CN116747290A - 一种噬菌体多肽在制备治疗痤疮药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种噬菌体多肽作为活性成分在制备治疗痤疮药物中的应用，该噬菌体多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段或衍生物。本申请所提供的噬菌体多肽，对痤疮丙酸杆菌具有显著的抑制和杀灭作用；通过实验验证表明，该噬菌体多肽具有优异的抗炎、抗菌作用，安全性好，杀菌浓度低且起效快；而且相较于抗生素，在保持与抗生素的效果等同的同时，其给药量少，耐药性低，不破坏皮肤微生物菌群的平衡，安全性更佳，将有助于治疗临床上耐药性痤疮丙酸杆菌所导致的痤疮。

Description

一种噬菌体多肽在制备治疗痤疮药物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种噬菌体多肽在制备治疗痤疮药物的应用。

背景技术

痤疮，也称为寻常痤疮(Acne vulgaris)，是一种常见的皮肤疾病，几乎所有的青少年和成人在其人生的某个阶段都会受到影响。其病因复杂，涉及异常角质化，皮脂生成过多，雄激素功能，细菌生长和免疫超敏反应。虽然上述过程中的一个或多个与痤疮相关，但是导致痤疮损害形成的事件的一种触发因素和确切顺序尚未被完全了解。与痤疮有关的其它因素是自由基的存在以及随后导致细胞损伤的氧化应激。已观察到痤疮通常发生在富含皮脂腺的区域，如面部、颈部和背部。

细菌痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)也与痤疮的发生有很关键的关系。其为驻留在人面部皮肤表面的重要细菌和优势细菌之一。痤疮丙酸杆菌是一种兼性厌氧、生长缓慢的棒状革兰氏阳性菌。其存在于皮脂腺中，且其构成皮肤共生微生物群的重要部分。痤疮丙酸杆菌利用皮脂和来自周围皮肤组织的副产物作为能量和营养源。这导致一些脂肪酸释放，其可以刺激细胞壁并引起炎症，从而导致痤疮或寻常痤疮；寻常痤疮是一种毛囊皮脂腺的慢性炎性病症。几乎所有的青少年在其人生的某个阶段会受到影响，其中15-20％患有中度至重度形式的痤疮。

痤疮已经以多种方式治疗。大多数治疗需要数周至数月才能观察到明显变化。如外用维A酸类、氧化剂类等效果不佳，口服异维A酸类抗痤疮药物副作用大；四环素类抗生素耐药性严重且副作用大；物理方法治疗花费大量时间金钱并且效果不佳；

抗菌肽是一类可由噬菌体、动物、植物内诱导产生的小分子多肽。作为机体的防御因子，抗菌肽具有杀死多种细菌和真菌、抑制部分病毒和寄生性原虫以及选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用。与抗生素通过干扰代谢途径或抑制核酸合成的杀菌机制不同，抗菌肽是通过干扰病菌细胞膜的稳定性，使细胞内容物外泄的方式杀死细菌。这种独特的杀菌方式使病原微生物难以产生抗药性。此外，抗微生物肽还具有无残留毒性、不会产生抗原性等优点，使其在临床和日常应用上具有优越的应用前景。现时已有多种抗菌肽对痤疮丙酸杆菌有显著的抑杀作用，如果蝇来源的天蚕素(crecropin)系列以及一些人工合成的多肽。

专利号201610762435.9公开了一种痤疮丙酸杆菌噬菌体及其应用，该噬菌体可用于拮抗痤疮丙酸杆菌生长，尤其是多重抗生素耐药性的菌株；包括不同宿主痤疮丙酸杆菌株适应的宿主修饰的噬菌体株；可用于寻常痤疮的预防和治疗，以及矫形外科的继发性痤疮丙酸杆菌感染。该噬菌体保藏号：CGMCC No.12669。

但是，痤疮丙烯杆菌噬菌体中是否还有对于抑菌有效的成份及其作用机理仍然知之甚少，本领域有必要进行进一步的研究探索，找到其它有效成分。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种噬菌体多肽在制备治疗痤疮药物的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种噬菌体多肽作为活性成分在制备治疗痤疮药物中的应用，所述噬菌体多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段或衍生物。

在某些具体的实施方式中，所述噬菌体多肽作为有效成分的剂量为200mg/L。

在某些具体的实施方式中，所述噬菌体多肽制成药物制剂，所述药物制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂和气体制剂中任一种。

在某些具体的实施方式中，所述药物制剂还包括药剂学上可接受药用辅料中的任一种或者多种。

在某些具体的实施方式中，所述噬菌体多肽制备施用于皮肤的药物制剂中的应用。

在某些具体的实施方式中，所述噬菌体多肽在预防或制备由痤疮丙酸杆菌感染所引起的疾病药物中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

本申请所提供的噬菌体多肽，用于制备治疗痤疮药物，其对痤疮丙酸杆菌具有显著的抑制作用；通过实验验证表明，该噬菌体多肽具有优异的抗炎、抗菌作用，安全性好，杀菌浓度低且起效快；而且相较于抗生素，在保持与抗生素的效果等同的同时，其给药量少，耐药性低，安全性更佳，将有助于临床上限制抗生素耐药性的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所提供的噬菌体多肽的鉴定图谱；

图2为本发明所提供的噬菌体多肽的抑菌实验结果；

图3为本发明所提供的噬菌体多肽的另一抑菌实验结果；

图4为本发明所提供的噬菌体多肽对细胞的毒性影响结果；

图5为本发明所提供的噬菌体多肽的浓度对痤疮丙酸杆菌的杀菌结果；

图6为本发明所提供的噬菌体多肽对痤疮小鼠模型的结节治疗效果图；

图7为本发明所提供的噬菌体多肽与其它抗生素的治疗效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：噬菌体多肽的制备

1)(宿主菌)痤疮丙酸杆菌的获取

将痤疮患者面部的痤疮脓包用无菌注射器挑破，收集内容物，迅速于无菌操作台内接种于哥伦比亚血培养基上，放置于低氧孵箱中，多次纯化分离获得该菌株，送于陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院临床检验科采用全自动微生物鉴定系统完成细菌鉴定，具体结果如图1所示，确定该菌株是一株痤疮丙酸杆菌。将宿主菌单菌落接种至BHI液体培养基扩增菌液，将一部分菌液与体积分数为50％甘油等比例混合后放置于-80℃冰箱冻存保菌；剩余部分菌液放置于-4℃冰箱备用，每次实验均采用三线法挑选单菌落扩增菌液。

2)痤疮丙酸杆菌噬菌体的分离纯化

取1L医院污水处理中心未经处理的污水备用，采用污水共培养法分离噬菌体。离心去除污水的固体杂质后取上清液100mL、痤疮丙酸杆菌液1mL、BHI液体培养基100mL混合均匀于37℃、180r/min低氧孵箱振荡培养(以后称低氧震荡培养)，以富集污水样本中存在的任何痤疮丙酸杆菌特异性噬菌体。取对数生长期菌液(分光光度计测得波长600nm处OD值为0.3～0.6)与上述混合液混合，再次培养过夜以富集噬菌体。24小时后取10mL共培养物，用超速离心机以10000×g离心10min离心后取上清液，再用滤器过滤掉上清液中的细菌。采用双层琼脂平板法检测过滤后的上清液中是否含有相应的噬菌体，约24小时后若观察到双层琼脂板上有透明噬菌斑形成，则可确定筛选到特异性噬菌体。挑选单个透明噬菌斑再次与宿主菌液共培养，以上实验步骤重复3次以获得纯化的噬菌体；收集最终纯化的噬菌体，命名为噬菌体ΦPaP11-13，储存于4℃冰箱备用。

本申请中的噬菌体多肽的性能测试：

1)噬菌体多肽的抗痤疮丙酸杆菌的测定

取约100mL噬菌体ΦPaP11-13上清液，加入DNA酶Ⅰ、RNA酶A至终质量浓度分别为5μg/mL和1μg/mL，37℃水浴1h，再添加pH值为8.0的乙二胺四乙酸至终物质的量浓度为20mmol/L。向混合物中加入蛋白酶K、十二烷基磺酸钠至终质量浓度分别为50μg/mL和0.05g/L，混匀后，56℃金属浴1h以裂解噬菌体衣壳。然后加入约1mL pH值为8的平衡酚，振荡，5000×g离心10min后收集上层水相。再次加入等体积氯仿抽提并以5000×g离心10min收集上层水相。最后加入约0.6mL异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱过夜，以沉淀噬菌体DNA。次日将混合物在4℃下以12000×g离心20min弃去上清液晾干沉淀。将沉淀用体积分数70％乙醇和无水乙醇分别洗涤1次，在4℃下以10000×g离心10min，弃去乙醇室温晾干。将沉淀溶解在500μL蒸馏水中，制得噬菌体ΦPaP11-13的DNA。使用纳米滴分光光度计测得OD260/OD280＝1.78，提示DNA纯度较高可送于基因序列分析。将噬菌体ΦPaP11-13的DNA送至北京生命之源有限公司，在Illumina NovaSeq PE150平台下进行全基因组测序如SEQ ID NO:1。然后使用NCBI网站的Blastx功能，将核苷酸序列翻译为蛋白质序列，然后在NCBI的GenBank数据库中寻找相似度最高的蛋白质，结果发现13391～14254位碱基编码的为酰胺酶，即该噬菌体多肽(简称裂解多肽)，其序列号为SEQ ID NO:1。

2)噬菌体多肽的抗菌能力测定

细菌的培养：痤疮丙酸杆菌(ATCC6919)在BHI培养基中厌氧条件下生长，菌株在37℃下培养。

菌悬液制备：细菌的浓度测定一般通过麦氏比浊管进行测定，麦氏比浊管浊度在0.5麦氏浊度左右，此时细菌菌落数约为1×10⁸cfu/ml，然后再按1:1000稀释成10⁵-10⁶cfu/ml的痤疮丙酸杆菌菌悬液。

结果如图2和图3所示，通过使用采用肉眼观察法、显微镜观察法和培养法检测噬菌体多肽对痤疮丙酸杆菌的抗微生物活性。

1)肉眼观，如图1所示，将痤疮丙酸杆菌菌悬液与半固体培养基混合后均匀平铺到BHI固体培养基平板上，放置10分钟待半固体凝固后滴入噬菌体多肽溶液5ul和/或10ul(浓度为200mg/L)，待水分蒸发后放置于无氧孵箱中培养约24小时，次日可见平板上滴入噬菌体多肽溶液处出现透明空斑，说明这块细菌死亡，杀菌效果有效。如图2和图3所示，将痤疮丙酸杆菌菌悬液加入液体BHI培养基，其中一瓶加入100ul的噬菌体多肽溶液，放置于无氧孵箱中培养约24小时，次日可见未加入噬菌体多肽溶液的瓶内液体浑浊，加入噬菌体多肽溶液的瓶内液体澄清，说明痤疮丙酸杆菌生长良好，加入噬菌体多肽溶液的瓶内液体的细菌死亡，杀菌有效；

2)显微镜观察：将平板透明空斑外区域与浑浊液体放于显微镜下，发现有较多痤疮丙酸杆菌，但将平板上滴入噬菌体多肽溶液出现的透明空斑和澄清的液体放于显微镜下，发现无细菌生长，说明细菌死亡，杀菌有效，效果非常好；

3)培养法：取下平板处透明空斑和澄清的液体，分别接种于BHI培养基中，置于无氧孵箱中培养过夜，次日发现无细菌生长，说明加入的样本中的细菌已全被杀死，该多肽的杀菌效果好。

3)噬菌体多肽的抗炎症的研究

(1)为了研究噬菌体多肽对痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤病的抗炎作用，本发明通过使用痤疮丙酸杆菌处理的炎性动物模型监测动物皮损、炎症因子以及细胞载量的变化来验证该肽的抗炎作用。

取实验大鼠随机分为3组，每组3只大鼠，分别为A组：空白透明质酸凝胶治疗组；B组：透明质酸+四环素治疗；C组：透明质酸+噬菌体多肽治疗；其中四环素类治疗采用四环素抗生素，为痤疮治疗指南的一线用药，实验采用四环素抗生素使用说明书的推荐浓度，噬菌体多肽使用浓度为200mg/L；在所有实验大鼠背部注射痤疮丙酸杆菌，24h可见大鼠背部已形成痤疮结节，遂开始治疗，A组给空白透明质酸，B组给四环素+透明质酸，C组给噬菌体多肽+透明质酸，其中凝胶给药方式为涂抹给药。72小时后，通过颈脱位处死动物进行比较；通过肉眼观察上述A组、B组和C组可知，与A组相比B、C组皮损直径平均缩小95％；说明C组能达到与B组相似的疗效。通过取皮损处组织进行细菌载量的测试，发现A组细菌载量降为平均3.4×10⁶，B组细菌载量降为2.8×10²，C组细菌载量降为2.5×10²。(具体测细菌载量的方法：分别在各组小鼠皮损中心处取同样质量的皮损，5g，将该样本研磨成匀浆，分别放置于生理盐水中浸泡，再采用超声波震荡仪进行震荡10min，然后过滤，将滤液进行双层琼脂板法测细菌滴度。此实验于无菌超净台内操作。将平板放置于无氧孵箱中约72小时后可计算平板上的菌落数量，以此来计算细菌载量，计算方法为：平板上的菌落数量÷稀释的倍数÷加入平板的样本体积)。

综上所述，该噬菌体多肽对痤疮丙酸杆菌具有明显的治疗效果。

3)：噬菌体多肽对Hacat细胞以及单核细胞的毒性作用。

分别取浓度为5、10、50、100、200、500、1000(mg/L)裂解多肽，分别加入Hacat细胞以及单核细胞的细胞培养瓶中，后续对这两种细胞进行存活率的检测，使用CCK-8检测(一种基于SST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测。其主要成分为水溶性四唑盐SST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，SST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜。SST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅；对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系)。结果如图4所示，从图4可见，不同浓度的裂解多肽对这两种细胞均无毒性，存活率均不低于90％，说明本发明所述的裂解多肽安全可靠，对生物体没有毒性。

4)噬菌体多肽的杀菌浓度确定

分别取浓度为5、10、50、100、200、500、1000(mg/L)裂解多肽，在痤疮丙酸杆菌生长的对数期内(分光光度计测得OD＝0.6)分别加入，空白组为生理盐水，均培养过夜；第二天使用平板计数法测痤疮丙酸杆菌的细菌滴度，结果如图5所示。痤疮丙酸杆菌的滴度越低表明裂菌多肽的杀灭作用越强，从图5可以看出，可以看出该裂菌多肽对痤疮丙酸杆菌具有较强的杀灭能力，并且在大约200mg/L的浓度时具有最强的杀灭作用。

5)噬菌体多肽对痤疮小鼠模型的结节治疗效果

痤疮小鼠模型:将6周龄雌性昆明小鼠背部皮肤脱毛，使用滴定为2×10⁸cfu/ml的痤疮丙酸杆菌注射到小鼠背部皮下，注射量为1ml；若小鼠产生的痤疮炎症结节不够明显可注射多次，保证痤疮小鼠的痤疮炎症结节平均值直径大于等于5cm。

分别取浓度为5、10、50、100、200、500、1000(mg/L)噬菌体多肽，在痤疮小鼠模型的结节处注射噬菌体多肽1ml，等待72小时进行炎症结节的直径测量，结果如图6所示。从图6可见，该噬菌体多肽浓度在50mg/L、200mg/L和500mg/L时均有良好的治疗效果，结节的直径分别降至1.9cm、1.4cm和3.3cm，较原始直径5.3cm，分别减少了180％，278％和60.6％，即使用200mg/L左右的噬菌体多肽时，痤疮小鼠模型的痤疮炎症结节缩小最为明显，而过高和过低的浓度均不能发挥良好的治疗效果。

6)噬菌体多肽的治疗时长和起效时间

本实施例中的痤疮小鼠模型为:将6周龄雌性昆明小鼠背部皮肤脱毛，使用滴定为2×10⁸cfu/ml的痤疮丙酸杆菌注射到小鼠背部皮下，注射量为1ml；若小鼠产生的痤疮炎症结节不够明显可注射多次，保证痤疮小鼠的痤疮炎症结节平均值直径大于等于5cm。

取上述痤疮小鼠模型随机分为3组，每组3只小鼠，分别为A组：裂解多肽组；B组：米诺环素组；C组：空白对照组(生理盐水)；其中米诺环素为四环素类抗生素，为痤疮治疗指南的一线用药，实验采用米诺环素使用说明书的推荐浓度，噬菌体多肽使用浓度为200mg/L，结果如图7所示。从图7可以看出，本申请所述的噬菌体多肽具有与米诺环素同等的治疗效果，并且起效时间与米诺环素也相似，约在5小时起效，24小时效果可以肉眼观测，72小时小鼠炎症结节明显缩小。即本申请所述的噬菌体多肽具有起效快、且治疗效果佳。

7)噬菌体多肽抗菌效果的动物研究

(1)为了研究裂解痤疮丙酸杆菌多肽对痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤病的抗炎作用，本发明通过使用痤疮丙酸杆菌处理的炎性动物模型监测动物皮损、炎症因子以及细胞载量的变化来验证该肽的抗炎作用。

取实验大鼠随机分为3组，每组3只大鼠，透明质酸凝胶作为给药载体，分别为A组：透明质酸凝胶空白组；B组：透明质酸凝胶+米诺环素治疗实验组；C组：透明质酸凝胶+裂解痤疮丙酸杆菌多肽治疗实验组；其中抗生素类治疗采用四环素抗生素，为痤疮治疗指南的一线用药，实验采用四环素抗生素使用说明书的推荐浓度，裂解痤疮丙酸杆菌多肽使用浓度为200mg/L；在所有实验大鼠背部注射痤疮丙酸杆菌，24h可见大鼠背部已形成痤疮结节，遂开始治疗，A组给空白透明质酸，B组给四环素+透明质酸，C组给裂解痤疮丙酸杆菌多肽+透明质酸，其中凝胶给药方式为涂抹给药。72小时后，通过颈脱位处死动物进行比较；通过肉眼观察上述A组、B组和C组可知，与A组相比B、C组皮损直径平均缩小95％；说明C组能达到与B组相似的疗效。通过取皮损处组织进行细菌载量的测试，发现A组细菌载量降为平均3.4×10⁶，B组细菌载量降为2.8×10²，C组细菌载量降为2.5×10²。(具体测细菌载量的方法：分别在各组小鼠皮损中心处取同样质量的皮损，5g，将该样本研磨成匀浆，分别放置于生理盐水中浸泡，再采用超声波震荡仪进行震荡10min，然后过滤，将滤液进行双层琼脂板法测细菌滴度。此实验于无菌超净台内操作。将平板放置于无氧孵箱中约72小时后可计算平板上的菌落数量，以此来计算细菌载量，计算方法为：平板上的菌落数量÷稀释的倍数÷加入平板的样本体积)。

8)噬菌体多肽的抗炎效果的研究

免疫组化使用一级I GF-1抗体、一级I GF-1R抗体和二级HRP标记的山羊抗兔抗体。石蜡切片被脱蜡和再水合。通过在微波炉中将载玻片在EDTA缓冲液中加热至沸腾来进行抗原回收。将载玻片自然冷却，用PBS洗涤，并用3％过氧化氢孵育10分钟。然后在自然干燥后，将样品与BSA孵育，随后在4℃下与一级抗体孵育过夜。将载玻片与辣根过氧化物酶结合的二级抗体在37℃下孵育50分钟，然后与新制备的DAB溶液反应，并用苏木精复染。实验结果显示，痤疮通过在炎症组织中I L-17水平，加重了大鼠耳组织的炎症反应。此外上调了组织中的I GF-1水平。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (6)

1.一种噬菌体多肽作为活性成分在制备治疗痤疮药物中的应用，其特征在于，所述噬菌体多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段或衍生物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述噬菌体多肽作为有效成分的剂量为200mg/L。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述噬菌体多肽制成药物制剂，所述药物制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂和气体制剂中任一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物制剂还包括药剂学上可接受药用辅料中的任一种或者多种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述噬菌体多肽制备施用于皮肤的药物制剂中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述噬菌体多肽在预防或制备由痤疮丙酸杆菌感染所引起的疾病药物中的应用。