CN101386640A - 金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF变异体cathelicidin-BF15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金环蛇抗菌肽cathelicidin－BF变异体cathelicidin－BF15及其应用，属于生物医学领域。金环蛇抗菌肽cathelicidin－BF变异体cathelicidin－BF15是一种直链多肽，含有15个氨基酸残基，分子量1939.47Da，等电点12.05。cathelicidin－BF15全序列为：缬氨酸－赖氨酸－精氨酸－苯丙氨酸－赖氨酸－赖氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－精氨酸－赖氨酸－亮氨酸－赖氨酸－赖氨酸－丝氨酸－缬氨酸。cathelicidin－BF15具有强烈的杀菌作用，对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用，此外具有结构简单，人工合成方便和广谱抗菌等有益特点。

Description

金环蛇抗菌肽cathelicidin—BF变异体cathelicidin—BF15及其应用

技术领域：

本发明提供一种金环蛇(Bungarus fasciatus)抗菌肽cathelicidin—BF变异体cathelicidin—BF15及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

Cathelicidin是一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类和鱼类中有发现。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。由于具有如此众多的活性，cathelicidin一直是国际上研究的热点。针对cathelicidin的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。

随着青霉素等传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物，已有的抗生素对这些病原微生物无能为力。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，大多数抗菌肽分子量小于10000Da，带正电，富含疏水碱基，能够形成两亲性的结构。抗菌肽的杀菌机制主要是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。而传统抗生素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。

目前，国外有许多公司正在进行抗菌肽的研究开发，已有多种抗菌肽进入临床试验阶段。如来源于人lactoferrin的hLF-1—1用于治疗骨髓干细胞移植相关的感染，已进入临床II期。来源于非洲爪蟾magainin的MSI-78对糖尿病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床III期试验阶段。来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃疡，已进入临床I期试验。除此之外，一些用于伤口愈合，内毒素感染，肿瘤，病毒感染的抗菌肽也已进入临床试验阶段。

在中国的传统中药和民族医药中，许多蛇类被作为药材而得到广泛的应用，如乌稍蛇，蟒蛇，蝮蛇，金环蛇，银环蛇，眼镜蛇，五步蛇等。蛇全身均可入药，蛇肉具有强壮神经、延年益寿功效，可治疗病后体弱、风痹麻木、关节疼痛等症。蛇胆具有祛风、清热、化痰、明目的功效，主治小儿疳积、痔疮肿痛。蛇胆汁乙醇溶液能有效治疗角膜炎、角膜溃疡、角膜斑翳。以蛇胆汁、川贝母、杏仁为主要原料制成的“蛇胆川贝液”，是目前临床使用方便、疗效显著的止咳祛痰良药，蛇蜕具有祛风定惊、杀虫、退翳消肿、清热解毒的功能，可治目翳、疮疖、痔漏、痄腮、疟疾、小儿惊痫、疥癣、瘰疬等症。蛇毒是目前国际药材市场上十分昂贵的珍奇药材，利用蝮蛇毒制成的注射液，具有明显的抗癌、抗血凝作用。

与此同时，传统中药药物成分的复杂性及其炮制方法的局限性造成药物活性成分不能更好的发挥作用，因而从这些传统药物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化的重要内容之一。迄今为止，国内外学者已经从蛇毒中分离出大量生物活性蛋白及多肽，其中的许多活性多肽具有很好的药物开发前景。

金环蛇属于眼镜蛇科环蛇属，是具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于中国南方各省及东南亚各国。目前关于金环蛇蛇毒蛋白，各种蛋白酶及抑制剂有大量报道，但是关于金环蛇蛇毒中抗菌肽的研究还没有报道。

发明人将本发明的金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF变异体cathelicidin—BF15全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF变异体cathelicidin-BF15编码基因经NCBI基因数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同基因。

发明内容：

本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种具有强烈的抗菌活性的金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF变异体cathelicidin—BF15及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

金环蛇cathelicidin-BF15是金环蛇抗菌肽cathelicidin—BF的一种变异体。cathelicidin-BF15是一种直链多肽，含有15个氨基酸残基，分子量1939.47Da，等电点12.05。cathelicidin-BF15全序列为：缬氨酸—赖氨酸—精氨酸—苯丙氨酸—赖氨酸—赖氨酸—苯丙氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—赖氨酸—亮氨酸—赖氨酸—赖氨酸—丝氨酸—缬氨酸。

金环蛇cathelicidin-BF15的制备方法：

根据分离纯化所得金环蛇抗菌肽cathelicidin—BF氨基酸序列，利用蛋白组学方法设计cathelicidin—BF的突变体cathelicidin—BF15。用自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。合成的cathelicidin—BF15溶于灭菌水，用于活性检测。

本发明的有益效果在于：

根据金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF的氨基酸序列，利用蛋白组学方法设计突变体cathelicidin—BF15，该抗菌肽具有强烈的杀菌作用，对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用，此外具有结构简单，人工合成方便和广谱抗菌等有益特点。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

制备cathelicidin-BF15：

I、cathelicidin-BF15的制备方法：根据分离纯化所得金环蛇抗菌肽cathelicidin—BF氨基酸序列，利用蛋白组学方法设计cathelicidin—BF的突变体cathelicidin—BF15。用自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。

III、纯化的cathelicidin—BF15用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

cathelicidin-BF15是金环蛇抗菌肽cathelicidin—BF的一种变异体。cathelicidin-BF15是一种直链多肽，含有15个氨基酸残基，分子量1939.47Da，等电点12.05。cathelicidin-BF15全序列为：缬氨酸—赖氨酸—精氨酸—苯丙氨酸—赖氨酸—赖氨酸—苯丙氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—赖氨酸—亮氨酸—赖氨酸—赖氨酸—丝氨酸—缬氨酸。

cathelicidin-BF15药理实验：

1.cathelicidin-BF15抗菌活性检测

挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于MH固体培养基平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加一定浓度的cathelicidin-BF15样品溶液10μl，于37℃倒置培养18—20小时，观察抑菌圈形成与否。

2.cathelicidin-BF15最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定：

试验菌株接种到MH液体培养基中，37℃振荡培养到对数生长期，用新鲜MH液体培养基稀释到2×10⁵cfu/ml。

在1.9mL培养基中加入经0.22μm孔径膜过滤的一定浓度的cathelicidin—BF15样品0.1mL作为第一管，混匀后取1mL加入第2管，依次倍比稀释，自第9管吸出1mL弃去，第10管系对照管，如表：

表.稀释方法

向各管中加入已稀释好的菌液0.05mL，混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表1所示。

表1.抗菌活性对比

MIC：最小抑菌浓度，BF：cathlicidin-BF，BF-15：cathlicidin-BF15，Amp：氨苄青霉素，

Ben：注射用青霉素纳，ICS：注射用亚胺培南—西司他丁钠，ND：未检测到活性，-：未实验，IS：临床分离株，DR：氨苄青霉素和青霉素耐药菌株。以上结果为三次独立重复实验平均值。

由表1可见，cathelicidin—BF15对多数试验菌株都具有较强的抗菌活性，尤其是对革兰氏阴性细菌都具有强的杀菌作用，而对大多数革兰氏阳性菌作用不明显。此外，cathelicidin—BF15还具有强的抗真菌活性，对白色念珠菌ATCC2002和毕赤酵母的最小抑菌浓度分别达到18.7μg/ml和9.4μg/ml。

Claims (2)

1、金环蛇抗菌肽cathelicidin—BF变异体cathelicidin—BF15，其特征在于cathelicidin—BF15是一种直链多肽；含有15个氨基酸残基，分子量1939.47Da，等电点12.05；cathelicidin-BF15全序列为：缬氨酸—赖氨酸—精氨酸—苯丙氨酸—赖氨酸—赖氨酸—苯丙氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—赖氨酸一亮氨酸—赖氨酸—赖氨酸—丝氨酸—缬氨酸。

2、权利要求1所述的金环蛇抗菌肽cathelicidin—BF变异体cathelicidin—BF15，其特征在于变异体cathelicidin—BF15作为制备广谱抗菌药物的应用。