KR20100132518A

KR20100132518A - 환형 화합물을 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR20100132518A
Application number: KR1020107022314A
Authority: KR
Inventors: 이쿠코 나카무라; 고지 요시카와; 데루히사 마사키; 류이치 가나사키; 니람 샤하브
Original assignee: 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤; 트롭바이오 리서치 센디리언 버하드; 시림 버해드
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2010-12-17
Also published as: EP2261317A1; EP2261317A4; CN101970639A; WO2009113660A1; CA2718394A1; CA2718394C; CN101970639B; JPWO2009113660A1; KR101566046B1; US8241872B2; MX2010009778A; EP2261317B8; US20110020872A1; EP2261317B1; ES2408190T3; JP5275337B2

Abstract

본 발명은 항진균제, 특히, 심재성 진균증 치료제, 예컨대, 부비강염 진균증 치료제로서 유용한 화합물을 생산하는 미생물을 제공한다. 항진균 작용을 갖는 화합물의 탐색 연구의 일환으로서, 천연에 존재하는 미생물에 대해서 예의 검토한 결과, 양호한 항진균 활성을 가지고 있으며, 의약, 특히, 항진균제로서 유용할 수 있는 환형 화합물을 생산하는 진균 아크레모늄 퍼시시눔(Acremonium persicinum)을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

Description

환형 화합물을 생산하는 미생물{MICROORGANISM PRODUCING CYCLIC COMPOUND}

본 발명은 의약 조성물, 진균증, 특히 심재성 진균증의 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용한 환형 화합물을 생산하는 진균 아크레모늄 퍼시시눔(Acremonium persicinum)에 관한 것이다.

심재성 진균증은, 항생 물질을 환자에게 장기간 투여한 경우에, 표적으로 하고 있는 병원균은 제거되지만, 항생 물질이 듣지 않는 진균이 증가함으로써 발증하거나(여기서, 살아 남은 진균이 비정상적으로 증식하는 현상은, 소위 균교대 현상이라고 불림), 혹은, 고령 환자, 수술 후의 환자, 또는 항암제나 면역 억제제를 투여 받은 환자는, 생체 방어 기능이 억제되어 있기 때문에 진균에 감염되기 쉬워지고, 그 진균이 증식하여 발증한다고 생각되고 있다.

심재성 진균증의 치료약으로서는, 1) 진균의 DNA 합성 저해 작용을 메커니즘으로 하는 핵산 염기계 약제인 플루시토신이나, 2) 진균의 세포막의 합성 저해 작용을 메커니즘으로 하는 폴리엔마크로라이드계 약제인 암포테리신 B, 이미다졸계 약제인 미코나졸, 그리고 트리아졸계 약제인 플루코나졸 등의 항진균제가 있다.

그런데, 이하에 나타내는, 3개의 오르니틴에 의해 구성되는 환형 헥사펩티드인 페리크롬(Ferrichrome)이 알려져 있지만(비특허문헌 1), 상기 문헌에는 페리크롬이 항진균 활성을 갖는다고 하는 기재는 없다.

비특허문헌 1: Journal of American Chemical Society, 102권, pp.4224-4231, 1980년

의약 조성물, 진균증, 특히 심재성 진균증 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용한 화합물을 생산하는 미생물을 제공한다.

본 발명자들은 항진균 작용을 갖는 화합물의 탐색 연구의 일환으로서, 천연에 존재하는 미생물에 대해서 예의 검토한 결과, 진균 아크레모늄 퍼시시눔 MF-347833주라고 칭하는 균주가, 우수한 항진균 작용을 갖는 화합물을 생산하는 것을 발견하였다. 또한, 상기 균주의 배양액을 상세하게 검토하고, 본 균주의 배양액으로부터 우수한 항진균 작용을 갖는 환형 화합물을 단리하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 하기 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 생산하는 진균 아크레모늄 퍼시시눔에 관한 것이다.

진균 아크레모늄 퍼시시눔은, 진균증, 특히, 심재성 진균증 등의 예방 및/또는 치료제가 될 수 있는 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 생산할 수 있다.

도 1은 화합물 A의 ¹H-NMR 스펙트럼의 차트이다.(측정 용매는 d₆-DMSO)
도 2는 화합물 A의 ¹³C-NMR 스펙트럼의 차트이다.(측정 용매는 d₆-DMSO)
도 3은 화합물 B의 ¹H-NMR 스펙트럼의 차트이다.(측정 용매는 d₆-DMSO)
도 4는 화합물 B의 ¹³C-NMR 스펙트럼의 차트이다.(측정 용매는 d₆-DMSO)

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

식 (I)의 화합물 또는 그 염을 생산하는 미생물의 균학적 성질을 이하에 나타낸다.

(1) 생산균의 유래

진균 아크레모늄속 MF-347833주는 말레이시아의 조호르주, Endau Rompin 국립 공원 내에서 채집된 낙엽 부식물로부터 분리되었다. 본 균주는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(수신명: 우편번호 305-8566 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1방치 1 츄오다이6)에 수탁 번호 FERM BP-10916(수탁일 2007년 10월 10일)으로서 기탁되어 있다.

(2) 생산균의 형태학적 성질

형태적 특징은 포테이토 덱스트로스 한천 배지 상에서의 형태를 관찰하여 판정하였다. 포테이토 덱스트로스 한천 배지(Difco사 제조 2010) 상에서의 생육은 왕성하며, 25℃에서 2주간 후에 직경 39-41 ㎜로까지 확대되고, 분생자의 형성도 보여졌다. 집락 표면은 양모형(floccose)이며, 집락 주연부는 파형(undulate)이었다. 중앙부로부터 주연부에 여러개의 방사형의 홈을 생기게 하였지만, 표면으로부터 홈은 확인하기 어려웠다. 집락의 색은 백색(white, 1A1)이지만 중앙부는 약간 연한 백황색(yellowish white, 4A2)이었다. 집락 이면에서는 중앙부로부터 주연부로 방사형으로 생긴 홈을 확인할 수 있었다. 색은 전체적으로 연베이지색(Ivory, 4A3)이지만, 집락 중앙부의 색은 연갈색(mustard brown, 5E6)이었다. 30℃에서의 2주간 후의 집락의 직경은 약 24 ㎜이며, 5℃와 37℃에서는 생육은 보여지지 않았다.

또한, 콘밀 한천 배지(Difco사 제조 0386) 상에서의 생육도 왕성하며, 25℃에서 2주간 후의 직경은 39-40 ㎜까지 확대되었다. 집락 표면은 펠트형(felty)이었다. 집락 주연부는 파형(undulate)이며 집락에 홈은 생기지 않았다. 집락의 색은 백색(white, 1A1)이었다. 집락 이면의 색도 백색(white, 1A1)이었다. 30℃에서 2주간 배양한 후의 집락의 직경은 14 ㎜였다. 집락 표면에 홈은 생기지 않았다. 5℃와 37℃에서 생육은 보여지지 않았다.

영양 균사의 굵기는 1.8-2.7 ㎛이며, 후막 포자는 관찰되지 않았다. 분생자병은 분지하지 않고, 무색이며 1개의 영양 균사, 혹은 결속이 느슨한 분생자속으로부터 생겼다. 분생자병의 표면에는 작은 사마귀형의 돌기가 다수 존재하고, 분생자병의 근원에는 격벽을 생기게 하였다. 분생자 형성 양식은 피알로형이며 분생자병의 근원으로부터 피알리드의 선단까지의 길이는 33-40 ㎛였다. 분생자는 무색이며 타원형이었다. 크기는 3.7-4.5×2.8-3.2 ㎛(평균 4×3 ㎛)였다. 약간 점성을 가지며, 피알리드의 선단에서 분생자 덩어리가 되었다. 분생자의 표면은 광학 현미경(400배)에서는 활면으로 보였지만, 전자 현미경(9000배)으로 관찰하면 거친 요철 모양을 확인할 수 있었다.

이러한 형태적 특징은, 본 균이 아크레모늄속에 속할 가능성을 시사하는 것이다. 이 때문에, Cephalosporium-artige Schi㎜elpilze(Hyphomycetes)/Walter Gams(1971)에서 비교 검토한 결과, Gliomastix절의 아크레모늄 퍼시시눔의 형태적 특징과 잘 일치하였다. 또한, 본 균의 28S rDNA와 18S rDNA를 상동성 검색한 결과, Gliomastix절의 아크레모늄 퍼시시눔의 클레이드에 포함됨으로써, 형태적으로도 유전자적으로도 모순이 없었다. 따라서, 본 균을 아크레모늄 퍼시시눔으로 동정하고, 아크레모늄 퍼시시눔 MF-347833주라고 칭하였다.

(3) 배양 특성

배양 특성은, 시판 배지, 및 문헌에 기재된 조성으로 조제한 배지로 판정하였다. 포테이토 덱스트로스 한천 배지는 Difco사 2010, 사부로(Sabouraud) 덱스트로스 한천 배지는 Difco사 0109, EmersonYpSs 한천 배지는 Difco사 0739, 콘밀 한천 배지는 Difco사 0386, 오트밀 한천 배지는 Difco사 0552를 각각 구입하였다. 맥아 추출 한천 배지, 자펙(Czapek) 용액 한천 배지, MY20 한천 배지의 조성은, JCM 카탈로그(Nakase, T. 6th ed., pp.617, Japan Collection of Microorganisms, the Institute of Physical and Chemical Research, Saitama, 1995)에 따랐다.

진균 MF-347833주는, 각 한천 배지에 접종하고 나서, 25℃에서 14일간 배양한 후에 관찰하였다. 색조의 기재는 Methuen Handbook of Colour(Kornerup, A. and J.H.Wanscher, 3rd ed., pp.252, Methuen, London, 1987)를 참조하였다. 생육 온도에 관해서는 포테이토 덱스트로스 한천 배지(Difco사 제조 2010) 상에서 판정하였다.

또한, 본 균주는 인공적으로 또는 자연적으로 변이를 일으키는 경우도 있으며, 본 발명에서 이용되는 진균 아크레모늄 퍼시시눔 MF-347833주는, 천연으로부터 분리된 미생물 외에, 이것에 자외선, 방사선, 화학 약제 등으로 인공적으로 변이시킨 것 및 이들 천연 변이주에 대해서도 포함한다.

식 (I)의 화합물은, 염기와의 염을 형성하는 경우도 있다. 이러한 염으로서는, 구체적으로는, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등의 무기 염기, 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민, 리신, 오르니틴 등의 유기 염기와의 염 등을 들 수 있다. 또한, 염은, 소위 착염이나 킬레이트 화합물도 포함한다. 이러한 염을 형성하는 금속으로서는 2가 또는 3가의 금속을 들 수 있고, 예컨대, 철, 알루미늄 등을 들 수 있다.

이하, 본 명세서에서,

식 (I)의 화합물의 프리체를 화합물 A,

식 (I)의 화합물의 알루미늄염을 화합물 B,

식 (I)의 화합물의 철염을 화합물 C

로 기재하는 경우가 있다.

식 (I)의 화합물에는 기하 이성체가 존재할 수 있다. 본 명세서 중, 식 (I)의 화합물이 이성체의 일 형태만으로 기재되는 경우가 있지만, 본 발명은 그 이외의 이성체도 포함하며, 이성체가 분리된 것, 혹은 이들의 혼합물도 포함한다.

또한, 식 (I)의 화합물에는, 비대칭 탄소 원자를 갖는 경우가 있고, 이것에 기초한 광학 이성체가 존재할 수 있다. 본 발명은 식 (I)의 화합물의 광학 이성체가 분리된 것, 혹은 이들의 혼합물도 포함한다.

나아가, 본 발명은 식 (I)의 화합물 또는 그 염의 각종 수화물이나 용매화물, 및 결정 다형의 물질도 포함한다. 또한, 본 발명은 여러가지 방사성 또는 비방사성 동위체로 표지된 화합물도 포함한다.

(생산 방법)

본 발명 미생물은, 통상, 일반 미생물의 배양 방법에 준하여 배양하면, 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 얻을 수 있다.

배지로서는, 진균 아크레모늄 퍼시시눔 MF-347833주가 이용하는 영양원을 함유하는 배지이면 좋고, 합성 배지, 반합성 배지 또는 천연 배지가 이용된다. 배지의 조성은, 예컨대 탄소원으로서는, L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-프럭토스, 수크로스, 이노시톨, L-람노스, 라피노스, D-만니톨, 만노스, 멜리비오스, 락토스, D-갈락토스, 말토스, 트레할로스, 살리신, 크산틴, 키틴, 전분, 포도당, 덱스트린, 글리세린, 식물유 등이, 질소원으로서는 육엑기스, 펩톤, 글루텐밀, 면실박, 대두분, 낙화생분, 어분, 옥수수 침지액, 건조 효모, 효모 엑기스, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 요산, 그 외의 유기, 무기의 질소원이 이용된다. 또한, 금속염으로서는, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 아연, 코발트 등의 황산염, 질산염, 탄산염, 인산염 등이 필요에 따라 첨가된다. 또한, 필요에 따라 메티오닌, 시스테인, 시스틴, 티오황산염, 올레인산메틸, 라드유, 실리콘유, 계면활성제 등의 생성 촉진 물질 또는 소포제를 첨가할 수도 있다.

배양 조건으로서는, 호기적 조건 하에서 배양하는 것이 일반적으로 유리하고, 배양 온도는 8.9∼31.2℃의 범위, 바람직하게는 26.0∼27.6℃ 부근에서 행해진다. 배양 기간은 배지의 조성, 온도 조건에 따라 적절하게 설정되지만, 통상 1∼30일 정도, 바람직하게는 2∼7일 정도이다.

배양물로부터 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 정제하여 단리하기 위해서는, 통상의 미생물의 배양물로부터 생리 활성 물질을 정제하여 단리하는 방법이 적용된다. 즉, 배양물로부터 적당한 유기 용매로 추출하고, 그 추출물로부터 정제하여 유효 물질을 단리한다. 즉, 항진균 활성을 지표로 하여, 적당한 용제에 대한 용해성 및 용해도의 차 등을 이용하는 일반적인 생리 활성 물질의 제조에 이용되는 수단에 따라, 분리, 정제된다. 이들 방법은 필요에 따라 단독으로 이용되며, 또는 임의의 순서로 조합하여, 반복하여 적용할 수 있다. 그 외에 정제법으로서는, 배양물을 그대로, 혹은 원심 분리 또는 여과하여 균체를 제거한 후, 적당한 용제에 대한 용해성 및 용해도의 차, 용액으로부터의 석출 속도의 차, 여러가지 흡착제에 대한 흡착 친화성의 차, 2종의 액상 사이에서의 분배의 차 등을 이용하는 방법을 적용할 수 있다. 구체적으로는 예컨대, 배양액을 적절한 담체에 접촉시켜 상기 화합물을 흡착시키고, 이어서 적당한 용매로 용출함으로써 상기 화합물을 정제하는 방법을 들 수 있다. 이들 방법은 필요에 따라 단독으로 이용되며, 또는 임의의 순서로 조합하여, 반복하여 적용할 수 있다.

본 발명 미생물은, 영양 배지에서 배양하면, 배양물로부터 통상법에 따라 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 얻을 수 있다. 식 (I)의 화합물 또는 그 염의 제조에서 사용하는 미생물은, 식 (I)의 화합물 또는 그 염의 생산능을 갖는 아크레모늄속의 미생물이면 어느 것이나 이용할 수 있다.

식 (I)의 화합물 또는 그 염의 1종 또는 2종 이상을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 당분야에서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되고 있는 방법에 따라 조제할 수 있다.

투여는 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 산제, 액제 등에 의한 경구 투여, 또는, 관절내, 정맥내, 근육내 등의 주사제, 좌제, 점안제, 안연고, 경피용 액제, 연고제, 경피용 첩부제, 경점막 액제, 경점막 첩부제, 흡입제 등에 의한 비경구 투여 중 어떤 형태여도 좋다.

경구 투여를 위한 고체 조성물로서는, 정제, 산제, 과립제 등이 이용된다. 이러한 고체 조성물에서는, 1종 또는 2종 이상의 유효 성분이, 적어도 1종의 불활성인 부형제, 예컨대 젖당, 만니톨, 포도당, 히드록시프로필셀룰로스, 미결정 셀룰로스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 및/또는 메타규산알루민산마그네슘 등과 혼합된다. 조성물은, 통상법에 따라, 불활성인 첨가제, 예컨대 스테아르산마그네슘과 같은 활택제나 카르복시메틸스타치나트륨 등과 같은 붕괴제, 안정화제, 용해 보조제를 함유하고 있어도 좋다. 정제 또는 환제는 필요에 따라 당의 또는 위용성 혹은 장용성 물질의 필름으로 피막하여도 좋다.

경구 투여를 위한 액체 조성물은, 약제적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 엘릭서제 등을 포함하며, 일반적으로 이용되는 불활성인 희석제, 예컨대 정제수 또는 에탄올을 포함한다. 상기 액체 조성물은 불활성인 희석제 이외에 가용화제, 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유하고 있어도 좋다.

비경구 투여를 위한 주사제는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제 또는 유탁제를 함유한다. 수성의 용제로서는, 예컨대 주사용 증류수 또는 생리 식염액이 포함된다. 비수성의 용제로서는, 예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알코올류, 또는 폴리솔베이트 80(약국방명) 등이 있다. 이러한 조성물은, 등장화제, 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제, 또는 용해 보조제를 추가로 포함하여도 좋다. 이들은 예컨대 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과, 살균제의 배합 또는 조사에 의해 무균화된다. 또한, 이들은 무균의 고체 조성물을 제조하여, 사용 전에 무균수 또는 무균의 주사용 용매에 용해 또는 현탁하여 사용할 수도 있다.

외용제로서는, 연고제, 경고제, 크림제, 젤리제, 습포제, 분무제, 로션제, 점안제, 안연고 등을 포함한다. 일반적으로 이용되는 연고 기제, 로션 기제, 수성 또는 비수성의 액제, 현탁제, 유제 등을 함유한다. 예컨대, 연고 또는 로션 기제로서는, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 백색 바셀린, 표백 밀랍, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 모노스테아르산글리세린, 스테아릴알코올, 세틸알코올, 라우로마크로골(lauromacrogol), 세스퀴올레인산소르비탄 등을 들 수 있다.

흡입제나 경비제 등의 경점막제는 고체, 액체 또는 반고체형의 것이 이용되며, 종래 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다. 예컨대 공지의 부형제나, 또한, pH 조절제, 방부제, 계면활성제, 활택제, 안정제나 증점제 등이 적절하게 첨가되어 있어도 좋다. 투여는, 적당한 흡입 또는 취송(吹送)을 위한 디바이스를 사용할 수 있다. 예컨대, 계량 투여 흡입 디바이스 등의 공지의 디바이스나 분무기를 사용하여, 화합물을 단독으로 또는 처방된 혼합물의 분말로서, 혹은 의약적으로 허용할 수 있는 담체와 조합하여 용액 또는 현탁액으로서 투여할 수 있다. 건조 분말 흡입기 등은, 단회 또는 다수회 투여용의 것이어도 좋고, 건조 분말 또는 분말 함유 캡슐을 이용할 수 있다. 혹은, 적당한 구출제, 예컨대, 클로로플루오로알칸, 히드로플루오로알칸 또는 이산화탄소 등의 적합한 기체를 사용한 가압 에어졸 스프레이 등의 형태여도 좋다.

통상 경구 투여의 경우, 1일 투여량은, 체중당 약 0.01∼100 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1∼10 ㎎/㎏이 적당하며, 이것을 1회로 혹은 2회∼4회로 나누어 투여한다. 정맥내 투여하는 경우는, 1일의 투여량은, 체중당 약 0.01∼100 ㎎/㎏이 적당하고, 1일 1회∼복수회로 나누어 투여한다. 투여량은 증상, 연령, 성별 등을 고려하여 각각의 경우에 따라 적절하게 결정된다.

식 (I)의 화합물 또는 그 염은, 전술한 식 (I)의 화합물 또는 그 염이 유효성을 나타낸다고 생각되는 질환의 여러가지 치료제 또는 예방제와 병용할 수 있다. 상기 병용은, 동시 투여, 혹은 별개로 연속하여, 혹은 원하는 시간 간격을 두고 투여하여도 좋다. 동시 투여 제제는, 배합제여도 별개로 제제화되어 있어도 좋다.

[실시예]

이하, 실시예에 기초하여, 식 (I)의 화합물 또는 그 염의 제조법을 더 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 하기 실시예에 기재된 화합물에 한정되는 것이 아니다. 또한, 식 (I)의 화합물 또는 그 염의 제조법은, 이하에 나타내는 구체적 실시예의 제조법에만 한정되는 것이 아니라, 식 (I)의 화합물 또는 그 염은 이들 제조법의 조합, 혹은 당업자에게 자명한 방법에 의해서도 제조될 수 있다.

또한, 실시예, 제조예, 및 후기 표 중에서, 이하의 약호를 이용하는 경우가 있다.

실시예 1

(화합물 A의 배양 생산)

종배지 1(표 3을 참조, 30 mL)을 삼각 플라스크(사이즈: 100 mL)에 분주하고, 오토클레이브로 멸균하였다(121℃, 30분). 이 종배지 1에 진균 MF-347833주의 사면 배양물(슬랜트 배양물)을 일백금이분, 무균적으로 접균하고, 25℃에서 4일간, 로터리 쉐이커로 진탕 배양하였다(220 rpm). 다음에, 생산 배지 1(표 4를 참조, 100 mL)을 삼각 플라스크(사이즈: 500 mL)에 분주하고, 오토클레이브로 멸균하였다(121℃, 30분). 이 플라스크에 종배양물(2 mL)을 무균적으로 접균하고, 25℃에서 7일간, 로터리 쉐이커로 진탕 배양(220 rpm)하였다. 배양은 HPLC로 분석하면서 행하였다(분석 HPLC 1, 조건은 표 5를 참조).

(화합물 A의 단리 정제)

상기 배양 방법으로 얻어진 배양물(2.6 L)에 등량의 아세톤을 첨가하고, 1시간 교반 후, 여과하여 배양 추출물을 얻었다. 그 배양 추출액에 2배량의 물을 가하고, Diaion SP 850 컬럼(사이즈: 400 mL, 미쓰비시케미컬사 제조)에 통액하며, 혼합 용매{아세톤:물=30:70(v/v), 1.9 L}로 용출하였다.

이 용출액에 물(2.1 L)을 가하고, Daisogel SP-120-ODS-B 컬럼(사이즈: 350 mL, 15/30 ㎛, DAISO사 제조)에 통액하며, 혼합 용매{MeCN:물=25:75(v/v), 340 mL}로 용출하였다.

이 용출액에 물(350 mL)을 가하고, OASIS HLB 카트리지(사이즈: 6 g, Waters사 제조)에 통액하며, MeOH(150 mL)로 용출하였다. 이 용출액을 감압 농축하고, 아세톤을 첨가하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 건조하여 황색 분말(100 ㎎)을 얻었다.

이 황색 분말(15 ㎎)을 소량의 MeOH에 용해하고, 분취 HPLC1로 정제하였다(조건은 표 6을 참조). 용출 시간이 약 22분인 피크를 분취하였다. 이 프랙션에 등량의 물을 가하고, OASIS HLB 카트리지(사이즈: 500 ㎎)에 통액하며, 물(50 mL)을 통액한 후, MeOH(50 mL)로 용출하였다. 이 용출액을 감압 농축하고, 아세톤을 첨가하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 건조하여, 화합물 A(13 ㎎)를 백색 분말로서 얻었다.

(화합물 A의 물리화학적 성질)

상기 방법으로 정제 단리한 화합물 A는, 이하의 물리화학적 성질을 나타내었다.

물리화학적 성질로부터 화합물 A의 화학 구조는, 이하의 식 (II)와 같이 결정하였다. 구성 아미노산의 입체 배치에 대해서는, 개량 머피법을 적용하고, D-Phe, L-Leu, L-Asn이라고 결정하였다. 오르니틴 부분에 관해서는, 유사 천연물의 페리크롬(비특허문헌 1)과 비교하여, 아미노산 분석으로부터 3개의 아미노산이 동일하기 때문에, L-오르니틴이라고 추정하였다.

실시예 2

(화합물 B 및 C의 배양 생산)

종배지 2(표 8을 참조)를 삼각 플라스크(사이즈: 100 mL)에 분주(30 mL)하고, 오토클레이브로 멸균하였다(121℃, 30분). 이 배지에 진균 MF-347833주의 사면 배양물(슬랜트 배양물)을 일백금이분, 무균적으로 접균하고, 25℃에서 4일간, 로터리 쉐이커(220 rpm)로 진탕 배양하였다.

다음에, 동일 조성의 종배지(160 mL)를 삼각 플라스크(사이즈: 500 mL)에 분주하고, 오토클레이브로 멸균하였다(121℃, 30분). 이 종배지에 종배양물(3.2 mL)을 무균적으로 접균하고, 25℃에서 3일간, 로터리 쉐이커로 진탕 배양(220 rpm)하였다.

다음에, 생산 배지 2(표 9를 참조)를 조제해 두고, 이 생산 배지 2(20 L)를 자 퍼멘터(jar fermenter)(사이즈: 30 L)에 주입하여, 멸균(121℃, 30분) 후에 종배양물(480 mL)을 무균적으로 접균하였다. 배양 조건은, 통기량을 20 L/분, 교반 속도를 200 rpm으로 하여, 25℃에서 7일간 배양하였다. 배양은 HPLC로 분석하면서 행하였다(분석 HPLC2, 조건은 표 11을 참조).

또한, 생산 배지 2 대신에 생산 배지 3을 이용하여도 동일한 배양 조건으로 생산할 수 있었다.

(화합물 B 및 화합물 C의 단리 정제)

상기 배양 방법으로 얻어진 배양물(생산 배지 2: 90 L)에 등량의 아세톤을 첨가하고, 1시간 교반 후, 여과하여 배양 추출물을 얻었다. 그 추출액에 등량의 물을 가하고, Diaion SP 850 컬럼(10 L, 미쓰비시케미컬사)에 통액하며, 혼합 용매{아세톤:물=40:60(v/v), 40 L}로 용출하였다.

이 용출액에 등량의 물을 가하고, Daisogel SP-120-ODS-B 컬럼(15/30 ㎛, 사이즈: 2 L, DAISO사 제조)에 통액하며, 혼합 용매{MeCN:물=25:75(v/v), 7 L}로 용출하였다. 이 용출액에 등량의 물을 가하고, 재차 Daisogel SP-120-ODS-B 컬럼(사이즈: 2 L)에 통액하며, 혼합 용매{MeCN:물=27.5:72.5(0.05% TFA를 함유)(v/v)}로 용출하였다.

이 용출액에 등량의 물을 가하고, 재차 Daisogel SP-120-ODS-B 컬럼(사이즈: 180 mL)에 통액하며, MeOH로 용출하고, 용출액을 감압 농축하였다.

잔사를 소량의 MeOH에 용해하고, 분취 HPLC2로 정제하였다(조건은 표 12를 참조).

용출 시간이 약 24∼25분인 프랙션에 등량의 물을 가하고, OASIS HLB 카트리지(사이즈: 6 g, Waters사 제조)에 통액하며, 물(100 mL)을 통액한 후, MeOH(100 mL)로 용출하였다. 이 용출액을 감압 농축하고, 물로 치환 후, 동결 건조함으로써, 화합물 C(130 ㎎)를 분말로서 얻었다. 이 분말을 용매(MeOH, 초산에틸, n-헥산)로 결정화하여, 화합물 C의 등색 결정을 취득하였다.

용출 시간이 약 19∼21분인 프랙션도 동일한 조작으로 분말로 하고, CHCl₃에 용해 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(구형 60 N, 중성, 40-100 ㎛, 간토카가쿠 가부시키가이샤 제조; CHCl₃:MeOH=10:1)로 정제하였다. 이 용출액을 감압 농축하고, 물로 치환 후, 동결 건조함으로써, 화합물 B(150 ㎎)를 백색 분말로서 얻었다. 이 백색 분말(109 ㎎)을 용매(MeOH, 초산에틸, n-헥산)로 결정화하여, 화합물 B(90.1 ㎎)를 무색 결정으로서 얻었다.

(화합물 B의 물리화학적 성질)

상기 방법으로 정제 단리한 화합물 B는, 이하의 물리화학적 성질을 나타내었기 때문에, 화합물 A와 알루미늄이 1:1의 비율인 화합물로 추정하였다.

(화합물 C의 물리화학적 성질)

상기 방법으로 정제하여 단리한 화합물 C는, 이하의 물리화학적 성질을 나타낸 것, 및 단결정 X선 구조 해석으로부터, 화합물 A와 철이 1:1의 비율인 화합물로 결정하였다.

실시예 3

(항진균 활성 측정법)

이하의 표에 나타낸 검정균에 대한 항진균 활성은, 미량 액체 희석법(구메 히카루, 야마자키 토시카즈 저, 임상과 미생물, 21권 5호, 573-580페이지, 1994년)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 화합물 B의 각종 검정균에 대한 항균 활성 시험의 결과를 이하의 표에 기재하였다.

이상의 시험의 결과, 식 (I)의 화합물 또는 그 염은 항진균 작용을 갖는 것이 확인되었다. 따라서, 식 (I)의 화합물 또는 그 염은, 진균증, 특히 심재성 진균증 등, 예컨대 부비강염 진균증의 치료 등에 사용할 수 있다.

따라서, 상기 결과로부터, 진균 아크레모늄 퍼시시눔 MF-347833주가, 진균증, 특히 심재성 진균증 등, 예컨대 부비강염 진균증의 치료 등에 사용될 수 있는 유용한 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 생산하는 미생물인 것이 확인되었다.

본 발명인 아크레모늄 퍼시시눔 MF-347833주라고 칭하는 미생물은, 우수한 항진균 작용을 갖는 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 생산한다. 얻어진 식 (I)의 화합물 또는 그 염은, 진균증, 특히, 심재성 진균증 등의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다.

이상, 본 발명을 특정 양태에 따라 설명하였지만, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

FERMBP-10916

20071010

Claims

아크레모늄(Acremonium)속에 속하며, 하기 식 (I)의 화합물 또는 그 염을 생산하는 미생물:

.
제1항에 있어서, 아크레모늄 퍼시시눔(Acremonium persicinum)인 미생물.
수탁 번호가 FERM BP-10916인 아크레모늄 퍼시시눔 MF-347833주(Acremonium persicinum MF-347833주)인 균주.
식 (I)의 화합물 또는 그 염을 생산하기 위한, 제3항에 기재된 균주의 용도.