JP4836629B2 - 抗菌活性または抗腫瘍活性を有する化合物およびその製造方法 - Google Patents
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Description
(4)(1)に記載の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤。
(5)(1)に記載の化合物および/または(2)に記載の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
(6)アクレモニウム・スピーシーズ(Acremonium sp.)AWA16-1株。
本発明者らは、アクレモニウム属に属する微生物の培養物から得られた化合物が、新規であり、かつ抗菌活性および/または抗腫瘍活性を示すことを見出した。
(1)物質の色 :無色
(2)分子量 :314
(3)分子式 :C19H22O4
(4)質量分析 :FAB-MS(高速中性粒子衝突イオン化質量分析)
実測値 315.25 (M + H)+
(5)紫外線吸収スペクトル(メタノール中): λmax(e)206 nm (38,000)
(6)1H NMR(重ジメチルスルホキシド中で測定、750 MHz):
δppm 1.13 (6H, s), 2.15 (3H, s), 2.17 (3H, s), 3.00 (2H, q), 4.55 (1H, s), 4.56 (1H, dd), 6.12 (1H, s), 6.17 (1H, s), 6.20 (1H, s), 6.25 (1H, s), 6.30 (1H, s), 9.35 (1H, s)
(7)13C NMR(重ジメチルスルホキシド中で測定、125 MHz):
δppm 18.6, 21.1, 24.8, 25.9, 28.3, 70.0, 89.7, 98.0, 102.3, 109.4, 110. 8, 111.3, 121.6, 134.8, 139.9, 156.2, 158.2, 158.3, 160.3
(8)溶解性 :メタノール、酢酸エチル、クロロホルムに可溶。ヘキサンに難溶。
(9)抗菌活性 :ペーパーディスク法にて、50 mgの式(III)の化合物を直径6 mmのペーパーディスクに加えた時、バシラス・サブティリス(Bacillus subtilisIFO3134)に対して直径10 mmの阻止円が形成された。また、50 mgの式(III)の化合物を直径6 mmのペーパーディスクに加えた時、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcusaureus IFO12732)に対して直径18 mmの阻止円が形成された。また、50 mgの式(III)の化合物を直径6 mmのペーパーディスクに加えた時、サリニビブリオ・コスチィコラ(Salinivibriocosticola ATCC 33508)に対して直径9 mmの阻止円が形成された。また、50 mgの式(III)の化合物を直径6 mmのペーパーディスクに加えた時、サイトファーガ・マリノフラバ(Cytophagamarinoflava IFO14170)に対して直径8 mmの阻止円が形成された。また、50 mgの式(I)の化合物を直径6 mmのペーパーディスクに加えた時、カンジダ・アルビカンス(Candidaalbicans IFO 1060)に対して直径15 mmの阻止円が形成された。
(10)ヒト肺癌由来細胞株A549細胞を、125 mg/ml濃度の式(III)の化合物の存在下で48時間培養したところ、A549細胞を完全に死滅させた。IC50値は17 mg/mlであった。
(1)物質の色 :無色
(2)分子量 :325
(3)分子式 :C17H27NO5
(4)質量分析 :FAB-MS(高速中性粒子衝突イオン化質量分析)
実測値308.26 (M - H2O + H)+
(5)紫外線吸収スペクトル(メタノール中): λmax(e)274 nm (5,400)
(6)1H NMR(重ジメチルスルホキシド中で測定、750 MHz):
δppm 0.86 (3H, t), 1.22(3H, d), 1.23 (8H, m), 1.25 (2H, m), 1.36 (2H, m), 3.30 (1H, d), 3.68 (1H, q), 3.92 (1H, m), 4.64 (1H, s), 4.70 (1H, d), 5.52 (1H, dd), 5.75 (1H, dd), 5.92 (1H, d), 8.20 (1H, s)
(7)13C NMR(重ジメチルスルホキシド中で測定、125 MHz):
δppm 14.0, 18.1, 22.1, 24.9, 28.6, 29.0, 31.2, 37.2, 43.7, 51.6, 70.2, 77.1, 79.6, 121.1, 138.4, 165.9, 172.5
(8)溶解性 :メタノール、酢酸エチル、クロロホルムに可溶。ヘキサンに難溶。
(9)ヒト肺癌由来細胞株A549細胞を、125 mg/ml濃度の式(IV)の化合物の存在下で48時間培養したところ、化合物無添加の細胞と比べて、A549細胞の増殖を42%阻害した。
本発明の化合物は、アクレモニウム属に属し、該化合物を生産する能力を有する微生物を培養し、得られる培養物から該化合物の少なくとも1種を単離することにより製造することができる。すなわち、該化合物を産生する微生物を培地に培養し、培養物中に該化合物を生成蓄積させ、該培養物から該化合物を単離することにより製造する。上記式(I)で表される化合物と式(II)で表される化合物は、同時に製造してもよいし、別々に製造してもよい。
本発明の製造方法において用いることのできる微生物としては、アクレモニウム属(Acremonium sp.)に属し、かつ上記式(I)で表される化合物および/または式(II)で表される化合物を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。式(I)で表される化合物を製造する場合は、少なくとも式(I)で表される化合物を生産する能力を有する微生物を用い、式(II)で表される化合物を製造する場合は、少なくとも式(II)で表される化合物を生産する能力を有する微生物を用いる。式(I)で表される化合物および式(II)で表される化合物の双方を生産することが可能な微生物を用いることにより、式(I)で表される化合物と式(II)で表される化合物を、同時に製造することができる。そして、微生物の培養物から所望の化合物を単離する。
アクレモニウム・スピーシーズ(Acremonium sp.)AWA16-1株は次の菌学的性質を有する。
各培養平板において2週間(25℃)培養後に巨視的観察を行い、コロニーの直径、色調(コロニー表面および裏面)、表面性状、可溶性色素産生の有無を観察した。なお、色調の( )内はKornerup and Wanscher(1978)で用いられている「色」のCode No.を示す。
コロニー直径:12-14 mm。
色調、表面:Yellowish white(2A-2)〜White(2A-1)。
色調、裏面:Pale yellow(4A-3)。
表面性状:ビロード状、放射状の漠を形成。
可溶性色素:あまり顕著ではない、Yellowish white(1A-2)
コロニー直径:9-12 mm。
色調、表面:Yellowish white(2A-2)〜White(2A-1)。
色調、裏面:Yellowish white(2A-2)。
表面性状:ビロード状。
可溶性色素:産生なし。
コロニー直径:10-14 mm。
色調、表面:Yellowish white(2A-2)。
色調、裏面:Greyish orange(6B-4)。
表面性状:ビロード状。
可溶性色素:産生なし。
コロニー直径:10-14 mm。
色調:White(1A-1)。
表面性状:ビロード状。
可溶性色素:産生なし。
a. 栄養菌糸:菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、無色で有隔壁菌糸。栄養菌糸のいたるところで円筒形の短い細胞から、亜球形で1細胞の厚膜胞子と考えられる構造が形成された。
無性生殖器官:分生子柄および分生子形成細胞:分生子柄はほとんど発育がみとめられず分生子形成細胞であるフィアライドが栄養菌糸から直接単性して形成される。フィアライドは基部に隔壁を形成。フィアライドの基部はやや膨らみ、基部から先端にむかってなだらかに細くなる傾向がみられた。
分生子:分生子はフィアロ型分生子、またはアレウム型分生子で卵型〜倒卵型、楕円型、無色、1細胞、表面は円滑でフィアライド先端部に分生子塊を形成する。
有性生殖器官:約1ヶ月間の培養検体からはテレオモルフの形成は確認されなかった。
本発明の化合物の製造方法において微生物の培養は、通常の微生物の培養方法で実施できる。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育・生産促進物質を適宜含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単独または組み合わせて用いられる。さらに、必要に応じて炭化水素、アルコール類、有機酸、アミノ酸(トリプトファン等)なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実かす、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの無機塩類を加えてもよい。さらに使用する微生物の生育や本発明の化合物の生産を促進する微量成分を適当に添加することができ、そのような成分は当業者であれば適当なものを選択することができる。
培養物からの本発明の化合物の単離・精製は、微生物代謝生産物をその培養物から単離・精製するために常用される方法に従って行われる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養菌体、または菌体の破砕物のいずれをも包含するものである。例えば培養物を濾過や遠心分離により培養濾液と菌体に分け、菌体をアセトン、もしくはクロロホルム/メタノール(9/1)混合溶媒などで抽出する。培養濾液は、そのまま、または酢酸エチル、クロロホルムなどで抽出して用いる。ついで、菌体抽出液と培養濾液もしくは培養濾液の抽出物とを合わせて濃縮し、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより精製を行い、本発明の化合物を得る。得られた化合物は、NMR解析などの通常の化学的手法により、上記「1.本発明の化合物」に記載した性質を示すか否かを調べることにより、本発明の化合物であることを確認することができる。
(1)抗菌剤
本発明の式(I)の化合物は、優れた抗菌活性を有するため抗菌剤として有用であり、ヒトおよび動物用医薬品、医薬品原料、農薬、食品の保存剤等として使用することができる。
本発明の化合物は、優れた抗腫瘍活性を有するため抗腫瘍剤として有用であり、ヒトおよび動物用医薬品、医薬品原料等として使用することができる。
本発明の抗菌剤および抗腫瘍剤を哺乳動物に投与する場合には、これらの医薬製剤は、医薬的に許容される担体または添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。使用される添加物は、医薬組成物の剤形に応じて上記の中から適宜または組み合わせて選択される。
種菌としてアクレモニウム・スピーシーズAWA16-1株を用いた。該菌株を、4 Lの寒天平板培地(1 L中、ポテトデキストロースブロース(ディフコ社製)24 g、寒天 15 g(和光純薬工業株式会社製)、自然海水 500 mL、蒸留水 500 mL(pH 6.8)を含む。)上で、25℃にて14日間培養した。
本発明の化合物の抗腫瘍活性を以下の様に評価した。ヒト肺癌由来細胞A549細胞を96穴マイクロプレートに8 x 103個/ 200 mL/ ウェルの濃度で播種し、14時間、CO2インキュベーター(5%二酸化炭素、37 ℃)にて培養した。上記式(III)の化合物および式(IV)の各化合物がそれぞれ125 mg/ mL〜0.5 mg/ mLの濃度になるような希釈系列を作成し、上記マイクロプレートのウェルに添加し、さらに72時間培養した。72時間後にアラマーブルー(関東化学株式会社より購入)を用いて生存細胞数を測定した。その結果、式(III)の化合物は、125 mg/ mLの濃度でA549細胞を完全に死滅させた。式(IV)の化合物は125 mg/ mLの濃度でA549細胞の増殖を、薬剤無添加群の42%に抑制した。
本発明の化合物の抗菌活性を以下の様に評価した。上記式(III)の化合物および(IV)の化合物の溶液を、2 mg/mLの濃度のメタノール溶液となるように調製した。この溶液から25 mLをとって、ペーパーディスク(東洋ろ紙株式会社製、直径6 mm)にしみ込ませた。クリーンベンチ中で15分間放置し、メタノールを蒸発させ除去した。このペーパーディスクを、あらかじめバシラス・サブティリス(Bacillussubtilis IFO3134)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureusIFO12732)、サリニビブリオ・コスチィコラ(Salinivibrio costicola ATCC 33508)、サイトファーガ・マリノフラバ(Cytophagamarinoflava IFO14170)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans IFO 1060)を植菌しておいた栄養寒天培地(日水製薬株式会社製)上にのせ、30℃にて、24時間培養した。24時間後にペーパーディスク周辺に形成された阻止円の直径を測定した。本発明の式(III)の化合物は、バシラス・サブティリス(Bacillussubtilis IFO3134)に対して直径10 mm、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureusIFO12732)に対して直径18 mm、サリニビブリオ・コスチィコラ(Salinivibrio costicola ATCC 33508)に対して直径9 mm、サイトファーガ・マリノフラバ(Cytophaga marinoflava IFO14170)に対して直径8 mm、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans IFO 1060)に対して直径15 mmの阻止円を形成した。本発明の式(IV)の化合物は、バシラス・サブティリス(Bacillussubtilis IFO3134)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureusIFO12732)、サリニビブリオ・コスチィコラ(Salinivibrio costicola ATCC 33508)、サイトファーガ・マリノフラバ(Cytophagamarinoflava IFO14170)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans IFO 1060)のいずれに対しても阻止円を形成しなかった。
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