JP2009073791A

JP2009073791A - 新規生理活性物質ｒｋｇｓ−ａ２２１５ａ

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Publication number: JP2009073791A
Application number: JP2007246182A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Osada; 裕之長田; Hideaki Kakeya; 秀昭掛谷; Mihoko Mori; 美穂子森; Keisoku Negishi; 恵則根岸
Original assignee: Godo Shusei KK; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Godo Shusei KK; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2009-04-09

Abstract

【課題】より有効な細胞周期阻害活性、抗腫瘍活性を有する新規生理活性物質、及びその製造方法を提供することを目的とする。また、その物質を有効成分とする細胞周期阻害剤及び抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【解決手段】以下の一般式（Ｉ）で表される生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを提供する。この物質は、ストレプトマイセス属に属する放線菌ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５ＦＥＲＭＰ−２１２９３株を用いて生産することができる。

【選択図】なし

Description

本発明は、新規生理活性物質及びその製造方法、並びにそれを有効成分とする細胞周期阻害剤、及び抗腫瘍剤に関する。

人体を構成する細胞は、恒常性を維持するためにその増殖と分化が厳しく制御されている。細胞は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期という一連の過程からなる細胞周期を経ることにより分裂、増殖を行う。この細胞周期の制御機構に異常が生じると癌や免疫疾患になる。細胞周期を制御するバイオプローブは、これらの制御機構の解析に役立つのみならず、抗腫瘍剤（または制癌剤）、免疫抑制剤のリード化合物になり得る。

例えば、細胞周期のＧ２／Ｍ期停止を引き起こす一つの薬剤として微小管阻害剤が知られている。タキソール（パクリタキセル）は、卵巣癌、肺癌、頭頚部癌、膀胱癌、及び食道癌等の多くの癌の治療に有効である（非特許文献１参照）。タキソールは細胞分裂中期から終期への移行期において有糸分裂を強力に阻害又は遅らせる（非特許文献２参照）。このタキソールの作用機構は、微小管の脱重合を起こりにくくし、その結果、癌細胞分裂を阻害して抗腫瘍活性を発揮する。したがって、細胞周期、特に細胞分裂の進行を阻害することは、抗腫瘍剤の作用機構として重要な意味を持つであろう。

Rowinsky, E.K. (1997) Semin Oncol. Vol.24 (6 Suppl. 19), S19-1-S19-12 Jordan, M.A., Toso, R.J., Thrower, D., and Wilson, L., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.90, pp.9552-9556

本発明は、より有効な細胞周期阻害活性、抗腫瘍活性を有する新規生理活性物質、及びその製造方法を提供することを目的とする。また、その物質を有効成分とする細胞周期阻害剤及び抗腫瘍剤を提供することを目的とする。

上記課題の解決のために鋭意検討した結果、沖縄県国頭郡東村から採取した土壌より分離された、ストレプトマイセス属に属する放線菌ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５ＦＥＲＭＰ−２１２９３株が細胞周期阻害活性及び抗腫瘍活性を有する物質を生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）式（Ｉ）で表されるＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステル。

（２）ストレプトマイセス属に属する、上記（１）に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの生産菌を培地に培養し、ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを生成蓄積せしめ、これを採取することを含むＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの製造方法。

（３）ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ生産菌が、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５ＦＥＲＭＰ−２１２９３株である上記（２）に記載の方法。

（４）上記（１）に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステルを有効成分とする医薬。

（５）上記（１）に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステルを有効成分とする細胞周期阻害剤。

（６）上記（１）に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステルを有効成分とする抗腫瘍剤。

本発明により、より有効な細胞周期阻害活性、抗腫瘍活性を有する新規生理活性物質を得ることができる。また、その物質を有効成分として、細胞周期阻害剤及び抗腫瘍剤を提供することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の新規生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａは、以下の式（Ｉ）で表される。

また、上記ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、トリエチルアミン塩等の有機塩基塩等が挙げられる。上記ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａのエステルとしては、特に制限はなく、例えばメチルエステル、エチルエステル等のアルキルエステルが挙げられる。これらのエステルは、常法に従い、すなわち、酸性触媒下、メタノール等の対応するアルコール化合物とＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａとを反応させることで得ることができる。ここで用いる酸性触媒としては、例えばｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。

生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを生産するストレプトマイセス属に属する菌の例としては、ストレプトマイセス・ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）株、ストレプトマイセス・オーランチオグリセウス(Streptomyces aurantiogriseus)株、ストレプトマイセス・ラセモクロモゲネス(Streptomyces racemochromogenes)株が挙げられる。特に、生産菌の代表的なものとして、放線菌ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５ＦＥＲＭＰ−２１２９３株が挙げられる。

ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５ＦＥＲＭＰ−２１２９３株は以下の菌学的性質を有する。
各種培地上での生育形態
培養はすべて２５℃で行い寒天平板培地上での生育形成を記載した。
（１−１）ＩＳＰ２培地（イースト・麦芽寒天培地）
生育は良好であり、２８℃、３日間の培養でコロニーの直径は５〜６ｍｍである。コロニーは綿状に生育して気菌糸を形成し気菌糸は灰白色である。コロニーの裏面は褐色である。
（１−２）ＩＳＰ３培地（オートミール寒天培地）
表面は褐色、コロニーの裏面は褐色で、水溶性褐色色素を形成する。
（１−３）ＩＳＰ４培地（スターチ・無機塩寒天培地）
表面は灰白色、コロニーの裏面は淡黄色である。
（１−４）ＩＳＰ５培地（グリセリン・アスパラギン寒天培地）
表面は灰白色、コロニーの裏面は灰白色である。

生理学的性質
（２−１）生育温度範囲：イースト・麦芽寒天培地において２０〜４５℃の範囲で生育した。
（２−２）ゼラチンの液化：陰性
（２−３）デンプンの加水分解：陽性
（２−４）硝酸塩の還元：陰性
（２−５）脱脂粉乳のペプトン化：陽性
脱脂粉乳の凝固：陰性
（２−６）耐塩性：３％ＮａＣｌ含有イースト・麦芽寒天培地では正常に生育するが、４％では生育阻害を受けた。
（２−７）炭素源の利用性（ＩＳＰ培地Ｎｏ．９を使用）：利用する糖はグルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−キシロースで、利用しない糖はＬ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−アラビノース、ラフィノース、シュクロース、イノシトールであった。
（２−８）メラニン様色素の生成：ＩＳＰ培地Ｎｏ．６、ＩＳＰ培地Ｎｏ．７ともに陰性であった。

なお、当該菌株ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５株は産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに２００７年４月１３日に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭＰ−２１２９３である。

また、ストレプトマイセス・エスピーＡ２２１５株は、例えば、紫外線、エックス線あるいは薬品等を用いる人工的な変異手段により容易に変異し得るものである。そのような変異株であっても、本発明に係る生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの生産能を有するものであれば適宜使用することができる。

上記放線菌株ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５株などの生産菌を培養し、当該培養物から新規物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ（以下「本発明化合物」とも記載する）を採取する方法は、具体的には後述する製造例に記載するが、概ねストレプトマイセス属に属する菌の培養方法に従って実施することができる。

まず、菌株を、放線菌が利用し得る栄養物を含有する培地で好気的に培養する。栄養源としては、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができ、例えば炭素源として、グルコース、ガラクトース、スクロース、グリセリン、水飴、デキストリン、でんぷん、糖蜜、動・植物油等が挙げられる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コーンスティープ・リカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を単独または組み合わせて用いることができる。また、必要に応じて、ナトリウム、コバルト、塩素、硫酸、燐酸、及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加しても良い。さらに、菌の生育を助け、生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの生産を促進するような有機及び無機物を適宜添加することができる。

培養法としては、特に限定されるものではないが、液体培養法が適している。培養に適当な温度は１５〜３７℃であるが、多くの場合、２６〜３０℃付近で培養する。生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの生産は、培地や培養条件により異なるが、振盪培養、タンク培養とも通常１〜１０日の間でその蓄積が最高に達する。培養物中の生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの蓄積量が最高になった時点で、培養を停止し、培養液から目的物質を採取する。

培養終了後、培養液から本発明のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを精製、単離するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、あるいは結晶化、溶媒抽出、減圧濃縮、凍結乾燥などの手段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、または反復して使用することが可能である。

以上のようにして製造される新規な生理活性物質ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａは、後述の試験例に示すように細胞周期阻害活性、抗腫瘍活性を有する。本発明のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａまたはその塩もしくはエステルを有効成分とする細胞周期阻害剤及び抗腫瘍剤は、その使用目的に合わせて、使用方法、剤形、投与量（使用量）が適宜決定される。例えば、その投与形態は、経口投与でも、非経口投与でも良い。剤形としては、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、または注射剤もしくは座剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、結合剤等の製薬上許容される添加剤を用いて、既知の方法で製造される。製剤中の、ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａまたはその塩もしくはエステルの含有量は、剤形等によっても異なるが、一般には０．１〜５重量％である。また、上記のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａまたはその塩もしくはエステルの臨床投与量は、年齢、体重、患者の感受性、症状の程度により異なるが、通常効果的な量は、成人一日０．１ｍｇ〜１ｇ程度であり、一日一回または数回に分けて投与することも可能である。さらに、必要に応じて上記の範囲外の量を用いることもできる。

また、ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａまたはその塩もしくはエステルを生化学試験用試薬として使用する場合、有機溶剤または含水有機溶剤に溶解する等して各種培養細胞系へ直接投与することにより、細胞周期の進行をＧ２／Ｍ期で阻止する。剤形としては、有機溶剤もしくは含水有機溶剤に溶解した液体剤の他、例えば、粉末もしくは顆粒等の固形剤としても良い。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができる。通常、上記ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａまたはその塩もしくはエステルを有効成分とする細胞周期阻害剤の効果的な使用量範囲は１〜２０μｇ／ｍＬであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なる。また、必要により上記の範囲外の量を用いることもできる。

以下、実施例等を記載して本発明を具体的に説明する。
（製造例１）
大豆粉２．５％、グルコース２％、可溶性澱粉１％、乾燥酵母０．４％、食塩０．２％、肉エキス０．１％、リン酸第二カリウム０．００５％の組成の培地（ｐＨ７．３）に、前記菌株ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５ＦＥＲＭＰ−２１２９３株を接種して２８℃で７２時間振盪培養を行った。この培養液１５０ｍＬを同組成の培地１５Ｌに接種し、２８℃で９６時間にわたって１ｖ／ｖ／ｍ（毎分１５Ｌ）の通気を行いながら、毎分２５０回転の攪拌培養を行った。上記培養液を助剤にパーライトを用いて菌体と上清に分離した後、上清をｐＨ７に調整し、ダイアイオンＨＰ２０を充填したカラム（ベッド容積：直径２１ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に吸着させた。蒸留水２２．５Ｌでゲルを洗浄後、メタノール１８Ｌで溶出した。メタノール溶液を減圧濃縮して得られたシロップに水を加えて４Ｌとし、ｎ−ブタノール４Ｌで２回抽出を繰り返した。抽出後、全てのｎ−ブタノールを合わせて減圧濃縮し、茶色の不定形固体１３．８ｇを得た。菌体はアセトン３０Ｌを用いて抽出し、助剤にパーライトを用いてろ過した。得られたアセトン水溶液を減圧濃縮し、得られた水溶液をｐＨ７に調整した後、蒸留水３０Ｌを加えた。ダイアイオンＨＰ２０（ベッド容積：５Ｌ）に吸着させ、蒸留水１５Ｌでゲルを洗浄後、メタノール１５Ｌで溶出した。メタノール溶液を減圧濃縮して得られたシロップに水を加えて４Ｌとし、ｎ−ブタノール４Ｌで２回抽出を繰り返した。抽出後、全てのｎ−ブタノールを合わせて減圧濃縮し、茶色の不定形固体７．２ｇを得た。

上清から得られた不定形固体１ｇを含水メタノール５０ｍＬにより溶解して含水メタノール可溶部を得、ダイアイオンＨＰ２０を充填したカラム（ベッド容積：直径２ｃｍ、長さ２３ｃｍ）に浸潤させ、最初に蒸留水を２００ｍＬ流した後、引き続いて水−メタノール溶液を配合割合を順次変えて（７０：３０、５０：５０、２５：７５）それぞれ２００または３００ｍＬ流し、最後にメタノールを７００ｍＬ流した。

本発明化合物は７５％メタノール水溶液及びメタノール溶液画分に溶出され、計３７６ｍｇの本発明化合物を含有する粗粉末を得た。この粗粉末はＯＤＳカラム（直径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ；センシューパックペガシルＯＤＳ、センシュー科学社製）とアセトニトリル−水混合溶出溶媒を用いて流速７ｍＬ／分と検出波長２１５ｎｍの条件下で分取高速液体クロマトグラフィーにより分離し、本発明化合物ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの粗品を得た。この粗品は溶出溶媒のみを７０％メタノールに変更した上記同条件下の分取高速液体クロマトグラフィーにより精製した。この結果、淡黄色不定形固体として精製標品ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを１８．７ｍｇ得た。また、菌体から得られた不定形固体についても同様に処理したところ、本発明化合物が得られた。表１及び表２に精製標品の物性値等を示す。

本発明化合物の活性を以下の方法に従って測定した。

（試験例１）
ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの細胞周期阻害活性
細胞周期の調節蛋白質であるｐ３４^ｃｄｃ２キナーゼが温度感受性に変異したマウス乳癌細胞ｔｓＦＴ２１０細胞を用いた。ｔｓＦＴ２１０細胞は通常３２℃で５％仔牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて５％炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養する。ｔｓＦＴ２１０細胞は３９℃で培養すると、細胞周期がＧ２期で停止し、これを３２℃にシフトダウンすると再び細胞分裂を開始してＧ１期へ移行する。３２℃で培養した細胞にＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを添加して、フローサイトメーターと顕微鏡観察により、細胞周期停止活性を解析した。結果を表３に示す。

表３の結果は本発明のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａが細胞周期阻害剤として有用であることを示している。

（試験例２）
ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの細胞増殖抑制効果
マウス乳癌細胞ｔｓＦＴ２１０細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（５％の仔牛血清を含む）で培養した。これに一連の希釈系列のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを加え、２４時間培養した後、ＷＳＴ−８試薬を加えて生育を計測した。その結果を表４に示す。

表４の結果は、本発明のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａが抗腫瘍剤として有用であることを示している。

（製剤例１）
注射・点滴剤
ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ１０ｍｇを含有するように、粉末ぶどう糖５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用前にエタノールに溶解し、０．８５％生理的食塩水１００ｍＬを添加して静脈内注射剤とし、一日、１０〜１００ｍＬを症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。

（製剤例２）
顆粒剤
ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ１ｇ、乳糖９８ｇ及びヒドロキシプロピルセルロース１ｇをよく混合した後、定法に従って粒状に成形し、これを十分に乾燥し篩別して、ビン、ヒートシール包装などに適した顆粒剤を製造した。一日、１００〜１０００ｍｇを症状に応じて経口で投与する。

ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａのメタノール中の紫外線吸収スペクトルを示す。ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す。ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す。

Claims

式（Ｉ）で表されるＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステル。
ストレプトマイセス属に属する、請求項１に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの生産菌を培地に培養し、ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａを生成蓄積せしめ、これを採取することを含むＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａの製造方法。
ＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ生産菌が、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ａ２２１５ＦＥＲＭＰ−２１２９３株である請求項２に記載の方法。
請求項１に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステルを有効成分とする医薬。
請求項１に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステルを有効成分とする細胞周期阻害剤。
請求項１に記載のＲＫＧＳ−Ａ２２１５Ａ、またはその塩もしくはエステルを有効成分とする抗腫瘍剤。