CN103936827A

CN103936827A - 一种韭菜籽抗菌三肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103936827A
Application number: CN201410162303.3A
Authority: CN
Inventors: 洪晶; 陈涛涛; 汪少芸; 户佩; 张扬
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: CN103936827B

Abstract

本发明涉及一种韭菜籽抗菌三肽及其制备方法与应用，属于食品及生物医学领域。该抗菌序列为Ser-Ala-Asn（SAN），该多肽能够抑制常见细菌生长，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。体外实验表明，该多肽可以有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的生长。且溶血活性较小，表明其在食品防腐剂和药物的开发应用方面有重要价值。

Description

一种韭菜籽抗菌三肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种韭菜籽抗菌三肽及其制备方法与应用，属于食品及生物医学领域。

背景技术

我国是一个农业大国，农作物的种类繁多，但由于受加工技术条件的所限，农作物的加工大都处于初级阶段，其加工后的残余物中仍有较大含量的蛋白质，而它们大多主要用于饲料工业或自然排放，不仅浪费了资源，同时也造成环境污染。植物活性肽概念的提出及分离检测技术的提高，使人们开始逐渐重视对富含蛋白质的农副产品的深加工并从中获得多种活性肽，如酪蛋白磷酸肽、降血压肽和易消化吸收肽等，植物来源活性肽的研究和开发对提高我国农产品深加工的附加值具有重要作用。

抗菌肽作为大多数生物自然防御系统的重要组成部分，对生物体抵御病原菌的入侵具有重要意义。抗菌肽是由多细胞生物免疫系统产生的一种小分子肽，具有分子量小，两亲性和良好的热稳定性等特点。抗菌肽具有广谱的抑菌作用，自20世纪80年代初天蚕素和防御素纯化鉴定以来，天然抗菌肽的研究引起人们的极大兴趣。植物对微生物的防御一直是植物病理学研究的热点，病菌危害是世界范围内农作物减产的重要原因。植物的生长时时都可遭受微生物的侵袭，目前研究表明，它虽然没有哺乳动物那样特异的免疫系统，但非特异的天然免疫体系却十分惊人：不同类型的具抗菌作用的物质(如过氧化氢酶裂解酶)、次生代谢物质以及抗菌蛋白和抗菌肽等在植物中广泛存在，对植物抗菌肽的研究近年来十分活跃，在许多研究领域都显示出越来越重要的理论和应用价值。

韭菜籽为我国常见食用蔬菜百合科植物韭菜Allium tuberosum Rottl干燥成熟的种子，韭菜籽（药典中常称为韭子）为我国传统中药品种，始载于《名医别录》，列为中品。据药典记载，韭菜籽具有温补肝肾、壮阳固精之功效。韭菜籽作为壮阳补肾用入药在我国民间已有数千年的历史。2002年我国卫生部将其列为药食两用植物天然产物。韭菜籽这种植物种子资源在我国十分丰富，产量居世界首位。目前国内外一直以来对韭菜尤其是其种子韭菜籽的研究很少。国外还未对韭菜籽进行过化学成分和功效等方面的研究，国内化学成分方面的研究也并不多，迄今为止, 对其活性多肽或药理研究国内外都还几乎没有报道。因此，有必要充分利用我国十分丰富的韭菜（韭菜籽）植物资源，对其进行深入系统研究，为实现韭菜籽中药现代化和开发高效、安全的健康食品和药品提供科学依据。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种韭菜籽抗菌三肽，及其制备方法和在食品和生物制药领域中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种韭菜籽抗菌三肽，其氨基酸序列为Ser-Ala-Asn。该多肽能够抑制常见细菌生长，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

所述的韭菜籽抗菌三肽的制备方法，从天然韭菜籽中分离纯化或人工合成方法得到。

从天然韭菜籽中分离纯化的具体步骤包括如下：

1）韭菜籽粗提物的制备：韭菜籽经粉碎，按质量体积比1：10加入体积分数为10%醋酸溶液，超声波辅助提取20 min，再在室温下搅拌提取8 h后，12000 rpm离心10 min，取上清液，冷冻干燥，即为韭菜籽粗提物。

2）分离纯化：取韭菜籽粗提物利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值，收集具有最佳抗菌活性的峰b，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离，RP-HPLC的洗脱梯度为0~5 min，体积分数为5%乙腈；5~40 min，体积分数为5%~30%乙腈梯度洗脱；40-50 min，体积分数为30%乙腈；流速为2.0 mL/min，检测波长214 nm，收集保留时间20.5~21.5min的洗脱峰，冷冻干燥即得所述韭菜籽抗菌三肽。

本发明还提供了所述的韭菜籽抗菌三肽在制备天然食品防腐剂、杀菌剂或杀菌药物中的应用。

本发明的优点在于：

所述抗菌三肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抑制作用，且溶血活性较小，表明其在食品防腐剂和药物的开发应用方面有重要价值。

附图说明

图1：韭菜籽提取物Sephedex G-50凝胶过滤色谱图。

图2：Sephedex G-50凝胶过滤色谱组分抗菌活性。

图3：凝胶色谱洗脱峰b的反相高效液相色谱图。

图4：反相高效液相色谱分离组分的抗菌活性。

图5：韭菜籽抗菌三肽的纯度鉴定图。

图6：韭菜籽抗菌三肽的质谱图。

图7：韭菜籽抗菌三肽的溶血活性。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施实例。

实施实例1

本发明所述抗菌肽的分离纯化包括Sephadex G-50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。

提取韭菜籽提取物：韭菜籽经高速中药粉碎机粉碎，按质量体积比1：10加入10%（V/V）乙酸浸泡，超声波辅助提取20 min，在室温下搅拌提取8 h，12000 rpm离心10 min，取上清液冷冻干燥，-80 ℃低温保存。

Sephadex G-50凝胶过滤色谱：按上述方法获得韭菜籽提取物冻干粉，溶解于去离子水中，12000 rpm离心15 min。取上清液用0.22 μm孔径微滤膜过滤。Sephadex G-50凝胶柱（1.6 cm×100 cm）用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3 mL/min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集各峰并测定抗菌活性。收集具有抗菌活性的组分b（见图2），冷冻干燥，-80 ℃低温保存备用。

高效液相色谱：去离子水溶解上述具有抗菌活性组分的冻干粉，采用RP-HPLC进一步分离。液相色谱系统为LC-20A，装配Gemini 5μ C18（250mm×10mm）反相柱（Phenomenex，UK），用水和乙腈（含0.05%（V/V）三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱。洗脱条件：0~5 min，5%（V/V）乙腈；5~40 min，5%~30%（V/V）乙腈；40~50 min, 30%（V/V）乙腈；洗脱流速2.0 mL/min，检测波长214 nm，洗脱曲线如图3所示。收集各峰并测定抗菌活性，收集保留时间为20.5~21.5 min的洗脱峰CLP-1（抗菌活性见图4），冷冻干燥即为本发明所述抗菌肽。

将收集到的抗菌组分CLP-1冷冻干燥，采用分析型高效液相色谱柱检验所得到的组分纯度，洗脱流速1.0 mL/min，检测波长214 nm，乙腈洗脱梯度5~30%，洗脱曲线如图5所示。经检测，该抗菌肽组分纯度达到94%，可测定其氨基酸序列。

用液相色谱与质谱联用（LC-MS/MS）方法测定氨基酸序列（图6），得到CLP-1的氨基酸序列SAN。

实施实例2

琼脂涂布法检测本发明所述天然抗菌三肽抑菌活性：

所用菌种为大肠杆菌(Escherichia coli, ATCC 25922)。具体操作如下：选取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养(37 ℃，130 rpm)，将200 μL过夜培养菌液接种于20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振摇培养4小时。培养好的菌悬液稀释1000倍，取100 μL加入平板培养基表面，涂布均匀。在涂布好菌液的平板培养基表面均匀地贴上直径为6 mm的圆形滤纸片，每个滤纸片上加8 μL待测样品。庆大霉素作为阳性对照，无菌水做阴性对照。将加完样品的平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养18~20 h，实验结果如图2和图4所示图2为Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离的两个组分a和b的抗菌活性检测（a₁, a₂和a₃为凝胶过滤色谱组分a， b₁，b₂和b₃为组分b），组分b的滤纸片周围出现抑菌圈，说明组分b具有抗菌活性。由图4可知，添加庆大霉素（标记为“+”）和抗菌三肽样品（标记为“10”）的滤纸片周围出现明显的抑菌圈，而加无菌水（标记为“0”）的滤纸片周围细菌正常生长，表明本发明所述抗菌肽对大肠杆菌有明显的抑制作用。

实施实例3

利用液体生长抑制法检测本发明所述抗三菌肽对细菌的抑制活力，即采用96孔板法测定样品最小抑菌浓度(MIC)，具体操作如下：

菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑单菌落接种于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为10⁴-10⁵ CFU/mL，按每孔100 μL菌液接种于96孔板中，加入10 μL以一定比例稀释后的多肽，将96孔板置于37℃过夜培养，用酶标仪检测630 nm波长的吸光值，结果见表一。

含有抗菌肽的细菌生长浓度(OD₆₃₀)与不加抗菌肽的细菌生长浓度的比值大于90%时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(MIC，定义为显著抑制细菌生长的最低浓度)。

由检测结果可知，该抗菌肽对常见细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌）具有较强的抑菌活力。

表一：韭菜籽抗菌三肽最小抑菌浓度

实施实例4

采用溶血活性评价韭菜籽天然抗菌三肽的毒性，具体操作如下：

新鲜的小鼠血红细胞用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗三次以除去因细胞裂解产生的血红蛋白。5%（V/V）血红细胞悬浮液200μL与等体积的不同浓度的样品溶液混合，在37℃下水浴30 min，然后2000 rpm离心5 min。取100μL上清液于96孔板中，用酶标仪在540 nm处测定光吸收值。以1.0%（V/V）Triton X-100为阳性对照，磷酸盐缓冲液作空白对照。溶血活性的强弱用溶血率的大小表示，计算公式如下所示：

式中，A_样为样品组光吸收值；A_空为空白对照组光吸收值。

检测结果如图7可知，该抗菌肽的溶血活性很弱，在浓度为1 mg/mL时，该抗菌肽的溶血率只为18%，表明该抗菌肽的毒性小。

Claims

1.一种韭菜籽抗菌三肽，其氨基酸序列为Ser-Ala-Asn。

2.一种如权利要求1所述的韭菜籽抗菌三肽，能够抑制常见细菌生长，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

3.一种如权利要求1所述的韭菜籽抗菌三肽的制备方法，其特征在于：从天然韭菜籽中分离纯化或人工合成方法得到。

4.根据权利要求3所述韭菜籽抗菌三肽的制备方法，其特征在于：从天然韭菜籽中分离纯化的具体步骤包括如下：

1）韭菜籽粗提物的制备：韭菜籽经粉碎，按质量体积比1：10加入体积分数为10%醋酸溶液，超声波辅助提取20 min，再在室温下搅拌提取8 h后，12000 rpm离心10 min，取上清液，冷冻干燥，即为韭菜籽粗提物；

2）分离纯化：取韭菜籽粗提物利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值，收集具有最佳抗菌活性的峰b，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离，RP-HPLC的洗脱梯度为0～5 min，体积分数为5%乙腈；5～40 min，体积分数为5%～30%乙腈梯度洗脱；40-50 min，体积分数为30%乙腈；流速为2.0 mL/min，检测波长214 nm，收集保留时间20.5～21.5min的洗脱峰，冷冻干燥即得所述韭菜籽抗菌三肽。

5.一种如权利要求1所述的韭菜籽抗菌三肽在制备天然食品防腐剂、杀菌剂或杀菌药物中的应用。