CN109652357B - 细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用,从牛支原体基因突变体库中筛选得到一株牛支原体Mbov_0328基因缺失突变菌株T9.386，该基因编码环二核苷酸磷酸二酯酶。突变菌株与牛胚胎肺细胞共培养时，表现出显著生长缺陷表型；在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。所述的突变株与野生菌株间的蛋白组学呈现显著的差异表达谱。突变菌株间具有38个差异表达蛋白，其中30个蛋白呈上调表达，8个蛋白呈下调表达。该突变株可在牛支原体代谢生理、致病和免疫防制领域应用。

Description

细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用

技术领域

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及到细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用。从牛支原体基因突变体库中筛选得到一株牛支原体Mbov_0328基因缺失突变菌株T9.386，该基因编码环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。突变菌株与牛胚胎肺细胞(EBL)共培养时，表现出显著的生长缺陷表型，在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。所述的突变株与野生菌株间的蛋白组学呈现显著的差异表达谱。该突变株可望在牛支原体致病和免疫防制中应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是牛的一种重要病原体，可以引起牛的肺炎、关节炎、乳腺炎及角膜结膜炎等症状。牛支原体于1961年首次在美国从患乳腺炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎。任何月龄肉牛和奶牛对该病均易感。牛支原体肺炎的发病率可达80％，平均病死率为10％。目前，牛支原体病在世界范围内广泛流行，已成为危害养牛业的主要传染病和常发病，给全球养牛业带来了严重的经济损失。美国每年由于牛支原体感染所致牛呼吸系统疾病和乳腺疾病造成的损失达1.4亿美元，单个牛场最高感染率可达70％(Rosengarten等，1999)。在英国，每年约有190万头牛患牛支原体肺炎，导致的经济损失达到5400万英镑(Nicholas&Ayling，2003)。

2008年，湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”。此后牛支原体肺炎被报道呈全国性流行，主要发生在新引入的育肥牛中，一般在引入后10-15天左右发病，发病率为80％以上。该病临床治疗效果差，病程长，病死率高，平均为10％，高达到60％(石磊等，2008)。该病的发生与我国肉牛养殖产业化的快速发展直接相关。由于我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度提高，肉牛“异地育肥”已经成为重要的肉牛养殖模式，全国出现大规模的“北牛南调、西牛东运”的牛群转运现象。架子牛反复倒运引起的运输应激成了该病暴发流行的诱因(郭爱珍等，2011)。与此同时，因奶牛牛支原体乳腺炎导致初生犊牛牛支原体肺炎的流行，给奶牛业带来重大损失。

然而，由于支原体本身的生物学特征及研究手段有限，50多年来一直缺乏针对该病原体的特异性防控手段，既无有效疫苗也无特效药物。阐明其毒力机制和致病机理是研究特效防治措施的前提条件。但目前对牛支原体的毒力机制仍知之甚少，尚未发现其具有经典的毒素和毒力因子和毒力岛。为发掘牛支原体的毒力基因，申请人构建了牛支原体突变体库，利用细胞共培养存活模型、细胞黏附和侵袭模型等，鉴定了一系列相关基因的突变体。本发明涉及一株与牛胚胎肺细胞共培养时存活能力缺陷的突变体，确定其突变基因为Mbov_0328，该基因编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株牛支原体Mbov_0328基因突变菌株。该基因的编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。与野生菌株比较，突变菌株与牛胚胎肺细胞共培养时，呈现出显著的生长缺陷，在PPLO固体培养基上呈现小菌落表型，表现显著的蛋白组差异表达。有研究表明该突变菌株生长缺陷表型与缺失基因的酶活性相关。基于牛支原体与细胞共培养下的存活能力与毒力相关，该突变株可望在牛支原体致病、生理代谢和免疫防制等领域有潜在应用前景。

为了实现本发明的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体全基因组的突变体库中筛选得到一株生长缺陷型菌株(T9.386)，该菌株含有突变基因Mbov_0328，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列长度为969bp，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2-7所示，该蛋白具有环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)和小片段核酸酶的功能。经验证，在PPLO培养基中，该突变菌株在对数生长期的生长速度比牛支原体野生菌株显著减慢。在牛胚胎肺细胞(EBL)的培养中，所述的突变菌株T9.386呈现显著的生长缺陷表型。同时，在PPLO固体培养基上，与野生菌相比，突变菌株呈现小菌落。突变菌株表型与突变基因的关系研究显示其生长缺陷表型与CDNPase酶的活性相关。比较蛋白组学分析显示，突变菌株较野生株存在38个差异表达蛋白(p<0.05)，其中30个蛋白呈上调表达，8个蛋白呈下调表达。环二核苷酸是致病菌十分重要的第二信使，对细菌生理活动及毒力具有广泛的调控功能。

环二核苷酸磷酸二酯酶是调节环二核苷酸代谢平衡的关键因子，且主要通过环二核苷酸发挥全局性调节功能。因此，本发明的牛支原体突变体的成功构建和鉴定可望在牛支原体生理、致病以免疫防制具有潜在的应用价值。

本发明的技术方案如下所述：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2010040。

由于牛支原体定点突变效率十分低，很难获得预期的突变菌株。本发明以牛支原体HB0801(基因组在GenBank上的登录号为CP002058)为亲本菌株，利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，利用庆大霉素做抗性筛选标志，对突变菌株进行筛选，成功构建了牛支原体突变体库。本发明使用的牛支原体细胞共培养模型是从突变体库中筛选出的一株生长缺陷型突变株T9.386，申请人将该突变株命名为牛支原体T9.386，Mycoplasma bovis T9.386，于2018年8月31日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018583。将该突变菌株T9.386与野生株(即本地分离株)Mycoplasma bovis HB0801菌株分别接种于PPLO培养基中，进行生长曲线检测，结果显示突变菌株T9.386在对数生长期生长较减慢，在其他阶段与野生菌株没有显著差异。将突变菌株T9.386和野生型菌株HB0801涂布于PPLO固体培养基中，通过菌落形态观察显示，突变菌株的菌落明显变小。

本发明构建的突变菌株的突变基因为Mbov_0328基因(其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示)，该基因编码蛋白具有环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)和小片段核酸酶活性，可以将环二核苷酸(CDNs)和nanoRNA(pApA/pGpG)最终降解成AMP和GMP，经验证突变菌株与细胞共培养时的生长缺陷表型与缺失基因的酶活性相关。将牛支原体HB0801和T9.386分别与EBL细胞共培养，人工添加核苷混合物(例如AMP，GMP，CMP，UMP)或核苷酸混合物(例如腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶)至共培养体系中，同时设定不含人工添加核酸或核苷酸的组为对照组，对牛支原体的生长情况进行分析。结果显示：突变菌株出现生长缺陷，人工添加核苷或核苷酸后，突变菌株的生长缺陷表型缓解，且呈剂量依赖关系，随核苷或核苷酸浓度的增加而升高。而野生菌株的生长情况随核苷或核苷酸浓度的增加而降低。

经过验证，本发明构建的突变菌株与野生菌株相比具有显著的差异蛋白组表达谱。

本发明对牛支原体进行了比较蛋白组学分析，所述的分析方法包括下列步骤：

利用Label-free质谱法对支原体HB0801和T9.386进行比较蛋白组学分析。将HB0801和T9.386菌株分别培养至对数末期，收集菌体，对全菌蛋白进行匀浆，SDT裂解和FASP酶解处理，并进行质谱检测。对检测结果进行分析，取差异表达倍数均大于2且p<0.05的基因为分析对象，共发现38个蛋白呈现差异表达，其中30个蛋白在T9.386中呈上调表达，8个蛋白呈下调表达。

本发明具有以下优点：

1、本发明的T9.386菌株是发明人从牛支原体基因缺失突变体库中筛选获得的细胞共培养时生长缺陷型突变菌株。

2、本发明的T9.386菌株，基因突变位点位于牛支原体基因组388368位点后，位于Mbov_0328基因的449位点后。

3、本发明的T9.386菌株已被发明人证实相较于野生型菌株HB0801呈现显著的生长缺陷及小菌落表型。

4、本发明的T9.386菌株与细胞共培养出现的生长缺陷表型与突变基因的酶活性相关。

5、本发明的T9.386菌株已被发明人证实相较于野生型菌株HB0801呈现差异蛋白组表达谱。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是本发明的牛支原体与EBL细胞共培养生长缺陷突变菌株高通量筛选图。附图标记说明：图1中的A图是共培养前的检测；图1中的B图是共培养后的的检测。标记中的红色圆圈代表共培养前后均无菌落生长，浅蓝色圆圈代表共培养前后菌落数相同，深蓝色圆圈代表共培养后菌落数减少，黄色圆圈代表共培养后无菌落生长。

图2：是本发明的牛支原体生长缺陷菌株T9.386定量检测分析图。倒数第二个方框中所示为生长缺陷最显著的牛支原体突变菌株T9.386。

图3：Mbov_0328基因序列中转座子插入突变位点。图中：紫色方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列，所示方向为转座子相对基因组的插入方向。

图4：是本发明的牛支原体与EBL细胞共培养生长曲线分析图。

图5：是本发明的牛支原体在PPLO培养基中生长曲线分析图。

图6：是两种牛支原体菌株的菌落形态图。附图标记说明：图6中的A图是野生型牛支原体HB0801的菌落图；图6中的B图是牛支原体突变株T9.386的菌落图。

图7：是本发明中人工添加核苷或核苷酸对牛支原体与EBL细胞共培养生长情况图。

图8：是本发明不同浓度核苷或核苷酸对牛支原体与EBL细胞共培养生长情况的影响图。附图标记说明：图8中的A图是是野生型牛支原体HB0801的生长情况；图8中的B图是牛支原体突变株T9.386的生长情况。

图9：是本发明的突变株T9.386与野生型菌株HB0801差异表达蛋白组热图。附图标记说明：图9中的A1，A2，A3代表牛支原体HB0801样品，A1，A2，A3代表3个样本重复；图9中的B1，B2，B3是牛支原体突变株T9.386样品，B1，B2，B3代表3个样本重复。红色模块代表蛋白表达量上调，蓝色模块代表蛋白表达量下调。

图10：是本发明牛支原体突变株T9.386与牛支原体野生型菌株HB0801差异表达蛋白KEGG分析图。

具体实施方式

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是本发明的牛支原体蛋白基因CDNPase的核苷酸序列。序列长度为969bp。

SEQ ID NO:2-6是牛支原体蛋白基因CDNPase编码的蛋白质序列。

实施例1：牛支原体生长缺陷突变体的筛选鉴定

1.牛支原体生长缺陷突变体高通量的筛选

将牛支原体突变体库转移至24个96孔板，利用华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室构建的细胞共培养生长缺陷实验模型和96针复制器，对牛支原体突变体库进行高通量筛选。将EBL细胞按照4×10⁴cell/cm²铺至96孔细胞培养板，利用96针复制器将突变体库接种至细胞中，在37℃，5％CO₂培养箱中共培养72h，经一次冻融(-80℃/+37℃)循环裂解细胞，利用96针复制器将各株突变体涂布PPLO固体平皿，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～7天。初步筛选出26株没有可见菌落的突变体(见图1)。

2. 26株牛支原体生长缺陷突变体定量的检测分析

将EBL细胞按照4×10⁴cell/cm²铺至24孔细胞培养板，利用感染比为0.5将初筛的26株突变体接种至EBL细胞中，设置野生株HB0801为阳性对照。将突变体与EBL细胞在37℃二氧化碳培养箱中共培养72h。经一次冻融(-80℃/37℃)循环裂解细胞，利用菌落计数法定量测定26株突变体菌落数。结果显示T9.386突变菌株生长缺陷表型最显著(图2)。申请人将该突变菌株命名为牛支原体T9.386，Mycoplasma bovis T9.386，于2018年8月31日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018583。

3.T9.386菌株突变基因的鉴定

利用细菌基因组提取试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司)，提取牛支原体T9.386突变体全基因组，对Tn4001转座子与牛支原体基因组连接处进行测序，将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对，结果显示，T9.386突变基因为Mbov_0328，转座子插入位点位于基因组388368位点后，位于Mbov_0328基因449位点后(图3)。

实施例2：牛支原体生长缺陷突变体的生长曲线的检测

1.牛支原体在EBL细胞中生长曲线检测

(1)牛支原体培养和计数：取牛支原体HB0801和T9.386分别以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养36h到达对数末期后，进行CFU计数。即将培养好的菌液进行10倍递增稀释，取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基，倒置于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～7d后，在体视显微镜下进行菌落计数，菌落数计算公式为：CFU/mL＝菌落数×稀释度×100。

(2)EBL细胞培养和计数：将EBL细胞培养于MEM完全培养基(即含10％热灭活胎牛血清的MEM培养基，MEM培养基，购自美国Hyclone公司)中，于37℃，5％CO₂条件下培养，待细胞长至80％满的单细胞层时，用含0.25％EDTA的胰酶37℃消化处理3min后，立即加入MEM完全培养基(购自美国Hyclone公司)终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用适当体积的MEM完全培养基吹打制成细胞悬液，并对细胞悬液用血球计数板进行计数。计数方法简述如下：取重悬均匀的细胞悬液适量沿盖片边缘缓缓滴入血球计数板，使盖片下充满悬液，在高倍显微镜下对血球计数板四周及中间的5个小格中的细胞进行计数，细胞数/mL＝(5个小格的细胞数/20)×稀释倍数×10⁶。

(3)牛支原体与EBL细胞共培养及生长曲线的检测：取计数好的细胞悬液按2×10⁴cells/cm²接种于24孔细胞培养板，即4×10⁴cells/每孔。取适量计数好的牛支原体悬液于8000g离心10min，菌体沉淀用PBS洗涤3次，将洗涤后的牛支原体用适量MEM完全培养基重悬，使细菌数为2×10⁴CFU/mL。取100μL处理好的菌液于含有EBL细胞的培养板中，并添加MEM完全培养基使每孔液体量为1.5mL。将支原体和细胞混合物于37℃，5％CO₂培养箱中分别培养24h、48h和72h。经一次冻融(-80℃/37℃)循环裂解细胞后，取适量菌液进行菌落计数，结果显示突变菌株的生长速度较野生菌株变慢(图4)。

2.牛支原体在PPLO中生长曲线的检测

(1)牛支原体培养和计数：取牛支原体HB0801和T9.386以1:1000的比例接种PPLO液体培养基，静置于37℃，5％CO₂培养箱中培养36h即到达对数期后，进行CFU计数，方法如下：将培养好的菌液进行10倍递增稀释，取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基，37℃，倒置培养，5％CO₂培养箱中培养3～7d后，在体视显微镜下进行菌落计数，菌落数计算公式为：CFU/mL＝菌落数×稀释度×100。

(2)牛支原体生长曲线的检测：将计数好的牛支原体用PPLO培养基稀释成10⁵CFU/mL，按1:10比例接种至PPLO培养基中，37℃，静置培养，5％CO₂培养箱中连续培养72h，每12h取适当菌液进行菌落计数，将各时间点的菌落数对时间作图获得生长曲线，比较突变株和野生株的生长曲线，显示突变菌株相较于野生株呈现生长延迟，野生株在培养24h后到达平台生长期，突变菌株培养36h才到达平台生长期(图5)。

由于支原体的生物合成和代谢能力有限，其生存需依赖于宿主提供的营养物质。尽管支原体中存在许多代谢的替代途径，可以使其在营养丰富条件下生长良好，但在宿主体内的增殖是病原体传播和建立致病性所必需的，CDNPase的缺失导致牛支原体在宿主细胞中生长缺陷，可能导致其对宿主的致病性产生影响。

实施例3：牛支原体共培养生长缺陷突变体的形态学观察

将培养至对数末期的牛支原体HB0801和T9.386菌株分别稀释适当倍数，涂布于PPLO固体培养基上，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～7d后，在体视显微镜下观察支原体菌落形态，结果显示T9.386突变菌株菌落小于HB0801菌株(图6)。

实施例4：牛支原体生长缺陷表型与突变基因酶活性关系的研究

1.人工添加核苷或核苷酸对牛支原体生长的影响

(1)核苷或核苷酸混合物的准备：将商业化各核苷(例如AMP，GMP，CMP，UMP)或核苷酸(腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶)(购自美国Sigma公司)粉末溶解于MEM完全培养基中，配制成1M；同时，将各核苷或核苷酸按相同比例进行混合，置于4℃备用。

(2)核苷或核苷酸对牛支原体生长的影响：取计数好的细胞悬液按2×10⁴cells/cm²接种于24孔细胞培养板。取适量处理好的牛支原体按感染比为0.5加入含有EBL细胞的细胞培养板中。添加4mM核苷或核苷酸混合物于共培养体系中，补充MEM完全培养基使每孔液体量为1.5mL，同时设置不添加核苷或核苷酸混合物的培养体系为对照组。将培养物于37℃，5％CO₂培养箱中培养72h。经一次冻融(-80℃/37℃)循环裂解细胞后，取适量菌液进行菌落计数。结果显示未添加组中，T9.386和HB0801的滴度分别为5×10²CFU/mL和6.7×10⁶CFU/mL,添加了核苷或核苷酸的组中，T9.386的最终滴度分别为7.9×10⁵CFU/mL和1.7×10⁴CFU/mL，HB0801的最终滴度分别为3.9×10⁴CFU/mL和4.1×10⁵CFU/mL，添加核苷或核苷酸后，缓解了T9.386突变菌株的生长缺陷表型，与野生株的生长差异由13400倍分别降低至8倍和390倍，同时抑制了HB0801的生长(图7)。

2.不同浓度核苷或核苷酸对牛支原体生长的影响

取计数好的细胞悬液按2×10⁴cells/cm²接种于24孔细胞培养板。取适量处理好的牛支原体按感染比为0.5加入含有EBL细胞的细胞培养板中。添加不同浓度的核苷或核苷酸混合物(浓度从0mM到20mM)于共培养体系中，补充MEM完全培养基使每孔液体量为1.5mL，将培养物于37℃，5％CO₂培养箱中培养72h。经一次冻融(-80℃/37℃)循环裂解细胞后，取适量菌液进行菌落计数。结果显示T9.386突变菌株的生长缺陷表型随核苷或核苷酸浓度的增加而减轻，当添加物的浓度达到5mM时，T9.386的滴度可达10⁴CFU/mL，当浓度大于10mM时，T9.386的滴度可达10⁴CFU/mL，而HB0801的生长情况随核苷或核苷酸的浓度增加而降低(图8)。

CDNPase的nanoRNase和磷酸二酯酶活性均可以将底物降解为单核苷酸。由于CDNPase的缺失可能导致生长缺陷的突变菌株细胞内单个核苷酸或核苷的含量降低，将单核苷酸和核苷添加到细胞培养基中显着促进了突变菌株的生长。因此，CDNPase可能参与了支原体中核苷酸的代谢。核苷或核苷酸代谢对细胞极为重要，它们是合成DNA和RNA的必需物质，也是重要的能源物质。

实施例5：牛支原体比较蛋白组学分析

1.牛支原体培养和全菌蛋白处理

取牛支原体HB0801和T9.386以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基各200mL，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养至对数末期。将培养好的菌液以8000g离心20min，弃上清，菌体用PBS洗涤三次，菌体沉淀在液氮中速冻后置于-80℃冰箱保存备用。

取适量冻存的菌体沉淀，加入200μL预冷的SDT裂解液(4％SDS,1mM DTT,100mMTris-HCl pH 7.6)，转移至预先装有适量石英砂的2ml离心管中，进行匀浆破碎(24×2，6.0M/S，60s，两次)，然后进行超声破碎(80W，工作10s，间歇15s，循环10次)，沸水浴15min。破碎后的蛋白于14000g离心40min，上清用0.22μm滤器过滤并收集滤液。采用BCA蛋白测定试剂盒对处理好的蛋白样品进行定量测定。分装蛋白样品冻存于-80℃备用。

2.FASP酶解蛋白

各蛋白样品均取30μL，分别加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μL UA缓冲液(配制方法：8M urea，150mM Tris-HCl，pH 8.0)混匀，将液体转入10kD超滤管中，14000g离心15min，弃滤液(重复该步骤一次)。加入100μL吲哚-3-乙酸缓冲液(100mM吲哚-3-乙酸溶解于UA缓冲液中)，600rpm振荡1min，室温避光反应30min，14000g离心15min。加入100μL UA缓冲液，14000g离心15min，重复该步骤两次。后加入100μL 25mMNH₄HCO₃溶液，14000g离心15min，重复该步骤两次。加入40μL胰酶缓冲液(4μg胰酶溶解于40μL 100mM的NH₄HCO₃中)，600rpm振荡1min，37℃放置16-18h。换新的收集管，14000g离心15min；再加入40μL 25mM的NH₄HCO₃，14000g离心15min，收集滤液。利用C18Cartridge色谱柱对肽段进行脱盐，将肽段冻干后加入40μL 0.1％甲酸溶液复溶，测定OD₂₈₀值，对肽段进行定量。

3.牛支原体差异蛋白质谱分析

(1)利用高压液相色谱将肽段分离：将酶解后的样品利用HPLC液相系统进行分离。样品由自动进样器进样，所用流动相为缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)，流速为300nL/min。利用梯度洗脱将肽段进行分离。

(2)肽段的质谱鉴定：将分离后的肽段利用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子，母离子扫描范围300–1800m/z，在200m/z条件下一级质谱分辨率为70,000，二级质谱分辨率17,500。质谱结果与NCBI数据库进行比对，结果显示T9.386与HB0801比较共有38个差异表达蛋白，其中30蛋白表达上调，8个蛋白表达下调(图9)。KEGG途径分析此38个差异表达蛋白显示5种差异表达的蛋白质包括3种上调蛋白Mbov_0353，Mbov_0709和Mbov_0325以及2种下调蛋白Mbov_0327，Mbov_0853/Mbov_0742，共参与11条种代谢途径。其中，上调蛋白Mbov_0353和Mbov_0325参与糖酵解和糖异生途径，分别负责乙醇和乙醛的转化以及甘油催化甘油-3-磷酸。另一个上调的蛋白Mbov_0709参与原核生物中的基因错配修复。下调的蛋白Mbov_0327呈现最显著的差异表达，该基因含有DHH-DHHA1结构域，表明其可能具有nanoRNase和磷酸二酯酶的功能。另一种下调蛋白Mbov_0853/Mbov_0742为麦芽糖ABC转运体蛋白(图10)。除了上述参与KEGG途径的5个差异表达蛋白外，16个蛋白包括3种已知蛋白质和13个假定蛋白质具有保守结构域。其中，上调的蛋白Mbov_0659，Mbov_0658和Mbov_0289具有S41肽酶结构域，其含有S41肽酶尾特异性蛋白酶(TSP)结构域。TSP结构域S41蛋白酶在蛋白质翻译后的加工中起重要作用，包括蛋白质成熟，将蛋白质转运至细胞周质以及降解受损或异常的蛋白质。Mbov_0467和Mbov_0696包含SMC_N超家族结构域，其涉及染色体的组织，分离和维持基因组的稳定性。Mbov_0119含有CYK3超家族结构域，一旦细胞复制且其染色体分离，该基因则负责分离细胞。Mbov_0756和Mbov_0193分别含有二级转运系统MFS_3超家族和MATE样超家族结构域，属于多重耐药外排泵转运蛋白。MSF转运蛋白参与多种物质的运输，包括独特的低分子量分子，如糖类，抗菌剂，氨基酸，核酸和中间代谢产物等，MATE样转运蛋白可以将细胞毒性化合物，包括抗生素和药物排出，以保护细胞。Mbov_0324基因编码产物为水甘油通道蛋白GlpF，参与甘油的摄取。上调的蛋白Mbov_0729，Mbov_0516，Mbov_0803和Mbov_0020为未知功能蛋白。下调表达蛋白中，Mbov_0305，Mbov_0274和Mbov_0739具有保守结构域。其中Mbov_0274和Mbov_0739具有周质底物结合蛋白UgpB超家族保守结构域，其对于周质底物结合蛋白运输G3P和甘油磷酸二酯非常重要(表1)。

表1本发明T9.386突变株与HB0801野生株差异表达蛋白保守结构域分析

C-di-AMP是细菌内的第二信使，可以感受外界环境的变化，从而调节细胞内的浓度，通过与其受体的作用，调节下游效应分子的功能，进而发挥特定的生物学作用，因此c-di-AMP在细菌内的稳态对于细菌维持正常的生理状态非常重要。DHH结构域基因是c-di-AMP特异性降解酶，其对细菌基因的表达及其功能具有广泛调节作用，缺失该基因会导致细菌出现一系列功能异常，包括如细菌的耐药性，细菌生长和生物被膜的形成，同时会显著降低病原菌对宿主的感染性及毒力等。T9.386中CDNPase基因的缺失导致牛支原体呈现生长缺陷，小菌落等表型，同时，该基因的缺失广泛影响了支原体的基因表达，特别的G3P和甘油磷酸二酯作为肺炎和磷酸盐的主要来源，对支原体的存活至关重要(Chandravanshi M，2016)，CDNPase基因的缺失导致支原体中G3P和甘油磷酸二酯转运相关蛋白表达下调，可能对支原体的存活产生影响，支原体的存活和生长是其在宿主体内扩散和产生致病性的关键，该基因的缺失可进一步影响支原体对宿主的毒力作用。

综上所述，与牛支原体野生株比较，含有CDNPase基因的牛支原体突变株表现出与宿主(EBL)细胞共培养时的生长缺陷，固体培养基中菌落变小，对数生长期生长变慢。该突变株存在38个差异表达蛋白等特征，这些特征导致该突变株将在牛支原体生理代谢、致病和免疫防制中具有潜在应用前景。

名词术语说明：

牛支原体Mbov_0328编码蛋白：以CDNPase表示。

牛支原体CDNPase基因突变株以牛支原体T9.386表示。

牛支原体本地分离株以牛支原体HB0801表示。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用

<141> 2019-02-20

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(969)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(969)

<400> 1

atg aaa ata ggt aat gca aaa gtt gct ata gat gca att gaa aaa tac 48

Met Lys Ile Gly Asn Ala Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Glu Lys Tyr

1 5 10 15

aaa aat ata atc att ttt cac cat att cgt cct gat gga gac tgt tta 96

Lys Asn Ile Ile Ile Phe His His Ile Arg Pro Asp Gly Asp Cys Leu

20 25 30

ggc tca caa gct gga tta gct gaa tta att aga act aac tac ccc gaa 144

Gly Ser Gln Ala Gly Leu Ala Glu Leu Ile Arg Thr Asn Tyr Pro Glu

35 40 45

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Lys Asn Val Tyr Thr Val Gly Asp Asn Val Gly Val Phe Asp Phe Met

50 55 60

aac tat aaa tat gat caa att gaa aaa ata gac ttt agt gac tct tta 240

Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Ile Glu Lys Ile Asp Phe Ser Asp Ser Leu

65 70 75 80

gga att gtg gtg gat gct tct agc tca aat cga att gaa tgt gct gag 288

Gly Ile Val Val Asp Ala Ser Ser Ser Asn Arg Ile Glu Cys Ala Glu

85 90 95

ctt tta tta aac aaa aaa att act gct gca ctt aga ata gac cat cat 336

Leu Leu Leu Asn Lys Lys Ile Thr Ala Ala Leu Arg Ile Asp His His

100 105 110

cct aat gat agt gat ata gaa tat caa tat atc tga gtt gat gag cac 384

Pro Asn Asp Ser Asp Ile Glu Tyr Gln Tyr Ile Val Asp Glu His

115 120 125

tat gta gct gct gca gaa atg att gca aaa att gct tat gaa gca aaa 432

Tyr Val Ala Ala Ala Glu Met Ile Ala Lys Ile Ala Tyr Glu Ala Lys

130 135 140

tga att gtt aat cag aga gct gct gag cat ata ttt tta gga ata gta 480

Ile Val Asn Gln Arg Ala Ala Glu His Ile Phe Leu Gly Ile Val

145 150 155 160

act gat agc gga aga ttt tta tat cct gat act tct gca aga aca cac 528

Thr Asp Ser Gly Arg Phe Leu Tyr Pro Asp Thr Ser Ala Arg Thr His

165 170 175

caa cta gtt tca ttt tta tat gaa aaa ggg aat ttg aag cca aag ttt 576

Gln Leu Val Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Gly Asn Leu Lys Pro Lys Phe

180 185 190

atg ttc aat gaa cta agc aaa aga acg atg gat gac att aaa ttc tcg 624

Met Phe Asn Glu Leu Ser Lys Arg Thr Met Asp Asp Ile Lys Phe Ser

195 200 205

ggt gaa ata ctt tca aat ttc aaa aaa caa ggc aga gtt tta tac tat 672

Gly Glu Ile Leu Ser Asn Phe Lys Lys Gln Gly Arg Val Leu Tyr Tyr

210 215 220

gag gtt act aat gaa gtg tta caa aaa ttt ggt cta agt agc ctt aaa 720

Glu Val Thr Asn Glu Val Leu Gln Lys Phe Gly Leu Ser Ser Leu Lys

225 230 235 240

gca gca aca ttt gtt aat gaa tta gct gat att gaa gat aat tct tgc 768

Ala Ala Thr Phe Val Asn Glu Leu Ala Asp Ile Glu Asp Asn Ser Cys

245 250 255

tga gcc ttc ttt ata caa tta gaa gat ggc aaa att aga gga cgt ctt 816

Ala Phe Phe Ile Gln Leu Glu Asp Gly Lys Ile Arg Gly Arg Leu

260 265 270

cgc tca aat ggc cca tta gtt aat aaa gta gct cca aaa tat ggt ggt 864

Arg Ser Asn Gly Pro Leu Val Asn Lys Val Ala Pro Lys Tyr Gly Gly

275 280 285

ggt ggt cat gat aat gct gct ggt att acg tta act aaa tga agt caa 912

Gly Gly His Asp Asn Ala Ala Gly Ile Thr Leu Thr Lys Ser Gln

290 295 300

gtt aat gat gta att aat gac cta aac cag tta att att gaa tga gag 960

Val Asn Asp Val Ile Asn Asp Leu Asn Gln Leu Ile Ile Glu Glu

305 310 315 320

gca aaa taa 969

Ala Lys

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

Met Lys Ile Gly Asn Ala Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Glu Lys Tyr

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Lys Asn Ile Ile Ile Phe His His Ile Arg Pro Asp Gly Asp Cys Leu

20 25 30

Gly Ser Gln Ala Gly Leu Ala Glu Leu Ile Arg Thr Asn Tyr Pro Glu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Gly Ile Val Val Asp Ala Ser Ser Ser Asn Arg Ile Glu Cys Ala Glu

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Leu Leu Leu Asn Lys Lys Ile Thr Ala Ala Leu Arg Ile Asp His His

100 105 110

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<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

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<211> 111

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 4

Ile Val Asn Gln Arg Ala Ala Glu His Ile Phe Leu Gly Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Ser Gly Arg Phe Leu Tyr Pro Asp Thr Ser Ala Arg Thr His Gln

20 25 30

Leu Val Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Gly Asn Leu Lys Pro Lys Phe Met

35 40 45

Phe Asn Glu Leu Ser Lys Arg Thr Met Asp Asp Ile Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Glu Ile Leu Ser Asn Phe Lys Lys Gln Gly Arg Val Leu Tyr Tyr Glu

65 70 75 80

Val Thr Asn Glu Val Leu Gln Lys Phe Gly Leu Ser Ser Leu Lys Ala

85 90 95

Ala Thr Phe Val Asn Glu Leu Ala Asp Ile Glu Asp Asn Ser Cys

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<211> 44

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<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

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Ala Phe Phe Ile Gln Leu Glu Asp Gly Lys Ile Arg Gly Arg Leu Arg

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Ser Asn Gly Pro Leu Val Asn Lys Val Ala Pro Lys Tyr Gly Gly Gly

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Gly His Asp Asn Ala Ala Gly Ile Thr Leu Thr Lys

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<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 6

Ser Gln Val Asn Asp Val Ile Asn Asp Leu Asn Gln Leu Ile Ile Glu

1 5 10 15

Claims (1)

1.一株生长缺陷型牛支原体Mbov_0328基因的突变菌株T9.386(Mycoplasma bovis)，其特征在于，所述突变菌株T9.386保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018583。

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