CN103409326B - 烟曲霉r9抗菌蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
烟曲霉R9抗菌蛋白及其制备方法，涉及一种抗菌蛋白。所述烟曲霉R9为CCTCC NO：M2013206。从曲霉菌R9培养上清中分离纯化到对长柄链格孢等具有明显可见抑制作用的蛋白，鉴定该蛋白的3个肽段序列，均在蛋白编号为gi|2297的18-kDa antigen[Aspergillus fumigatus]序列中，而该蛋白在抗菌方面的功能尚未见报道。具有抗菌谱广、抗菌活性强等优点，从而为寻找新的抗菌活性物质、新型抗生素的开发及农业病虫害的生物防治提供科学依据，并且有望为新型农业抗生素的筛选提供可选择资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌蛋白，尤其是涉及一种来源于海洋真菌烟曲霉R9的抗菌蛋白及其制备方法。
背景技术
随着21世纪人类社会面临“人口剧增、资源匮乏、环境恶化”三大问题的严峻挑战和由于陆栖微生物在抗生素、酶、酶的抑制剂、多糖等生物活性物质的大量开发与应用，陆地微生物资源日益减少，新型病原微生物的不断出现，人类已经把目光投向了海洋。海洋覆盖着地球表面积的71%，是生物资源的巨大宝库，地球上约有80%的物种生存在海洋里，其中微生物种类更是超过百万种，但到目前为止已经鉴定和研究的微生物不到总量的5%，已发现的活性物质只占总数的1%([1].Haefner,B.,Drugs from the deep:marine natural products as drugcandidates.Drug Discovery Today,2003.8(12):536–544.)。由于海洋特殊的生态环境：高盐、低光或无光、高湿、高寒、高压以及重金属区等，海洋微生物在生长与代谢过程中所产生各种与陆地微生物不同的具有特殊结构和功能的活性物质，这为人类研究与开发新型药物提供了宝贵的资源。
植物致病菌是造成主要粮食和经济作物减产的头号杀手([2].Oerke,E.C.,et al.CropProtection and Crop Production[J].Elsevier,Amsterdam,1994.)。在过去的40年里，主要依赖于大量使用合成农药来防治植物病害([3].Oerke,E.C.Crop losses to pests[J].Agric.Sci,2006.(144):31-43.)。但实事已经证明，合成农药已经对环境和人类健康造成了巨大的负面影响。同时开发新型合成农药的高成本及耐药微生物的迅速出现等因素，更加引起我们对生物农药的关注。微生物农药作为生物农药市场的主体，具有抗菌谱广、活性功能多样化及活性物质丰富等优点。其中，抗菌蛋白因其来源广泛及独特的杀菌作用，为新型抗真菌药物的研发提供重要信息。
抗菌蛋白是一类具有抗菌作用的蛋白类物质，普遍存在于自然界中，继1980年在美国天蚕体内发现了第一个动物来源的抗生素多肽－杀菌肽以来，在真菌、昆虫、两栖类、水产动物、包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少1700余种抗菌蛋白。
抗菌蛋白具有相对分子量小、等电点高、热稳定性好、杀菌范围广、作用机制独特等特性及特点，在生理条件下多数带正电荷，并且具有广谱抗菌的优点，不仅对细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞有杀伤活性，而且在免疫调节、激素调节及刺激伤口愈合等方面有重要作用。多数抗菌蛋白的等电点大于7，呈现出较强的阳离子特性。其水溶性较好，对较高或较低的pH值以及较大的离子强度均具有较强的抗性。研究表明，抗菌蛋白的耐热性较高，多数抗菌蛋白在100℃中沸水浴30min仍能保持较强的抑菌活性。随着抗生素的大量使用，耐药性的问题越来越严重，寻找合适的活性物质来替代抗生素是解决这一问题最有效的途径。抗菌蛋白具有水溶性好、热稳定、广谱抗菌及不易引起病原产生耐药性等优点，是理想的抗生素替代品。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9。
本发明的目的之二在于提供一种烟曲霉R9抗菌蛋白及其制备方法。
本发明所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9已于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013206，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9是从中国2011年第22次大洋科考期间在南大西洋所采集的深海沉积物样品中分离纯化而得到（样品站位信息：站位编号为22V-TVG11，经度为14.87°W，纬度为12.12°S，水深为2647m）。该菌在马铃薯固体培养基（PDA）上生长迅速，菌株呈白色丝绒状到绿色颗粒状，菌落反面呈黄色，产大量孢子，具有少量渗出液，轻霉味；通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了其内源转录区间ITS序列；得到的该菌ITS序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，结果发现，其与曲霉属的烟曲霉KARVS04(Aspergillus fumigatus KARVS04)具有99%的序列相似性。基于生理特性、形态学特征及其分子鉴定信息，该深海来源菌株为一株烟曲霉，并将其命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9。
扩增获得的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9的ITS序列为：
1 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC
51 ATTACCGAGT GAGGGCCCTC TGGGTCCAAC CTCCCACCCG TGTCTATCGT
101 ACCTTGTTGC TTCGGCGGGC CCGCCGTTTC GACGGCCGCC GGGGAGGTCT
151 TGCGCCCCCG GGCCCGCGCC CGCCGAAGAC CCCAACATGA ACGCTGTTCT
201 GAAAGTATGC AGTCTGAGTT GATTATCGTA ATCAGTTAAA ACTTTCAACA
251 ACGGATCTCT TGGTTCCGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAA
301 GTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TCGAGTCTTT GAACGCACAT
351 TGCGCCCCCT GGTATTCCGG GGGGCATGCC TGTCCGAGCG TCATTGCTGC
401 CCTCAAGCAC GGCTTGTGTG TTGGGCCCCC GTCCCCCTCT CCCGGGGGAC
451 GGGCCCGAAA GGCAGCGGCG GCACCGCGTC CGGTCCTCGA GCGTATGGGG
501 CTTTGTCACC T。
本发明所述烟曲霉R9抗菌蛋白的3个肽段氨基酸序列均在蛋白编号为gi|2297的18-kDa antigen[Aspergillus fumigatus]序列中，具体如下序列中划线标记序列所示：MVAIKNLFLLAATAVSVLAAPSPLDARATWTCINQQLNPKTNKWEDKRLLYNQAKAESN SHHAPLSDGKTGSSYPHWFTNGYDGNGKLIKGRTPIKFGKADCDRPPKHSQNGMGKDDHYLLEFPTFPDGHDYKFDSKKPKEDPGPARVIYTYPNKVFCGIVAHQRGNQGDLRLCSH。
本发明所述烟曲霉R9抗菌蛋白的制备方法包括以下步骤：
1）将分离纯化所得的烟曲霉R9划线活化于PDA平板培养，在无菌操作下挖菌块，并接种于装有YTMM液体培养基的三角瓶中，振荡培养后，收集发酵液，经定性滤纸过滤除去菌丝体，得到滤液上清；
2）在步骤1）所得上清中加入固体硫酸铵至浓度为20%饱和度，在4℃下静置12～24h得混合溶液，再将混合溶液离心后，收集上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至浓度为80%饱和度，在4℃下静置12～24h得混合溶液，将混合溶液再离心后，收集沉淀，再将沉淀物重溶于水中，得粗蛋白溶液；
3）将步骤2）获得的粗蛋白溶液用透析袋进行透析除盐，获得透析液离心，以除去不溶性杂质；
4）将步骤3）获得的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基（DEAE）阴离子交换色谱柱分离纯化，载样缓冲液流速为1mL/min，基线走平后手动上样，按照如下洗脱程序运行：0%B-3CV，0-40%B-10CV，100%B-2CV，0%B-2CV，其中B为洗脱缓冲液，1CV为一个柱体积（20mL），根据紫外吸收峰出现的先后顺序收集第二个非吸附峰，利用50mL超滤浓缩离心管（MWCO3000）将收集的组分浓缩至终体积为0.5～1.0mL，离心超滤浓缩后，利用对该粗蛋白溶液敏感的受试菌为指示菌跟踪活性组分；
5）将步骤4）浓缩后具有活性的非吸附组分继续在羧甲基（CM）阳离子交换色谱柱上分离纯化，载样缓冲液流速为1mL/min，基线走平后手动上样，按照如下洗脱程序运行：0%B-3CV，0-40%B-10CV，100%B-2CV，0%B-2CV，其中B为洗脱缓冲液，1CV为一个柱体积（20mL），根据紫外吸收峰出现的先后顺序收集第二个非吸附峰，利用50mL超滤浓缩离心管（MWCO3000）将收集的组分浓缩，离心至终体积为0.5～1.0mL，离心超滤浓缩后，以宛氏拟青霉等为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，活性峰组分通过SDS-PAGE（恒压180V，45～60min）和硝酸银染色方法鉴定其纯度；
6）割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，经灭菌去离子水洗涤后，进行MALDI-TOF-TOF鉴定。
在步骤1)中，所述培养可于26～30℃下培养3～6天；所述挖菌块可采用直径为6mm的打孔器挖菌块；所述YTMM液体培养基的组成成分及按质量百分比含量为：每100mL液体培养基中含1%酵母提取物、1%麦芽提取物、0.6%蛋白胨及2.5%甘露醇，其余为灭菌海水；所述振荡培养的条件可于26～30℃，180rpm下，振荡培养5～8天。
在步骤2）中，所述离心和再离心的条件可于4℃，12,000g，离心30min。
在步骤3）中，所述透析袋可采用截留分子量为3.5kDa的透析袋；所述离心的条件可于4℃，6,000g，离心10min。
在步骤4）中，所述离心的条件可为4℃，5000g；所述载样缓冲液是pH为8.1，含20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱程序中选用的洗脱缓冲液是pH为8.1，含20mM Tris-HCl，1M NaCl缓冲液；手动上样体积为2mL；所述跟踪活性组分的检测方法可采用活性检测纸片法；所述活性检测纸片法的具体步骤如下：用直径为6mm的无菌打孔器将受试霉菌制成菌块，用牙签挑取一菌块于PDA平板中央，26～30℃条件下培养1～2天，待霉菌菌丝体扩散生长后，在距离菌丝边缘1cm的位置放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，再在每个滤纸片上分别加50μL左右浓缩成分和阴性对照，将指示板静置于26～30℃培养并观察，通过与对照培养的比较，观测菌丝体的生长是否受到抑制，如果受到抑制，霉菌的菌丝体边缘会形成月牙型或者线型边缘。
在步骤5）中，所述离心的条件可为4℃，5000g；所述载样缓冲液是pH为8.1，含20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱程序中选用的洗脱缓冲液是pH为8.1，含20mM Tris-HCl，1M NaCl缓冲液；所述手动上样体积为2mL；所述追踪抗真菌活性组分可采用活性检测纸片法，所述活性检测纸片法的具体步骤如下：用直径为6mm的无菌打孔器将受试霉菌制成菌块，用牙签挑取一菌块于PDA平板中央，26～30℃条件下培养1～2天，待霉菌菌丝体扩散生长后，在距离菌丝边缘1cm的位置放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，再在每个滤纸片上分别加50μL左右浓缩成分和阴性对照，将指示板静置于26～30℃培养并观察，通过与对照培养的比较，观测菌丝体的生长是否受到抑制，如果受到抑制，霉菌的菌丝体边缘会形成月牙型或者线型边缘。
本发明采用盐析、透析、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、超滤浓缩等方法从海洋曲霉菌R9培养上清中分离纯化到对长柄链格孢、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉、绿色木霉、黄单胞菌具有明显可见抑制作用的蛋白，通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定了该蛋白的3个肽段序列，发现此3个肽段序列均在蛋白编号为gi|2297的18-kDa antigen[Aspergillusfumigatus]序列中，而该蛋白在抗菌方面的功能尚未见报道。
本发明同时测定了烟曲霉R9(Aspergillus fumigatus R9)抗菌活性蛋白对敏感受试真菌最低抑制浓度，测定方法包括以下步骤：
1）用直径为6mm的无菌打孔器将受试霉菌制成菌块，用牙签挑取一菌块于PDA平板中央，26～30℃条件下培养1～2天，作为受试菌平板；
2)将纯化后的烟曲霉R9抗菌蛋白浓度依次二倍稀释为400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL和3.125μg/mL；
3)在上述受试菌菌丝边缘1.0cm处均匀放置8块纸片，在其中7块纸片上加入50μL各二倍稀释的抗菌蛋白溶液，在最后一块纸片上加上缓冲液作为空白对照，各受试菌平板静置于28℃培养箱中培养12h以上，观察并将跟空白对照一样没有产生菌丝抑制作用的临界浓度确定为该抗菌蛋白对各受试菌菌的最低抑制浓度（MIC），计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×50μL。本发明测定的烟曲霉R9(Aspergillus fumigatus R9)抗菌蛋白对5株敏感真菌，即长柄链格孢、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉、绿色木霉、香蕉炭疽菌的最低抑制浓度分别为0.6250μg/纸片，0.6250μg/纸片，1.2500μg/纸片，2.5000μg/纸片和1.2500μg/纸片，显示出其良好的抑菌效果。
本发明菌株烟曲霉R9是从中国大洋第22航次科学考查采集的南大西洋深海沉积物样品中分离得到。分离纯化得到的烟曲霉R9抗菌蛋白对植物致病真菌及细菌均有抑制作用，具有抗菌谱广、抗菌活性强等优点，从而为寻找新的抗菌活性物质、新型抗生素的开发及农业病虫害的生物防治提供科学依据，并且有望为新型农业抗生素的筛选提供可选择资源。
附图说明
图1为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9粗蛋白在DEAE-sepharose Fast Flow柱上的色谱分离。在图1中，横坐标为洗脱运行时间（min），纵坐标为紫外吸收值（mAU），AP2为活性组分。
图2为非吸附成分AP2在CM-sepharose Fast Flow柱分离效果图。在图2中，横坐标为洗脱运行时间（min），纵坐标为紫外吸收值（mAU），BP2为活性组分。
图3为15%SDS-PAGE检测纯化抗菌蛋白纯度的电泳图。在图3中，1为蛋白分子量标准，2为纯化产物烟曲霉R9抗菌蛋白。
图4为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对黄单胞菌的抑制作用效果图。在图4中，1为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白，2为溶解该抗菌蛋白的载样缓冲液作为空白对照。
图5为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对绿色木霉的抑制作用效果图。在图5中，1为溶解该抗菌蛋白的载样缓冲液作为空白对照，2为烟曲霉R9抗菌蛋白。
图6为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对长柄链格孢的抑制作用效果图。在图6中，1为溶解该抗菌蛋白的载样缓冲液作为空白对照，2为烟曲霉R9抗菌蛋白。
图7为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对香蕉炭疽菌的抑制作用效果图。在图7中，1为溶解该抗菌蛋白的载样缓冲液作为空白对照，2为烟曲霉R9抗菌蛋白。
图8为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对宛氏拟青霉的抑制作用效果图。在图8中，1为溶解该抗菌蛋白的载样缓冲液作为空白对照，2为烟曲霉R9抗菌蛋白。
图9为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对棉花枯萎病菌的抑制作用效果图。在图9中，1为溶解该抗菌蛋白的载样缓冲液作为空白对照，2为烟曲霉R9抗菌蛋白。
图10表示烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对绿色木霉的最低抑制浓度的测定。在图10中，纸片1～7依次加入蛋白量为20μg、10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg和0.3125μg，纸片8上所加成分为空白对照载样缓冲液。
图11表示烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对长柄链格孢的最低抑制浓度的测定。在图11中，纸片1～7依次加入蛋白量为20μg、10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg和0.3125μg，纸片8上所加成分为空白对照载样缓冲液。
图12表示烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对香蕉炭疽菌的最低抑制浓度的测定。在图12中，纸片1～7依次加入蛋白量为20μg、10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg和0.3125μg，纸片8上所加成分为空白对照载样缓冲液。
图13表示烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对宛氏拟青霉的最低抑制浓度的测定。在图13中，纸片1～7依次加入蛋白量为20μg、10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg和0.3125μg，纸片8上所加成分为空白对照载样缓冲液。
图14表示烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对棉花枯萎病菌的最低抑制浓度的测定。在图14中，纸片1～7依次加入蛋白量为20μg、10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg和0.3125μg，纸片8上所加成分为空白对照载样缓冲液。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。在下面的实施例中，所用的菌种均为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9，所用的YTMM液体培养基配方如下：
YTMM液体培养基的组成成分及按质量百分比含量为：每100mL液体培养基中含1%酵母提取物、1%麦芽提取物、0.6%蛋白胨及2.5%甘露醇，其余为灭菌海水。
实施例1：从烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9发酵上清中分离获得粗蛋白
在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9发酵上清中加入固体硫酸铵至浓度为20%饱和度，放置4℃静置24h得混合溶液，再将混合溶液于4℃，12,000g，离心30min，收集上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至浓度为80%饱和度，放置4℃静置24h得混合溶液，再将混合溶液于4℃，12,000g，离心30min，收集沉淀，获得沉淀物重溶于水中，获得粗蛋白溶液；获得的粗蛋白溶液用截留分子量为3.5kDa的透析袋进行透析除盐，获得透析液于4℃，6,000g，离心10min，以除去不溶性杂质。所获得的上清液即为粗蛋白溶液。
实施例2：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9粗蛋白在二乙基氨基乙基（DEAE）阴离子交换色谱柱上分离纯化
用载样缓冲液(pH8.1，20mM Tris)平衡DEAE-sepharose Fast Flow柱，载样缓冲液流速为1mL/min；将烟曲霉R9粗蛋白在DEAE-sepharose Fast Flow柱手动上样后（体积为2mL），按照如下洗脱程序运行：0%B-3CV，0-40%B-10CV，100%B-2CV，0%B-2CV，其中B为洗脱缓冲液(pH8.1，20mM Tris-HCl，1M NaCl)，1CV为一个柱体积（20mL），洗脱缓冲液冲洗柱子；按紫外吸收峰出现的先后顺序收集第二个非吸附峰AP2（图1）。
实施例3：非吸附组分AP2在羧甲基（CM）阳离子交换色谱柱上分离纯化
同样用载样缓冲液(pH8.10，20mM Tris)平衡CM-sepharose Fast Flow柱，载样缓冲液流速为1mL/min；将非吸附组分AP2在CM-sepharose Fast Flow柱手动上样后（体积为2mL），按照如下洗脱程序运行：0%B-3CV，0-40%B-10CV，100%B-2CV，0%B-2CV，其中B为洗脱缓冲液(pH8.10，20mM Tris-HCl，1M NaCl)，1CV为一个柱体积（20mL），洗脱缓冲液冲洗柱子；按紫外吸收峰出现的先后顺序收集第二个非吸附峰BP2（图2）。
实施例4：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白最终纯化的SDS-PAGE电泳图谱
活性峰组分BP2通过15%SDS-PAGE（恒压180V，45-60min）和硝酸银染色方法鉴定其纯度，电泳图谱显示活性峰组分BP2在银染条件下只有一条单一的条带被显色（图3）。
实施例5：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对黄单胞菌的抑制作用
从平板上挑取黄单胞菌单菌落接种于5mL液体LB中，37℃，180rpm震荡培养16h；将刚经过高温高压灭菌的LB琼脂培养基冷却至55℃左右，按100∶1（体积比）的比例加入指示菌悬液，摇匀后倒板，室温放置直至平板凝固，并放4℃保存；用直径6mm的打孔器在凝固的指示板上打孔并用牙签挑去孔里的培养基，在孔里加入50μL左右烟曲霉R9抗菌蛋白，将指示板静置于37℃培养并观察有无透明抑菌圈（图4）。
实施例6：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对受试真菌的抑制作用
用直径为6mm的无菌打孔器将绿色木霉、长柄链格孢、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、棉花枯萎病菌分别制成菌块，用牙签挑取一菌块于PDA平板中央，28℃条件下培养2d，待霉菌菌丝体扩散生长后，在距离菌丝边缘1cm的位置放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，再在滤纸片上加50μL左右烟曲霉R9抗菌蛋白，将指示板静置于28℃培养并观察（图5～9）。
实施例7：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白对受试真菌最低抑制浓度的测定
挑取受试真菌菌块接种于PDA固体平板培养基上，于28℃条件下静置培养1天至菌丝充分伸展开来，在距菌丝边缘1.0cm处均匀放置8块无菌纸片，依次顺序在相邻7块纸片上加50μL二倍稀释的抗菌蛋白溶液，第8块纸片上仅加上缓冲液作为空白对照，抗菌蛋白各溶液浓度依次分别为400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL和3.125μg/mL，将对菌丝生长无影响的临界浓度之上的浓度定为最低抑制浓度，计算公式为：MIC（μg/纸片）=浓度×50μL。将指示板静置于28℃培养并观察测定得到烟曲霉R9抗菌蛋白对5株敏感真菌，即长柄链格孢、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉、绿色木霉、香蕉炭疽菌的最低抑制浓度分别为0.6250μg/纸片，0.6250μg/纸片，1.2500μg/纸片，2.5000μg/纸片和1.2500μg/纸片（图10～14）。
Claims (12)
1.烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9，已于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013206。
2.如权利要求1所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9，其特征在于其ITS序列为：
3.烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的3个肽段氨基酸序列均在蛋白编号为gi|2297的18-kDa antigen[Aspergillus fumigatus]序列中，具体如下序列中划线标记序列所示：
MVAIKNLFLLAATAVSVLAAPSPLDARATWTCINQQLNPKTNKWEDKRLLYNQAKAESNS HHAPLSDGKTGSSYPHWFTNGYDGNGKLIKGRTPIKFGKADCDRPPKHSQNGMGKDDHYLLEFPTFPDGHDYKFDSKKPKEDPGPARVIYTYPNKVFCGIVAHQRGNQGDLRLCSH；
所述方法包括以下步骤：
1)将权利要求1所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9划线活化于PDA平板培养，在无菌操作下挖菌块，并接种于装有YTMM液体培养基的三角瓶中，振荡培养后，收集发酵液，经定性滤纸过滤除去菌丝体，得到滤液上清；所述YTMM液体培养基的组成成分及按质量百分比含量为：每100mL液体培养基中含1％酵母提取物、1％麦芽提取物、0.6％蛋白胨及2.5％甘露醇，其余为灭菌海水；
2)在步骤1)所得上清中加入固体硫酸铵至浓度为20％饱和度，在4℃下静置12～24h得混合溶液，再将混合溶液离心后，收集上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至浓度为80％饱和度，在4℃下静置12～24h得混合溶液，将混合溶液再离心后，收集沉淀，再将沉淀物重溶于水中，得粗蛋白溶液；
3)将步骤2)获得的粗蛋白溶液用透析袋进行透析除盐，获得透析液离心，以除去不溶性杂质；
4)将步骤3)获得的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基阴离子交换色谱柱分离纯化，载样缓冲液流速为1mL/min，基线走平后手动上样，按照如下洗脱程序运行：0％B-3CV，0-40％B-10CV，100％B-2CV，0％B-2CV，其中B为洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液的组成为20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.1，1CV为一个柱体积，根据紫外吸收峰出现的先后顺序收集第二个非吸附峰，利用50mL超滤浓缩离心管将收集的组分浓缩至终体积为0.5～1.0mL，离心超滤浓缩后，利用对该粗蛋白溶液敏感的受试菌为指示菌跟踪活性组分；
5)将步骤4)浓缩后具有活性的非吸附组分继续在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，载样缓冲液流速为1mL/min，基线走平后手动上样，按照如下洗脱程序运行：0％B-3CV，0-40％B-10CV，100％B-2CV，0％B-2CV，其中B为洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液的组成为20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.1，1CV为一个柱体积，根据紫外吸收峰出现的先后顺序收集第二个非吸附峰，利用50mL超滤浓缩离心管将收集的组分浓缩，离心至终体积为0.5～1.0mL，离心超滤浓缩后，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，活性峰组分通过恒压180V的SDS-PAGE电泳45～60min和硝酸银染色方法鉴定其纯度；
6)割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，经灭菌去离子水洗涤后，进行MALDI-TOF-TOF鉴定。
4.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养是于26～30℃下培养3～6天；所述挖菌块采用直径为6mm的打孔器挖菌块。
5.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述振荡培养的条件是于26～30℃，180rpm下，振荡培养5～8天。
6.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述离心和再离心的条件是于4℃，12,000g，离心30min。
7.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述透析袋采用截留分子量为3.5kDa的透析袋。
8.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述离心的条件是于4℃，6,000g，离心10min。
9.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述离心的条件为4℃，5000g；所述载样缓冲液是pH为8.1，含20mMTris-HCl缓冲液；洗脱程序中选用的洗脱缓冲液是pH为8.1，含20mM Tris-HCl，1M NaCl缓冲液；手动上样体积为2mL。
10.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述跟踪活性组分的检测方法采用活性检测纸片法；所述活性检测纸片法的具体步骤如下：用直径为6mm的无菌打孔器将受试霉菌制成菌块，用牙签挑取一菌块于PDA平板中央，26～30℃条件下培养1～2天，待霉菌菌丝体扩散生长后，在距离菌丝边缘1cm的位置放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，再在每个滤纸片上分别加50μL浓缩成分和阴性对照，将指示板静置于26～30℃培养并观察，通过与对照培养的比较，观测菌丝体的生长是否受到抑制，如果受到抑制，霉菌的菌丝体边缘会形成月牙型或者线型边缘。
11.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述离心的条件为4℃，5000g；所述载样缓冲液是pH为8.1，含20mMTris-HCl缓冲液；洗脱程序中选用的洗脱缓冲液是pH为8.1，含20mM Tris-HCl，1M NaCl缓冲液；所述手动上样体积为2mL。
12.如权利要求3所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)R9抗菌蛋白的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述追踪抗真菌活性组分采用活性检测纸片法，所述活性检测纸片法的具体步骤如下：用直径为6mm的无菌打孔器将受试霉菌制成菌块，用牙签挑取一菌块于PDA平板中央，26～30℃条件下培养1～2天，待霉菌菌丝体扩散生长后，在距离菌丝边缘1cm的位置放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，再在每个滤纸片上分别加50μL左右浓缩成分和阴性对照，将指示板静置于26～30℃培养并观察，通过与对照培养的比较，观测菌丝体的生长是否受到抑制，如果受到抑制，霉菌的菌丝体边缘会形成月牙型或者线型边缘。
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