrocyter (EA) innehållande l x lÖ8 celler/ml, l ml av en 5-faldigt utspädd lösning av en Veronalå -buffertlösning innehållande isotont gelatin (denna 5-faldigt utspädda lösning betecknas GVB++ för korthetens skull) och 0,5 ml komplementserum (marsvinskomplement) utspätt l5O gånger med GVB++. Blandningen hölls vid 37°C 60 minuter.

Därefter tillsattes 5 ml iskall fysiologisk saltlösning och blandningen centrifugerades.

Absorbansen i den separerade överflytande vätskan bestämdes vid 0D4l3 och den grad med vilken testföreningen inhiberade hemolys av sensiterade erytrccyter bestämdes. Värdet för 50%=ig hemolysinhiberande aktivitet (y7ml)-bestämdes enligt metoden ovan och anges i tabell I för var och en av test- föreningarna.

Tabell 1.

Antikomplementär aktivitet (7Yml) Testförening Marsvinskomplement Humant komplement A ' 5 3 B 125 86 C l3O 86 Resultaten i tabellen ovan visar att föreningen enligt upp- finningen har en antikomplementär aktivitet som är ungefär -26 gånger så hög som aktiviteten för tidigare kända före- ningar när det gäller marsvinsserum och ungefär 29 gånger så hög som den för tidigare kända föreningar när humant serum användes.

Claims (2)

1. 25 7902866-8 PATENTKRAV l. 3-0-(ß-D-glukuronopyranosyl)-sojasapogenol B represen- terat av formeln u" (I) och farmaceutiskt godtagbara salter därav.

2. Sätt att framställa en förening med formeln (I) a t av att man k ä n n e t e c k n (a) aerobt odlar mikroorganismen i ett kulturmedium, som innehåller assimilerbara käl kol, oorganiska salter och spårmineraler vid ett pH- l,5 och en temperatur Stachybotrys sp. T-791 lor av kväve, -värde av ungefär 3,5 till ungefär l av ungefär l5°C till ungefär 38°C och utvinner den erhållna produkten med formeln I ur odlingsvätskan; eller - 7902866-8 26 (b) hydrolyserar en 3-0-(6-O-alkyl-ß-D-glukuronopyrano- syl)-sojasapogenol B, som har den allmänna formeln (III) COOR 0 OH H “O on vari R betecknar en lägre alkylgrupp; eller (c) partiellt hydrolyserar sojasaponin B i vatten eller ett vattenhaltigt lösningsmedel i närvaro av en vätehalo- genid, en stark oorganisk syra eller en stark organisk syra och isolerar föreningen med formeln I ur det partiella hydrolysatet.