CN115261398A - 基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其步骤包括：构建展示寡肽的噬菌体质粒，寡肽与展示蛋白之间使用内含肽连接；将噬菌体质粒转入宿主菌中，培养获得母代噬菌体；使用母代噬菌体侵染培养好的宿主菌，产生子代噬菌体；收集子代噬菌体；达成内含肽切割条件，使内含肽自切割释放噬菌体表面的寡肽；超滤分离寡肽和噬菌体。本发明方法简单高效，无需破碎菌体，也无需进行蛋白纯化，且噬菌体可以重复利用，是一种高效简便的寡肽生产和提纯工艺，非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。

Description

基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，特别涉及一种基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法。
背景技术
寡肽又称为小肽、低聚肽或称为小分子活性肽，2～10个氨基酸彼此缩合形成的化合物，是多肽的一种分类。在20世纪60年代出Newey和Smyth(1959,1960)第一次提供了肽被完整吸收的资料。蛋白质在小肠中被消化成氨基酸与寡肽，且寡肽可以完整的进入肠粘膜细胞并水解成氨基酸进入血液循环。寡肽具有不需要消化直接吸收、吸收时不消耗能量、不增加肠胃功能负担、100％被人体吸收等特点。
传统的寡肽合成主要分为化学合成和生物合成。化学合成利用固相或者液相介质，将肽链依照顺序逐个添加到合成中间产物上。这种化学合成的方法适用于二肽或者三肽的合成，但是对于长一点的寡肽的合成，就会出现反应步骤多，副产物和中间产物多，产量低和提纯困难等问题。生物合成是利用生物系统的蛋白表达技术，将寡肽融合蛋白表达在宿主内部，再经过蛋白纯化和寡肽释放来获得目的寡肽。这种方法的优势是不受寡肽长度和氨基酸序列的影响，可以简单高效地合成寡肽，副产物少，也是目前工业上合成寡肽的重要方法。但生物合成的方法还是需要经过菌株破碎和蛋白纯化的步骤，极大地提高了寡肽的生产成本，也降低了寡肽的合成规模，是寡肽生物合成的重要限速步骤。因此，开发免菌体破碎和蛋白纯化的寡肽生产工艺和提高寡肽的表达效率，对于寡肽的工业化生产而言，具有重要的价值，
1985年，Smith GP第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，创建了噬菌体展示技术。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达。截至2017年，人们已经开发出多种噬菌体表面展示技术，如单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统等。噬菌体侵染进入宿主菌中，抑制宿主菌的自我复制和生长代谢，将绝大多数营养物质用于噬菌体的复制与组装。一个宿主菌可以产生上百个噬菌体，一个噬菌体上可以展示几十或者上百个目标短肽或蛋白，这使得一个细菌产生上万个分子数的蛋白，非常适用于蛋白或者寡肽的表达。
在发明中，我们公布一种基于噬菌体展示和自切割内含肽的寡肽表达和提纯技术，该技术将寡肽展示在噬菌体(M13噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体和P1噬菌体等)的表面，寡肽与展示蛋白之前使用内含肽连接。将构建的噬菌体质粒转染到宿主中获得母代噬菌体，再用母代噬菌体感染宿主，不断产生子代噬菌体，超滤、离心或者浓缩获得子代噬菌体，通过内含肽自切割噬菌体释放表面的寡肽，最后使用超滤获得小分子寡肽。这种方法简单高效，无需破碎菌体，也无需进行蛋白纯化，且噬菌体可以重复利用，是一种高效简便的寡肽生产和提纯工艺，非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法。
为了达到上述目的，所采取的技术解决方案如下：
一种基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其步骤包括：
(1)构建展示寡肽的噬菌体质粒，寡肽与展示蛋白之间使用内含肽连接，寡肽在融合蛋白N端，即为展示蛋白-内含肽-寡肽；
(2)将噬菌体质粒转入宿主菌中，培养获得母代噬菌体；
(3)使用母代噬菌体侵染培养好的宿主菌，产生子代噬菌体；
(4)收集子代噬菌体；
(5)达成内含肽切割条件，使内含肽自切割释放噬菌体表面的寡肽；
(6)超滤分离寡肽和噬菌体，分离的噬菌体回到步骤(3)，重新用于侵染宿主菌。
其中的母代噬菌体，指的是构建好的噬菌体基因组转化进入大肠杆菌后，基因组经过复制、转录、翻译和包装，完成整个噬菌体生长周期，从大肠杆菌宿主中组装并释放出来的第一代噬菌体。第一代噬菌体具有完整的浸染宿主菌和产生子代噬菌体的能力。
优选的，所述寡肽为长度在2-50个氨基酸的短肽。
优选的，所述寡肽为二肽-1、AP二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽(GSH)、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-9、九肽-1、十肽-4。
优选的，所述噬菌体为M13噬菌体、T7噬菌体、T4噬菌体、P1噬菌体或λ噬菌体。
优选的，所述展示蛋白为M13噬菌体的PIII或者PVIII蛋白、T7噬菌体的10B蛋白、T4噬菌体的SOC或HOC蛋白、λ噬菌体的D蛋白。
优选的，所述内含肽是N端活性缺失的内含肽。
优选的，所述内含肽的N端的半胱氨酸替换成无活性的其他氨基酸，如丙氨酸等。
优选的，步骤(2)中所述宿主菌为大肠杆菌。
优选的，步骤(2)中采用电转法或者氯化钙转化法将质粒转入宿主菌中。
优选的，步骤(3)中培养好的宿主菌，是指处于生长对数期的大肠杆菌。
优选的，步骤(4)中收集子代噬菌体的方法为超滤法、聚乙二醇沉淀法或离心法。
优选的，步骤(5)中所述内含肽切割条件为使噬菌体处于高盐或低pH条件下，以激发内含肽的自切割活性，不同的内含肽，自切割活性的激活条件也不同，根据选用的内含肽确定激活条件。
优选的，步骤(6)中采用3kDa的超滤膜，用超滤离心的方法分离寡肽和噬菌体，在超滤离心的作用下，寡肽穿过超滤膜，噬菌体截留在超滤膜上。
本发明公开了一种基于噬菌体展示和自切割内含肽的寡肽表达和提纯技术，该技术将寡肽展示在噬菌体(M13噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体和P1噬菌体等)的表面，寡肽与展示蛋白之前使用内含肽连接。将构建的噬菌体质粒转染到宿主中获得母代噬菌体，再用母代噬菌体感染宿主，不断产生子代噬菌体，超滤、离心或者浓缩获得子代噬菌体，通过内含肽自切割噬菌体释放表面的寡肽，最后使用超滤获得小分子寡肽。这种方法简单高效，无需破碎菌体，也无需进行蛋白纯化，且内含肽切割后的噬菌体仍可以重复利用，是一种高效简便的寡肽生产和提纯工艺，非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。
附图说明
图1 T7噬菌体gp10B蛋白展示内含肽-寡肽示意图。
图2 T7噬菌体gp10B蛋白和内含肽切割表达和提纯寡肽流程示意图。
图3展示寡肽后母代T7噬菌体效率测试。
图4展示寡肽后子代T7噬菌体效率测试。
图5 HPLC检测基于噬菌体展示和内含肽切割方法表达和提纯的寡肽效果。
具体实施方式
下面通过表达纯化寡肽对噬菌体表面展示寡肽的纯化的构建及验证。对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例公布了基于T7噬菌体展示寡肽的方法。内含肽Dna B和寡肽与T7 gp10B蛋白的C端融合，形成T7 gp10B蛋白-Dna B-寡肽融合蛋白。利用T7噬菌体展示和制备寡肽的示意图见图1和图2。
构建好的重组T7噬菌体质粒后，取T7 select packing extract一支，冰上融化后加入到质粒中。
再加入25μL包装蛋白，轻微混匀。22℃孵育2h。转移至一个消毒的1.5m L离心管中，加入270μL新鲜配置的LB终止反应。加入20μL氯仿，轻轻混匀后，4℃保存。将T7噬菌体与培养好的大肠杆菌(OD600值为0.8-1.0)混合，利用上层平板法检测T7的噬菌体的效价。挑取单噬菌斑接种到大肠杆菌(OD600值为0.8-1.0)中，37℃200rpm震荡培养4h。培养结束后，8000rpm离心1min，取上清，即为母代噬菌体。使用双层琼脂糖平板测定上清中母代T7噬菌体的效价。将母代噬菌体侵染培养好的大肠杆菌(OD600值为0.8-1.0)中，37℃200rpm震荡培养过夜。培养基经5000rpm 4℃离心30min，取上清。加入到50kDa超滤管中，5000rpm 4℃离心20min，取截留液，加入50U肠激酶，25℃消化过夜。加入到3kDa的超滤管中，8000rp离心20min。上层即为噬菌体，下层流通液即为寡肽。上层噬菌体经50kDa超滤管浓缩后可用于重复感染宿主菌。下层流通液经HPLC检测后，结晶或干燥成粉末。
T7噬菌体效价结果见图3和图4，相较于不展示寡肽的噬菌体，展示寡肽后T7噬菌体的效价发生轻微的降低，但可以满足寡肽的表达和生产。
本发明利用噬菌体展示和内含肽自切割的寡肽表达和提纯技术表达了各种小分子肽，结果见图5和表1，提纯的寡肽产量高、纯度高好。这说明本发明方法具有操作简单、成本低、产物产量和纯度高等特点，适用于大规模寡肽的工业化生产和制备。
表1
寡肽 三肽-1 GSH 四肽-7 六肽-9 九肽-1 十肽-4
产量mg/L 26.9 11.3 21.0 13.5 35.6 13.7
纯度 99％ 99％ 99％ 99％ 99％ 99％
。

Claims (12)

1.一种基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建展示寡肽的噬菌体质粒，寡肽与展示蛋白之间使用内含肽连接；
(2)将噬菌体质粒转入宿主菌中，培养获得母代噬菌体；
(3)使用母代噬菌体侵染培养好的宿主菌，产生子代噬菌体；
(4)收集子代噬菌体；
(5)达成内含肽切割条件，使内含肽自切割释放噬菌体表面的寡肽；
(6)超滤分离寡肽和噬菌体，分离的噬菌体回到步骤(3)，重新用于侵染宿主菌。
2.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述寡肽为长度在2-50个氨基酸的短肽。
3.权利要求2所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述寡肽为二肽-1、AP二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-9、九肽-1、十肽-4。
4.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述噬菌体为M13噬菌体、T7噬菌体、T4噬菌体、P1噬菌体或λ噬菌体。
5.权利要求4所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述展示蛋白为M13噬菌体的PIII或者PVIII蛋白、T7噬菌体的10B蛋白、T4噬菌体的SOC或HOC蛋白、λ噬菌体的D蛋白。
6.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述内含肽是N端活性缺失的内含肽。
7.权利要求6所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述内含肽的N端的半胱氨酸替换成无活性的其他氨基酸。
8.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(2)中所述宿主菌为大肠杆菌。
9.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(2)中采用电转法或者氯化钙转化法将质粒转入宿主菌中。
10.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(3)中培养好的宿主菌，是指处于生长对数期的大肠杆菌。
11.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(4)中收集子代噬菌体的方法为超滤法、聚乙二醇沉淀法或离心法。
12.权利要求1所述的基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：
步骤(6)中采用3kDa的超滤膜，用超滤离心的方法分离寡肽和噬菌体。
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