CN113444163A - 活性肽及其制备方法 - Google Patents

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CN113444163A CN202010226352.4A CN202010226352A CN113444163A CN 113444163 A CN113444163 A CN 113444163A CN 202010226352 A CN202010226352 A CN 202010226352A CN 113444163 A CN113444163 A CN 113444163A
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Abstract

本发明公开了活性肽及其制备方法，涉及基因工程技术领域。本发明公开的活性肽具有更好的抗菌活性、更低的溶血性及细胞毒性，此外，本发明提供的制备方法得率高，所制备的活性肽纯度高，可供医药及畜牧等领域使用。

Description

活性肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及活性肽及其制备方法。
背景技术
抗菌肽是一类具有抗菌活性的生物短肽，在自然界中分布广泛、种类繁多，但是产量不多；它是机体先天性免疫系统的重要组成部分，它们组成了高等动物防御外来生物的第一道的防线；迄今已有成百上千种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定。抗菌肽对细菌、真菌、衣原体、支原体、病毒和肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用，并且对抗生素耐药菌株有效。
抗菌肽作用机理是能够与细胞膜表面相互作用，使膜的通透性发生改变，打破酸碱平衡，改变渗透压平衡，形成离子通道，导致细菌内容物溢出而死亡，所以抗菌肽对细菌不容易产生耐药性，因而有望成为新一代的肽类抗生素，在医药、畜牧养殖添加剂、食品添加剂等方向具有广泛应用价值。
目前市场上传统抗菌肽的提取困难，化学合成成本高，但其抗菌活性没有达到最理想的效价，还可能有细胞毒性等副作用，提示我们需要对传统抗菌肽分子进行适当修饰，以提高其抗菌效价、降低或消除其副作用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性肽及其制备方法。本发明提供的活性肽是一种新型抗菌肽，其具有更好的抗菌活性、更低的溶血性及细胞毒性，此外，本发明提供的制备方法得率高，所制备的活性肽纯度高，为其实现产业化奠定了技术基础。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种活性肽，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1-5中的任意一种：
Figure BDA0002426146620000011
Figure BDA0002426146620000021
本发明提供的SEQ ID NO.1-5所示的活性肽不属于任何传统分类的抗菌肽，属于新型抗菌肽，是在传统的哺乳动物来源抗菌肽基础上，进行了优化改造，对其分子进行了修饰和改造，并采用基因工程重组技术异源表达系统来生产的新型抗菌肽，其具有更好的抗菌活性、更低的溶血性及细胞毒性。
另一方面，本发明提供如上所述的活性肽在制备抗菌制剂中的应用。
本发明的研究显示，如上所述的活性肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌，具有广谱性，应用范围广，这表明本发明提供的活性肽可以用于制备成抗菌制剂，为当前杀菌消毒领域提供一种新的选择。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述菌为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗菌制剂为喷雾剂、溶液剂、凝胶剂、乳液剂、软膏剂、含漱剂、贴剂、吸入剂、滴眼剂、滴鼻剂、膜剂或泡沫剂。
本领域技术人员应当容易地理解到，本发明的抗菌制剂的剂型本领域技术人员可以根据其使用环境进行选择，包括但不限于上述的喷雾剂、溶液剂、凝胶剂、乳液剂、软膏剂、含漱剂、贴剂、吸入剂、滴眼剂、滴鼻剂、膜剂和泡沫剂，利用本发明提供的活性肽制备其他剂型的抗菌制剂，也是属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种抗菌制剂，其含有如上所述的活性肽。
另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上所述的活性肽。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
atgggtcgtaaaaaacgtaaacgtaaaaaaaaaaaaaaactgaaaaaaaaactgtctaaagacgacgacgacaaaatgggtcgtaaaaaacgtaaacgtaaaaaaaaaaaaaaactgaaaaaaaaactgtctaaagacgacgacgacaaaatgggtcgtaaaaaacgtaaacgtaaaaaaaaaaaaaaactgaaaaaaaaactgtctaaagacgacgacgacaaacaccaccaccaccaccactga。
SEQ ID NO.7所示核苷酸序列可以编码SEQ ID NO.2所示的活性肽，其他活性肽的核苷酸序列本领域技术人员可以在此基础上，根据氨基酸的密码子合理变化得到，这对本领域技术人员来说是容易实现的。
SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列是经过了密码子优化后的序列，采用该核苷酸序列在大肠杆菌中重组表达上述活性肽，其表达效率更高，更能提高活性肽的得率。
另一方面，本发明提供上述活性肽在制备抗菌药物中的应用。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另一方面，本发明提供一种载体，含有如上所述的核酸分子。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体含有多个所述核酸分子。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，多个所述核酸分子以同向串联的方式存在于所述载体上。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子的数量为1-10个。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子的数量为3个。
本发明的研究显示，相较于其他数量的核酸分子，当3个上述核酸分子同向串联表达时，其具有更高的表达效率，这是本领域技术人员不曾预料的。
增加核酸分子的数量可以提高活性肽的表达水平，有利于提高活性肽的得率。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，相邻两个核酸分子插入有切割序列，所述切割序列所编码的多肽序列可被蛋白酶特异性识别并切割。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述蛋白酶选自肠激酶和羧肽酶B中的至少一种。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述多肽序列的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示：KDDDDK。
利用上述多肽序列，可以使得所表达出的多个串联活性肽能够被肠激酶和羧肽酶B识别并切割，得到具有活性的单体活性肽；此外，通过上述多肽序列的引入，可以避免串联活性肽被其他蛋白酶降解以及对宿主菌如大肠杆菌造成杀伤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述切割序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示：
aaagacgacgacgacaaa。
需要说明的是，切割序列并不限于SEQ ID NO.8，根据密码子的简并性，本领域技术人员可以选用其他的核苷酸序列以编码上述多肽序列，其也是属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体含有驱动所述核酸分子表达的启动子。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据需要选择合适的启动子以驱动上述核酸分子表达，无论选用何种启动子驱动表达，其均属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述启动子为T7启动子。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体的骨架为pET-28a。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，多个所述核酸分子位于所述载体的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间。
另一方面，本发明提供一种重组细胞，其含有如上任一项所述的载体。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重组细胞选自大肠杆菌。
大肠埃希菌(E.coli)是目前利用最广泛的表达宿主菌，其具有遗传背景清晰，易于操作，培养简单，生产成本低的特点。
另一方面，本发明提供一种制备如上所述的活性肽的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述方法包括：在培养所述重组细胞的培养液的OD600达到30-50时，加入诱导剂进行诱导培养。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，诱导培养的温度为28-33℃，pH为6.8-7.2，诱导培养的时间5-15h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，诱导剂为IPTG或者乳糖。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，诱导剂在培养液中的浓度控制为0.5-2mM。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，当重组细胞为大肠杆菌时，所述方法包括：在培养结束后，收集菌体对其进行细胞壁破碎，收集破壁液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：对所述破壁液进行超滤，收集澄清液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在本发明的一些实施方案中，采用分子截留量为750KD的中空纤维膜对所述破壁液进行超滤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：使用肠激酶和羧肽酶B对澄清液中进行酶切，得到酶切溶液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：将所述酶切溶液进行超滤后再进行阳离子层析，用洗脱溶液洗脱后，收集洗脱液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，阳离子层析所用的层析介质为SP-Sepharose Fast Flow介质。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述洗脱溶液是含1.5-2M NaCl的Tris-HCl溶液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：对所述洗脱液进行阴离子层析，收集流穿液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，阴离子层析所用的层析介质为Q-Sepharose Fast Flow介质。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：采用分子截留量为1KD的切向流膜对所述流穿液进行超滤浓缩，得到所述活性肽。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中候选多肽的溶血检测结果。
图2为实施例3中的pET-28a(+)-3DEMP19的载体图谱。
图3为实验例1中的不同DEMP19编码序列的表达效率检测结果。
图4为实验例2中的不同DEMP19串联体个数对表达效果的影响。
图5为实施例7中的DEMP19活性肽单体样品的Tricine-SDS-PAGE电泳图。
图6为对照组1、对照组2与实施例3的3DEMP19编码序列的序列比对结果。
图7为实施例8中的DEMP19活性肽单体样品的平皿抑菌活性图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
采用化学固相合成的方式，合成SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5中的候选氨基酸序列；采用反相C18色谱柱检测合成的多肽纯度，确定合成的多肽纯度大于95％；其中C18检测条件为A：含有0.05％(V/V)的水，B：含有0.05％的乙腈，检测波长为210nm，在40分钟内，B从0线性提高至90％(V/V)。取得合格的合成候选序列的多肽后，采用最低抑菌浓度(MIC)作为评价指标，优选了一株革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和一株革兰氏阴性细菌大肠杆菌作为指示菌进行抑菌活性评价。MIC检查：(1)采用LB培养基倍比稀释不同浓度的抗菌药物溶液；(2)分别添加到96孔聚苯乙烯板中，在第1至11孔加药液，每孔100μl，药物浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml，第12孔添加100μl LB培养基作为生长对照；(3)将菌悬液采用LB培养基稀释制备成约2 106CFU/ml的悬液；(4)将100μl菌悬液添加至96孔板中，在37℃条件下，培养约20小时，测定吸光值，判定最小抑菌浓度。实验结果如下表：
Figure BDA0002426146620000061
从MIC分析可以得出，SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5的多肽均具有良好的抑菌能力，其中SEQ ID NO.2具有较优的抑菌能力，因此作为候选序列进行进一步开发。
实施例2
将实施例1中化学合成的5条候选氨基酸序列，采用溶血性作为评价指标，具体溶血检测数据如图1所示，其中SEQ ID NO.2序列具有较低的溶血性作为后续优选开发对象，后文中，将SEQ ID NO.2的多肽命名为DEMP19。溶血性检测，采用新鲜的人红细胞进行，(1)采用pH＝7.4的PBS溶液将人红细胞1000g离心力离心7分钟，洗涤2-3次；(2)将候选多肽溶解至同样的PBS溶液中，按照0、100uM、200uM、400uM与洗涤后的人红细胞同等比例加入；(3)37℃条件下，孵育1小时；(4)1000g离心力离心5分钟；(5)在405nm的波长下，检测离心后的上清。计算公式如下：
Figure BDA0002426146620000071
实施例3
1构建含有3个DEMP19基因串联体的表达载体，方法如下：
(1)采用全基因合成技术合成含3个DEMP19串联体的基因片段：
Figure BDA0002426146620000072
其中，下划线处字母为DEMP19基因序列(SEQ ID NO.7，该序列是根据大肠杆菌密码子偏好性进行设计，编码的氨基酸序列为MGRKKRKRKKKKKLKKKLS(SEQ ID NO.2)；斜体字母为切割序列，编码多肽的序列为：KDDDDK，作用是串联相邻两个DEMP19活性肽，并可被肠激酶和羧肽酶B特异性识别和切割；波浪线处字母为His tag编码序列，便于下游纯化工艺；5’端和3’端分别具有限制性内切酶NcoI和XhoI。
上述序列表达的串联体(3DEMP19)氨基酸序列如下：
MGRKKRKRKKKKKLKKKLSKDDDDKMGRKKRKRKKKKKLKKKLSKDDDDKMGRKKRKRKKKKKLKKKLSKDDDDKHHHHHH
(2)酶切连接：
由于三个串联基因导致片段中的序列重复，PCR扩增可能会导致片段的缺失，因此本实施例采用直接酶切连接的方法构建表达载体；具体的以步骤(1)合成的3DEMP19串联体基因片段为模板，采用CutSmart缓冲液在37℃的孵育温度下，50倍量的NcoI和XhoI进行消化、酶切1h，回收258bp的片段，为串联体基因；步骤(2)同等条件，用NcoI和XhoI酶切pET-28a(+)载体，回收5.3K的线性化载体；步骤(3)将线性载体DNA100ng，插入片段DNA500ng，加入2μl 10X连接缓冲液，2μl T4连接酶，添加无菌水至20μl，在22℃的温度小孵育半个小时，65℃热失活10分钟，PCR验证，得到含有3个DEMP19基因串联体的表达载体，该载体命名为pET-28a(+)-3DEMP19。构建后的载体图谱见图2。
2构建含有pET28a(+)-3DEMP19表达载体的重组大肠杆菌
方法：
将测序正确的重组载体pET-28a(+)-3DEMP19用热激法转化BL21大肠杆菌，并用LB(含硫酸卡那霉素，30mg/L)平皿进行筛选。热激法采用42℃热激1分钟，冰上静置2分钟；然后加入无抗性的LB肉汤培养基37℃、120rpm培养约1小时；最后将其均匀涂布在含有硫酸卡那霉素的LB抗性平板上，37℃倒置培养过夜，进行阳性克隆筛选。
得到的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)-3DEMP19。
实验例1
检测实施例2得到的重组大肠杆菌中的DEMP19串联体的表达情况
检测方法：取实施例2的重组大肠杆菌BL21(DE3)-3DEMP19，采用LB基础培养基在37℃、220rpm培养重组BL21(DE3)-3DEMP19，当菌体密度OD600达到1-2时，降温至30℃，添加1mM IPTG诱导4-5小时；离心收集菌体，PBS洗涤一次后，冰上超声破碎；12000rpm离心后取上清进行全菌电泳，用于检测诱导表达情况，结果见图3。
此外，设置对照组，比较不同3DEMP19编码序列对表达水平的影响，对照组的3DEMP19编码序列如下：
对照组1：
5’ATGGGACGAAAAAAAAGAAAGAGGAAGAAAAAGAAGAAGCTGAAAAAGAAGCTGAGCAAAGATGACGACGACAAAATGGGTCGTAAAAAGCGCAAACGTAAAAAGAAGAAGAAATTGAAGAAGAAATTGTCCAAAGATGATGATGATAAAATGGGCCGTAAAAAGCGCAAACGTAAAAAGAAAAAGAAGCTGAAAAAGAAGCTGAGCAAAGATGACGACGACAAACATCACCACCACCACCATTGA3’；
对照组2：
5’ATGGGCCGTAAAAAACGTAAACGTAAAAAAAAAAAAAAACTTAAAAAAAAACTTTCTAAAGATGATGATGATAAAATGGGCCGTAAAAAACGTAAACGTAAAAAAAAAAAAAAACTTAAAAAAAAACTTTCTAAAGATGATGATGATAAAATGGGCCGTAAAAAACGTAAACGTAAAAAAAAAAAAAAACTTAAAAAAAAACTTTCTAAAGATGATGATGATAAACATCATCATCATCATCATTGA3’。
对照组1、对照组2以及实施例3的3DEMP19编码序列三者的碱基序列比较见图6。
按实施例2基本相同的方法，用对照组1或2的3DEMP19编码序列(该序列也是根据大肠杆菌密码子偏好性进行设计)代替实施例2中的3DEMP19编码序列，制备重组大肠杆菌，并进行表达测试，结果见图3。
图3中，第1泳道为对照组1的诱导表达量，第3泳道为对照组2的诱导表达量，泳道4、5、6为实施例2的诱导表达量；可以看出，泳道4、5、6的条带颜色更深，说明实施例2的重组大肠杆菌中的3DEMP19串联体表达水平比对照组至少高1倍，表明实施例2中的3DEMP19编码序列(SEQ ID NO.7)其表达效率更高，高于对照组的3DEMP19编码序列，在本发明公开之前，何种编码序列具有更高的表达效率，这对本领域技术人员来说是很难预期的，难以预料SEQID NO.7表达效率更高。
实施例4
按照实施例2方法，构建含有5个DEMP19串联体，并转化大肠杆菌，得到表达5个DEMP19串联体的重组大肠杆菌。
实施例5
按照实施例1方法，构建含有7个DEMP19串联体的表达载体，并转化大肠杆菌，得到表达7个DEMP19串联体的重组大肠杆菌。
实验例2
比较DEMP19串联体个数对表达效果的影响
分别取实施例3-5的重组大肠杆菌，参照实验例1的检测方法，检测实施例1-3的重组大肠杆菌的DEMP19串联体的表达水平，结果见图4。
图4中，第2泳道为实施例1的3个DEMP19串联体，第3泳道为实施例2的5个DEMP19串联体，第4泳道为实施例3的7个DEMP19串联体，从图中可以看出，实施例2-4的重组大肠杆菌均能够有效表达DEMP19串联体，但是，随着DEMP19串联体个数的增加，DEMP19形成包涵体的问题出现(反应在图2中就是条带分子量增大)，对于下游纯化带来不便，而3个DEMP19串联体是可溶性表达，更利于后续表达。
实施例6
为了大规模获得DEMP19多肽，需要在发酵罐中进行表达培养，本实施例进行了200L中试发酵规模的工艺，条件如下：
取实施例3得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)-3DEMP19，用种子培养基进行种子扩培，待大肠杆菌到达一定数量后接种于发酵基础培养基中，进行IPTG诱导表达。
其中，种子培养基为LB培养基；
发酵基础培养基包括(g/L)：葡萄糖甘油20，酵母粉10，蛋白胨15，(NH4)2SO45，K2HPO4·3H2O 9，KH2PO4 3.5，MgSO4·7H2O 5；
补料培养基(g/L)：甘油控制在20，酵母粉120，蛋白胨150；
诱导的时机为菌体生长对数中后期，反应器规模OD600达到30-50，诱导剂IPTG的浓度为1mM，诱导时长为10h；
发酵液中3DEMP表达方法如下：
诱导结束后，取10ml的培养液，10000rpm离心10min，PBS洗涤一次后等体积重悬，用6M HCl调节pH至1-2，50-60℃孵育30分钟，10000rpm离心10min后取上清，采用实施例1中C18的检测方法检测3DEMP的含量。
结果显示，在200L中试发酵规模的工艺条件下，3个DEMP19串联体(3DEMP19)的表达水平可以达到500mg/L以上。
实施例7
重组3DEMP19串联体蛋白的单体切割
(1)将实施例3培养的BL21(DE3)-3DEMP19菌液，进行5000rpm连续流离心后，收集菌体；
(2)将收集的菌体重悬至30L的80mM Tris缓冲液中，用6M HCl调节重悬液的pH至1-2，50-60℃孵育30分钟，破壁释放3DEMP19；
(3)采用5M NaOH调节破壁液pH至5-6，并采用孔径为750KD的中空纤维膜进行澄清超滤；
(4)将澄清液进行一步镍柱亲和捕获，捕获后采用重组肠激酶和羧肽酶B的双酶液进行酶切，其中双酶液的缓冲体系为10mM Tris-HCl(pH7.5)，其中肠激酶的含量为0.5mg/ml，羧肽酶B的含量为10mg/ml，进行柱上酶切，其中柱子温度控制为25℃孵育12小时，收集流出液，即酶切液；
(5)双酶切后的流出液，采用10KD的切向流膜进行超滤，收集透出液，透出液进行阳离子层析，层析介质为SP-Sepharose Fast Flow介质，采用含有1.5-2M NaCl的200mMTris-HCl(pH＝7)洗脱后，收集洗脱液；
(6)上述洗脱液进行阴离子流穿层析，阴离子层析所用的层析介质为Q-SepharoseFast Flow介质，收集流穿液；
(7)上述流穿液经过1KD的切向流膜浓缩换液后，得到具有抗菌活性的DEMP19活性肽单体。
DEMP19活性肽单体样品采用Tricine-SDS-PAGE进行检测，并分析DEMP19活性肽单体纯度。
结果见图5，图5显示单体的纯化大于98％，分子量大小与DEMP19的理论分子量一致；此外，经过C18 HPLC检测DEMP19活性肽单体的纯度大于98％，达到了制药产业化水平。
实施例8
DEMP19活性肽单体生物学活性检测-平皿抑菌活性
(1)将指示菌大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃，180-220rpm培养5-8小时后，调整OD600为0.5左右作为待用菌悬液；待15ml含有1％的琼脂糖的LB培养基灭菌冷却到50℃左右，加入25μl的待用菌悬液，倒入平皿凝固；用无菌打孔器打孔，加入50μl的实施例5得到的DEMP19抗菌肽单体样品，37℃正放培养过夜，观察抑菌圈的大小，结果如图7所示。从抑菌圈可以看出，实施例7得到的DEMP19活性肽单体对革兰氏阴性菌如大肠杆菌具有良好的抑菌效果。
(2)同(1)的方法，将指示菌更换为枯草芽孢杆菌，培养基更换为胰酪大豆胨液体培养基进行培养。从抑菌圈可以看出，实施例7得到的DEMP19活性肽单体对革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌具有良好的抑菌效果。
(3)同(1)的方法，将指示菌更换为金黄色葡萄球菌，培养基更换为胰酪大豆胨液体培养基进行培养。从抑菌圈可以看出，实施例7得到的DEMP19活性肽单体对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。
(4)同(1)的方法，将指示菌更换为白色念珠菌，培养基更换为沙氏葡萄糖培养基进行培养。从抑菌圈可以看出，实施例7得到的DEMP19活性肽单体对真菌如白色念珠菌具有良好的抑菌效果。
从实施例8中，可以得出，本发明实施例提供的DEMP19活性肽单体对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及白色念珠菌等真菌均具有良好的抑菌效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 潘彩秀
<120> 活性肽及其制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys
1 5 10 15
Lys Leu Ser
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Gly Arg Lys Lys Arg Lys Arg Lys Lys Lys Lys Lys Leu Lys Lys
1 5 10 15
Lys Leu Ser
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Arg Lys Lys Arg Lys Arg Lys Lys Lys Lys Lys Leu Lys Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ser Leu Lys Lys Lys Leu Lys Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Gly
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ser Leu Lys Lys Lys Leu Lys Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 7
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgggtcgta aaaaacgtaa acgtaaaaaa aaaaaaaaac tgaaaaaaaa actgtctaaa 60
gacgacgacg acaaaatggg tcgtaaaaaa cgtaaacgta aaaaaaaaaa aaaactgaaa 120
aaaaaactgt ctaaagacga cgacgacaaa atgggtcgta aaaaacgtaa acgtaaaaaa 180
aaaaaaaaac tgaaaaaaaa actgtctaaa gacgacgacg acaaacacca ccaccaccac 240
cactga 246
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaagacgacg acgacaaa 18

Claims (10)

1.一种活性肽，其特征在于，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1-5中的任意一种。
2.权利要求1所述的活性肽在制备抗菌制剂中的应用；
优选地，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述菌为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌；
优选地，所述菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌；
优选地，所述抗菌制剂为喷雾剂、溶液剂、凝胶剂、乳液剂、软膏剂、含漱剂、贴剂、吸入剂、滴眼剂、滴鼻剂、膜剂或泡沫剂。
3.一种抗菌制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的活性肽。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的活性肽；优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述载体含有多个所述核酸分子；
优选地，所述核酸分子的数量为1-10个，优选为3个；
优选地，多个所述核酸分子以同向串联的方式存在于所述载体上；
优选地，相邻两个核酸分子插入有切割序列，所述切割序列所编码的多肽序列可被蛋白酶特异性识别并切割；
优选地，所述蛋白酶选自肠激酶和羧肽酶B中的至少一种；
优选地，所述多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述切割序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所；
优选地，所述载体含有驱动所述核酸分子表达的启动子；
优选地，所述启动子为T7启动子；
优选地，所述载体的骨架为pET-28a；
优选地，多个所述核酸分子位于所述载体的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间。
6.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求5所述的载体。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌。
8.一种制备如权利要求1所述的活性肽的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求6或7所述的重组细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在培养所述重组细胞的培养液的OD600达到30-50时，加入诱导剂进行诱导培养；
优选地，诱导培养的温度为28-33℃，pH为6.8-7.2，诱导培养的时间5-15h；
优选地，诱导剂选自IPTG或者乳糖；
优选地，诱导剂在培养液中的浓度控制为0.1-1mg/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当重组细胞为大肠杆菌时，所述方法包括：在培养结束后，收集菌体对其进行细胞壁破碎，收集破壁液；
优选地，所述方法还包括：对所述破壁液进行超滤，收集澄清液；
优选地，采用分子截留量为750KD的中空纤维膜对所述破壁液进行超滤；
优选地，所述方法还包括：使用肠激酶和羧肽酶B对澄清液中进行酶切，得到酶切溶液；
优选地，所述方法还包括：将所述酶切溶液进行超滤后再进行阳离子层析，用洗脱溶液洗脱后，收集洗脱液；
优选地，阳离子层析所用的层析介质为SP-Sepharose Fast Flow介质；
优选地，所述洗脱溶液是含1.5-2M NaCl的Tris-HCl溶液；
优选地，所述方法还包括：对所述洗脱液进行阴离子层析，收集流穿液；
优选地，阴离子层析所用的层析介质为Q-Sepharose Fast Flow介质；
优选地，所述方法还包括：采用分子截留量为1KD的切向流膜对所述流穿液进行超滤浓缩，得到所述活性肽。
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