RU2618850C2

RU2618850C2 - Плазмидный вектор pET-mChBac75Na, штамм бактерии Eschrichia coli BL21(DE3/ pET-mChBac75Na для экспрессии антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5 Nα и способ получения указанного пептида

Info

Publication number: RU2618850C2
Application number: RU2016123389A
Authority: RU
Inventors: Сергей Владимирович Баландин; Илья Александрович Болосов; Павел Валерьевич Пантелеев; Владимир Николаевич Кокряков; Ольга Валерьевна Шамова; Татьяна Владимировна Овчинникова
Priority date: 2016-06-14
Filing date: 2016-06-14
Publication date: 2017-05-11
Also published as: RU2016123389A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантному получению антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα из лейкоцитов козы Capra hircus, который может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве антибиотика широкого спектра действия. Конструируют плазмидный вектор рЕТ-mChBac75Na для экспрессии минибактенецина ChBac7.5Nα в клетках Escherichia coli в составе гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα. Трансформируют данным вектором родительский штамм Escherichia coli BL21(DE3), получая штамм-продуцент гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα. Далее проводят культивирование клеток штамма-продуцента, осуществляют лизис клеток, аффинную очистку гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα на металлохелатном носителе в денатурирующих условиях, расщепление гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα бромцианом в 6М гидрохлориде гуанидина и финальную очистку целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Изобретение позволяет получить биологически активный минибактенецин ChBac7.5Nα по упрощенной технологии. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению минибактенецина ChBac7.5Nα - пролин-богатого антимикробного пептида из лейкоцитов козы Capra hircus, который может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве антибиотика широкого спектра действия.

Антимикробные пептиды (АМП) нейтрофилов играют важную роль в реализации защитных функций организма человека и животных [Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете. СПб.: Наука, 2006. 261 с]. Среди известных к настоящему времени АМП кателицидины животных отряда парнокопытных привлекают особое внимание исследователей благодаря высокой антимикробной активности и сочетанию свойств, делающих эти пептиды перспективными с точки зрения практического применения. Среди пептидов, выделенных из лейкоцитов животных этой группы, - такие АМП, как протегрины свиньи, бактенецины коровы, PR-39 свиньи, ВМАР-27, -28 коровы, SMAP-29 овцы, додекапептид и индолицидин коровы. Минибактенецин ChBac7.5Nα из лейкоцитов козы (SEQ ID No. 1) является N-концевым фрагментом ранее изученного пептида ChBac7.5 и имеет структурное сходство с N-концевой частью бактенецина Вас7 быка. Минибактенецин ChBac7.5Nα проявляет высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных бактерий, включая антибиотикорезистентные штаммы, обладает липополисахарид-связывающей активностью, не вызывает гемолиза эритроцитов и не проявляет токсичности по отношению к культивируемым клеткам человека, что дает основание рассматривать это соединение как перспективный прототип для разработки на его основе новых антибактериальных терапевтических препаратов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения бактенецина Вас7 быка, включающий стадии получения лейкоцитарной массы, кислотной экстракции белков и пептидов, диализа, катионообменной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [Gennaro R., Skerlavaj В., Romeo D. // Infect Immun. 1989. 57(10): 3142-3146]. К недостатку способа можно отнести необходимость переработки больших объемов крови для получения пептида в количествах, необходимых для его применения в медицинской и ветеринарной практике.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента биологически активных пептидов и получения антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα.

Поставленная задача решается за счет конструирования экспрессирующего плазмидного вектора pET-mChBac75Nα, состоящего из двух фрагментов ДНК:

- BglII/XhoI-фрагмента с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No. 2, который содержит промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, lac-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий восемь остатков гистидина, модифицированный белок-носитель тиоредоксин A Escherichia coli (TrxL) и антимикробный пептид минибактенецин ChBac7.5Nα;

- BglII/XhoI-фрагмента плазмиды рЕТ-20b(+), который содержит терминатор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген β-лактамазы.

Поставленная задача решается также за счет создания штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pET-mChBac75Na - продуцента гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα, получаемого путем трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) указанным вектором pET-mChBac75Nα, а также за счет способа получения антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα, включающего культивирование указанного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET-mChBac75Na, разрушение клеток, аффинную очистку гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα (SEQ ID No. 3) на металлохелатном носителе в денатурирующих условиях, расщепление гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα бромцианом в 6М гидрохлориде гуанидина и очистку целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

В состав заявленного вектора pET-mChBac75Na включают регуляторные элементы, контролирующие экспрессию гибридного белка: промотор и терминатор для РНК-полимеразы бактериофага Т7, lac-оператор, консенсусный сайт связывания бактериальной рибосомы, стартовый и стоп-кодоны. В состав заявленного вектора также входят сайт инициации репликации (Ori) плазмиды pBR322 и маркерный ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных вектором pET-mChBac75Na клеток Escherichia coli к ампициллину и позволяющий проводить отбор клеток, содержащих векторную ДНК, путем выращивания на соответствующей селективной питательной среде. Токсичность целевого пептида в отношении микроорганизма-продуцента в предлагаемой системе нейтрализуется за счет использования белка-носителя тиоредоксина, а также за счет использования строгого контроля экспрессии с промотора бактериофага Т7. Наряду с этим, тиоредоксин обеспечивает высокий уровень накопления гибридного белка в цитоплазме Escherichia coli. Необходимость использования белка-носителя обусловлена также возможностью его деградации в гетерологичной системе. Для высвобождения пептида минибактенецина ChBac7.5Nα из молекулы гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα между последовательностями тиоредоксина и целевого пептида вводят остаток метионина, позволяющий проводить избирательное расщепление гибридного полипептида бромцианом. Используемый в предлагаемом изобретении вариант тиоредоксина содержит замену внутреннего остатка метионина на лейцин (M37L), что уменьшает число индивидуальных полипептидных фрагментов, образующихся в результате реакции с бромцианом. Очистку целевого пептида упрощают за счет включения в состав гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα аффинной метки - последовательности из восьми остатков гистидина, позволяющей проводить очистку гибридного полипептида методом аффинной хроматографии на сорбентах с иммобилизованными (хелатированными) ионами металлов, т.е. металлохелатную очистку.

Конструирование плазмидного вектора pET-mChBac75Na для экспрессии гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα, содержащего последовательность минибактенецина ChBac7.5Nα, может быть осуществлено путем лигирования BglII/XhoI-фрагмента плазмиды pET-20b(+) (Novagen), содержащего область инициации репликации, Т7 терминатор, гены β-лактамазы и LacI, со вставкой, кодирующей ген гибридного белка. Вставка, которая кодирует гибридный белок, может быть получена химическим синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей сборкой и амплификацией промежуточных и конечного продуктов при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выбор структуры олигонуклеотидных праймеров для синтеза каждого из структурных элементов (промотора, оператора, сайта связывания рибосомы, тиоредоксина, октагистидиновой последовательности, минибактенецина ChBac7.5Nα) основывают на данных по их нуклеотидным последовательностям, доступных из открытых источников (банки данных GenBank, EMBL-Bank, DDBJ). Матрицей для амплификации последовательности тиоредоксина служит бактериальный геном либо плазмида рЕТ-32а(+) (Novagen). Замену метионинового кодона в составе тиоредоксина (M37L) осуществляют на стадии сборки методом направленного мутагенеза при помощи ПЦР. Перед лигированием для получения липких концов очищенный ампликон и плазмидный вектор обрабатывают рестриктазами. Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки штамма Escherichia coli с выключенной системой рекомбинации и рестрикции ДНК, например, штамма DH5α, DH10B или XL1-Blue. Отбор клонов, содержащих плазмидный вектор со вставкой, проводят при помощи ПЦР и рестрикционного анализа выделенной векторной ДНК. Правильность сборки конструкции определяют секвенированием векторной ДНК.

Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET-mChBac75Na - продуцент гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα, содержащего последовательность целевого пептида минибактенецина ChBac7.5Nα, - получают путем трансформации препаратом векторной ДНК pET-mChBac75Na компетентных клеток Escherichia coli и отбора клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок. Наличие и уровень экспрессии рекомбинантного белка контролируют с помощью ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях. В качестве родительского штамма для создания штамма-продуцента используют Escherichia coli BL21(DE3). Преимущество использования данного штамма в качестве основы для создания штамма-продуцента заключается в том, что BL21 (DE3) обладает фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого гибридного белка и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Escherichia coli. В хромосомную ДНК BL21(DE3) интегрирован ген Т7 РНК-полимеразы, который совместно с Т7 промотором и Т7 терминатором в плазмидном векторе pET-mChBac75Na обеспечивает продукцию гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα клетками Escherichia coli при индукции изопропилтио-β-D-галактозидом (ИПТГ) или лактозой. Базальная экспрессия (до момента добавления индуктора) Т7 РНК-полимеразы и гибридного белка поддерживается на минимальном уровне благодаря наличию системы контроля на основе lас-операторов и гена lac-репрессора, присутствующего в хромосоме штамма-продуцента.

Клетки штамма-продуцента сохраняют культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки родительского штамма Escherichia coli. Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные, хорошо растут на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). Рост в жидких средах характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует. Клетки растут при температуре от 4°С до 42°С при рН от 6,8 до 7,5; в качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения и их смеси: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмидном векторе pET-mChBac75Na гена β-лактамазы.

Штамм-продуцент хранят на чашках и косяках при температуре 4°С, пересевая на свежие среды один раз в месяц, а также при температуре минус 70°С и более низкой в консервирующих средах с добавлением 10-30% глицерина.

Биосинтез продукта (экспрессию) проводят следующим образом: клетки штамма-продуцента выращивают в питательной среде (например, LB, MBL или М9) с добавлением необходимого селектирующего агента (100 мкг/мл ампициллина) при температуре от 20°С до 37°С до достижения культурой средней или поздней логарифмической фазы роста, ступенчато увеличивая объем культуральной жидкости путем последовательных пересевов материала, после чего индуцируют синтез гибридного белка добавлением изопропилтио-β-D-галактозида или лактозы и инкубируют дополнительно в течение 2-24 ч при температуре от 20°С до 37°С. Увеличения выхода гибридного белка достигают с помощью принудительной аэрации культуральной жидкости и культивирования штамма-продуцента на обогащенных питательных средах (например, с добавлением глюкозы, глицерина, дикарбоновых кислот, аминокислот, неорганических солей, в т.ч. содержащих микроэлементы).

Очистка антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα включает следующие обязательные стадии: разрушение клеток, аффинную очистку гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα на металлохелатном носителе в денатурирующих условиях, расщепление гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα бромцианом в 6М гидрохлориде гуанидина и очистку целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Для очистки клеточного материала от примесей, содержащихся в культуральной жидкости, особенно при выделении гибридного белка из клеточной культуры с низкой плотностью, желательным является предварительное концентрирование клеток с помощью центрифугирования или фильтрации. Разрушение (лизис) клеток осуществляют физическим или химическим способом или комбинацией способов, например, с помощью ультразвукового дезинтегратора, Френч-пресса, дезинтегратора Гаулина, либо с использованием осмотического шока, детергентов, хаотропных агентов, гидролитических ферментов (лизоцим, ДНКаза). С целью снижения нагрузки на аффинный сорбент нерастворимые примеси из клеточного лизата должны быть удалены центрифугированием или фильтрацией. Для металлохелатной очистки может быть использован сорбент, содержащий такие хелатирующие группы, как иминодиацетат (IDA), нитрилотриацетат (NTA) или карбоксиметиласпартат (СМА, TALON) в комплексе с катионами Ni²⁺ Со²⁺ или Cu²⁺ [Chaga G.S. (2001) J Biochem Biophys Methods. 49(1-3): 313-34]. Элюирование гибридного белка проводят, уменьшая рН буферного раствора или увеличивая концентрацию имидазола либо добавляя в буферный раствор ЭДТА. Реакцию с бромцианом проводят, растворяя белок в 6М гидрохлориде гуанидина с добавлением 0,1М соляной кислоты, вносят бромциан в 10-200-кратном стехиометрическом избытке по отношению к числу остатков метионина в образце, инкубируют в темноте в течение 16-20 ч. После этого проводят очистку продуктов реакции расщепления гибридного белка с помощью повторной металлохелатной хроматографии, разделяя таким образом целевой пептид, белок-носитель и нерасщепленный гибридный белок. Очистку минибактенецина ChBac7.5Nα проводят методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в системе ацетонитрил-вода с добавлением 0,1% ТФУ, используя градиент концентрации ацетонитрила. Степень чистоты пептида может быть повышена путем повторной очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Соответствие полученного препарата природному минибактенецину ChBac7.5Nα устанавливают методами ПААГ-электрофореза в денатурирующих услових, МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии, секвенированием N-концевой аминокислотной последовательности, тестированием антимикробной активности методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Для определения N-концевой аминокислотной последовательности применяют автоматическое микросеквенирование, основанное на химической деградации полипептидной цепи по методу Эдмана, позволяющему последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки и идентифицировать в виде фенилтиогидантоинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Степень очистки целевого пептида определяют методами ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях и МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии, а также с помощью повторной обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

Фиг. 1. Физическая карта плазмидного вектора для экспрессии антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα: BglII, XhoI - сайты рестрикции; pBR322 Ori -участок инициации репликации плазмиды; bla - ген устойчивости к β-лактамным антибиотикам; Т7 promoter - промотор транскрипции; Т7 terminator - терминатор транскрипции; lac operator - сайт связывания lac-репрессора; RBS - сайт связывания рибосомы; His8-TrxL-mChBac75Na - последовательность, кодирующая гибридный белок, содержащий минибактенецин ChBac7.5Nα.

Фиг. 2. Хроматограмма очистки рекомбинантного минибактенецина ChBac7.5Nα методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (звездочкой указан пик, соответствующий целевому пептиду).

Фиг. 3. МАЛДИ масс-спектр минибактенецина ChBac7.5Nα, полученного генно-инженерным способом.

Таблица. Антимикробная активность минибактенецина ChBac7.5Nα, полученного генно-инженерным способом.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Конструирование плазмидного вектора pET-mChBac75Nα

Нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2, содержащую промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, lac оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид (последовательно связанные гистидиновый октамер, тиоредоксин с заменой M37L, сайт расщепления бромцианом и минибактенецин ChBac7.5Nα), получают химико-ферментативным синтезом с помощью ПЦР. Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР, синтезируют твердофазным фосфорамидитным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфорамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом.

Фрагмент, кодирующий белок-носитель тиоредоксин (M37L), получают методом ПЦР-амплификации и направленного мутагенеза с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве исходной матрицы плазмиду рЕТ32а(+), содержащую ген тиоредоксина. Остальные участки последовательности pET-mChBac75Na получают путем последовательного отжига и элонгации взаимно перекрывающихся олигонуклеотидов, а также отжига, элонгации и амплификации промежуточных продуктов синтеза. На завершающей стадии синтеза последовательность амплифицируют с помощью праймеров, несущих на 5'-концах сайты узнавания рестриктаз BglII и XhoI. Продукт амплификации гидролизуют указанными рестриктазами, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, полосу ДНК величиной 573 п. н. выделяют из геля с помощью колонок с силикагелем и лигируют с фрагментом ДНК размером 3,49 тыс.п.н., полученным в результате обработки плазмиды рЕТ-20b(+) рестриктазами BglII и XhoI. В результате лигазной реакции получают кольцевую ковалентно замкнутую ДНК размером 4084 п.н. (фиг. 1). Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки Escherichia coli DH10B, приготовленные с помощью 0,1 М хлорида кальция. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°C и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.

Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляют методом «ПЦР с клонов» с использованием праймеров на плазмидный остов и вставку. Отобранные клоны подращивают в жидкой питательной среде и выделяют плазмидную ДНК, которую анализируют на наличие вставки с помощью рестрикционного анализа. Окончательное строение плазмид, содержащих требуемый фрагмент, подтверждают определением нуклеотидной последовательности с помощью секвенирования по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирают плазмиду со вставкой, нуклеотидная последовательность которой полностью соответствует запланированной (SEQ ID No. 2).

Пример 2.

Получение штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET-mChBac75Na, вырабатывающего гибридный белок His8-TrxL-mChBac75Nα, и определение его продуктивности

Проводят трансформацию компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3), приготовленных с помощью 0,1М хлорида кальция, плазмидой pET-mChBac75Na, полученной согласно примеру 1. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°C и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина и 0,5% глюкозы. Чашки инкубируют при 37°C в течение 18 ч.

Бактериологической петлей переносят выросшие колонии в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, подращивают до оптической плотности OD₆₀₀ 0,7 на термостатируемой качалке со скоростью вращения 200 об⋅мин^-1 при температуре 37°C, отбирают 0,3 мл культуры для последующего электрофоретического анализа, добавляют индуктор - изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают инкубацию при температуре 37°C в течение 5 ч, отбирая каждый час пробы по 0,3 мл для определения оптической плотности OD₆₀₀ и последующего электрофоретического анализа. Равные аликвоты суспензии клеток, отобранных до внесения индуктора и после завершения роста, центрифугируют, отделяют супернатант и анализируют осадок клеток ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях. Для этого образцы лизируют буфером, содержащим 2% додецилсульфат натрия (SDS), на водяной бане в течение 5 мин. Электрофорез проводят в 15% ПААГ в присутствии SDS. Гель прокрашивают 0,1% кумасси G-250 в присутствии 25% изопропилового спирта. Появление отчетливой полосы в районе 16,4 кДа в образцах, отобранных после индукции, свидетельствует о способности штамма синтезировать гибридный полипептид His8-TrxL-mChBac75Nα.

Пример 3.

Получение рекомбинантного антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα

Клетки штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET-mChBac75Na, полученного согласно примеру 2, выращивают в богатой питательной среде LB с добавлением 20 мМ глюкозы, 1 мМ MgSO₄, 0,1 мМ CaCl₂, 5 мкМ FeCl₂, 100 мкг/мл ампициллина до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀ 1,0 при температуре 37°C. Индукцию синтеза белка проводят с помощью изопропилтио-β-D-галактозида в концентрации 0,2 мМ, после чего инкубируют 6 ч при температуре 37°C. Уровень экспрессии гибридного белка, а также содержание гибридного белка, белка-носителя и минибактенецина ChBac7.5Nα в препарате на последующих стадиях очистки определяют с помощью ПААГ-электрофореза в трис-трициновой буферной системе в денатурирующих условиях.

По окончании ферментации клеточную биомассу отделяют центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин, ресуспендируют в буфере А (100 мМ фосфатный буфер, рН 7,8, содержащий 6М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол). После этого клетки разрушают с помощью ультразвукового гомогенизатора. Полученный лизат центрифугируют (осветляют) при 25000 g в течение 20 мин. Все работы по получению осветленного лизата проводят при температуре 4°C. Супернатант наносят на предварительно уравновешенную колонку с Ni-NTA агарозой (Qiagen) из расчета 1 г суммарного белка на 100 мл смолы. Колонку промывают буфером А. Фракцию, обогащенную рекомбинантным белком, элюируют 100 мМ фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 6М гуанидин-HCl и 0,5 мМ имидазол, и подвергают диализу против 100 объемов 1% раствора уксусной кислоты в деионизированной воде при температуре 4°C в течение 18 ч через диализную мембрану, удерживающую молекулы с массой более 10 кДа. Полученный раствор белка лиофильно высушивают.

Очищенный гибридный белок His8-TrxL-mChBac75Nα растворяют в 6М гидрохлориде гуанидина с 0,1М HCl в концентрации 5%, добавляют равную массу бромциана (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°C в защищенном от света месте в течение 16 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего образец лиофильно высушивают. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют трижды.

Продукты реакции растворяют в воде до исходной концентрации белка 5%, оттитровывают 1М NaOH до рН 5.0. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин и отбрасывают. Разделение продуктов реакции расщепления и очистку минибактенецина ChBac7.5Nα проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на препаративных колонках в системе ацетонитрил-вода с добавлением 0,1% ТФУ (фиг. 2). Детектирование ведут при длине волны 214 нм. Фракцию, содержащую минибактенецин ChBac7.5Nα, собирают и лиофильно высушивают.

Для определения N-концевой аминокислотной последовательности минибактенецина ChBac7.5Nα применяют автоматическое микросеквенирование на приборе Precise 491 cLC Protein Sequencing System (РЕ Applied Biosystems). Идентификацию фенилтиогидантоин-производных аминокислот проводят на анализаторе 120 А РТН Analyzer (РЕ Applied Biosystems). С помощью автоматического микросеквенирования устанавливают идентичность аминокислотных последовательностей генно-инженерного и природного минибактенецина ChBac7.5Nα.

Для определения молекулярной массы очищенного белка используют МАЛДИ-времяпролетный масс-спектрометрический анализ на приборе Reflex III (Bruker Daltonics), оснащенном УФ-лазером с длиной волны 336 нм. В качестве матрицы используют 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 20% ацетонитрил и 0,1% трифторуксусную кислоту. Полученный пик с m/z 2894,37 (фиг. 3) соответствует молекулярному иону природного минибактенецина ChBac7.5Nα (расчетная молекулярная масса 2894,81).

Пример 4.

Тестирование антимикробной активности рекомбинантного минибактенецина ChBac7.5Nα

Антимикробную активность рекомбинантного минибактенецина ChBac7.5Nα, полученного согласно примеру 3, определяют методом двукратных серийных разведений пептида в жидкой питательной среде LB/2 и инкубации с тестовыми культурами (Staphylococcus aureus 209Р, Escherichia coli С600, Pseudomonas РА01)

Тест-культуры высевают из консерва в 10 мл жидкой среды Мюллера-Хинтона (МНВ) и растят в течение 16 ч при 37°C и 220 об⋅мин^-1. Аликвоту культуры объемом 300 мкл добавляют к 6 мл среды МНВ и инкубируют на роторной качалке при 37°С до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀~1,0. После этого осаждают клетки центрифугированием и ресуспендируют в питательной среде в концентрации 4⋅10⁵ КОЕ/мл. В качестве питательной среды для инкубации с пептидом используется среда МНВ в двух модификациях: с добавлением физиологической концентрации NaCl (1%) и без добавления NaCl. В состав среды также входит 0.05% бычий сывороточный альбумин (БСА, BSA) для предотвращения сорбции пептида на пластике.

Тестирование проводят в полистироловых 96-луночных планшетах. Аликвоты тест-культур объемом 50 мкл добавляют к 50 мкл раствора полипептида, предварительно разведенного от 25 до 0,2 мкМ в пересчете на конечную концентрацию в лунке. После добавления культуры планшет инкубируют в течение 24 ч при 37°C и интенсивном перемешивании со скоростью 900 об⋅мин^-1. Значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) определяют визуально и спектрофотометрически при длине волны 600 нм как минимальную концентрацию пептида, при которой отсутствует рост микроорганизмов. Эксперименты проводят три раза в трехкратной повторности, причем итоговый МИК рассчитывают как медиану девяти полученных значений. Полученные данные представлены в Таблице.

Пример 5. Тестирование гемолитической активности рекомбинантного минибактенецина ChBac7.5Nα

Для тестирования гемолитической активности пептида, полученного согласно примеру 3, используют свежевыделенные человеческие эритроциты. Для предотвращения свертывания к цельной крови добавляют нитратный буфер. Кровь центрифугируют в растворе фиколла и урографина, плотностью 1,077 г/мл, в течение 15 мин при 1500 об⋅мин^-1. Фракцию эритроцитов отбирают со дна и трижды промывают двадцатью объемами изотонического натрий-фосфатного буфера (рН 7,4) с последовательным осаждением эритроцитов путем центрифугирования при 2000 об⋅мин^-1 в течение 10 мин. После отмывки эритроцитов готовят их 8% суспензию в изотоническом натрий-фосфатном буфере (PBS).

Для теста в 96-луночном планшете проводят серии двойных разведений исследуемого полипептида от 100 до 0,8 мкМ (в пересчете на конечную концентрацию) объемом 50 мкл. В качестве отрицательного контроля («К-») используют супернатант, полученный после центрифугирования эритроцитов, инкубировавшихся в растворе натрий-фосфатного буфера без добавления полипептидов. В качестве положительного контроля («К+») используют 100 мМ мелиттин - мембранолитический пептид из яда пчелы Apis mellifera. После этого в опытные и контрольные лунки добавляют по 50 мкл 8% суспензии эритроцитов. Планшет инкубируют в течение 1,5 ч при 37°C и перемешивании со скоростью 1000 об⋅мин^-1. После инкубации планшеты центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об⋅мин^-1 для осаждения интактных эритроцитов. Далее аликвоты супернатанта переносят в другой планшет для измерения количества свободного гемоглобина. Оценку содержания гемоглобина в растворе осуществляют по поглощению раствора при 405 нм. Эксперименты проводят дважды с кровью одного и того же человека в трехкратной повторности.

Процент гемолиза рассчитывают по формуле:

Гемолиз (%)=(OD₄₀₅ пробы - OD₄₀₅ «К-»)×100%/(OD₄₀₅ «К+» - OD₄₀₅ «К-»).

Определенные по данной методике значения для 0,8-100 мкМ растворов рекомбинантного минибактенецина ChBac7.5Nα укладываются в диапазон 0,33-1,05% (±0,3%).

Аминокислотные и нуклеотидные последовательности

SEQ ID No. 1

SEQ ID No. 2

SEQ ID No. 3

SEQUENCE LISTING

<110> ИБХ РАН

Баландин, Сергей

Болосов, Илья

Пантелеев, Павел

Кокряков, Владимир

Шамова, Ольга

Овчинникова, Татьяна

<120> ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-mChBac75Na, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli

BL21(DE3)/ pET-mChBac75Na ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА

МИНИБАКТЕНЕЦИНА ChBac7.5N? И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА

<130> (Reference Number)

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> Capra hircus

<400> 1

Arg Arg Leu Arg Pro Arg Arg Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg

1 5 10 15

Pro Arg Pro Arg Pro Arg

20

<210> 2

<211> 578

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Genetically engineered sequence

<400> 2

agatctgcgg gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc 60

ggataacaat tcccctctag agtcgacgga tcttacttta agaaggagat atacatatga 120

gccatcacca ccaccatcac catcacggat ctagcgataa aattattcac ctgactgacg 180

acagttttga cacggatgta ctcaaagcgg acggggcgat cctcgtcgat ttctgggcag 240

agtggtgcgg tccgtgcaaa ctgatcgccc cgattctgga tgaaatcgct gacgaatatc 300

agggcaaact gaccgttgca aaactgaaca tcgatcaaaa ccctggcact gcgccgaaat 360

atggcatccg tggtatcccg actctgctgc tgttcaaaaa cggtgaagtg gcggcaacca 420

aagtgggtgc actgtctaaa ggtcagttga aagagttcct cgacgctaac ctggccggat 480

ctcatatgcg ccgtctgcgc ccgcgtcgcc ctcgtctgcc gcgccctcgc ccgcgtccgc 540

gtccgcgccc gcgttaagga tccgcgaatt ctctcgag 578

<210> 3

<211> 146

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Genetically engineered sequence

<400> 3

Met Ser His His His His His His His His Gly Ser Ser Asp Lys Ile

1 5 10 15

Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp

20 25 30

Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys

35 40 45

Leu Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys

50 55 60

Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro

65 70 75 80

Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly

85 90 95

Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys

100 105 110

Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser His Met Arg Arg Leu Arg

115 120 125

Pro Arg Arg Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg

130 135 140

Pro Arg

145

Claims

1. Плазмидный вектор pET-mChBac75Na для экспрессии в клетках Escherichia coli антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα в составе гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα, состоящий из двух фрагментов ДНК:

BglII/XhoI-фрагмента с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No. 2, содержащего промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, lac-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий октагистидиновую последовательность, белок тиоредоксин и минибактенецин ChBac7.5Nα;

BglII/XhoI-фрагмента плазмиды рЕТ-20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген β-лактамазы.

2. Штамм бактерии Escherichia coli BL21(DE3)/pET-mChBac75Na - продуцент гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα, получаемый путем трансформации клеток родительского штамма BL21(DE3) плазмидным вектором pET-mChBac75Na по п. 1.

3. Способ получения антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα, включающий экспрессию гена гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα в штамме-продуценте Escherichia coli BL21(DE3)/pET-mChBac75Na по п. 2, лизис клеток, аффинную очистку гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα на металлохелатном носителе в денатурирующих условиях, расщепление гибридного белка His8-TrxL-mChBac75Nα бромцианом в 6М гидрохлориде гуанидина и очистку целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.