CN1374322A - 来自益母草的广谱抗真菌多肽lhafp及其纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种来自中药益母草种子的具有广谱抗真菌的多肽其纯化方法,所获得的抗真菌肽对人畜及植物安全无害,该抗真菌肽以膜结合的方式起作用,靶标微生物难以产生抗耐性,该抗菌肽可通过转基因的手段,使之在植物中高丰度表达,用于植物抗病的基因工程育种,该抗菌肽经纯化后可作药用;所提供的纯化方法可以从众多的植物种子蛋白中,分离出多种抗菌肽,该方法省去了其它种子抗真菌肽纯化方法中的加盐处理、硫铵沉淀及分子筛层析等步骤,减少了样品的损失,使得率提高。该抗菌肽对多种植物病原真菌、酵母、革兰氏阳性和阴性细菌均有明显抑制作用,这对LHAFP迅速应用于农业、食品、轻工和医学领域将具有重要价值。

Description

来自益母草的广谱抗真菌多肽LHAFP及其纯化方法

技术领域：本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自中药益母草种子的具有广谱抗真菌的多肽其纯化方法。

背景技术：中药是我国医药经济中独具特色的重要组成部分。随着医药市场的持续增长，植物药市场的规模在快速增长，加之当今疾病谱和医疗模式的根本性变化，以及对化学药物的毒副作用认识加深，人们自我保健意识增强，中医药已被越来越多的国家所认同，各国竞相应用现代科技手段从传统药物中寻找新药或药物先导化合物。世界各国对植物药的研究开发，必将形成全球的一个新的经济增长点(肖培根，2000)。然而，目前对于中药的研究还主要停留在复方或复合成分上，对于药用植物的有效成分研究不多，仅有青蒿素等少数单一有效成分得到深入研究和开发。这就势必限制对中药材植物这一宝贵资源的利用与发掘。

病原真菌是一类广泛寄生于植物、动物和人类的病原微生物。近年来，由真菌引起的无免疫应答性疾病逐年增多，且很多这类病人由于没有临床有效的药物而失去生命。令人欣慰的是，近年发现的天然产生的抗真菌肽有着巨大的潜力(Selitrennikofe，2001)。抗菌肽是一类由生物产生的具有抗菌活性的多肽，广泛分布于植物、动物和微生物中。就其作为抗菌药物而言，优势十分明显：1)潜在资源十分丰富，大量先导结构尚待发现。2)抗菌肽大多具有广谱抗菌活性，或抗细菌、或抗真菌、或两者皆抗，且对病毒、原虫、癌细胞及爱滋病毒(HIV)也有作用(Selitrennikoff，2001)。3)抗菌机制独持，多以在膜上形成孔道导致细胞内容物泄漏的方式摧毁病原菌，因而病原菌难以产生抗性。由于其药用优势明显，国际上以抗菌肽为目标开发新一代抗生素已经成为热点之一(Hancock，1999)。近年来，动物和植物中具有抗真菌活性抗菌肽的陆续发现引起了广泛的兴趣和重视。如从树蛙皮肤中分离出来的Dermaseptins和Temporins，鲎的Tachyplesin，来自果蝇的Drosomycin和Metchnikowin，麻蝇的AFP，刺肩蝽的Thanatin，来自美洲烟叶夜蛾的Heliomicin，小牛嗜中性粒细胞的β-defencin等，从植物种子中分离到的抗真菌肽有洋葱的Cce-AMP1，胭脂花的Mj-AMP-1，-2，大丽花dmAMP1等，这些抗菌肽对丝状真菌或酵母以及一些细菌表现出明显的抑制作用，并对病毒、癌细胞也有抑制作用。目前已有数十种抗菌肽的一级结构及基因序列已被确定并实施专利保护，如来源于蛙类皮肤分泌物的抗菌肽Magainin(马盖宁)和源于人体的抗菌肽Protegin已进入临床试验阶段(胡云龙，1997；Fricker，2002)。

中国在知识产权上专利保护的抗菌肽先导结构很少。在抗菌肽的应用上多采用别国已实行专利保护的抗菌肽基因进行修饰和进行抗病转基因植物研究。益母草是我国的一种传统药用植物，属于唇形科(Labiatae)益母草属(Leonurus)，以全草(包括种子)入药，具有活血调经、利尿消肿之功效(Lee，1991)。而植物在生长发育过程中，面临着各种病原微生物的侵染，植物却很少感病，特别是在种子阶段，多数种子在贮藏和萌发过程中基本不会感染病原菌。因此，从益母草种子中分离纯化出抗真菌肽LHAFP。该抗菌肽对多种植物病原真菌、酵母、革兰氏阳性和阴性细菌均有明显抑制作用，这对LHAFP迅速应用于农业、食品、轻工和医学领域将具有重要价值。

发明内容：本发明的目的在于提供可用于医药、农业和食品工业上的抗真菌多肽及其高效简便的纯化方法。

本发明依次通过以下步骤实现：

1、抗菌肽的粗提：种子经过粉碎，用10mM磷酸缓冲液(pH＝6.0，内含1mMLEDTA，1mM Leupeptin 10mM硫脲)浸提搅拌过夜，检测样品抗真菌活性后得到粗纯品；

2、抗菌肽的纯化：粗纯后样品经过两次SP Sepharose HP离子交换柱，收集有抗真菌活性的部分，再经两次HPLC反向柱层析，得到单一的抗真菌肽活性峰；

3、抗菌肽的氨基酸序列分析：经上述步骤纯化的抗真菌肽表现为HPLC单峰，在SDS-PAGE上为单带，对此样品进行氨基酸序列测定，该抗菌肽由58个氨基酸组成，命名为LHAFP：

AIGCNTVASKMAPCLPYVTGKGPLGGCCGGVKGLIDAARTTPDRQAVCNCLKTLAKSY。

4、抗真菌活性的测定：用绿色木霉为检测抗真菌肽活性的检测菌，5小时后，即可检测出样品是否具有抗真菌活性；

5、抗菌肽基因的克隆：

1)根据对抗真菌肽LHAFP氨基酸序列的测定结果，设计Degeneration引物如下：

Primer 1

5’GCA ATA GGT TG(CT) AA(CT) AC(AGCT) GT(AGCT) GC 3’

Primer 2

5’TAG GAC TTC GCT A(AG)(AGCT) GT(CT) TT(AGCT) A 3’

2)纯化益母草未成熟种子的RNA，通过RT-PCR克隆编码抗真菌肽LHAFP的cDNA，DNA序列分析结果如下，所克隆的基因和氨基酸序列测定结果完全一致：

GCG ATC GGG TGT AAC ACC GTT GCG TCT AAG ATG GCG CCC TGT CTT CCC TAT GTT ACC GGGAAG GGG CCC CTT GGG GGG TGT TGT GGG GGG GTT AAG GGG CTT ATC GAT GCG GCG CGT ACC ACCCCC GAT CGT CAG GCG GTT TGT AAC TGT CTT AAG ACC CTT GCG AAG TCT TAT

本发明的优点是：

1)所获得的抗真菌肽来自于药用益母草，该种植物以全株(包括种子)入药，对人畜及植物安全无害；

2)该抗真菌肽以膜结合的方式起作用，靶标微生物难以产生抗耐性；

3)该抗菌肽可通过转基因的手段，使之在植物中高丰度表达，用于植物抗病的基因工程育种，该抗菌肽经纯化后可作药用；

4)所提供的纯化方法可以从众多的植物种子蛋白中，分离出多种抗菌肽。该方法省去了其它种子抗真菌肽纯化方法中的加盐处理、硫铵沉淀及分子筛层析等步骤，减少了样品的损失，使得率提高。

具体实施方式：

实施例：

                益母草种子100g粉碎研磨成粉

                            ↓500ml 10mM磷酸缓冲液(pH＝6.0，内含1mMEDTA，1mM Leupeptin 10mM硫脲)浸提

                           搅拌过夜

                            ↓3200×g离心30min，收集上清液，并合并沉淀，向沉淀中加入300ml上述提取液搅

                            拌2h

                            ↓

              3200×g离心30min，收集上清液，弃沉淀

                            ↓

                      合并两次收集上清液

                            ↓将HiPrep 16/10 CMFF(Amersham Pharmacia Biotech AB)用上述缓冲液充分平衡后，上样100ml上清液(上清液上样前先经过0.45μm的膜过滤)，充分平衡后用含

     0~1M NaCl上述缓冲液进行梯度洗脱，收集真菌活性部分。

                            ↓

                    合并几次离子交换收集液

                            ↓

                          HPLC纯化色谱柱：Hypersil C8(8×100mm)，15μ(大连依利特公司)洗脱条件：100％流动相A，60分钟内直线梯度变到50％流动相A/50％流动相B流动相：A：0.05％TEA(三氟乙酸)，B：乙腈(含0.05％TFA)检测波长：280nm，流速：2ml/min上样量：上述离子交换收集液5ml

                    合并收集抗真菌活性峰

                            ↓

                  真空浓缩干燥后，超纯水溶解

                            ↓

                          HPLC纯化色谱柱：  Brownlee column 11805 (Perkin公司)活脱条件：100％A→50min→35％B/75％A流动相与检测波长：同上流速：0.5ml/min上样量：100μl(2.5μg/μl)

                合并收集抗真菌活性峰

                        ↓

     真空浓缩后，超纯水充分透析获得纯品(LHAFP)

Claims (2)

1、一种来自益母草的广谱抗真菌多肽LHAFP，其特征在于具有如下的氨基酸序列：

GCG ATC GGG TGT AAC ACC GTT GCG TCT AAG ATG GCG CCC TGT CTT CCC TATGTT ACC GGG AAG GGG CCC CTT GGG GGG TGT TGT GGG GGG GTT AAG GGG CTT ATCGAT GCG GCG CGT ACC ACC CCC GAT CGT CAG GCG GTT TGT AAC TGT CTT AAG ACCCTTGCGAAGTCTTAT

2、一种来自益母草的广谱抗真菌多肽LHAFP的纯化方法，其特征在于依次包括下列步骤：

(1)抗菌肽的粗提：种子经过粉碎，用10mM磷酸缓冲液(pH＝6.0，内1mMEDTA，1mM Leupeptin 10mM硫脲)浸提搅拌过夜，检测样品抗真菌活性后得到粗纯品；

(2)抗菌肽的纯化：粗纯后样品经过两次SP Sepharose HP离子交换柱，收集有抗真菌活性的部分，再经两次HPLC反向柱层析，得到单一的抗真菌肽活性峰；

(3)抗菌肽的氨基酸序列分析：经上述步骤纯化的抗真菌肽表现为HPLC单峰，在SDS-PAGE上为单带，对此样品进行氨基酸序列测定，该抗菌肽由58个氨基酸组成，命名为LHAFP：

AIGCNTVASKMAPCLPYVTGKGPLGGCCGGVKGLIDAARTTPDRQAVCNCLKTLAKSY。

(4)抗真菌活性的测定：用绿色木霉为检测抗真菌肽活性的检测菌，5小时后，即可检测出样品是否具有抗真菌活性；

(5)抗菌肽基因的克隆：

①根据对抗真菌肽LHAFP氨基酸序列的测定结果，设计Degeneration引物如下：

Primer1

5’GCA ATA GGT TG(CT)AA(CT)AC(AGCT)GT(AGCT)GC  3’

Primer2

5’TAG GAC TTC GCT A(AG)(AGCT)GT(CT)TT(AGCT)A 3’

②纯化益母草未成熟种子的RNA，通过RT-PCR克隆编码抗真菌肽LHAFP的cDNA，DNA序列分析结果如下，所克隆的基因和氨基酸序列测定结果完全一致：

GCG ATC GGG TGT AAC ACC GTT GCG TCT AAG ATG GCG CCC TGT CTT CCC TATGTT ACC GGG AAG GGG CCC CTT GGG GGG TGT TGT GGG GGG GTT AAG GGG CTT ATCGAT GCG GCG CGT ACC ACC CCC GAT CGT CAG GCG GTT TGT AAC TGT CTT AAG ACCCTT GCG AAG TCT TAT