CN103205367B - 桃色顶孢霉s2915及其抗真菌活性蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

桃色顶孢霉S2915及其抗真菌活性蛋白的制备方法，涉及微生物菌株和微生物源蛋白。所述菌株为桃色顶孢霉。抗真菌活性蛋白的制备：从平板上挑取已活化的菌块接种于培养基培养，取上清加入硫酸铵得混合溶液，离心后所得的沉淀物重溶于水中得粗蛋白溶液，透析离心得除去不溶性杂质的粗蛋白溶液，然后在二乙基氨基乙基阴离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，浓缩后，利用对该粗蛋白溶液敏感的受试真菌立枯丝核菌为指示菌跟踪活性组分，得具有活性的非吸附组分，继续在色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，利用超滤浓缩管离心超滤浓缩，以立枯丝核菌为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，得桃色顶孢霉抗真菌活性蛋白。

Description

桃色顶孢霉S2915及其抗真菌活性蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物菌株和微生物源蛋白，尤其是涉及一种桃色顶孢霉S2915及其抗真菌活性蛋白的制备方法。

背景技术

真菌不仅是人和其他动物致病的重要病原，而且是农业生产上作物病害和食品污染的重要根源。在世界范围内，由于真菌致病菌造成的主要粮食和经济作物减产达到了20%（[1]Oerke E C.(2006).Crop losses to pests[J].Agric Sci14(4):31-43），因此从自然环境中寻找新的抗真菌药物用以解决严重危害农业生产的真菌病成为了研究热点之一。针对以前所使用药物或者化学制剂的局限性，对未来发展新药提出了一些新的要求：药物在体内保持一定的稳定性，能够低成本地可持续生产，抗菌效果好且对人体无毒副作用。

长期使用化学农药对环境和农药施用者的健康威胁较大，破坏农田生态系统，影响农业资源的可持续利用。相对于化学合成农药，抗真菌蛋白因抗菌谱广且对耐药菌株具有良好的杀菌作用，因而受到广泛关注。抗真菌蛋白来源广泛，哺乳动物、昆虫、两栖动物、细菌和真菌以及植物都是相关来源（[2]De Lucca A J,Walsh T J.(1999).Antifungal peptides:novel therapeutic compounds against emerging pathogens[J].AntimicrobAgents Chemother43(1):1-11）。目前已分离得到多种抗菌蛋白，包括PR-蛋白、类甜蛋白、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂、核糖体失活蛋白、几丁质酶、类几丁质蛋白、类亲环蛋白、非特殊脂转移蛋白和富含甘氨酸/组氨酸蛋白（[3]Wang H X,Ng T B.(2001).Purification of allivin,a novel antifungal protein from bulbs of the round-cloved garlic LifeSci70(3):357-365）。PR-蛋白是植物受到病原微生物侵染时高度表达的一种防御蛋白复合体，目前已从不同的植物及组织中分离到多种具有抗菌活性的蛋白（[4]Bertini L,Caporale C,Testa M,et al.(2009).Structural basis of the antifungal activity of wheat PR4proteins[J].FEBS Lett583(17):2865-2871）。

微生物和植物生长息息相关，微生物来源的抗真菌蛋白在植物防御中也发挥着重要的作用（[5]Ganz,T.(2003).Defensins:antimicrobial peptides of innate immunity[J].Nat RevImmunol3(9):710-720）。其中，青霉属和曲霉属是丝状真菌中目前发现的仅有的产抗真菌蛋白的两个属。曲霉属中的巨大曲霉、黑曲霉和棒曲霉分别能够产生AFP、AnAFP以及AcAFP等抗菌蛋白。对这类丝状真菌来源的抗真菌蛋白敏感的真菌主要有镰刀菌属、犁头霉属、被孢霉属、根毛霉属、根霉菌属、曲霉属、青霉属、毛霉菌属、地丝菌属、丝衣霉属、葡萄孢属、链格孢属、木霉属、稻瘟病菌以及马铃薯晚疫病菌等不同种属的真菌（[5]Ganz,T.(2003).Defensins:antimicrobial peptides of innate immunity[J].Nat Rev Immunol3(9):710-720；[6]Kovacs L,Viragh M,Tako M,et al.(2011).Isolation and characterization ofNeosartorya fischeri antifungal protein(NFAP)[J].Peptides32(8):1724-1731；[7]Skouri-Gargouri H,Ben Ali M,Gargouri A.(2009).Molecular cloning,structural analysis andmodelling of the AcAFP antifungal peptide from Aspergillus clavatus[J].Peptides30(10):1798-1804.）。

抗真菌蛋白与当前临床使用药物具有不一样且独特的作用机制，因而倍受青睐。抗菌肽（蛋白）的治疗比目前广泛使用的抗生素治疗方法具有一些明显的优点，因此被认为是未来临床医学的替代药品。目前，利用基因工程技术在植物体表达各种不同来源的抗菌肽(蛋白)使转基因作物获得对致病菌的拮抗作用已取得一定的进展。

然而，尽管抗真菌蛋白在自然界广泛存在并具有一些优良的特性，却基本未见直接应用这类抗真菌蛋白于食品保藏和临床治疗相关真菌疾病。这是由于在临床医疗上使用这些抗菌肽（蛋白）还面临着一些问题。但是，来自丝状真菌的抗真菌蛋白符合未来药物发展方向的许多必备特征，在未来抗真菌药物研究领域具有广阔的发展空间。

本发明中涉及的顶孢霉真菌，是一类重要的抗生素产生菌，如头孢菌素C产生菌Acremonium chrysogenum因具有强的杀细菌能力而被广泛应用于临床上；Schiell et al.从A.tubakii DSM12774的发酵液及菌丝体中分离出具有抗蠕虫活性物质peptaibol（[8]Schiell M,Hofmann J,Kurz M,et al.(2001).Cephaibol antibiotics with anthelmintic properties fromAcremonium tubakii DSM12774[J].The Journal of Antibiotic54:220～233）。郭勇霞等从Acremonium hansfordii发酵液中萃取分离到一个对多种植物病原菌都有抑制作用的脂溶性化合物（[9]Wang YZ,Guo F,Zhou YG.(2002).Survey of Acremonium species from China with threenew records[J].Mycosystema21:192～195）。然而，有关本发明所涉及的桃色顶孢霉S2915及其蛋白在抗植物致病真菌方面的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915。

本发明的目的之二在于提供一种桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌活性蛋白的制备方法。

所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915已于2013年01月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013040，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。

所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915是从2010年第21次中国大洋科学考察采集的西南印度洋深海沉积物样品中分离纯化得到。28℃培养条件下，该菌能在GPY液体或者固体培养基上生长。该菌菌丝紧贴固体培养基表面缓慢生长，菌丝较为致密，为白偏土黄色，不易从平板表面挑起，经过7天左右的平板培养，可产生与菌丝颜色一致的孢子。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了其内源转录区间ITS序列；得到的该菌ITS序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，结果发现，其与顶孢霉属的桃色顶孢霉具有99%的序列相似性。基于生理特性、形态学特征及其分子鉴定信息，该深海来源菌株为一株桃色顶孢霉，并将其命名为桃色顶孢霉（Acremoniumpersicinum）S2915。扩增获得的该菌株ITS序列为：

1     GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTCTCCGTT GGTGAACCAG CGGAGGGATC

51    ATTACTGAGT CTAACAAACT CCCAAACCCC TGTGAACATA CCTACTGTTG

101   CTTCGGCGGG ACCGCCCCGG GCGCCTTCGC GGTGCCCCGG AACCAGGCGC

151   CCGCCGGGGA CATCAAACTC TTGATTGTTA TAGTGGCATT CTCTGAGTAA

201   AGCATACAAA TAAGTCAAAA CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGCTCTGGCA

251   TCGATGAAGA ACGCAGCGAA ATGCGATAAG TAATGCGAAT TGCAGAATTC

301   AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCTA GTATTCTGGC

351   GGGCATGCCT GTCTGAGCGT CATTTCAACC CTCGCCCCCG GCTTTTGCTG

401   GGAGCGGTGT TGGGGATCGG CCGCCCGTCA CTGGGAGGCC GGCCCCGAAA

451   TAGAGTGGCG ACCACGCCGT GTGCTCCTCT GCGTAGTAGT AAATCACCTC

501   GCAGGCGGAC AGCGGTGCGG CCT

所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的抗真菌蛋白经LC-MS/MS鉴定，其部分氨基酸序列如下所示：

KNMITGTSXADCAILIIAGGVGEFEAGISKD

所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915培养上清抗菌谱的测定，包括以下步骤：

1）从GPY平板上挑取生长有桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的菌块接种于GPY液体培养基中，于28℃，180r/min条件下，摇瓶培养7d，真空抽滤除去菌体，获得菌株培养上清；

2）将步骤1）获得的菌株培养上清5mL用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，贮存于－80℃条件备用；

3）分别接种宛氏拟青霉、尖孢镰刀菌、长柄链格孢、核盘菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌及绿色木霉等7株霉菌于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板培养基上，静置于28℃培养箱中培养1～2d，待菌丝生长至合适大小，该平板即可作为受试菌平板；

4）在步骤3）得到的受试菌菌丝边缘1.0cm处放置两块纸片，其中一块纸片上加40μL步骤2）过滤除菌的培养上清，另一块纸片上对应地加等量的培养基作为空白对照，受试菌平板置于28℃条件下培养12～24h，观察受试菌菌丝的生长是否受到了菌株培养上清的抑制作用。

所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）从平板上挑取已活化的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915菌块接种于GPY液体培养基，摇瓶培养，所得菌体培养液取上清；

2）在步骤1）所得的上清中加入硫酸铵至饱和度达70%（m/v），得混合溶液；

3）将步骤2）所得的混合溶液离心，获得的沉淀物重溶于水中，得粗蛋白溶液；

4）将步骤3）获得的粗蛋白溶液透析，离心，以除去不溶性杂质，得除去不溶性杂质的粗蛋白溶液；

5）将步骤4）所得的除去不溶性杂质的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基（DEAE）阴离子交换色谱柱上分离纯化，按紫外吸收峰出现的先后顺序依次收集各洗脱组分，各组分利用超滤浓缩管离心超滤浓缩后，利用对该粗蛋白溶液敏感的受试真菌立枯丝核菌为指示菌跟踪活性组分，得具有活性的非吸附组分；

6）将步骤5）得到的具有活性的非吸附组分继续在羧甲基（CM）阳离子交换色谱柱上分离纯化，同样按紫外吸收峰出现的先后顺序依次收集各洗脱组分，各组分利用超滤浓缩管离心超滤浓缩，以立枯丝核菌为敏感受试指示菌，采用纸片法予追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分根据SDS-PAGE电泳图判断获得蛋白的纯度，得桃色顶孢霉（Acremoniumpersicinum）S2915抗真菌活性蛋白。

在步骤1）中，所述GPY液体培养基的组成成分及按质量百分比含量为：每100mL液体培养基中含1%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.05%酵母提取物，其余为去离子水；所述摇瓶培养的条件可为28℃，180r/min条件下摇瓶培养7d；所述上清可将所得菌体培养液通过抽滤的方法获得。

在步骤2）中，所得混合溶液可于4℃条件下静置过夜。

在步骤3）中，所述离心，可将混合溶液于4℃，12000g下离心15min。

在步骤4）中，所述透析，可在4℃条件下透析；所述离心，可于4℃，8000g条件下离心20min。

在步骤5）中，所述离心，可于4℃，5000g条件下离心；所述抗真菌活性检测方法的具体步骤如下：在距受试真菌菌丝边缘1.0cm处放置直径为0.65cm无菌纸片，并在各纸片上分别加上40μL的以上各浓缩组分，将受试菌平板置于28℃培养箱中培养至可观察到对菌丝有明显抑制作用的现象为止；所述指示菌跟踪活性组分的抗真菌活性检测方法可采用纸片法。

在步骤6）中，所述离心，可于4℃，5000g条件下离心。

本发明采用盐析、透析、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、超滤浓缩等方法从桃色顶孢霉S2915培养上清中分离纯化到1个2.5kDa的小分子量蛋白，该蛋白对长柄链格孢、核盘菌、绿色木霉、立枯丝核菌及胶孢炭疽菌等5株植物致病真菌具有明显抑制作用，并将其命名为AFP2915。通过LC-MS/MS质谱鉴定了该蛋白的部分肽段序列，发现该肽段序列隶属毕赤酵母1-alpha转录延伸因子的部分氨基酸序列。有关该序列是否具有抗菌功能尚未见报道。根据本发明的结论，确定了所纯化桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌活性蛋白对长柄链格孢、核盘菌、绿色木霉、立枯丝核菌及胶孢炭疽菌等5株植物致病真菌具有明显的抑制作用，从而证实了该蛋白的抗菌功能。

桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌活性蛋白对敏感真菌最低抑制浓度的测定方法，包括以下步骤：

1）分别接种长柄链格孢、核盘菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌及绿色木霉等5株敏感霉菌于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，静置于28℃培养箱中培养1～2天，作为受试菌平板；

2)将纯化并浓缩的桃色顶孢霉S2915抗真菌蛋白AFP2915浓度依次二倍稀释为1280μg/mL、640μg/mL、320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL和10μg/mL；

3)在上述受试菌菌丝边缘1.0cm处均匀放置6块纸片，在其中5块纸片上加入40μL以上各二倍稀释的抗真菌蛋白AFP2915溶液，在最后一块纸片上加上缓冲液作为空白对照，各受试菌平板静置于28℃培养箱中培养12h以上，观察并将跟空白对照一样没有产生菌丝抑制作用的临界浓度确定为AFP2915对各敏感真菌的最低抑制浓度（MIC），计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×40μL。本发明测定的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌活性蛋白对5株敏感真菌，即长柄链格孢、核盘菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌及绿色木霉的最低抑制浓度分别为1.6μg/纸片，3.2μg/纸片，1.6μg/纸片，0.8μg/纸片和6.4μg/纸片，显示出其良好的抑菌效果。

附图说明

图1为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915在GPY固体培养基上培养7天后的菌落形态。

图2为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915在GPY液体培养基中培养7天后的上清对长柄链格孢、绿色木霉、胶孢炭疽菌、核盘菌以及立枯丝核菌的抑制效果。在图2中，字母A、B、C、D和E分别代表桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915培养上清对长柄链格孢、绿色木霉、胶孢炭疽菌、核盘菌以及立枯丝核菌的抑制效果。纸片1所加成分为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915培养上清，纸片2所加成分为培养基，作为空白对照。

图3为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915粗蛋白成分在DEAE-sepharose FastFlow柱上的色谱分离效果。在图3中，横坐标为洗脱运行时间（min），纵坐标为紫外吸收值（mAU）；标记P1表示抗菌活性组分。

图4为抗菌活性组分在CM-sepharose Fast Flow柱的分离效果图。在图4中，横坐标为洗脱运行时间（min），纵坐标为紫外吸收值（mAU）；标记P6表示抗菌活性组分。

图5为纯化的抗菌活性蛋白对受试真菌立枯丝核菌的抑制作用。在图5中，P6为纯化的抗菌活性组分。

图6为纯化后活性组分P6的SDS-PAGE电泳图。在图6中，左边泳道M表示蛋白分子量标准Marker；右边泳道2915表示经CM柱纯化后的活性蛋白。

图7表示桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对长柄链格孢的最低抑制浓度的测定。在图7中，纸片1～5依次加入蛋白量为12.8μg，6.4μg，3.2μg，1.6μg和0.8μg，纸片6上所加成分为空白对照缓冲液。

图8表示桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对绿色木霉的最低抑制浓度的测定。在图8中，纸片1～5依次加入蛋白量为51.2μg，25.6μg，12.8μg，6.4μg和3.2μg，纸片6上所加成分为空白对照缓冲液。

图9表示桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对胶孢炭疽菌的最低抑制浓度的测定。在图9中，纸片1～5上依次加入蛋白量为6.4μg，3.2μg，1.6μg，0.8μg和0.4μg，纸片6上所加成分为空白对照缓冲液。

图10表示桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对核盘菌的最低抑制浓度的测定。在图10中，纸片1～5依次加入蛋白量为25.6μg，12.8μg，6.4μg，3.2μg和1.6μg，纸片6上所加成分为空白对照缓冲液。

图11表示桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对立枯丝核菌的最低抑制浓度的测定。在图11中，纸片1～5依次加入蛋白量为12.8μg，6.4μg，3.2μg，1.6μg和0.8μg，纸片6上所加成分为空白对照缓冲液。

图12表示纯化的活性蛋白经不同温度处理后对敏感真菌立枯丝核菌的抑制作用。在图12中，1为未经处理的对照蛋白；2为活性蛋白在60℃处理30min后的抗菌活性；3为活性蛋白在80℃处理30min后的抗菌活性；4为活性蛋白在100℃处理30min后的抗菌活性；5为活性蛋白在121℃处理20min后的抗菌活性。

图13表示纯化的活性蛋白经不同pH处理后对敏感真菌立枯丝核菌的抑制作用。在图13中，1为未经处理蛋白的抗菌活性；2～7分别表示活性蛋白在经pH2、4、6、8、10、12的酸碱处理后的抗菌活性。

图14表示纯化的活性蛋白经3种蛋白酶处理后对敏感真菌立枯丝核菌的抑制作用。图14中，1～4依次表示未处理蛋白的抗菌活性、蛋白酶K处理蛋白的抗菌活性，胰蛋白酶处理蛋白的抗菌活性；木瓜蛋白酶处理蛋白的抗菌活性。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

1.菌种

本发明涉及菌株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915来源于本申请人从2010年第21次中国大洋科学考察采集的西南印度洋深海沉积物样品中分离获得，是一株培养上清对长柄链格孢、核盘菌、绿色木霉、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌具有明显菌丝生长抑制活性的真菌。28℃培养条件下，该菌可在GPY液体或者固体培养基上生长。该菌菌丝紧贴固体培养基表面缓慢生长，菌丝较为致密，为白偏土黄色，不易从平板表面挑起，经过7天左右的平板培养，可产生与菌丝颜色一致的孢子(图1)。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了其内源转录区间ITS序列；得到的该菌ITS序列与NCBI GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与顶孢霉属的桃色顶孢霉具有99%的序列相似性。基于形态学、菌落生长特征，及ITS序列比对结果，该深海来源菌株为一株桃色顶孢霉，并将其命名为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915。

2.培养基

GPY（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉培养基）液体培养基：每100mL液体培养基中含1%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.05%酵母提取物。

实施例1：挑取桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915孢子于GPY固体培养基平板上划线，平板用封口膜封闭之后置于28℃条件下静置培养7d，观察菌落培养状态并拍照记录（图1）。

实施例2：测试桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915培养上清对长柄链格孢、绿色木霉、胶孢炭疽菌、核盘菌以及立枯丝核菌的抑制作用

挑取受试菌菌块接种于PDA固体平板培养基上，于28℃条件下静置培养2d至菌丝充分伸展开来，在距菌丝边缘1.0cm处放置两无菌纸片，在纸片1上加40μL的上述无菌培养上清，纸片2上加40μL的培养基作为空白对照，静置于28℃条件下培养24h以上，便可观测到各受试菌菌丝生长受桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915培养上清抑制的现象，而空白对照则无此效果（图2）。

实施例3：桃色顶孢霉S2915抗菌粗蛋白成分在DEAE-sepharose Fast Flow柱上的色谱分离

用起始缓冲液（pH8.10，20mM Tris）平衡DEAE-sepharose Fast Flow柱，将桃色顶孢霉S2915培养上清粗蛋白在DEAE-sepharose Fast Flow柱上样后，继续用4个柱体积的起始缓冲液（pH8.10，20mM Tris）冲洗柱子，洗脱获得低盐浓度条件下在DEAE-sepharose FastFlow柱上各非吸附成分，继而用洗涤缓冲液（pH8.10，20mM Tris，1M NaCl）继续冲洗DEAE-sepharose Fast Flow柱，获得各吸附组分。其中P1为活性组分（图3）。

实施例4：非吸附组分P1在CM-sepharose Fast Flow柱色谱分离

同样使用起始缓冲液（pH8.10，20mM Tris）平衡CM-sepharose Fast Flow柱，把在DEAE柱上的非吸附组分P1在CM-sepharose Fast Flow柱上样，使用5个柱体积的起始缓冲液（pH8.10，20mM Tris）冲洗柱子，获得各非吸附活性组分；继而在十个柱体积内使起始缓冲液（pH8.10，20mM Tris）完全转换为洗涤缓冲液（pH8.10，20mM Tris，1M NaCl），并获得在CM-sepharose Fast Flow柱上的各吸附组分。图4中P6为活性组分。

实施例5：纯化活性产物对敏感真菌立枯丝核菌的抑制效果

将立枯丝核菌块接种至PDA（马铃薯葡萄糖培养，200g马铃薯煮沸30min，用8层纱布过滤后得滤液，滤液中加入20g葡萄糖和15g琼脂，加去离子水定容至1L）平板上，于28℃条件下培养至菌丝充分伸展，在离菌丝1.0cm处放置无菌纸片，并在各纸片上滴加40μL纯化得到的各组分。图5中，P6为活性组分的抑菌效果。

实施例6：纯化产物P6的SDS-PAGE电泳图

纯化后的组分P6在电压180V，常温条件下行15%SDS-PAGE电泳，经硝酸银染色检测组分P6的纯度。结果显示，纯化获得的组分P6在银染条件下仅观察到一条单一的条带，大小约2.5kDa，该抗菌活性蛋白命名为AFP2915（图6）。

实施例7：桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对长柄链格孢最低抑制浓度的测定

挑取受试菌菌块接种于PDA平板培养基上，于28℃条件下静置培养2天至菌丝充分伸展开来，在距菌丝边缘1.0cm处均匀放置6块无菌纸片，依次顺序在相邻5块纸片上加40μL二倍稀释的抗真菌蛋白溶液，第6块纸片上仅加上缓冲液作为空白对照，抗真菌蛋白各溶液浓度依次分别为320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL和20μg/mL，将对菌丝生长无影响的临界浓度之上的浓度定为最低抑制浓度，计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×40μL。

实施例8：桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对绿色木霉最低抑制浓度的测定

挑取受试菌菌块接种于PDA固体平板培养基上，于28℃条件下静置培养1d至菌丝充分伸展开来，在距菌丝边缘1.0cm处均匀放置6块无菌纸片，依次顺序在相邻5块纸片上加40μL二倍稀释的抗真菌蛋白溶液，第6块纸片上仅加上缓冲液作为空白对照，抗真菌蛋白各溶液浓度依次分别为1280μg/mL、640μg/mL、320μg/mL、160μg/mL和80μg/mL，将对菌丝生长无影响的临界浓度之上的浓度定为最低抑制浓度，计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×40μL。

实施例9：桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对胶孢炭疽菌最低抑制浓度的测定

挑取受试菌菌块接种于PDA固体平板培养基上，于28℃条件下静置培养2d至菌丝充分伸展开来，在距菌丝边缘1cm处均匀放置6块无菌纸片，依次顺序在相邻5块纸片上加40μL二倍稀释的抗真菌蛋白溶液，第6块纸片上仅加上缓冲液作为空白对照，抗真菌蛋白各溶液浓度依次分别为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL和10μg/mL，将对菌丝生长无影响的临界浓度之上的浓度定为最低抑制浓度，计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×40μL。

实施例10：桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对核盘菌最低抑制浓度的测定

挑取受试菌菌块接种于PDA固体平板培养基上，于28℃条件下静置培养2d至菌丝充分伸展开来，在距菌丝边缘1cm处均匀放置6块无菌纸片，依次顺序在相邻5块纸片上加40μL二倍稀释的抗真菌蛋白溶液，第6块纸片上仅加上缓冲液作为空白对照，抗真菌蛋白各溶液浓度依次分别为640μg/mL、320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL和40μg/mL，将对菌丝生长无影响的临界浓度之上的浓度定为最低抑制浓度，计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×40μL。

实施例11：桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌蛋白AFP2915对立枯丝核菌最低抑制浓度的测定

挑取受试菌菌块接种于PDA固体平板培养基上，于28℃条件下静置培养1d至菌丝充分伸展开来，在距菌丝边缘1.0cm处均匀放置6块无菌纸片，依次顺序在相邻5块纸片上加40μL二倍稀释的抗真菌蛋白溶液，第6块纸片上仅加上缓冲液作为空白对照，抗真菌蛋白各溶液浓度依次分别为320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL和20μg/mL，将对菌丝生长无影响的临界浓度之上的浓度定为最低抑制浓度，计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×40μL。

实施例12：温度对蛋白AFP2915抗菌活性的影响

将AFP2915抗菌蛋白溶液于60℃、80℃、100℃条件下分别处理30min以及121℃高压灭菌条件下处理20min；待溶液冷却至室温后，以未处理的蛋白溶液为阳性对照，检测各样品对立枯丝核菌的抑菌活性。

将立枯丝核菌菌块接种至PDA平板上，于28℃条件下培养至菌丝充分伸展，在离菌丝1.0cm处放置无菌纸片，并在纸片上分别滴加40μL经不同温度处理后的AFP2915蛋白溶液（图12）。

实施例13：pH对蛋白AFP2915抗菌活性的影响

取等量的AFP2915蛋白溶液，用5mol/L HCl和5mol/L NaOH分别调至pH为2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和12.0，常温处理30min，用相应酸和碱调至中性，溶液过滤除菌并检测抑菌活性，以未处理的蛋白溶液作为对照。

将立枯丝核菌菌块接种至PDA平板上，于28℃条件下培养至菌丝充分伸展，在离菌丝1.0cm处放置无菌纸片，并在各纸片上分别滴加40μL经不同pH处理后的AFP2915蛋白溶液（图13）。

实施例14：蛋白酶对蛋白AFP2915抗菌活性的影响

在等量AFP2915蛋白溶液中，分别加入蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等3种蛋白酶至终浓度为1mg/mL，分别以未经蛋白酶处理的AFP2915蛋白溶液和未加蛋白样品的3种蛋白酶溶液为对照，于37℃温育2h，以立枯丝核菌为指示菌，检测此3种蛋白酶对AFP2915蛋白的抗菌活性是否产生影响。

将立枯丝核菌菌块接种至PDA平板上，于28℃条件下培养至菌丝充分伸展，在离菌丝1.0cm处放置无菌纸片，并在个纸片上分别滴加40μL上述经不同蛋白酶处理的AFP2915溶液及各蛋白酶溶液空白对照（图14）。

Claims (9)

1.桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915，其特征在于所述桃色顶孢霉（Acremoniumpersicinum）S2915已于2013年01月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013040。

2.如权利要求1所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915，其特征在于其ITS序列为：

1   GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTCTCCGTT GGTGAACCAG CGGAGGGATC

51  ATTACTGAGT CTAACAAACT CCCAAACCCC TGTGAACATA CCTACTGTTG

101  CTTCGGCGGG ACCGCCCCGG GCGCCTTCGC GGTGCCCCGG AACCAGGCGC

151  CCGCCGGGGA CATCAAACTC TTGATTGTTA TAGTGGCATT CTCTGAGTAA

201  AGCATACAAA TAAGTCAAAA CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGCTCTGGCA

251  TCGATGAAGA ACGCAGCGAA ATGCGATAAG TAATGCGAAT TGCAGAATTC

301  AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCTA GTATTCTGGC

351  GGGCATGCCT GTCTGAGCGT CATTTCAACC CTCGCCCCCG GCTTTTGCTG

401  GGAGCGGTGT TGGGGATCGG CCGCCCGTCA CTGGGAGGCC GGCCCCGAAA

451  TAGAGTGGCG ACCACGCCGT GTGCTCCTCT GCGTAGTAGT AAATCACCTC

501  GCAGGCGGAC AGCGGTGCGG CCT。

3.如权利要求1所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915，其特征在于其抗真菌蛋白经LC-MS/MS鉴定，其部分氨基酸序列如下所示：

KNMITGTSXADCAILIIAGGVGEFEAGISKD。

4.如权利要求1所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915，其特征在于其培养上清抗菌谱的测定，包括以下步骤：

1）从GPY平板上挑取生长有桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的菌块接种于GPY液体培养基中，于28℃，180r/min条件下，摇瓶培养7d，真空抽滤除去菌体，获得菌株培养上清；

2）将步骤1）获得的菌株培养上清5mL用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，贮存于－80℃条件备用；

3）分别接种宛氏拟青霉、尖孢镰刀菌、长柄链格孢、核盘菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌及绿色木霉共7株霉菌于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，静置于28℃培养箱中培养1～2d，待菌丝生长至合适大小，该平板即可作为受试菌平板；

4）在步骤3）得到的受试菌平板的菌丝边缘1.0cm处放置两块纸片，其中一块纸片上加40μL步骤2）过滤除菌的培养上清，另一块纸片上对应地加等量的培养基作为空白对照，受试菌平板置于28℃条件下培养12～24h，观察受试菌菌丝的生长是否受到了菌株培养上清的抑制作用。

5.如权利要求1～4中任一所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）从平板上挑取已活化的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915菌块接种于GPY液体培养基，摇瓶培养，所得菌体培养液取上清；

2）在步骤1）所得的上清中加入硫酸铵至饱和度达70%，单位为m/v，得混合溶液；

3）将步骤2）所得的混合溶液离心，获得的沉淀物重溶于水中，得粗蛋白溶液；

4）将步骤3）获得的粗蛋白溶液透析，离心，以除去不溶性杂质，得除去不溶性杂质的粗蛋白溶液；

5）将步骤4）所得的除去不溶性杂质的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基阴离子交换色谱柱上分离纯化，按紫外吸收峰出现的先后顺序依次收集各洗脱组分，各组分利用超滤浓缩管离心超滤浓缩后，利用对该粗蛋白溶液敏感的受试真菌立枯丝核菌为指示菌跟踪活性组分，得具有活性的非吸附组分；

6）将步骤5）得到的具有活性的非吸附组分继续在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，同样按紫外吸收峰出现的先后顺序依次收集各洗脱组分，各组分利用超滤浓缩管离心超滤浓缩，以立枯丝核菌为敏感受试指示菌，采用纸片法追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分根据SDS-PAGE电泳图判断获得蛋白的纯度，得桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915抗真菌活性蛋白。

6.如权利要求5所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述GPY液体培养基的组成成分及按质量百分比含量为：每100mL液体培养基中含1%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.05%酵母提取物，其余为去离子水；所述摇瓶培养的条件为28℃，180r/min条件下摇瓶培养7d；所述上清是将所得菌体培养液通过抽滤的方法获得。

7.如权利要求5所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所得混合溶液于4℃条件下静置过夜；在步骤3）中，所述离心，是将混合溶液于4℃，12000g下离心15min；在步骤4）中，所述透析，是在4℃条件下透析；所述离心，是于4℃，8000g条件下离心20min。

8.如权利要求5所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于在步骤5）中，所述指示菌跟踪活性组分的抗真菌活性检测方法采用纸片法。

9.如权利要求5所述桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）S2915的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于在步骤5）和6）中，所述利用超滤浓缩管离心超滤浓缩，是于4℃，5000g条件下利用超滤浓缩管离心超滤浓缩。