CN114605495A - 一种乳四肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种乳四肽的合成方法。本申请的合成方法，包括：构建含有融合蛋白的表达载体质粒；融合蛋白具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；融合蛋白含有用于纯化蛋白的亲和层析标签；将表达载体质粒转化至宿主菌中，并使宿主菌诱导表达融合蛋白；将表达融合蛋白的宿主菌依次进行菌体破碎和除杂处理，得到含有融合蛋白的菌液；将菌液于亲和层析柱中进行亲和纯化，然后在亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活融合蛋白的内含肽进行自切割，得到乳四肽。本申请提供了一种乳四肽的合成方法，有效解决目前乳糖四肽合成困难、产量低和纯化成本高等问题。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种乳四肽的合成方法。
背景技术
近年来，小分子肽成为合成领域中的明星靶标，在食品、药品、保健品和护肤品等领域展现重要的功能和应用价值。来自乳清消化中的β-乳球蛋白的甘氨酸-苏氨酸-色氨酸-酪氨酸(GTWY)四肽小分子(又被称为乳四肽，lacto-tetrapeptide)被报道能够增强神经活性、改善海马依赖性记忆功能，提高宿主的记忆能力，在预防和治疗老年痴呆、阿尔兹海默症等退行性神经疾病上发挥重要的作用。因此乳四肽在医疗领域和食品保健品领域具有重要的潜在价值。但是，目前还没有较为成熟的乳四肽合成技术，这阻碍了乳四肽的应用和发展。
发明内容
鉴于此，本申请提供了一种乳四肽的合成方法，有效解决目前乳糖四肽合成困难、产量低和纯化成本高等问题。
本申请提供了一种乳四肽的合成方法，包括：
步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽Ssp DnaB和乳四肽组成；所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述融合蛋白的末端连接有用于纯化蛋白的亲和层析标签；
步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌诱导表达所述融合蛋白；
步骤3、将表达所述融合蛋白的宿主菌依次进行菌体破碎和除杂处理，得到含有所述融合蛋白的菌液；
步骤4、将所述菌液于亲和层析柱中进行亲和纯化，然后在所述亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活所述融合蛋白的内含肽进行自切割，得到乳四肽。
具体的，为了保证纯化寡肽的完整性和正确性，所述融合蛋白不能有连接肽等额外的氨基酸残基。
具体的，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，所述内含肽Ssp DnaB的氨基酸序列为：
MGSSHHHHHHHHAISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQLSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHN。
具体的，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，所述乳四肽的氨基酸序列为：GTWY。
另一实施例中，步骤1具体包括：将所述融合蛋白构建到原核表达载体中，得到含有融合蛋白的表达载体质粒。
另一实施例中，所述原核表达载体可以为市售任意原核表达载体，包括但不限于pET系列载体、pGEX系列载体、pSUMO系列载体和pBAD系列载体中的一种或多种。
另一实施例中，所述融合蛋白的数量为1个或复数个，所述融合蛋白的数量为2个以上时，两个相邻所述融合蛋白以所述原核表达载体的核糖体结合位点RBS相隔。
另一实施例中，所述融合蛋白的数量为2个、3个或4个。
另一实施例中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
具体的，所述SEQ ID NO:2的核苷酸序列末端三个核苷酸TAA为终止子。
具体的，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中，所述内含肽Ssp DnaB的核苷酸序列为：
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACCATCACGCTATCTCTGGCGATAGTCTGATCAGCCTGGCTAGCACAGGAAAAAGAGTTTCTATTAAAGATTTGTTAGATGAAAAAGATTTTGAAATATGGGCAATTAATGAACAGACGATGAAGCTAGAATCAGCTAAAGTTAGTCGTGTATTTTGTACTGGCAAAAAGCTAGTTTATATTCTAAAAACTCGACTAGGTAGAACTATCAAGGCAACAGCAAATCATAGATTTTTAACTATTGATGGTTGGAAAAGATTAGATGAGCTATCTTTAAAAGAGCATATTGCTCTACCCCGTAAACTAGAAAGCTCCTCTTTACAATTGTCACCAGAAATAGAAAAGTTGTCTCAGAGTGATATTTACTGGGACTCCATCGTTTCTATTACGGAGACTGGAGTCGAAGAGGTTTTTGATTTGACTGTGCCAGGACCACATAACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAAC。
具体的，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中，所述四肽-9的核苷酸序列为：GGTACCTGGTAT。
另一实施例中，步骤1中，所述亲和层析标签选自GST亲和层析标签、His标签亲和层析标签、MBP亲和层析标签、Halo亲和层析标签、Flag亲和层析标签和CL7亲和层析标签中的一种或多种。
另一实施例中，步骤2中，所述宿主菌选自BL21系列大肠杆菌、Rosetta系列大肠杆菌、OrigamiB系列大肠杆菌、JM109系列大肠杆菌和TOP10系列大肠杆菌中的一种或多种；优选的，所述宿主菌为BL21系列大肠杆菌。
具体的，步骤2具体包括：将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，挑取单克隆菌株至培养基中扩大培养，直至培养基的OD600值为0.8，加入Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和表达诱导剂，37℃继续培养4-6h，然后离心收集细菌沉淀，将细菌沉淀用PBS清洗1～3次。
另一实施例中，步骤3中，所述菌体破碎处理选自加热破碎法、裂解液超声破碎法或高压破碎法中的一种或多种；
所述除杂处理包括将破碎后菌体离心后，弃沉淀，将收集得到的上清过滤。
优选的，所述菌体破碎处理为裂解液超声破碎法，裂解液超声破碎法具体包括将菌体重悬在裂解缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，镜检染色直至没有明显的菌体。
具体的，所述除杂处理具体包括将破碎菌体经过12000rpm，4℃离心20min，收集上清，然后上清经0.45μm滤膜过滤。
另一实施例中，所述激活内含肽切割的缓冲液为pH 5～6.5的磷酸缓冲液、pH 5～6.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和pH 5～6.5哌嗪-1,4-二乙磺酸中的一种或多种；优选的，所述激活内含肽切割的缓冲液为pH 6的磷酸缓冲液。
具体的，步骤4具体包括：用裂解缓冲液充分平衡亲和层析柱后，将所述菌液通入所述亲和层析柱中，所述菌液的流速为0.1～1ml/min，然后通入裂解缓冲液充分清洗所述亲和层析柱；在所述亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液，混匀后室温放置过夜，收集流通液，为乳四肽。
具体的，所述亲和层析标签为His标签亲和层析标签，采用Ni-NTA亲和层析柱，步骤4具体包括：Ni-NTA亲和层析柱用裂解缓冲液充分平衡后，加入所述菌液，所述菌液的0.5ml/min流速，再用含20mM咪唑裂解缓冲液充分清洗；接着加入pH 6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温放置过夜，收集含有乳四肽的流通液，再用含200mM咪唑裂解缓冲液洗脱内含肽未进行自切割的融合蛋白，该融合蛋白可重新过亲和层析柱收集乳四肽。
本申请开发了一种基于自切割型内含肽的乳四肽表达和提纯方法，内含肽和乳四肽融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的DNA序列为SEQ ID NO:2。本申请通过表达载体质粒转化在宿主菌中，通过诱导宿主菌能够表达出大量的内含肽-乳四肽的融合蛋白，占总蛋白的90％以上。经过亲和标签纯化后可获得高纯度的内含肽-乳四肽的融合蛋白。在亲和层析柱上进行内含肽切割后，收集含有乳四肽的流通液，该流通液的乳四肽的含量可达每升菌液20mg产量，纯度在90％以上。本申请实施例结果表明本申请能够快速高效得表达和提纯乳四肽，降低乳四肽的生产成本，提高乳四肽的工业化生产和应用价值，对乳四肽在食品和医疗领域的发展具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例提供了一种乳四肽的合成方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的构建含有融合蛋白的表达载体质粒的结构示意图；
图3为本申请实施例提供的步骤3)得到的融合蛋白的菌液裂解缓冲液的胶图；
图4为本申请实施例提供的步骤5)得到的融合蛋白的菌液裂解缓冲液的蛋白纯化图；
图5为本申请实施例提供的HPLC检测流通液的乳四肽的结果图。
具体实施方式
本申请提供了一种乳四肽的合成方法，用于解决现有技术中乳糖四肽合成困难、产量低和纯化成本高的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
实施例1
本申请实施例提供了乳四肽的合成方法，本申请合成原理见图1，融合蛋白为相互串联连接的内含肽与乳四肽，融合蛋白的末端连接有亲和标签，通过基因工程的方法在宿主菌中表达融合蛋白，菌体破碎除杂后得含有融合蛋白的菌液；菌液通过亲和层析柱纯化和除杂后，亲和层析柱上附着有融合蛋白，在亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活融合蛋白的内含肽进行自切割，得到的流通液含有大量的乳四肽，内含肽仍附着在亲和层析柱上，合成方法具体包括：
1)融合蛋白表达载体的构建：按照图2所示，本申请实施例采用原核表达载体pET系列空白载体，在pET系列空白载体的外源基因插入位点插入两个融合蛋白，融合蛋白为相互串联连接的内含肽(Ssp DnaB intein)与乳四肽(4肽Lac)，两个融合蛋白之间由pET表达载体的核糖体结合位点RBS相隔，融合蛋白的末端连接有亲和标签6×His；将内含肽-乳四肽的融合蛋白编码的DNA序列为SEQ ID NO:2构建到pET-28a载体中。
2)诱导表达：将构建好的表达载体质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中，挑取单克隆菌株至LB培养基中扩大培养中OD600值为0.8，加入1/20体积1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和终浓度为1mM的IPTG，37℃200rpm继续培养5h。10000rpm，4℃离心20min，收集菌体。菌体用PBS清洗2次，得到菌体。
3)菌体破碎：将上述菌体重悬在裂解缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH 8.0)中，使用常规超声手段进行菌体破碎，镜检染色直至没有明显的菌体。然后将破碎菌体经12000rpm，4℃离心20min，收集上清，该上清经过0.45μm滤膜过滤，得到含有所述融合蛋白的菌液裂解缓冲液。
验证该步骤中含有所述融合蛋白的菌液裂解缓冲液是否成功诱导表达，结果如图3，IPTG诱导能够表达出大量的内含肽-乳四肽融合蛋白，占总蛋白的90％以上。
4)亲和层析：Ni-NTA亲和层析柱用裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的菌液裂解缓冲液通过该Ni-NTA亲和层析柱，菌液裂解缓冲液流速为0.5ml/min，再用含20mM咪唑裂解缓冲液充分清洗亲和层析柱。
5)内含肽切割：在亲和层析柱中加入pH 6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温放置过夜，收集流通液，流通液含有高浓度乳四肽。再用含200mM咪唑裂解缓冲液洗脱亲和层析柱的内含肽未自切割的融合蛋白。
验证该步骤中含有所述融合蛋白的菌液裂解缓冲液是否成功纯化，结果如图4所示，图4为内含肽-乳四肽融合蛋白纯化图，左第一列Lane 1为蛋白分子量Marker；左第二列Lane 2为IPTG诱导后的菌体破碎上清；左第三列Lane 3为柱清洗液；左第四列Lane 4为20mM咪唑洗脱液；左第五列Lane 5为50mM咪唑洗脱液；左第六列Lane 6为200mM咪唑洗脱液。
图4可知，经过亲和标签纯化后可获得高纯度的内含肽-乳四肽融合蛋白。对本申请实施例的流通液进行HPLC检测，结果如图5所示。在柱上进行内含肽切割后，流通液中乳四肽的含量可达每升菌液20mg产量，纯度在90％以上。这些结果表明本发明能够快速高效得表达和提纯乳四肽，提高乳四肽的工业化生产和应用价值。本申请利用内含肽-乳四肽融合蛋白技术来高效合成和提纯乳四肽，任何内含肽相关的乳四肽合成和提纯方法应均属于本发明的保护范畴之内。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 广州市乾相生物科技有限公司
<120> 一种乳四肽的合成方法
<130> MP22006881
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His His His Ala Ile Ser Gly
1 5 10 15
Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg Val Ser Ile Lys
20 25 30
Asp Leu Leu Asp Glu Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala Ile Asn Glu Gln
35 40 45
Thr Met Lys Leu Glu Ser Ala Lys Val Ser Arg Val Phe Cys Thr Gly
50 55 60
Lys Lys Leu Val Tyr Ile Leu Lys Thr Arg Leu Gly Arg Thr Ile Lys
65 70 75 80
Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly Trp Lys Arg Leu
85 90 95
Asp Glu Leu Ser Leu Lys Glu His Ile Ala Leu Pro Arg Lys Leu Glu
100 105 110
Ser Ser Ser Leu Gln Leu Ser Pro Glu Ile Glu Lys Leu Ser Gln Ser
115 120 125
Asp Ile Tyr Trp Asp Ser Ile Val Ser Ile Thr Glu Thr Gly Val Glu
130 135 140
Glu Val Phe Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro His Asn Phe Val Ala Asn
145 150 155 160
Asp Ile Ile Val His Asn Gly Thr Trp Tyr
165 170
<210> 2
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac catcacgcta tctctggcga tagtctgatc 60
agcctggcta gcacaggaaa aagagtttct attaaagatt tgttagatga aaaagatttt 120
gaaatatggg caattaatga acagacgatg aagctagaat cagctaaagt tagtcgtgta 180
ttttgtactg gcaaaaagct agtttatatt ctaaaaactc gactaggtag aactatcaag 240
gcaacagcaa atcatagatt tttaactatt gatggttgga aaagattaga tgagctatct 300
ttaaaagagc atattgctct accccgtaaa ctagaaagct cctctttaca attgtcacca 360
gaaatagaaa agttgtctca gagtgatatt tactgggact ccatcgtttc tattacggag 420
actggagtcg aagaggtttt tgatttgact gtgccaggac cacataactt tgtcgcgaat 480
gacatcattg tacacaacgg tacctggtat taa 513
Claims (10)
1.一种乳四肽的合成方法，其特征在于，包括：
步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽Ssp DnaB和乳四肽组成；所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述融合蛋白的末端连接有用于纯化蛋白的亲和层析标签；
步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌诱导表达所述融合蛋白；
步骤3、将表达所述融合蛋白的宿主菌依次进行菌体破碎和除杂处理，得到含有所述融合蛋白的菌液；
步骤4、将所述菌液于亲和层析柱中进行亲和纯化，然后在所述亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活所述融合蛋白的内含肽Ssp DnaB进行自切割，得到乳四肽。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤1具体包括：将所述融合蛋白构建到原核表达载体中，得到含有融合蛋白的表达载体质粒。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述原核表达载体选自pET系列载体、pGEX系列载体、pSUMO系列载体和pBAD系列载体中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述融合蛋白的数量为复数个，两个相邻所述融合蛋白以所述原核表达载体的核糖体结合位点RBS相隔。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述融合蛋白的数量为2个、3个或4个。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤1中，所述亲和层析标签选自GST亲和层析标签、His标签亲和层析标签、MBP亲和层析标签、Halo亲和层析标签、Flag亲和层析标签和CL7亲和层析标签中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤2中，所述宿主菌选自BL21系列大肠杆菌、Rosetta系列大肠杆菌、OrigamiB系列大肠杆菌、JM109系列大肠杆菌和TOP10系列大肠杆菌中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤3中，所述菌体破碎处理为加热破碎法、裂解液超声破碎法或高压破碎法中的一种或多种；
所述除杂处理包括将破碎后菌体离心后，弃沉淀，将收集得到的上清过滤。
10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述激活内含肽切割的缓冲液为pH5～6.5的磷酸缓冲液、pH 5～6.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和pH 5～6.5哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液的中的一种或多种。
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