CN110151761B

CN110151761B - 一种替代抗生素的药物--褪黑素抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的应用

Info

Publication number: CN110151761B
Application number: CN201910269332.2A
Authority: CN
Inventors: 武琥琮; 刘家奇; 朱国强; 张东; 夏芃芃; 任文凯
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN110151761A

Abstract

本发明提供一种替代抗生素的药物‑‑褪黑素预防患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的应用。脑膜炎型大肠杆菌从番鸭脑脊液中分离鉴定，利用此菌株首次构建3周龄ICR小鼠脑膜炎模型，分别通过神经症状评分，死亡率差异统计，血脑屏障损伤程度，脑膜炎相关炎症因子表达等方面评估小鼠脑膜炎模型的成功构建。以抗生素为参照，分别使用褪黑素和四种联合抗生素处理小鼠，一周后检测脑膜炎小鼠发病的情况，结果显示褪黑素与联合使用抗生素均能降低脑膜炎小鼠的神经症状，提高脑膜炎小鼠存活率，褪黑素促进血脑屏障保持完整性，降低炎症细胞侵入中枢神经系统，经由脑肠轴作用预防小鼠脑膜炎的发病，为预防新生儿脑膜炎疾病提供新的抗生素替代品和治疗策略。

Description

一种替代抗生素的药物--褪黑素抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的应用

技术领域

本发明涉及针对一种替代抗生素的药物--褪黑素(脑白金)抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的应用。本发明进一步提供了用于替代抗生素预防脑膜炎发病的药物及其应用特性，有望为预防脑膜炎的发病提供新的策略。

背景技术

自Vieusseux在1806年首次报道细菌性脑膜炎(bacterial meningitis,BM)以来，该病一直被认为是一种重要的致死性疾病，是人和动物临床颇为关注的中枢神经系统感染。导致细菌性脑膜炎的病原菌有很多，其中由大肠杆菌引起的新生儿脑膜炎的死亡率位居世界前列。致脑膜炎型大肠杆菌主要包括新生儿脑膜炎大肠杆菌(NeonatalMeningitis Escherichia coli，NMEC)和禽致脑膜炎型大肠杆菌(Avian meningitisEscherichia coli， APEC)。APEC属于肠道外致病性大肠杆菌，其禽类感染谱的广泛性和造成动物生产经济损失的严重性已引起业界高度关注。最近Tivendale等试验证明APEC也可引起包括人在内的哺乳动物疾病，表明APEC病原的感染宿主扩大，正在考虑是重要的人兽共患病的潜在病原体。相关研究证明，APEC的某些菌株与NMEC极为类似，具有专嗜神经组织的特性，临床表现以站立不稳、运动失调等神经症状为特征，且与常规APEC菌株的临床症状不同。APEC的致病过程包括：细菌存活在血液大量增殖引起菌血症；增加血脑屏障渗透性从而穿过血脑屏障，侵入中枢神经系统；最终导致中枢神经系统损伤，引起脑膜炎。

虽然20世纪30、40年代随着抗生素的发现和临床应用，其病死率有所下降，但其死亡率和愈后神经系统后遗症的发生率仍相当高。国内外学者一直对细菌性脑膜炎及其脑损伤进行研究探讨，但到目前为止其病理和致病机制还有待系统和深入诠释。预防脑膜炎发病主要存在如下几个问题：新生儿血脑屏障未发育完全，因此会有病原菌侵入脑内，需寻找能够促进血脑屏障发育并有预防作用的药物；抗生素的大量或过度使用会导致机体肠道菌群混乱，引起机体代谢和免疫力下降，还会造成细菌耐药性的产生；因此寻找更为有效的替代抗生素的药物至关重要。

褪黑素首次是在松果体中发现，具有调节生物节律的作用。目前发现，褪黑素已在生物体其他组织中均有分泌，具有多种功能：包括提高免疫力，改善肠道菌群种类和丰度，抗炎抗氧化等；能够自由通过血脑屏障，且目前的研究未发现有副作用；具有预防和治疗的作用，在体外杀菌实验中，已证明褪黑素能够抑制革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌和沙门氏菌)的生长，具有良好的杀菌作用。本实验中，褪黑素能够发挥与多种抗生素联合使用时相同的杀菌作用，可以解决长期大量使用抗生素的弊端。由于抗生素不能阻断细菌溶解释放出的毒性物质(如内毒素)诱导产生的炎症反应，同时裂解细菌体内释放大量内毒素，促使病情持续恶化，而褪黑素用药时间短，且能够抑制细菌毒素诱导的炎症反应，发挥抗氧化、抗凋亡等作用，有效缓解或降低疾病造成的组织损伤和死亡。

研究表明，褪黑素能够通过调节肠道微生物菌群降低肥胖和脂肪肝。然而，褪黑素替代抗生素预防APEC XM-TW感染小鼠的脑膜炎发病的保护作用未见报道，并且通过调节肠道微生物来预防脑膜炎小鼠发病也尚未见相关报道，因此本研究具有创新性、先进性和应用性，为预防脑膜炎疾病提供新的思路和技术手段。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明主要目的在于提供一种替代抗生素的新药物-褪黑素(脑白金)，开发褪黑素的新的应用方向，寻找能够预防脑膜炎型大肠杆菌病原感染，减弱脑膜炎发病造成的血脑屏障损伤和中枢神经系统炎症反应的有效药物，本发明提供了褪黑素作为抗生素替代品，用于预防脑膜炎疾病和改善肠道菌群的潜在应用前景。

本发明另一目的在于提供一种小鼠脑膜炎模型，通过脑膜炎病症指标的评估，作为探究抵抗脑膜炎疾病的模型和研究平台。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一种替代抗生素预防脑膜炎发病的药物，其特征在于：所述替代抗生素预防脑膜炎发病的药物为褪黑素，其溶解、浓度和处理时间分别为：酒精溶解，30mg/kg(即每天针对每公斤的实验小鼠注射30mg褪黑素)，腹腔注射处理一周。

褪黑素在替代抗生素抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染药物中的用途，所述褪黑素浓度为30mg/kg，酒精溶解，通过腹腔注射的方式处理一周。

脑膜炎型大肠杆菌为从发病番鸭脑脊液中分离的APEC TW-XM菌株，该禽致脑膜炎型大肠杆菌分离株，分类命名为禽致病性大肠杆菌Avian pathogenic Escherichia coliTW-XM(APEC TW-XM)。

抗生素对照组为氨苄青霉素(1g/L)、链霉素(1g/L)、庆大霉素(1g/L)、万古霉素(0.5g/L)四种联合使用，添加于饮水中，经由饮水的方式喂食一周，且饮水每日更换。

所述脑膜炎动物模型为3周龄ICR SPF级小鼠。

所述脑膜炎模型为APEC TW-XM感染3周龄ICR小鼠引起的脑膜炎模型。

脑膜炎型大肠杆菌APEC TW-XM感染3周龄ICR小鼠脑膜炎模型的构建方法，其特征在于，所述脑膜炎型大肠杆菌APEC TW-XM于发病番鸭脑脊液中分离鉴定；所述的3 周龄小鼠为刚断奶的ICR小鼠，通过腹腔注射的方式使得3周龄小鼠感染脑膜炎型大肠杆菌APEC TW-XM。

不同感染菌量(CFU＝10⁷，CFU＝10⁸，CFU＝10⁹)的APEC TW-XM感染小鼠死亡速度按剂量由小到大依次增加。

APEC TW-XM感染小鼠后出现明显的神经症状，如神经萎靡、角弓反张等。

APEC TW-XM感染小鼠后血脑屏障的紧密连接蛋白表达量降低，即血脑屏障的完整性降低。

APEC TW-XM感染小鼠后脑内炎症因子TNF-α表达量升高15倍，iNOS表达量升高 23倍，IL-1β表达量升高2000多倍，IL-6表达量升高3000多倍。

所述的一种替代抗生素预防APEC TW-XM感染3周龄ICR小鼠后的血脑屏障破坏和中枢神经系统损伤的药物，为褪黑素。

一种替代抗生素的药物--褪黑素在制备抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的药物中的应用，褪黑素补充方式为腹腔注射(与饮水方式给药相比保护力更佳)，四种联合抗生素补充方式为饮水方式，APEC TW-XM感染菌量10⁷CFU，感染方式为腹腔注射。

褪黑素和四种联合抗生素均能降低APEC TW-XM感染小鼠后出现的神经萎靡、角弓反张等神经症状。褪黑素和参照药物四种联合抗生素一样，均能缓解APEC TW-XM感染小鼠后造成的血脑屏障完整性降低。褪黑素和四种联合抗生素均能降低APEC TW-XM感染小鼠后引起的脑内炎症因子表达量升高。褪黑素可以通过调节肠道微生物菌群来预防 APECTW-XM对小鼠的感染，降低死亡率，减少对血脑屏障完整性的破坏。

本发明通过综合测试脑膜炎发病的指标确定脑膜炎模型构建成功。研究结果显示，感染模型出现多种神经症状，如精神萎靡，角弓反张，抽搐；血脑屏障完整性破坏，如紧密连接蛋白表达量降低，Evans blue染料侵入脑内；中枢神经系统发生炎症反应，如IL-1β， IL-6，TNFα表达量显著升高。

本研究通过检测褪黑素预防脑膜炎发病的几项指标包括：

(1)褪黑素能够显著降低小鼠脑膜炎出现的神经症状及致死率；

(2)褪黑素能够显著降低血脑屏障完整性的破坏；

(3)褪黑素能够显著降低中枢神经系统的炎症因子表达及炎症细胞的侵入；

(4)褪黑素能够通过调节肠道微生物预防脑膜炎疾病的发病。

相对于现有技术，本发明的有益效果：本发明探索出了褪黑素新的用药前景，开拓了一个新的应用领域，明确褪黑素对细菌型脑膜炎的预防效果，具有高效防御APEC TW-XM诱发的细菌型脑膜炎，同时调节肠道菌群的分布和丰度，经由脑肠轴，显著降低中枢神经系统的炎症反应，降低炎症因子的表达和炎症细胞的侵入，降低脑膜炎小鼠的死亡率和组织损伤。

附图说明

图1APEC TW-XM感染3周龄小鼠后出现脑膜炎神经症状图。

图2APEC TW-XM感染3周龄小鼠，测试不同感染菌剂量存活率结果图；*p＜0.05，**p＜0.01。

图3APEC TW-XM感染3周龄小鼠后，利用Evans blue染色检测血脑屏障完整性结果图。

图4APEC TW-XM感染3周龄小鼠后，利用荧光定量检测脑内紧密连接蛋白和炎症因子表达情况结果图；*p＜0.05，**p＜0.01。

图5褪黑素处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，褪黑素增加脑膜炎小鼠存活率结果图；*p＜0.05，**p＜0.01。

图6褪黑素处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，褪黑素降低脑膜炎小鼠脑内载菌量结果图；*p＜0.05，**p＜0.01。

图7褪黑素处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，利用Evans blue 染色检测褪黑素缓解脑膜炎小鼠血脑屏障完整性破坏的结果图。

图8褪黑素处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，褪黑素缓解脑膜炎小鼠脑内炎症因子的表达结果图；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图9褪黑素处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，褪黑素降低脑膜炎小鼠脑内炎症细胞侵入中枢神经系统的结果图。

图10褪黑素与抗生素共同处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，脑膜炎小鼠神经症状评分结果图；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图11褪黑素与抗生素共同处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，脑膜炎小鼠的存活率结果图；*p＜0.05，**p＜0.01。

图12褪黑素与抗生素共同处理3周龄ICR小鼠一周后，APEC TW-XM感染小鼠，利用Evans blue染色检测血脑屏障完整性结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1：

1.主要药物及试剂

褪黑素(melatonin，MT)，购自Sigma公司，美国；福尔马林、PBS、DAB试剂、苏木素、伊红、蒸馏水。胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)均购自Oxoid 公司；氯化钠(NaCl)、柠檬酸氢二胺(C₆H₁₄N₂O₇)、乙酸钠(CH₃COONa)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、硫酸镁(MgSO₄)、硫酸锰(MnSO₄)等分析试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；麦康凯琼脂购自海博公司；链霉素、氨苄西林、庆大霉素、万古霉素均购自索莱宝公司；EVANS BLUE染色剂、葡萄糖(Glucose)购自Sigma公司；Faststart Universal SYBR GREEN Master(ROX)荧光定量试剂盒购自Roche公司；石蜡、载玻片、盖玻片、生理盐水、1mL注射器购自必邦公司；其余常规试剂均为国产分析纯试剂。

2.主要仪器

超净工作台购自苏州净化设备有限公司；荧光定量PCR7500均购自ABI公司；组织研磨仪购自上海净信公司；台式冷冻离心机及移液器均购自Eppendorf公司； OLYMPUS光学显微镜(日本)，解剖器械一套。

3.菌株

APEC TW-XM来自南京农业大学，参考文献如下：

[1]Ma J,Bao Y,Sun M,et al.Correction for Ma et al.Two Functional TypeVI Secretion Systems in Avian Pathogenic Escherichia coli Are Involved inDifferent Pathogenic Pathways.[J]. Infection&Immunity,2015,83(8):3340.。

[2]Hejair H M,Zhu Y,Ma J,et al.Functional role of ompF and ompCporins in pathogenesis of avian pathogenic Escherichia coli.[J].MicrobPathog,2017,107:29-37.

[3]Hejair H M A,Ma J,Zhu Y,et al.Role of outer membrane protein T inpathogenicity of avian pathogenic,Escherichia coli[J].Research in VeterinaryScience,2017,115:109-116.

专利申请人保证从申请日起二十年内向公众发放该生物材料。

4.实验动物

SPF级ICR小鼠，雄性，体重12～15g，3周龄，由扬州大学比较医学中心提供。喂养条件如下：10只一笼，室温18～20℃，湿度50～60％，通风良好，自由摄食进水。实验过程中对ICR小鼠的处置方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物指导性意见》。

5.实验方法

(1)APEC TW-XM菌株的准备

首先从保种管中复苏细菌，四区划线于LB固体平板中，37℃培养箱过夜培养，翌日，挑取单菌落于液体LB培养基培养16小时，然后按照细菌与培养基1:100的比例将菌液转接到液体LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝1时，收集菌液，用PBS将细菌悬浮洗涤 2遍，并用生理盐水重悬，倍比稀释成cfu＝10⁹，cfu＝10⁸，cfu＝10⁷，用于试验小鼠攻毒。

(2)脑膜炎小鼠动物模型的构建

将小鼠随机分为四组，三组感染组，一组对照组，每组15只。

通过腹腔注射的方式将cfu＝10⁹，cfu＝10⁸，cfu＝10⁷以100μl体积攻入小鼠腹腔中。观察小鼠发病症状及死亡情况。

(3)样品收集

攻菌感染后，每组选5只小鼠在发病未死前通过尾静脉注射100μL Evans blue(4％溶于生理盐水，4μL/g)，然后统一在12h时收集脑组织；以及未注射Evans blue的小鼠脑组织。

渗透性检测(EB染色)：

小鼠灌注后，采集同一部位同等质量的脑组织，研磨均匀，加入500μL PBS并离心，取上清液加入三氯乙酸(TCA)4℃过夜。再离心45min，13000rpm/min。在波长620nm 检测EB含量。

炎症因子的检测：

采取Trizol发提取脑组织RNA，具体步骤如下：将组织放于冰液氮预冷好的研钵中，加入液氮，快速用研钵棒将组织磨碎，收集到无RNA酶的EP管中，加入1mL TRIZOL 裂解液涡旋振荡，室温孵化3min后加入300μL氯仿涡旋振荡，至于RNA专柜孵化3min 后，置于4℃，12000r/min离心机离心15min。吸取上层水相液体至1mL无RNA酶的 EP管，加入2倍体积的异丙醇，轻柔颠倒几次，放入-20℃冰箱中沉淀20min；然后置于4℃，12000r/min离心机离心10min，去上清，待其自然干燥。用30μl经DPFC处理过的无RNA酶的超纯水溶解，用Nanodrop2000分光光度计测量提取的RNA纯度和浓度。

按照TIANGEN公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒上提供的方法进行：建立如下(表1，包括表1-1和表1-2)反应体系，混匀后置于PCR仪：

表1-1.一步法去除基因组DNA和RNA反转录反应

表1-2反转录反应条件

按照Vazyme Biotech公司的2×AceQ qPCR SYBR Green试剂盒上提供的方法进行：建立如下(表2，包括表2-1和表2-2以及表2-3)反应体系，混匀后置于PCR仪：

表2-1.qRT-PCR反应体系

表2-2.qRT-PCR反应条件

表2-3.引物序列：

以上序列从上至下为SEQ ID NO.1-18。

实施例2

(1)APEC TW-XM菌株的准备

首先从保种管中复苏细菌，四区划线于LB固体平板中，37℃培养箱过夜培养，翌日，挑取单菌落于液体LB培养基培养16小时，然后按照细菌与培养基1:100的比例将菌液转接到液体LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝1时，收集菌液，用PBS将细菌悬浮洗涤2遍，并用生理盐水重悬，倍比稀释成cfu＝10⁷，用于小鼠感染。

(2)褪黑素预防脑膜炎小鼠发病的实验

将小鼠随机分成四组，(NS)组6只、melatonin(MT)组6只、APEC TW-XM(A) 组26只(10只-细菌计数，6只-病理切片，10只用于统计存活率)、APEC TW-XM+melatonin(A+MT)组26只(10只-细菌计数，6只-病理切片，10只用于统计存活率)；30mg/kg的褪黑素，预处理1周；一周后，选择APEC TW-XM OD600＝1时的状态，然后稀释到cfu＝1×10⁷/只，进行攻毒，褪黑素预处理和攻毒均采取腹腔注射的途径。

12h时，选择6只尾静脉注射Evans blue(4％溶于生理盐水，4μL/g)，1h后，对小鼠进行深度麻醉，心脏灌注50mL冰浴的含有100U/mL肝素的生理盐水。再取脑组织然后称重。

(3)样品收集

细菌计数：

将小鼠安乐死并分离组织，收集同一部位同等质量的脑，无菌操作，利用PBS进行10倍倍比稀释涂布在麦康凯平板上，18h后统计细菌数。

渗透性检测(EB染色)：同实施例1。

炎症因子的检测：同实施例1。

病理切片的制作：

脑组织固定：将脑组织冲洗干净，置于福尔马林(由水配置4％甲醛)溶液中，组织体积：福尔马林比例为1:20，浸泡48h；

脑组织冲洗：将脑组织置于流水下冲洗2h；

脑组织脱水：将冲洗干净后的脑组织室温下分别通过70％乙醇(12h)、80％乙醇(3h)、95％乙醇Ⅰ(2h)、95％乙醇Ⅱ(2h)、100％乙醇Ⅰ(1.5h)、100％乙醇 Ⅱ(1.5h)、二甲苯Ⅰ(5min)、二甲苯Ⅱ至透明；

脑组织浸蜡：蜡Ⅰ(1.5h)、蜡Ⅱ(1.5h)；

脑组织包埋：将融好的纯蜡倒入蜡盒中，再将脑组织放入蜡中，待蜡凝固后，插入标签，用刀切开，放入-20℃冰箱，过夜；

切片、展片、烤片：将蜡块修整成梯形，用石蜡切片机将样品切成厚度为4μm 的连续切片，正面放入约为45℃水浴中展片，利用防脱片收集组织。常温防止24h，将玻片放入烤箱(60℃)内烘烤至少2h。

苏木素-伊红染色(HE染色):石蜡切片经二甲苯Ⅰ(10min)、二甲苯Ⅱ(10min)、无水乙醇Ⅰ(1min)、无水乙醇Ⅱ(1min)、90％乙醇Ⅰ(1min)、80％乙醇Ⅰ(1min)、 70％乙醇Ⅰ(1min)、流水冲洗3min、苏木精(5min)、流水冲洗3min、1％盐酸酒精分化(20s)、流水冲洗(5min)、0.5％氨水(1min)、流水冲洗(3min)，伊红(40s)，流水冲洗至(至不变色)。

再进行脱水、透明；

用吸水纸擦去多余二甲苯，在湿润情况下滴加中性树脂，加上盖玻片封片。

置于显微镜下观察脑组织病变情况。

实施例3

(1)APEC TW-XM菌株的准备

同实施例2。

(2)褪黑素调节肠道菌群预防脑膜炎发病实验

将小鼠随机分成四组，APEC TW-XM组：每天腹腔注射100μl的生理盐水；每天更换无菌水；A+MT组：每天腹腔注射100μl的30mg/kg的MT；每天更换无菌水； A+抗生素组：每天腹腔注射100μl的生理盐水；每天更换含抗生素的无菌水；A+抗生素+MT：每天腹腔注射100μl的30mg/kg的MT；每天更换含抗生素无菌水；处理一周后，第8天进行攻菌(cfu＝10⁷)，收集样品。

(3)样品收集

渗透性检测(EB染色)：同实施例1。

炎症因子的检测：同实施例1。

病理切片的制作：同实施例2.

说明书附图图注：

图1：APEC TW-XM感染小鼠神经症状图

APEC TW-XM感染3周龄小鼠，在12h时出现明显的神经症状，小鼠精神萎靡，抽搐，持续角弓反张直至死亡，证明APEC TW-XM能够导致小鼠脑膜炎的发病。

图2：APEC TW-XM感染小鼠后存活率结果图

不同细菌量感染小鼠后，细菌量cfu＝10⁹组在5h开始出现死亡，5h死亡1只，6h死亡1只，7.5h死亡1只，10h死亡1只，12h死亡1只，13h死亡1只，15h死亡2只，直至18h，10只小鼠全部死亡；细菌cfu＝10⁸组在8h开始出现死亡，8h死亡2只，10h 死亡3只，11h死亡1只，12h死亡2只，直至17h全部死亡；细菌量cfu＝10⁷组在10h 开始出现死亡，10h死亡2只，11h死亡1只,12h死亡4只，14h死亡1只，仅剩两只老鼠存活。证明APEC TW-XM能够导致小鼠死亡。

图3：APEC TW-XM感染小鼠后Evans blue染色血脑屏障完整性结果图

APEC TW-XM感染3周龄小鼠，在10h时出现神经症状时，通过尾静脉注射100μLEvansblue(4％浓度EB)，12h收集脑组织，对照组未染上EB染料，APEC XM感染组小鼠脑内染上了EB染料，证明APEC感染小鼠后破坏小鼠的血脑屏障完整性。

图4：APEC TW-XM感染小鼠后脑内紧密连接蛋白和炎症因子表达结果图

APEC TW-XM感染3周龄小鼠，在12h时收集脑组织，利用荧光定量PCR技术检测脑内紧密连接蛋白和炎症因子表达，结果显示，感染组相对对照组，其紧密连接蛋白 β-catetin、claudin-5、ZO-1表达显著降低，降低倍数分别为17倍、2.4倍和2.7倍，紧密连接蛋白抑制蛋白snail-1表达显著升高，升高5.1倍，说明大脑紧密连接性降低，屏障受到破坏；感染组相对对照组，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS表达显著升高，升高分别为16倍、2500倍、3500倍和25倍。说明APEC TW-XM能够引起小鼠脑内严重的炎症反应。

图5：褪黑素增加APEC TW-XM感染脑膜炎小鼠存活率结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在12h时收集脑组织，结果显示，褪黑素处理的APEC TW-XM感染组的存活率显著高于APEC TW-XM感染组，高达9倍。说明褪黑素能够预防APEC TW-XM感染小鼠所导致脑膜炎的发病。

图6：褪黑素降低脑膜炎小鼠脑内载菌量结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在12h时收集脑组织，结果显示，褪黑素处理的APEC TW-XM感染组的脑内载菌量显著低于APEC TW-XM 感染组，降低倍数约为15倍。说明褪黑素能够阻断并抑制APEC TW-XM侵入小鼠脑内和细菌定植在脑内。

图7：褪黑素增加脑膜炎小鼠血脑屏障完整性结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在10h时通过尾静脉注射100μL Evans blue染料(4％EB)，12h时收集脑组织，结果显示，褪黑素处理的APEC TW-XM感染组小鼠脑内染色程度显著低于APEC TW-XM感染组，说明褪黑素处理组能够保护小鼠血脑屏障的完整性，防御细菌侵入脑内，降低小鼠脑膜炎发病率。

图8：褪黑素降低脑膜炎小鼠脑内炎症因子的表达结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在12h时收集脑组织，利用荧光定量PCR技术检测脑内炎症因子表达，结果显示，褪黑素处理的APEC TW-XM感染组小鼠脑内炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS与APEC TW-XM感染组比较，表达显著降低，分别为3.3倍、2倍、2.5倍和2.8倍。说明褪黑素能够显著预防APEC TW-XM感染引起小鼠脑内的严重炎症反应。

图9：褪黑素降低脑膜炎小鼠脑内炎症细胞侵入中枢神经系统结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在12h时收集脑组织，利用荧光定量PCR技术检测脑内炎症因子表达，结果显示，褪黑素处理的APEC TW-XM感染组小鼠脑内炎症细胞与APEC TW-XM感染组比较，侵润脑内显著降低，说明褪黑素能够显著预防APEC TW-XM感染引起小鼠脑内的严重炎症反应。

图10：感染小鼠神经症状评分结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在12h时收集脑组织，结果显示，褪黑素处理的APEC TW-XM感染组小鼠与抗生素处理的APEC TW-XM 感染组小鼠比较，神经症状评分结果说明褪黑素与抗生素均能够显著预防APEC TW-XM 感染引起小鼠脑膜炎发病神经症状的产生，神经症状评分均低于感染组和褪黑素与抗生素共处理组的2倍。

图11：褪黑素通过调节肠道微生物增加脑膜炎小鼠存活率结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在12h时收集脑组织，结果显示，褪黑素处理的APEC TW-XM感染组小鼠与抗生素处理的APEC TW-XM 感染组小鼠比较，存活率均显著高于APEC TW-XM感染组和褪黑素与抗生素共同处理的感染组，高达5倍。而褪黑素在抗生素处理后的感染组中未发挥预防保护的作用。结果说明褪黑素通过调节肠道微生物提高脑膜炎小鼠存活率。

图12：褪黑素通过调节肠道微生物增加脑膜炎小鼠血脑屏障的完整性结果图

利用褪黑素处理3周龄小鼠一周后，APEC TW-XM感染4周龄小鼠，在10h时通过尾静脉注射100μL Evansblue染料(4％EB)，12h时收集脑组织，结果显示，褪黑素处理的APECTW-XM感染组小鼠与抗生素处理的APEC TW-XM感染组小鼠脑内染色程度显著低于APECTW-XM感染组，说明褪黑素处理组和抗生素处理的APEC TW-XM感染组能够保护小鼠血脑屏障的完整性，防御细菌侵入脑内，降低小鼠脑膜炎发病率。

本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种替代抗生素的药物--褪黑素抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的应用

<130> xhx2019040401

<141> 2019-04-04

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaagacg gcacacccac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttgtgctc tgcttgtgag 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcaagagac ttccatccag t 21

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtgaagtagg gaaggccg 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aggcactccc ccaaaagat 19

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgagggtctg ggccatagaa 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtccctcctc tgataccttc ctc 23

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctggcagtgt cattcacatc tttc 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agccacagga ttacaagaa 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccaatgtcca gtccaaga 18

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaagggctca ttgcggtggt tgt 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctcgctgttg gagttcagaa gtgga 25

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccattctcct gctcccact 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tggcactggt atctcttcac a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cagctgggct gtacaaacct t 21

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cattggaagt gaagcgtttc g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggtgaaggtc ggtgtgaacg gatt 24

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gatgccaaag ttgtcatgga tgacc 25

Claims

1.一种替代抗生素的药物--褪黑素在制备抵抗患儿脑膜炎大肠杆菌病原感染的药物中的应用，其特征在于，褪黑素添加方式为腹腔注射；脑膜炎型大肠杆菌APEC TW-XM 感染菌量10⁷CFU以上，感染方式为腹腔注射；褪黑素降低APEC TW-XM感染小鼠后出现的神经症状；褪黑素缓解APEC TW-XM感染小鼠后造成的血脑屏障完整性降低的症状；褪黑素能降低APEC TW-XM感染小鼠后引起的脑内炎症因子表达量升高的情况；褪黑素通过调节肠道微生物菌群来预防APEC TW-XM对小鼠的感染，降低死亡率，减少对血脑屏障完整性的破坏。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褪黑素浓度为30 mg/kg。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褪黑素采用酒精溶解。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褪黑素通过腹腔注射的方式处理一周。