JPH06100582A - 新規化合物ｊｓ４９、その使用および製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗腫瘍性を有する新規な化合物を提供する。 【構成】 次式（Ｉ）で示される化合物ＪＳ４９または
その酸付加塩。 【化１】 上記式（Ｉ）で示される化合物ＪＳ４９またはその酸付
加塩を有効成分として含む抗腫瘍剤。ストレプトミセス
属に属し、ＪＳ４９の生産能を有する菌株を適当な培地
で培養し、その培養物より化合物ＪＳ４９を得る。この
方法により上記式（Ｉ）で示される化合物ＪＳ４９を製
造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【産業上の利用分野】本発明は新規物質に、さらに詳し
くは抗腫瘍性を有する新規化合物ＪＳ４９に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗腫瘍物質に関しては、既に多数のもの
が医薬として実用化されている。一般に、化学物質の生
理活性はその化学構造に依存するところが大きいため、
抗腫瘍性を有する新規な化合物に対しては、不断の希求
があると言えよう。

【０００３】〔発明の概要〕

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の希求
に応えるものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明による
新規化合物は、次式（Ｉ）で示される化合物ＪＳ４９ま
たはその酸付加塩である。

【化２】 本発明は、また、この物質の使用に関する。すなわち、
本発明による抗腫瘍剤は、上記式（Ｉ）で示される化合
物ＪＳ４９またはその酸付加塩を有効成分として含有す
るものである。本発明は、さらにまた、この物質の製造
法に関する。すなわち、本発明による上記式（Ｉ）で示
される化合物ＪＳ４９の製造法は、ストレプトミセス属
に属し、ＪＳ４９の生産能を有する菌株を適当な培地で
培養し、その培養物より化合物ＪＳ４９を得ること、を
特徴とするものである。

【０００５】〔発明の具体的説明〕新規化合物ＪＳ４９ １）化学構造 本発明による新規化合物ＪＳ４９は、前記の式（Ｉ）で
示される化学構造を有する。この化学構造は、プロトン
核磁気共鳴スペクトル（図１）および炭素１３核磁気共
鳴スペクトル（図２）の解析により、さらに、マススペ
クトルより判明した分子量および分子式より、決定され
たものである。 ２）物理化学的性状 1)融点：１３１〜１３５℃ 2)比旋光度：〔α〕²¹ _Ｄ＋１８３° （ｃ０．５５５、
メタノール中） 3)溶解性：メタノール、エタノールに可溶。クロロホル
ム、アセトン、酢酸エチルに微溶。ヘキサン、水に不
溶。 4)Ｒｆ値：０．２３ 吸着剤：メルク社製「シリカゲル６０Ｆ₂₅₄ 」 展開溶媒：クロロホルム‐メタノール（５：１） 5)高分解能マススペクトル（ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ）⁺
４６５．２２１９、Ｃ₂₃Ｈ₃₃Ｎ_２Ｏ_８ 理論値 ４６５．２２３７ 6)分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₂Ｎ_２Ｏ_８ 7)紫外吸収スペクトル：図３に示す。 λ_max ｎｍ（ε）： メタノール中；２６７（２７０００），３４５（２７０
００） ０．０１規定水酸化ナトリウム‐メタノール中；２４９
（２４０００），３４０（２７０００） 8)赤外吸収スペクトル（ＫＢｒディスク法）：図４に示
す。 ν_max cm^-1：３４００，１６５０，１５８５ 9)プロトン核磁気共鳴スペクトル（５００メガヘルツ、
重ＤＭＳＯ中）：図１に示す。 10) 炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１２５メガヘル
ツ、重ＤＭＳＯ中）：図２に示す。 式（Ｉ）で示される化合物は、塩基性の窒素原子の位置
において酸付加塩があり得る。本発明化合物は、これら
の付加塩をも包含するものである。酸付加塩を形成すべ
き酸としては、例えば無機酸、例えば塩酸、硫酸、硝
酸、リン酸など、あるいは有機酸、例えば酢酸、プロピ
オン酸、マレイン酸、オレイン酸、パルミチン酸、クエ
ン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルタミン酸、パ
ントテン酸、ラウリルスルホン酸、などをあげることが
できる。なお、酸付加塩を医薬として使用する場合に
は、酸は薬学上許容されるものでなければならない。

【０００６】ＪＳ４９の製造 １）概要 化合物ＪＳ４９は現在のところ微生物の培養によっての
み得られているが、類縁化合物の合成化学的修飾によっ
て製造することも、あるいは全合成化学的に製造するこ
ともできよう。また、遺伝子工学的手法によることもで
きよう。すなわち、化合物ＪＳ４９の産生に関与する遺
伝子を適当な微生物に導入し、この様な形質転換微生物
を培養し、この培養物から得ることも可能であろう。微
生物の培養による場合の菌株としては、例えば、ストレ
プトミセス属に属するＪＳ４９生産能を有するものが使
用される。具体的には、本発明者らの分離したストレプ
トミセス・ビオラセウスニガー（Streptomyces violac
eusniger）ＪＳ４９株がＪＳ４９を生産することが本発
明者らによって明らかにされているが、その他の菌株に
ついては、抗生物質生産菌単離の常法によって適当なも
のを自然界より分離することが可能である。また、スト
レプトミセス・ビオラセウスニガーＪＳ４９株を含めて
ＪＳ４９の生産菌を放射線照射その他の変異処理に付し
て、ＪＳ４９の生産能を高める余地も残されている。遺
伝子工学的手法もまた可能であることは前記したところ
である。

【０００７】２）生産菌株ＪＳ４９株 ＪＳ４９生産能を有するストレプトミセス属の菌株とし
て本発明者らの見出しているＪＳ４９株は、下記の内容
のものである。 (1) 由来および寄託番号 ＪＳ４９株は、群馬県で採取した土壌から分離されたも
のであり、平成４年９月７日に工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されて、「微工研条寄第３９９７号」
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９９７）の番号を得ている。 (2) 菌学的性状 ＪＳ４９株の菌学的性状は以下の通りである。本菌株の
“特徴づけ”は『特許庁産業別審査基準記載』の方法に
よった。本菌株の基生菌糸は分断しない。気菌糸は長い
主軸を形成し、それより不規則に分枝した先端に、１０
〜５０個またはそれ以上からなるコンパクトな４〜９回
転の螺旋状の胞子鎖を形成する。胞子は非運動性で、培
養初期はシースに覆われ胞子形態は不鮮明であるが、培
養３週間に及ぶと胞子がシースから突出し、円形あるい
は楕円形を呈し、幅０．６〜０．８、長さ０．８〜１．
０μｍで、胞子表面はいぼ状である。菌核、胞子のう、
その他の特殊形態は観察されない。細胞壁化学型はＩ型
である。培養性状は表１に示す。集落表面の菌叢色は灰
色系列であるが、培養が長期に及ぶと黒湿化する。裏面
色は不鮮明色を呈し、ｐＨで変化しない。拡散性色素は
認められない。生理的性状は、表２に示す。本菌株は、
中温性で炭素源はシュクロース、ラムノース以外利用す
る。本菌株の形態的性状と細胞壁化学型から本菌株はス
トレプトミセス（Streptomyces、以後Ｓ．と略す。）属
に位置する。上述の諸性状を基に「細菌名承認リスト、
１９８０」およびそれ以後の有効名リストに記載された
Ｓ属の種について検索し、近縁種を選出した。Ｓ．ビオ
ラセウスニガーの診断的性状を比較すると本菌株とＳ．
ビオラセウスニガーの性状はよく一致しており、炭素源
の資化能のみ異なっている（表３）。従って本菌株は
Ｓ．ビオラセウスニガーに最も近似であるので、本菌株
ＪＳ４９はＳ．ビオラセウスニガーに含まれる一菌株と
同定し、ストレプトミセス・ビオラセウスニガー（Stre
ptomyces violaceusniger）ＪＳ４９株と称する。

【０００８】 _{表１． 培養性状 培地 集落表面の菌叢色 集落の裏面色 拡散性色素} シュクロース・ 灰色系列 淡黄色 なし ^{硝酸塩寒天} グルコース・ア 灰色系列 淡黄味茶色 なし ^{スパラギン寒天 淡黄色} グリセリン・ア 灰色系列 淡黄色 なし ^{スパラギン寒天} 無機塩・スターチ寒天 灰色系列 明茶味灰色 なし ^明黄色 チロシン寒天 白色系列 淡黄色 なし 栄養寒天 白色系列 淡黄色 なし イースト・麦芽寒天 灰色系列 淡黄味茶色 なし ^{暗黄味橙色} オートミール寒天 灰色系列 淡黄色 なし ^{明茶味灰色}

【０００９】 表２． 生理的性状 生育温度範囲 ２０〜３７℃ 最適温度 ２０〜３０℃ メラニン様色素 チロシン寒天 − ペプトン・イースト鉄寒天 − トリプトン・イースト・ブロス − スターチの加水分解 ＋ ゼラチンの液化 − 脱脂粉乳のペプトン化 ＋ 脱脂粉乳の凝固 − 硝酸塩の還元 − 炭素源の資化 Ｄ‐グルコース ＋ Ｌ‐アラビノース ＋ Ｄ‐キシロース ＋ Ｄ‐フラクトース ＋ シュクロース − Ｌ‐ラムノース − ラフィノース ＋ ｉ‐イノシトール ＋ Ｄ‐マンニット ＋

【００１０】 表３． 本菌株と近縁種との比較 _{本菌株 ストレプトミセス・ JS49 ビオラセウスニガー} 胞子鎖形態 螺旋状 ＋ ＋ 胞子表面 いぼ状 ＋ ＋ 菌叢色 灰色 ＋ ＋ 裏面色 不鮮明色 ＋ ＋ pH感受性 − − 拡散性色素産生 − − pH感受性 − − メラニン色素産生 − − スターチの加水分解 ＋ ＋ 硝酸塩の還元 − − 生育温度 １０℃ − − ３７℃ ＋ ＋ ４５℃ − − 炭素源の資化 アラビノース ＋ ＋ キシロース ＋ ＋ イノシトール ＋ ＋ マンニット ＋ ＋ ラムノース − ＋ ラフィノース ＋ ＋ シュクロース − ＋ フラクトース ＋ ＋

【００１１】培養／ＪＳ４９の生産 化合物ＪＳ４９は、ストレプトミセス属に属するＪＳ４
９生産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培養物か
ら目的物を採取することにより製造することができる。
培地は、ＪＳ４９生産菌が利用し得る任意の栄養源を含
有するもので有り得る。具体的には、例えば、炭素源と
してグルコース、フラクトース、マルトース、スターチ
および油脂類などが使用でき、窒素源として大豆粉、綿
実粕、乾燥酵母、酵母エキスおよびコーンスティープリ
カーなどの有機物ならびにアンモニウム塩または硝酸
塩、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムおよび
塩化アンモニウムなどの無機物が利用できる。また、必
要に応じて、塩化ナトリウム、塩化カリウム、燐酸塩、
重金属塩など無機塩類を添加することができる。発酵中
の発泡を抑制するために、常法に従って適当な消泡剤、
例えばシリコーン油を添加することもできる。培養方法
としては、一般に行なわれている抗生物質の生産方法と
同じく、好気的液体培地培養法が最も適している。培養
温度は、２０〜３７℃が適当であるが、２５〜３０℃が
好ましい。この方法でＪＳ４９の生産量は、振盪培養、
通気攪拌培養ともに培養２〜４日間で最高に達する。こ
のようにして、ＪＳ４９の蓄積された培養物が得られ
る。培養物中では、ＪＳ４９はその一部は菌体中に存在
するが、その大部分は培養濾液中に存在する。このよう
な培養物からＪＳ４９を採取するには、合目的的な任意
の方法が利用可能である。その一つの方法は、溶解性の
原理に基づくものであって、具体的には、培養濾液中の
ＪＳ４９についてはこれを水不混和性かつＪＳ４９が可
溶の溶媒、例えば酢酸エチル等で分配し、酢酸エチル可
溶の画分を採取する方法、あるいは菌体内のＪＳ４９に
ついては濾過、遠心分離などで得た菌体集体をメタノー
ル、エタノール、アセトンなどで抽出処理して回収する
方法などがある。菌体を分離せずに培養物そのままを上
記の抽出操作に付すこともできる。適当な溶媒を用いた
向流分配法も抽出の範疇に入れることができる。培養物
からＪＳ４９を採取する他の一つの方法は、吸着の原理
に基づくものであって、既に液状となっているＪＳ４９
含有物、例えば培養濾液あるいは上記のようにして抽出
操作を行なうことにより得られる抽出液を対象として、
適当な吸着剤、例えばシリカゲル、活性炭、「ダイヤイ
オンＨＰ−２０」（三菱化成社製）などを用いて目的の
ＪＳ４９を吸着させ、その後、適当な溶媒にて溶離させ
ることによってＪＳ４９を得ることができる。このよう
にして得られたＪＳ４９溶液を減圧濃縮乾固すれば、Ｊ
Ｓ４９粗標品が得られる。このようにして得られたＪＳ
４９の粗標品を更に精製するためには、上記の抽出法お
よび吸着法にゲル濾過法、高速液体クロマトグラフィー
などを必要に応じて組合せて必要回数行なえばよい。例
えば、シリカゲルなどの吸着剤、「セファデックスＬＨ
−２０」（ファルマシア社製）などのゲル濾過剤を用い
たカラムクロマトグラフィー、「ＹＭＣパック」（山村
科学社製）などを用いた高速液体クロマトグラフィーお
よび向流分配法を適宜組合せて実施することができる。
具体的には、例えば、ＪＳ４９粗標品を「セファデック
スＬＨ−２０」カラムに対し、クロロホルム‐メタノー
ル（１：１）混合液で活性画分を溶出させ、濃縮乾固す
るとＪＳ４９の純品が得られる。得られる粗精製あるい
は精製ＪＳ４９は、必要に応じ、常法によって前記した
ような酸付加塩の形にすることができる。

【００１２】ＪＳ４９の用途 現在、ヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）は、子宮頸
癌等との関連が強く示唆されているが、ＪＳ４９は、マ
ウス正常細胞にＨＰＶ遺伝子をトランスフェクトした形
質転換株の形態を正常形態に復帰させる活性を有する。
従って、本発明による化合物ＪＳ４９は、抗腫瘍活性を
有するという点で有用である。 （１）生物活性 ＪＳ４９は、２〜１００ng／mlの濃度範囲で、ＨＰＶty
pe１６の遺伝子をマウス正常繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に
トランスフェクトした細胞の形態を正常形態に復帰させ
た。上記のように、本発明のＪＳ４９は抗腫瘍活性を示
すことが明らかにされた。従って、本発明のＪＳ４９は
抗腫瘍剤として使用することができる。 （２）抗腫瘍剤 このように、本発明のＪＳ４９はヒトの腫瘍、特に悪性
腫瘍に対して抗腫瘍性を示すことが明らかにされた。従
って、本発明化合物は、抗腫瘍剤もしくは腫瘍治療剤と
して使用することができる。抗腫瘍剤としての本発明化
合物は、合目的的な任意の投与経路で、また、採用投与
経路によって決る剤型で投与することができる。薬剤と
しては、製薬上許容される担体あるいは希釈剤で希釈さ
れた形態が普通である。抗腫瘍剤として本発明化合物を
実際に投与する場合には、これらを注射用蒸留水または
生理食塩水に溶解して注射する方法が代表的なものの一
つとして挙げられる。具体的には、腹腔内注射、皮下注
射、静脈または動脈への血管内注射および注射による局
所投与などの方法がある。剤型としては、上記したよう
な注射剤の他に、懸濁剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセ
ル剤、軟膏剤、クリーム剤等の形態を採用することがで
きる。これらの製剤を製造するには、製薬上許容される
担体あるいは希釈剤等、具体的には溶剤、可溶化剤、等
張化剤、保存剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、
安定剤等を添加することができる。溶剤としては、上記
したように注射用蒸留水、生理食塩水等が代表的であ
り、可溶化剤としては、例えばエタノール、ポリソルベ
ート剤が、賦形剤としては、例えば乳糖、デンプン、結
晶セルロース、マンニトール、マルトース、リン酸水素
カルシウム、軽質無水ケイ酸、炭酸カルシウム等が、結
合剤としては、例えばデンプン、ポリビニルピロリド
ン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム等が、
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセ
ルロースカルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステ
アリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等が、安定剤と
しては、例えば乳糖、マンニトール、マルトース、ポリ
ソルベート類、マクロゴール類、ポリオキシエチレン硬
化ヒマシ油等があげられる。また、必要に応じて、グリ
セリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウ
ム、界面活性剤、塩基性物質（例えば、エチレンジアミ
ン、エタノールアミン、炭酸ナトリウム、アルギニン、
メグルミン、トリスアミノメタン）を添加することもで
きる。これらの成分を用いて、注射剤、錠剤、顆粒剤、
カプセル剤等の剤型に製造することができる。本発明化
合物の投与量は、動物試験の結果および種々の状況を勘
案して、連続的または間欠的に投与した時に総投与量が
一定量を越えないように定められる。具体的な投与量
は、投与方法、患者または被処理動物の状況、例えば年
齢、体重、性別、感受性、食餌、投与時間、併用する薬
剤、患者またはその病気の程度に応じて変化することは
言うまでもなく、また、一定の条件のもとにおける適量
と投与回数は、上記指針を基にして専門医の適量決定試
験によって決定されなければならない。具体的には、成
人１日当り０．０１〜１ｇ程度である。

【００１３】

【実施例】

１）培養 使用した培地は、下記の組成の成分を１リットルの水に
溶解して、ｐＨ７．４に調整したものである。 デキストリン ３０ｇ グルコース ３ｇ ソーヤフレーク ２０ｇ 炭酸カルシウム ３ｇ 塩化コバルト ０．０１ｇ ５０リットル容ジャーファーメンターに上記培地３０リ
ットルを調製、殺菌したものへ、ストレプトミセス・ビ
オラセウスニガーＪＳ４９株を接種し、２７℃にて３日
間、通気攪拌培養を行なった。 ２）ＪＳ４９の採取 上記の条件で培養後、培養液（３０リットル）を遠心分
離し、菌体と上清とに分け、上清については、ダイヤイ
オンＨＰ−２０（三菱化成社製）のカラムに通液してＪ
Ｓ４９を吸着させ、充分水洗した後、メタノールで溶出
し、溶出液を濃縮後、更にシリカゲル（和光純薬社製
「ワコーゲルＣ２００」）のカラムに吸着させ、クロロ
ホルム‐メタノール混液（４：１）で活性画分を溶出し
た（画分（１））。菌体については、アセトンでＪＳ４
９を抽出し、抽出液を濃縮後、酢酸エチルで分配し、酢
酸エチル層及び水層を得、各層を更に下記の操作に付し
た。酢酸エチル層は、濃縮後、シリカゲルカラムに吸着
させ、クロロホルム‐メタノール混液（４：１）で活性
画分を溶出した（画分（２））。水層は、クロロホルム
‐メタノール混液（１０：１）で抽出し、濃縮後、シリ
カゲルカラムに吸着させ、クロロホルム‐メタノール混
液（４：１）で活性画分を溶出した（画分（３））。画
分（１）〜（３）を合わせて濃縮してＤ−ＯＤＳ−７・
Ｓ−７カラム（山村科学社製）を用いた高速液体クロマ
トグラフィーに付し、水‐アセトニトリル混液（６５：
３５）で溶出した。溶出液を濃縮後、セファデックスＬ
Ｈ−２０のカラムを用いたゲル濾過に付し、クロロホル
ム‐メタノール混液（１：１）で展開し、活性画分を濃
縮乾固してＪＳ４９の純品１７．１mgを得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＪＳ４９の重ＤＭＳＯ中における５００メガヘ
ルツプロトン核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。

【図２】ＪＳ４９の重ＤＭＳＯ中における１２５メガヘ
ルツ炭素１３核磁気共鳴スペクトルを模写したものであ
る。

【図３】ＪＳ４９のメタノール中（実線）および０．０
１規定水酸化ナトリウム‐メタノール中（破線）での紫
外吸収スペクトルを模写したものである。

【図４】ＪＳ４９のＫＢｒディスク法による赤外吸収ス
ペクトルを模写したものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式（Ｉ）で示される化合物ＪＳ４９また
   はその酸付加塩。 【化１】
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物を有効成分として
   含有する抗腫瘍剤。
3. 【請求項３】ストレプトミセス属に属し、ＪＳ４９の生
   産能を有する菌株を適当な培地で培養し、その培養物よ
   り化合物ＪＳ４９を得ることを特徴とする、請求項１に
   記載の化合物ＪＳ４９の製造法。