CN110923289B - 一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，包括如下步骤：1)数据库比对得到柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因序列；2)对该柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白序列第5位和第15位氨基酸进行突变；3)构建具有两个活性中心的二聚体蛋白；4)分子对接打分；5)筛选备选化合物分子；6)配制用于给柑橘黄龙病病树吊水的药剂；7)给病树治疗；8)取病树枝条的韧皮部组织，提取总DNA；9)PCR法选择其中病菌浓度下降最多的备选化合物分子为目的化合物分子。本发明通过提供一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，通过分子生物学分析，结合田间筛选出可以治疗植物黄龙病的化合物。

Description

一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法
技术领域
本发明属于植物保护领域，涉及一种植物病的药物的筛选方法，具体涉及一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法。
背景技术
柑橘类水果是世界上产量最大的4种水果之一，也是我国南方地区重要的经济作物，近年来由于柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)的危害，给地方经济和果农造成巨大的损失。
柑橘黄龙病是当前世界柑橘产业的头号杀手。该病能侵染几乎所有的柑橘栽培品种，目前尚无有效治愈手段。其病原暂定于α-变型菌纲(Proteobacteria)、韧皮杆菌属(Liberibacter)，是一种韧皮部专性寄生的难培养革兰氏阴性细菌。
柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,Las)是危害程度最广的黄龙病病原菌，是一种限于筛管组织内寄生，通过柑橘木虱(Diaphorina citr)传播的革兰氏阴性细菌。
目前，黄龙病菌尚不能进行成功的离体培养，因此筛选防治药剂的工作进行迟缓。尚无理想的特效药剂和抗病品种的情况下，防控木虱、挖除病树和种植无病苗木是目前柑橘黄龙病防控的三大核心措施。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，该方法通过分子生物学分析，结合田间筛选出可以治疗植物黄龙病的化合物分子。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，包括如下步骤：
1)使用流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因通过GenBank数据库比对柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacterasiaticus,Las)的全基因组，得到相似序列，命名为柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因，其编码蛋白质的氨基酸序列如Seq ID No.1所示；
2)对该柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质序列第5和第15位氨基酸进行突变，得到氨基酸序列如Seq ID No.2所示的蛋白质；
3)以流感嗜血杆菌琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质作为模板进行柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质同源模型的构建，得到一具有两个活性中心的二聚体蛋白；
由于流感嗜血杆菌琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质序列与柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因蛋白的序列相似度达到了41.44％，可以作为模板构建柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因蛋白的三维结构，模拟发现柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因蛋白为一具有两个活性中心的二聚体蛋白；
4)根据得到二聚体蛋白的两个活性中心，利用分子对接软件，对小分子化合物库(ZINC15数据库)的化合物分子进行分子对接打分；
5)根据对接结果的排序，筛选出其中抑制常数Ki值达到微摩尔级别的化合物分子作为备选化合物分子；
6)将备选化合物分子用等摩尔浓度NaOH配制，或者加氢氧化钠到pH等于7，制成用于给病树吊水的药剂母液；
备选化合物分子实物通过商业化公司购买。
7)选生长年份相同的有病果树，分为对照组，50mM组，100mM组，200mM组，将步骤6)制备的药剂按照对应组别用水进行稀释成用于吊水的药剂，每隔一周吊水1升，共治疗5次，累计9周；
8)取治疗后一个月和三个月各组有病果树枝条的韧皮部组织，提取总DNA；
9)采用PCR的方法扩增黄龙病菌16SrDNA，扩增的片段长度为1160bp，根据扩增片段的浓度检测病菌浓度，选择其中病菌浓度下降最多的备选化合物分子即目的化合物分子。
更进一步地，步骤2)所述对柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质序列第5位和第15位氨基酸进行改造，是将第5位的半胱氨酸突变为苏氨酸，第15位的半胱氨酸突变为丙氨酸。
更进一步地，步骤8)所述提取总DNA的步骤为：取0.1g新鲜有病果树枝条的韧皮部组织，用无菌剪刀剪碎，放入2mL离心管中，加入一颗直径2mm的灭菌钢珠(用于使韧皮部组织能够充分的破碎)；打样机打至粉末状；立即加入1ml 2×CTAB提取缓冲液，65℃水浴30分钟，其间10分钟摇动一次；然后冷却至室温，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，充分颠倒混匀，室温下，12000r/min离心10-15分钟；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分颠倒混匀，12000r/min，离心10-15分钟。将上清液转入另一离心管中；然后在上清液中加入0.6倍体积的异丙醇混匀，-20℃沉淀30-60分钟，12000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液；加入1ml 70％乙醇混匀，清洗沉淀，12000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液，重复清洗沉淀一次，弃去上清液，常温晾干离心管中残液；然后加入20-30μL水溶解DNA，仪器测定DNA浓度，-20℃保存备用。
更进一步地，所述酚-氯仿-异戊醇混合液由酚、氯仿、异戊醇按照体积比酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1混合而成；所述氯仿-异戊醇混合液由氯仿、异戊醇按照体积比氯仿：异戊醇＝24:1混合而成。
更进一步地，步骤9)所述PCR的反应体系为：
PCR缓冲液10μL；
上游引物，0.5μL；
下游引物0.5μL；
总DNA 2μL；
H2O 7μL；
PCR扩增程序为：94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃80s，25-30循环，72℃10min，16℃10min；
其中，上游引物序列如Seq ID No.3所示：5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’，下游引物如Seq ID No.4所示：5’GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’。
更进一步地，步骤6)所述用等摩尔浓度NaOH配制的方法为：称取1摩尔质量的备选化合物和1摩尔质量的NaOH固体，加入到少量水中，溶解并定容至1升，即制成药剂母液；
所述加氢氧化钠到pH等于7的配制方法为：称取1摩尔质量的备选化合物加入到少量水中，溶解后用NaOH固体调节pH至7.0，定容至1升，即制成药剂母液。
本发明通过研究细菌生长的相关机制，找到细菌生长有关的重要靶点琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶。在基因组中找到编码该酶蛋白的基因，并根据基因推测出蛋白质的氨基酸序列，表达出目的蛋白质。结果发现此蛋白质的溶解性低，不能够进一步的用于药物的筛选，因此分析该蛋白质的氨基酸序列，获得氨基酸发生改变的蛋白质突变体。
本发明采用琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶作为靶点设计研发抗黄龙病菌靶向药物，节约了成本，提高了筛选效率，可用于进一步开发为新型的治疗黄龙病的药物的基础。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，通过分子模拟分析筛选出备选化合物分子，再结合田间鉴定得到可有效降低柑橘黄龙病病毒的目标分子。
附图说明
图1为原始琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的SDS-PAGE结果图。
图2为原始琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的二级结构分析。
图3为突变后琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的二级结构分析。
图4为琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶突变位点图。
图5为突变后的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的SDS-PAGE结果图。
图6A为突变后的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的分子模拟结构。
图6B为化合物与突变后的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的结合位点示意图。
图7A和图7B为使用备选化合物分子对患有黄龙病的柑橘树进行输液治疗。
图8为使用本发明提供的方法筛选出的四个化合物治疗黄龙病一个月后的黄龙病原菌浓度的电泳图。
图9为为使用本发明提供的方法筛选出的四个化合物治疗黄龙病三个月后的黄龙病原菌浓度的电泳图。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
现有研究认为原核生物薄壁菌门变形菌纲根瘤菌目根瘤菌科韧皮部杆菌属细菌是引起柑橘黄龙病的主要病原。由于柑橘黄龙病病菌尚不能人工培养，因此无法直接利用。现有研究发现许多细菌(包括流感嗜血杆菌)缺乏二氨基庚二酸的细菌不能够存活，因此以表达二氨基庚二酸的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶作为目标靶点。
实施例1通过虚拟筛选获得备选化合物
使用流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因通过GenBank数据库比对柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,Las)的全基因组，得到相似序列(GenBank:ACT57255.1)
由于流感嗜血杆菌琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质结构目前研究的最深入，其蛋白质序列与柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因蛋白的序列相似度达到了41.44％，因此选择其作为模板构建柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因蛋白的三维结构，模拟发现柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因蛋白为一具有两个活性中心的二聚体蛋白；
命名为柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白(简写为：dapE)，其编码的氨基酸序列如Seq ID No.1所示；
MTPDCLEHLI QLIKCPSVTP QDGGAFFILV NTLKLLGFSI EEKDFQTKNT SIVKNLYARFGTEAPHLMFA GHIDVVPPGD FNHWTYPPFS ATIAEGKIYG RGIVDMKGSI ACFIAAVARF IPKYKNFGSISLLITGDEEG PAINGTKKML SWIEKKGEKW DACIVGEPTC NHIIGDTIKI GRRGSLSGEI TIHGKQGHVAYPHLTENPIR GLIPLLHQLT NIGFDTGNTT FSPTNMEITT IDVGNPSKNV IPAQVKMSFN IRFNDLWNEKTLKEEIRSRL IKGIQNVPKL SHTVHFSSPV SPVFLTHDRK LTSLLSKSIY NTTGNIPLLS TSGGTSDARFIKDYCPVIEF GLVGRTMHAL NENASLQDLE DLTCIYENFL QNWFITPSQ
通过分析，该蛋白的分子量为43102.63Daltons，由389个氨基酸组成，含有37个强碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，37个强酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)，134个疏水性氨基酸(丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，缬氨酸)和106个极性氨基酸(天冬酰胺，半胱氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，丝氨酸，酪氨酸)，等电点为7.45。
在基因文库中通过比对获得橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因序列，然后在北京赛百盛基因技术有限公司合成并克隆到质粒载体pET28a，获得重组DNA分子，然后把重组DNA分子转化到大肠杆菌BL21中，表达琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白，具体过程为：从-80℃冰箱中取出感受态大肠杆菌BL21，迅速插入湿冰中，溶解约5min，加入1μL含有重组DNA的pET28a(1μg/μL)，轻轻混匀，静置冰上30min于42℃中水浴热休克大肠杆菌90sec，迅速移入湿冰中，静置2min，加入450μL无菌LB培养液，于37℃摇床225rpm震荡培养45min，涂布在含卡拉霉素(100μg/mL)的LB平板上，待干燥后，倒置培养于37℃培养箱中过夜；第二天再接种于含卡拉霉素的液体LB中，37℃，250rpm，至OD600＝0.6左右，加入诱导物IPTG至终浓度为0.1mmol/L，继续振荡培养48h，表达突变蛋白。收集蛋白，层析洗脱纯化蛋白。将该蛋白进行SDS-PAGE，结果如图1所示，在图1中，1为分子量标准；2为没有酶蛋白的细胞液；3为存在少量酶蛋白的细胞液；4为存在大量酶蛋白的沉淀；5为经过Ni柱层析滤出的蛋白，6、7、8为蛋白洗脱液(箭头所指为酶蛋白)。从6-8栏蛋白洗脱液中蛋白含量很低说明，该蛋白为一个不稳定的蛋白，主要出现在沉淀中，由于没蛋白不稳定，也无法通过层析的方法进行分离和纯化。
分析琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白序列，经分析认为在第五位和第十五位的两个半胱氨酸很可能是造成蛋白质不稳定的因素，为此，对基因序列进行了改造，把第五位的半胱氨酸突变为苏氨酸，第十五位的半胱氨酸突变为丙氨酸，可以使蛋白质的亲水性增加。突变后氨基酸序列如Seq ID No.2所示。
MTPDSLEHLI QLIKAPSVTP QDGGAFFILV NTLKLLGFSI EEKDFQTKNT SIVKNLYARFGTEAPHLMFA GHIDVVPPGD FNHWTYPPFS ATIAEGKIYG RGIVDMKGSI ACFIAAVARF IPKYKNFGSISLLITGDEEG PAINGTKKML SWIEKKGEKW DACIVGEPTC NHIIGDTIKI GRRGSLSGEI TIHGKQGHVAYPHLTENPIR GLIPLLHQLT NIGFDTGNTT FSPTNMEITT IDVGNPSKNV IPAQVKMSFN IRFNDLWNEKTLKEEIRSRL IKGIQNVPKL SHTVHFSSPV SPVFLTHDRK LTSLLSKSIY NTTGNIPLLS TSGGTSDARFIKDYCPVIEF GLVGRTMHAL NENASLQDLE DLTCIYENFL QNWFITPSQ
利用在线结构预测软件Predictprotein预测原始琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的结构，结果如图2所示。其中被框住且带有下划线序列为helix(螺旋)，被框住无下划线序列为sheet(折叠)。
同样利用在线结构预测软件Predictprotein对突变的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的结构进行预测，结果如图3所示，其中被框住且带有下划线序列为helix(螺旋)，被框住无下划线序列为sheet(折叠)，其他为无规律的卷曲。
从图2和图3在突变位点及结构比较可以看出，突变后蛋白的结构与原始蛋白一致，说明酶的活性应该和突变前一致。
对原始琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白的核酸序列进行突变，突变位置如图4所示，对dapE编码基因前端DNA序列进行突变，突变后DNA序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
然后把突变的DNA序列重组到pET28a载体上，转化到BL21大肠杆菌中进行表达，具体过程为：从-80℃冰箱中取出感受态大肠杆菌BL21，迅速插入湿冰中，溶解约5min，加入1μL含有突变DNA的pET28a(1μg/μL)，轻轻混匀，静置冰上30min于42℃中水浴热休克大肠杆菌90sec，迅速移入湿冰中，静置2min，加入450μL无菌LB培养液，于37℃摇床225rpm震荡培养45min，涂布在含卡拉霉素(100μg/mL)的LB平板上，待干燥后，倒置培养于37℃培养箱中过夜；第二天再接种于含卡拉霉素的液体LB中，37℃，250rpm，至OD600＝0.6左右，加入诱导物IPTG至终浓度为0.1mmol/L，继续振荡培养48h，表达突变蛋白。收集突变蛋白，层析洗脱纯化蛋白。
对得到的突变蛋白进行SDS-PAGE，结果如图5所示，其中，1为分子量标准；2为存在大量酶蛋白的细胞液；3为存在少量酶蛋白的沉淀；4为经过Ni柱层析滤出的蛋白，5和6为蛋白洗脱液液(箭头所指为酶蛋白)。从图5中箭头所指可以看出，突变后蛋白质比未突变蛋白质在溶液中的稳定性大大增强，可以采用层析的方法进行分离和纯化。
3.以流感嗜血杆菌琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白作为模板进行同源模型的构建，得到一具有两个活性中心的二聚体蛋白，分子模拟如图6A所示。
4.根据得到的活性中心，利用分子对接软件autodock，对小分子化合物库(ZINC15数据库)的化合物分子进行分子对接，分子对接示意图如图6B所示。
5.根据对接结果的排序，筛选出其中Ki值达到微摩尔级别的化合物分子作为备选化合物分子，如下表1所示：
表1候选化合物
Figure BDA0002310800050000071
Figure BDA0002310800050000081
上述化合物均含有羧基，能够与琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶的活性位点结合。
实施例2田间筛选治疗柑橘黄龙病的化合物
由于黄龙病菌不能够在实验室培养，因此将表1所列打分较高的四个备选化合物进行田间试验，以确定药物的抑菌效果。
从Sigma-Aldrich公司购买筛选出来的四种备选化合物分子。
1.将备选化合物分子用等摩尔浓度NaOH配制，制成用于给柑橘黄龙病病树吊水的药剂；
配制方法为：
称取1摩尔质量的备选化合物和1摩尔质量的NaOH固体，加入到少量水中，溶解并定容至1升，即制成药剂母液；
2.选生长5年，发现有病的果树，共计12棵，处理剂量如下：0(对照)，处理1(50mM)，处理2(100mM)，处理3(200mM)，每隔一周吊水1升，共治疗5次，累计9周。
3.取样病树叶片样品，提取总DNA；
分别采集100g树枝韧皮部样品，所有采集样品用自封口熟料袋封装后4℃保存，并在一周内处理。
具体处理方法为：
细菌总DNA的提取
取0.1g新鲜有病果树枝条的韧皮部组织，用无菌剪刀剪碎，放入2mL离心管中，加入一颗直径2mm的灭菌钢珠；打样机打至粉末状；立即加入1ml 2×CTAB提取缓冲液(品牌:Solarbio货号:LS00066)，65℃水浴30分钟，其间10分钟摇动一次；然后冷却至室温，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，充分颠倒混匀，室温下，12000r/min离心10-15分钟；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分颠倒混匀，12000r/min，离心10-15分钟。将上清液转入另一离心管中；然后在上清液中加入0.6倍体积的异丙醇混匀，-20℃沉淀30-60分钟，12000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液；加入1ml 70％乙醇混匀，清洗沉淀，12000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液，重复清洗沉淀一次，弃去上清液，常温晾干离心管中残液；然后加入20-30μL水溶解DNA，仪器测定DNA浓度，-20℃保存备用。
4.黄龙病菌的PCR检测
将提取的总DNA浓度全部调整为519ng/μL使用PCR缓冲液10μL；上游引物(5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’)，0.5μL；下游引物(5’GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’)0.5μL；总DNA 2μL，H2O 7μL。PCR扩增程序：94℃4min；94℃30s,55℃30s,72℃80s,25-30cycles；72℃10min，16℃10min。扩增25个循环已经初步看到药物的效果，然后再通过扩增30个循环以进一步累积病菌16SrDNA的浓度。
PCR检测结果如图8和图9所示，图8中第一批样品表示处理前(治疗前)取样，第二批样品表示治疗一个月以后的样品，1-1为阳性对照(青霉素)，2-2为阴性对照(未感病植株)，3-3为化合物-1，3-4为化合物-2，3-5为化合物-3，3-6为化合物-4。图9中第三批样品表示治疗三个月以后的样品，1-1，1-2，1-3均为阳性对照(青霉素)，2-2，3-1为阴性对照(未感病植株)，3-3为化合物-1，3-4为化合物-2，3-5为化合物-3，3-6为化合物-4。
从治疗后一个月和三个月的结果可以看出，通过持续给药治疗，病树中检测到的病菌持续下降。化合物-1，化合物-3，化合物-4都取得了很好的治疗效果，尤其化合物-3的效果最为显著。
上述结果说明，患病植株体内的病菌数，经过治疗大为减少；患病植株的病症减轻
从上述实施例可以看出，本发明提供一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，该方法利用蛋白质模拟出与黄龙病病菌细胞壁合成有重要意义的酶蛋白质dapE的结构，然后以此结构为模型，通过autodock的方法，筛选出一系列与该蛋白质能够对接的化合物，用上述化合物直接在黄龙病病树上吊水，可以发现某些化合物能够减少病树体内的病菌数量，以及病树的病症得到恢复。说明该方法用于筛选黄龙病治疗药物非常有效。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京联合大学
<120> 一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 389
<212> PRT
<213> Candidatus Liberibacter asiaticus
<400> 1
Met Thr Pro Asp Cys Leu Glu His Leu Ile Gln Leu Ile Lys Cys Pro
1 5 10 15
Ser Val Thr Pro Gln Asp Gly Gly Ala Phe Phe Ile Leu Val Asn Thr
20 25 30
Leu Lys Leu Leu Gly Phe Ser Ile Glu Glu Lys Asp Phe Gln Thr Lys
35 40 45
Asn Thr Ser Ile Val Lys Asn Leu Tyr Ala Arg Phe Gly Thr Glu Ala
50 55 60
Pro His Leu Met Phe Ala Gly His Ile Asp Val Val Pro Pro Gly Asp
65 70 75 80
Phe Asn His Trp Thr Tyr Pro Pro Phe Ser Ala Thr Ile Ala Glu Gly
85 90 95
Lys Ile Tyr Gly Arg Gly Ile Val Asp Met Lys Gly Ser Ile Ala Cys
100 105 110
Phe Ile Ala Ala Val Ala Arg Phe Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Phe Gly
115 120 125
Ser Ile Ser Leu Leu Ile Thr Gly Asp Glu Glu Gly Pro Ala Ile Asn
130 135 140
Gly Thr Lys Lys Met Leu Ser Trp Ile Glu Lys Lys Gly Glu Lys Trp
145 150 155 160
Asp Ala Cys Ile Val Gly Glu Pro Thr Cys Asn His Ile Ile Gly Asp
165 170 175
Thr Ile Lys Ile Gly Arg Arg Gly Ser Leu Ser Gly Glu Ile Thr Ile
180 185 190
His Gly Lys Gln Gly His Val Ala Tyr Pro His Leu Thr Glu Asn Pro
195 200 205
Ile Arg Gly Leu Ile Pro Leu Leu His Gln Leu Thr Asn Ile Gly Phe
210 215 220
Asp Thr Gly Asn Thr Thr Phe Ser Pro Thr Asn Met Glu Ile Thr Thr
225 230 235 240
Ile Asp Val Gly Asn Pro Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Gln Val Lys
245 250 255
Met Ser Phe Asn Ile Arg Phe Asn Asp Leu Trp Asn Glu Lys Thr Leu
260 265 270
Lys Glu Glu Ile Arg Ser Arg Leu Ile Lys Gly Ile Gln Asn Val Pro
275 280 285
Lys Leu Ser His Thr Val His Phe Ser Ser Pro Val Ser Pro Val Phe
290 295 300
Leu Thr His Asp Arg Lys Leu Thr Ser Leu Leu Ser Lys Ser Ile Tyr
305 310 315 320
Asn Thr Thr Gly Asn Ile Pro Leu Leu Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ser
325 330 335
Asp Ala Arg Phe Ile Lys Asp Tyr Cys Pro Val Ile Glu Phe Gly Leu
340 345 350
Val Gly Arg Thr Met His Ala Leu Asn Glu Asn Ala Ser Leu Gln Asp
355 360 365
Leu Glu Asp Leu Thr Cys Ile Tyr Glu Asn Phe Leu Gln Asn Trp Phe
370 375 380
Ile Thr Pro Ser Gln
385
<210> 2
<211> 389
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Pro Asp Ser Leu Glu His Leu Ile Gln Leu Ile Lys Ala Pro
1 5 10 15
Ser Val Thr Pro Gln Asp Gly Gly Ala Phe Phe Ile Leu Val Asn Thr
20 25 30
Leu Lys Leu Leu Gly Phe Ser Ile Glu Glu Lys Asp Phe Gln Thr Lys
35 40 45
Asn Thr Ser Ile Val Lys Asn Leu Tyr Ala Arg Phe Gly Thr Glu Ala
50 55 60
Pro His Leu Met Phe Ala Gly His Ile Asp Val Val Pro Pro Gly Asp
65 70 75 80
Phe Asn His Trp Thr Tyr Pro Pro Phe Ser Ala Thr Ile Ala Glu Gly
85 90 95
Lys Ile Tyr Gly Arg Gly Ile Val Asp Met Lys Gly Ser Ile Ala Cys
100 105 110
Phe Ile Ala Ala Val Ala Arg Phe Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Phe Gly
115 120 125
Ser Ile Ser Leu Leu Ile Thr Gly Asp Glu Glu Gly Pro Ala Ile Asn
130 135 140
Gly Thr Lys Lys Met Leu Ser Trp Ile Glu Lys Lys Gly Glu Lys Trp
145 150 155 160
Asp Ala Cys Ile Val Gly Glu Pro Thr Cys Asn His Ile Ile Gly Asp
165 170 175
Thr Ile Lys Ile Gly Arg Arg Gly Ser Leu Ser Gly Glu Ile Thr Ile
180 185 190
His Gly Lys Gln Gly His Val Ala Tyr Pro His Leu Thr Glu Asn Pro
195 200 205
Ile Arg Gly Leu Ile Pro Leu Leu His Gln Leu Thr Asn Ile Gly Phe
210 215 220
Asp Thr Gly Asn Thr Thr Phe Ser Pro Thr Asn Met Glu Ile Thr Thr
225 230 235 240
Ile Asp Val Gly Asn Pro Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Gln Val Lys
245 250 255
Met Ser Phe Asn Ile Arg Phe Asn Asp Leu Trp Asn Glu Lys Thr Leu
260 265 270
Lys Glu Glu Ile Arg Ser Arg Leu Ile Lys Gly Ile Gln Asn Val Pro
275 280 285
Lys Leu Ser His Thr Val His Phe Ser Ser Pro Val Ser Pro Val Phe
290 295 300
Leu Thr His Asp Arg Lys Leu Thr Ser Leu Leu Ser Lys Ser Ile Tyr
305 310 315 320
Asn Thr Thr Gly Asn Ile Pro Leu Leu Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ser
325 330 335
Asp Ala Arg Phe Ile Lys Asp Tyr Cys Pro Val Ile Glu Phe Gly Leu
340 345 350
Val Gly Arg Thr Met His Ala Leu Asn Glu Asn Ala Ser Leu Gln Asp
355 360 365
Leu Glu Asp Leu Thr Cys Ile Tyr Glu Asn Phe Leu Gln Asn Trp Phe
370 375 380
Ile Thr Pro Ser Gln
385
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgcgtatgc aatacgagcg gca 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcctcgcgac ttcgcaaccc at 22

Claims (6)

1.一种用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）使用流感嗜血杆菌琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因通过GenBank数据库比对柑橘黄龙病菌亚洲种的全基因组，得到柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶基因，其编码蛋白质的氨基酸序列如Seq ID No.1所示；
2）对该柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质序列第5位和第15位氨基酸进行突变，得到氨基酸序列如Seq ID No.2所示的蛋白质；
3）以流感嗜血杆菌琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质作为模板对突变后的柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶进行蛋白质同源模型的构建，得到突变后的柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质为一具有两个活性中心的二聚体蛋白；
4）根据得到二聚体蛋白的两个活性中心，利用分子对接软件autodock，对小分子化合物库的化合物分子进行分子对接打分；
5）根据对接结果的排序，筛选出其中抑制常数Ki值达到微摩尔级别的化合物分子作为备选化合物分子；
6）将备选化合物分子用等摩尔浓度NaOH配制，或者加氢氧化钠到pH等于7.0，制成用于给柑橘黄龙病病树吊水的药剂母液；
7）选生长年份相同的有病果树，分为对照组，50mM组，100mM组，200mM组，将步骤6）制备的药剂按照对应组别用水进行稀释成用于吊水的药剂，每隔一周吊水1升，共治疗5次，累计9周；
8）取治疗后一个月和三个月各组有病果树枝条的韧皮部组织，提取总DNA；
9）采用PCR的方法扩增黄龙病菌16SrDNA，扩增的片段长度为1160bp，根据扩增片段的浓度检测病菌浓度，选择其中病菌浓度下降最多的备选化合物分子即目的化合物分子。
2.如权利要求1所述的用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述对柑橘黄龙病菌亚洲种琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶蛋白质序列第5位和第15位氨基酸进行改造，是将第5位的半胱氨酸突变为苏氨酸，第15位的半胱氨酸突变为丙氨酸。
3.如权利要求1所述的用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，其特征在于，步骤8）所述提取总DNA的步骤为：取0.1g新鲜有病果树枝条的韧皮部组织，用无菌剪刀剪碎，放入2mL离心管中，加入一颗直径2mm的灭菌钢珠；打样机打至粉末状；立即加入1ml 2×CTAB提取缓冲液，65℃水浴30分钟，其间10分钟摇动一次；然后冷却至室温，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，充分颠倒混匀，室温下，12000r/min 离心10-15分钟；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分颠倒混匀，12000r/min，离心10-15分钟；将上清液转入另一离心管中；然后在上清液中加入0.6倍体积的异丙醇混匀，-20℃沉淀30-60分钟，12000r/min 4℃ 离心10分钟，弃去上清液；加入1ml 70%乙醇混匀，清洗沉淀，12000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液，重复清洗沉淀一次，弃去上清液，常温晾干离心管中残液；然后加入20-30μL水溶解DNA，仪器测定DNA浓度，-20℃保存备用。
4.如权利要求3所述的用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，其特征在于，所述酚-氯仿-异戊醇混合液由酚、氯仿、异戊醇按照体积比酚：氯仿：异戊醇=25:24:1混合而成；所述氯仿-异戊醇混合液由氯仿、异戊醇按照体积比氯仿：异戊醇=24:1混合而成。
5.如权利要求1所述的用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，其特征在于，步骤9）所述PCR的反应体系为：
PCR缓冲液10 μL；
上游引物，0.5 μL；
下游引物0.5 μL；
总DNA 1μL；
H2O 8μL；
PCR扩增程序为：94℃ 4 min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 80s，25-30循环，72℃ 10min，16℃ 10 min；
其中，上游引物序列如Seq ID No.3所示，下游引物如Seq ID No.4所示；总DNA浓度调整为519 ng/μL。
6.如权利要求1所述的用于治疗柑橘黄龙病的药物的筛选方法，其特征在于，步骤6）所述用等摩尔浓度NaOH配制的方法为：称取1摩尔质量的备选化合物和1摩尔质量的NaOH固体，加入到少量水中，溶解并定容至1升，即制成药剂母液；
所述加氢氧化钠到pH等于7的配制方法为：称取1摩尔质量的备选化合物加入到少量水中，溶解后用NaOH固体调节pH至7.0，定容至1升，即制成药剂母液。
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