CN1703510A - 设计肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及联合利用噬菌体展示和内含肽介导的蛋白裂解反应对重组肽进行遗传改造，具体是进行设计、制备和修饰。

Description

设计肽的方法
技术领域
本发明涉及联合利用噬菌体展示和内含肽(intein)介导的蛋白裂解反应对重组肽进行遗传改造，具体是进行设计、制备和修饰。
背景技术
噬菌体展示和其它高通量筛选方法已经用于获得结合在选定的受体或其它靶标上的小分子量的肽。虽然结合在靶标上的肽可以通过生物淘选(biopanning)相当快速地鉴定出来，但将这些序列开发成为有用的高亲和力的肽还是会需要相当长的时间。此外，组合方法，如噬菌体展示通常仅仅是基于结合反应来鉴定肽，致使要想发现一种具有足够水溶性的生物活性肽需要测试数种候选物。遗憾的是，通过化学合成制备一系列不同的肽费力且昂贵，特别是当这种肽需要通过特别的二硫键排列使其形成环状的时候。
为了加速鉴定出具有期望活性的肽，已经将肽与谷胱甘肽-S-转移酶或碱性磷酸酶一起制备成融合蛋白的形式。然而，与载体(carrier)蛋白融合之后，肽可能会失去它的活性。另外，如果肽是一种酶的抑制剂，融合蛋白可能不适于证实这种活性。这些问题可以通过利用蛋白酶或者肽键水解化学试剂如溴化氰或羟胺将肽从载体上释放来避免，但肽的产率通常非常低。利用这些试剂也可能引起肽自身的降解。
通过噬菌体展示系统发现的肽可能在水中非常难溶，致使其难以在生物学系统中进行研究或应用。
内含肽介导的蛋白剪接系统用于制备重组蛋白已有记载(Chong et al.，1997)。内含肽是含有蛋白剪接活性的蛋白，通常在细菌内表达重组蛋白时用作融合伴侣。内含肽所具有的自体裂解能力可以使靶蛋白与内含肽分离，这样就不需要进行蛋白酶或肽键水解化学试剂的处理(chong et al.，1997；Mathys et al.，1999)。
内含肽的剪接活性是可诱导的，例如通过硫醇试剂，或者温度以及pH的变化进行诱导(Evans et al.，1999)。
内含肽系统已经被应用于产生小的环肽(WO 00/36093)。该文献公开的方法中利用了断裂内含肽(split intein)的反式剪接能力来催化肽的环化。该文献中制备的肽是主链环肽，也就是说，肽的N-末端和C-末端氨基酸之间有肽键。该方法中靶肽被插入到一个断裂内含肽的两部分之间，该结构对于获得主链-环肽是必不可少的。
尽管噬菌体展示是选择新的肽配体的强大工具，但是现在的噬菌体展示文库的化学多样性却十分有限，因为它必须依赖于对二十种天然氨基酸的利用。已经有一些体外或体内方法可以向噬菌体展示出的肽和蛋白中添加额外的氨基酸。同样，具有非天然氨基酸的合成肽也已经可以连接在通过噬菌体展示诱变术进行修饰而得到的噬菌体展示蛋白上(Dwyer et al.，2000)。
加入氨基酸类似物以增加噬菌体展示肽的化学多样性是非常重要的，因为它可以导致鉴定出更有活性而且稳定的肽，这样的肽可以更好地在药物发现方法中起到前导化合物(lead compound)的作用。
发明概述
我们现在设计了一种改进的通过利用内含肽介导的蛋白剪接来快速产生可溶性噬菌体展示肽的方法。本发明的方法对于产生具有二硫桥的肽特别有用，该肽的裂解(cleavage)是通过温度/pH-诱导的内含肽剪接进行的。在一个实施例中记载了明胶酶十二肽抑剂CTTHWGFTLC(CTT)的制备。CTT是含有二硫键的低分子量肽，它是通过筛选在丝状噬菌体上展示的随机肽文库而发现的。
内含肽系统还使我们可以制备含有非天然氨基酸的CTT肽变体。含有5-氟色氨酸(fluorotryptophan)的CTT肽与野生型CTT肽相比，在人血清中表现得更稳定，并且是肿瘤细胞侵入的更有效的抑制剂。
CTT-肽在水中可溶。然而，出于标记的目的，在该肽中插入一个额外的酪氨酸残基是必要的。但是，化学合成的、含有这样一个额外酪氨酸的经修饰的CTT肽在水中是不溶的，致使其在实验室中没有实用价值。于是，我们以内含肽融合体的形式表达了含有额外酪氨酸的CTT肽的组合文库，其中所述酪氨酸侧面连有随机的疏水氨基酸，我们还测试了这样的肽的可溶性和活性。我们发现利用这个系统，具有改进的可溶性的肽可以很方便地进行筛选。
这样我们利用内含肽介导的蛋白裂解反应在大肠杆菌中制备重组肽。利用该方法可快速制备和纯化出毫克级水平的十个残基长度的明胶酶抑制剂肽CTTHWGFTLC。对该肽的丙氨酸扫描诱变显示，色氨酸残基对于明胶酶抑制活性是起主要作用的。在通过生物合成方式将羟基化的和氟代的色氨酸类似物掺入内含肽融合蛋白中以后，内含肽裂解也可以发生。所述类似物利用转化为色氨酸营养缺陷型的蛋白表达株进行有效掺入，该营养缺陷型株是利用体外装配的噬菌体Mu DNA转座复合物进行插入诱变而得到的。所有含有色氨酸类似物的肽都保留了明胶酶抑制活性。与野生型CTTHWGFTLC肽相比，含有5-氟色氨酸的肽在血清中的稳定性增强，并且是更有效的肿瘤细胞入侵抑制剂。这些研究公开了一种新的通过生物合成方式掺入非天然氨基酸来修饰肽并提高其活性的可能性。这些研究总体上表明，内含肽介导的肽表达是通用的肽设计工具，使具有潜在的治疗应用价值的高活力肽的开发成为可能。
此外，我们利用proMMP-9作为靶进行了噬菌体筛选。经过三轮的筛选，我们用一对寡核苷酸引物在内含肽载体中克隆了筛选出来的肽，所述引物经过设计，使任何插入的噬菌体肽都可以得到扩增而不需要知道该肽的序列。得到的肽具有序列ADGA-(X)n-GAAG，其中ADGA与GAAG氨基酸序列得自噬菌体，(X)n是插入的肽。例如，我们成功地表达了两种这样的肽，它们的特异性可以通过抑制噬菌体结合而显示出来。
另外，本申请还记载了一种肽展示系统，其中用营养缺陷型大肠杆菌将氨基酸类似物掺入噬菌体颗粒。该系统有利于筛选具有改进的活性或稳定性的肽。在营养缺陷型细菌株中，在天然氨基酸缺乏的情况下，氨基酸营养缺陷迫使转运RNAs发生错氨酰化，进而将氨基酸类似物掺入肽。上述方法在这里用于制备噬菌体颗粒。
因此，本发明提供制备肽的方法，包含以下步骤：提供编码包含目的肽的多肽的核酸分子，将上述核酸分子插入与内含肽融合的表达载体，并且表达所述肽-内含肽融合体。
在本发明优选的一个实施例中，为该方法所提供的核酸分子是经过PCR扩增的、源自噬菌体展示载体的核酸分子，或者是来自核糖体展示、质粒-肽展示或其它遗传展示系统。
该方法还可以进一步包含以下步骤：诱导所述肽裂解，以及通过亲和柱纯化所述肽。在本发明的一个优选实施例中，肽裂解是通过温度和pH的变化诱导的。
该方法通常可利用适当的宿主系统在体内进行。在这样的系统中，所述肽-内含肽融合体可以在例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中表达。可以使用其它的微生物或真核生物宿主，例如酵母细胞，昆虫细胞以及哺乳动物细胞。
另一方面，该方法也可在体外进行。在这样的方法中，翻译过程在没有活细胞的情况下完成，翻译机制通常从细胞裂解物或细胞抽提物中获得。
上面概述的方法可在蛋白设计中应用于多种目的，例如构建具有随机亲水氨基酸以提高肽的水溶性的肽文库，制备具有非天然氨基酸的肽，或者制备肽合并物(pool)以备筛选具有改进的特性的肽。
该方法的一个具体应用是制备通过噬菌体展示得到的任意肽，在该方法中设计了一对通用的内含肽寡核苷酸引物，其结构可容许扩增插入的肽而无需知道其肽序列。
我们设计了如下通用引物：
(1)内含肽正向SapI引物具有如下序列：CCT TTC TGC TCT TCC AACGCC GAC GGG GCT。该引物将来自噬菌体的氨基酸ADGA添加到肽上。
(2)内含肽反向PstI引物具有如下序列：ACT TTC AAC CTG CAG TTA CCCAGC GGC CCC。该引物将来自噬菌体的氨基酸GAAG添加到肽上。
这些引物序列可用于扩增以及克隆内含肽融合体形式的任何噬菌体展示肽。简而言之，噬菌体肽通过PCR进行扩增，插入物用限制性酶SapI和PstI消化。插入的肽连接到经相似消化处理的内含肽载体上。连接好的载体被转化到宿主细胞内，并进行表达。该方法进一步还可以包括纯化从宿主细胞中获得的肽。
我们的研究将内含肽系统的应用扩展到了制备小分子量的肽，以及它们的具有非天然氨基酸的修饰形式。掺入非天然氨基酸，例如氟色氨酸的可能性将有利于在药物的发现过程中开发具有增强的活性和/或稳定性的肽。另外，利用经改造的具有多重氨基酸营养缺陷型的菌株，可以将多种氨基酸以非天然氨基酸代替。
在一个优选的制备包含非天然氨基酸的肽的实施例中，所述肽直接利用噬菌体展示技术在营养缺陷型宿主中进行筛选，然后，筛选出的肽在噬菌体上以内含肽融合体的形式进行表达。
这种非天然氨基酸展示系统与制备在fUSE5载体中的现有噬菌体库完全兼容，因为掺入氨基酸类似物并不依赖于特殊的密码子。因此，含有氨基酸类似物的新文库可以用现有文库进行感染而简单制备。这包括建库所必需的冗长的克隆和转化步骤。另外，由内含肽辅助进行的肽表达可以有效地补充噬菌体展示系统，例如，含有氟色氨酸的肽可以直接表达为用于活性分析的可溶肽。
该系统最适合用于稀有氨基酸，如色氨酸。将色氨酸类似物掺入噬菌体文库是很重要的，因为在通过噬菌体展示选择的肽中色氨酸经常被富集。
发明详述
缩写：
CTT：     CTTHWGFTLC肽(Koivunen et al.，1999a)；
iCTT：    重组CTTHWGFTLC肽；
STT：     STTHWGFTLS肽；
MMP：     基质金属蛋白酶；
5OH-Trp： 5-羟色氨酸；
5F-Trp：  5-氟色氨酸；
6F-Trp：  6-氟色氨酸；
7A-Trp：  7-重氮色氨酸；
附图说明
图1A和1B，合成的肽或内含肽产生的肽对MMP-2和MMP-9的抑制。(A)MMP-9用CTT，iCTT，或STT处理，肽浓度如图所示，MMP-9活性用生物素化的明胶来测定。(B)丙氨酸突变肽的活力(见表1)与CTT活力的比较，将CTT在明胶降解实验中抑制MMP-2的活性作为100％。在所有的实验中所述肽与酶预孵30分钟，之后加入底物。结果显示三次测量的平均值±SD并代表至少两次独立的实验。
图2A，2B，2C和2D.将色氨酸类似物掺入内含肽-CTT肽融合蛋白。(A)本研究中用到的色氨酸类似物(B)12％SDS-PAGE显示的尿素溶解的内含肽-CTT融合蛋白细菌裂解液。所有的试样通过IPTG诱导。内含肽-CTT融合提的表观分子量大约是30kDa。(C)正常色氨酸和包含5OH-Trp的CTT肽的紫外吸收光谱。包含5F-Trp以及6F-Trp的肽的紫外吸收光谱与野生型肽的类似，未显示。(D)含有色氨酸类似物的CTT肽的荧光发射光谱。这些肽的荧光发射的最大值校正为相同的值。
图3A和3B.含有色氨酸类似物的CTT肽的活性和稳定性。(A)以β-酪蛋白(21kDa)为底物时对MMP-2的抑制。所述肽(100μM)与MMP-2以及β-酪蛋白(0.1mg/ml)孵育2h，试样在15％SDS-PAGE胶上跑胶。(B)浓度为150μMdiCTT，5F-CTT或阴性对照肽CERGGLETSC与未稀释的人血清在37℃孵育指定的时间。提取样品，冷冻储存并印迹到硝酸纤维素膜上。CTT水平通过多克隆抗-CTT抗体进行定量。对印迹进行扫描，三次测量的结果用平均值±SD进行表示。另外两次的实验结果与该结果接近。
图4A和4B.在10％加热灭活的胎牛血清(A)或10％未加热的正常人血清(B)中检测肽抑制HT-1080肿瘤细胞入侵。在重组肽不存在或以150μM浓度存在的情况下，使细胞通过基质胶(Matrigel)包被的穿孔(Transwell)迁移16小时。结果以三个孔的平均值±SD表示。这些结果代表三次独立的实验。星号(*)代表在Student’s t-检验中的统计学显著性(P＜0.05)。
图5.CTT肽、合并物(pool)1和合并物2存在的情况下凝胶酶A(MMP-2)受到的抑制。合并物1和合并物2中都含有10种不同的CTT衍生物。文库中含有CTT肽衍生物的216种不同组合。来自合并物1的克隆4和来自合并物2的克隆7经纯化并测试其对明胶酶A的抑制活性。
图6.从特异性结合proMMP-9的噬菌体克隆#43中得到的肽插入物，利用通用的内含肽寡聚核苷酸引物进行克隆，表达内含肽-肽融合体，所述肽利用HPLC进行纯化。微量滴定孔覆盖20ng/孔的proMMP-9，用牛血清白蛋白封闭，在有或无15μM肽的情况下使噬菌体结合。未结合的噬菌体以TBS-Tween洗去，结合的噬菌体以抗噬菌体抗体-HRP偶联剂检测。表达和纯化的肽#43抑制携带相同肽#43的噬菌体与proMMP-9结合，但不抑制携带不同肽(肽#63)的另一种结合proMMP-9的噬菌体的结合。同样，肽插入物#63仅抑制携带肽#63的噬菌体结合，但不抑制携带肽#43的噬菌体结合。肽CTT对噬菌体#43和#63的结合没有影响，证实了噬菌体结合的特异性。
图7.制备营养缺陷型噬菌体宿主株的策略示意图。
图8.用于噬菌体整合的氨基酸类似物的结构。
图9A和9B.在氨基酸类似物存在的情况下制备噬菌体。噬菌体按照方法中所述进行制备。在三个平行实验中，连续稀释培养物上清，将其用于感染大肠杆菌K91/kan。感染性噬菌体的百分比与在亲代氨基酸存在的情况下培养的噬菌体作比较。图中显示在色氨酸(A)和甲硫氨酸(B)存在的情况下制备噬菌体的代表性数据。
图10.氟色氨酸的掺入改变了噬菌体本来的荧光性质。噬菌体试样在含1％SDS的缓冲液中加热变性，记录荧光光谱在295nm的激发。发射荧光经测量范围是300-500nm。
图11.含氟噬菌体(fluorophage)文库经两轮的利用人细胞系Eahy926和KS1767生物淘选后富集。噬菌体用Eahy926除杂(subtracted)并用KS1767结合进行选择。
实验1
方法
化学法肽合成。依照已报道的Fmoc-化学法(Koivuen et al.，1999a)，用Applied Biosystems 433A型(Foster City，CA)来合成肽，只是二硫键的形成是利用过氧化氢进行的。简单来说，肽溶于50mM醋酸铵(pH7.5)中至浓度1mg/ml，然后每100mg肽中加入0.5毫升3％过氧化氢。经过30分钟的孵育，将pH调至3.0，用线性乙腈梯度(30分钟内0％→70％)在0.1％三氟醋酸中利用反相HPLC纯化环化的肽。
内含肽-肽融合体的克隆。以5’-CGCCTGCAGTTAACA-3’为引物，将编码CTTHWGFTLC肽的合成寡核苷酸5’-GGTGGTGCTCTTCCAACTGTACGACCCATTGGGGATTTACTTTATGTTAACTGCAGGCG-3’用Dynazyme IIDNA聚合酶(Finnzymes，Espoo，Finland)转变成双链形式，并用SapI和PstI进行消化。纯化后的插入肽与SapI-PstI-消化的pTwin载体骨架连接(NewEngland Biolabs)(Evans et al.，1999)。通过序列分析来验证插入的准确性。利用丙氨酸密码子GCG通过类似的克隆策略制备丙氨酸突变肽。为了克隆任意的噬菌体插入肽，使用通用的寡核苷酸5’-CCT TTC TGC TCT TCC AACGCC GAC GGG GCT-3’(内含肽正向SapI)，5’-ACT TTC AAC CTG CAG TTACCC AGC GGC CCC-3’(内含肽反向PstI)。对于亲水的CTT肽文库，制备合成的简并寡核苷酸5’-GGTGGTTGCTCTTCCAACGGCCGCCVAVVAVTATVAVGGCTGTACCACCCATTTACTTT ATGTTAACTGCAGGCG-3’(其中V为A，C或G)，并用与正常CTT肽相同的引物将其转化为双链DNA。
在细菌中制备肽。将编码内含肽融合肽的质粒转化到大肠杆菌ER2566菌株(New England Biolabs)中。所得的克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养至OD600达0.7。蛋白表达利用0.3mM的IPTG进行诱导，在37℃孵育4h。将细菌沉淀物悬浮在20mM Tris-HCl(pH8.5)/500mM NaCl/1mM EDTA/1％ Triton X-100(缓冲液B1)中。接下来超声处理，离心，可溶部分过几丁质亲和柱(New England Biolabs)。含有几乎所有的内含肽-融合蛋白的不溶部分溶在8M尿素/100mM Tris-HCl(pH8.0)/100mM NaCl/2mMEDTA中溶解并经超声处理。溶解的物质再用不合Triton X-100的缓冲液B1稀释最少16倍，再经过离心澄清。澄清后的上清液也通过几丁质柱。柱子用不含Triton X-100的缓冲液B1彻底清洗。利用22℃在50mM醋酸铵/1mM EDTA(pH7.0)中孵育过夜在柱上进行内含肽裂解反应。游离肽被洗脱，经冷冻干燥或Sep-Pak C18筒(Waters)处理而被浓缩，并用反相HPLC进行纯化。利用MALDI-TOF质谱分析对每种肽进行鉴定。利用邻苯二醛或HPLC分析对肽进行定量。用已知浓度的CTT肽作为标准。
色氨酸营养缺陷型大肠杆菌ER2566突变体的产生。体外装配的噬菌体Mu DNA转座复合物基本上按以前记载的方法制备(Lamberg et al.，2002)。简单说，含有卡那霉素抗性基因的1.1pmol转座子DNA和4.9pmol的MuA蛋白在20μl的l50mM Tris-HCl(pH6.0)/50％甘油/0.025％ Triton X-100/150mM NaCl/0.1mM EDTA中混合。转座复合物装配反应在30℃进行2h。复合物以1∶8或1∶16稀释度电穿孔至电感受态大肠杆菌ER2566中并在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养皿中铺板。获得的克隆影印至含有1mM DL-色氨酸(Sigma)的M9基本平板。选出一个需要补充色氨酸进行生长的命名为ER2566/Trp82的克隆用于进一步的研究。为了确定转座子插入位点，用基因组DNA分离试剂盒(Qiagen)分离染色体DNA并用PstI消化。得到的基因片断与PstI消化的pUC19质粒连接，在卡那霉素存在的情况下对转化物进行选择。转座子边界的DNA序列通过转座子特异引物5’-ATCAGCGGCCGCGATCC-3’和5’-TTATTCGGTCGAAAAGGATCG-3’测序确定。插入物的基因组位置通过BLAST搜索进行鉴定。
用于将氨基酸类似物掺入噬菌体颗粒的营养缺陷型大肠杆菌的产生。按已记载的方法，制备体外装配的含有卡那霉素抗性基因的噬菌体Mu DNA转座复合物，并将其电穿孔入MC1061(Lamberg et al.，2002)。成功的转座根据是否获得卡那霉素抗性进行鉴定，得到的菌落通过影印至含有0.5mM L-亮氨酸，1mM硫胺素，含有或不含0.5mM甲硫氨酸或色氨酸的M9基本琼脂板来筛选营养缺陷型。选出依赖Met或Trp生长的克隆用于掺入研究。为了进行噬菌体感染，来自大肠杆菌株NK5468(E.coli Genetic Center，YaleUniversity，New Haven，CT)的F’-菌毛[lacIq L8 pro且lacYZ中有Tn9]通过接合进行转移。根据是否获得氯霉素抗性来鉴定成功的接合。
将色氨酸类似物掺入肽。将编码内含肽-CTT融合肽的质粒转化至营养缺陷型ER2566/Trp82。克隆在补充0.6％甘油，0.1mM CaCl2，2mM MgCl2，0.01mM FeSO4，100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml卡那霉素以及0.5mM DL-色氨酸的M9培养基上培养至OD600达0.8-1.0。色氨酸类似物5-羟-L-色氨酸(5OH-Trp，Sigma)，5-氟-DL-色氨酸(5F-Trp)，6-氟-DL-色氨酸(6F-Trp)以及DL-7-重氮色氨酸(7A-Trp，IcN Biomedicals)的掺入通过培养基替换(mediumshift)程序完成(Minks et al.，1999；Mohammadi et al.，2001；Ross et al.，1997；tang et al.，2001)。细菌经离心，悬浮在缺少色氨酸或类似物的新鲜M9培养基中。细菌在37℃生长15分钟消耗掉绝大部分残留的色氨酸，然后加入终浓度为0.5mM的色氨酸类似物，并加入0.5mM的IPTG。37℃培养4h，使细菌沉淀成团，按如上所述的方法纯化融合蛋白。
明胶酶抑制实验。明胶酶proMMP-2和proMMP-9(Roche)分别经对氨基苯乙酸汞(p-aminophenylmercuric acetate)或胰蛋白酶的活化，然后在每一种待测试肽存在或不存在的情况下孵育30分钟。明胶酶抑制活性用以下实验测定：(i)用明胶酶试剂盒(Roche)按厂家说明检测生物素化明胶的降解。(ii)然后，MMP-2特异性荧光肽底物MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH2(Calbiochem)(终浓度为2.5μM)的降解用MOS-250荧光分光光度计(Bio-Logic SA，Claix，France)以330nm激发光和390nm发射光进行测量。(iii)将活化的MMP-2与0.1mg/ml浓度的β-酪蛋白共同在37℃孵育2小时，之后将试样在15％ SDS-PAGE胶上进行分析，以此研究β-酪蛋白的降解。
细胞侵入(cell invasion)。HT-1080人纤维肉瘤细胞在含有10％胎牛血清，并补充了青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养。根据文献记载，利用基质胶包被的侵入室(invasion chamber)在含血清培养基中进行侵入实验(Koivunnen等1999)。简单说，细胞与肽预培养1h，然后使其经由基质胶包被的侵入室(Becton Dickinson)迁移16h。迁移的细胞用结晶紫染色并计数。
光谱测定和荧光测定。在20mM Tris-HCl(pH7.4)/50mM NaCl/0.1mMEDTA中用Genesys 5分光光度计(Thermo Spectronic，Rochester，NY)测量每种肽在200-375nm范围内的吸收光谱。在有色氨酸、5FW或6FW存在的情况下培养的CTT噬菌体的荧光光谱是通过在10mM Tris-HCl(pH7.5)/140mMNaCl/1％SDS中的加热变性的噬菌体(2×109/ml)来测量的。用MOS-250分光光度计记录300-500nm的荧光发射光谱(三次扫描的平均值)。这些肽在295nm激发(带宽5nm)，记录300-500nm范围的发射光谱。
肽在人血清中的稳定性。血样采自实验室人员，血清分装后储存在-70℃。将肽加入未稀释的人血清中至终浓度为150μM。血清在37℃保温，在不同的时间点取出等份试样，用PBS/0.05％ Tween 20稀释，立即在液氮中冻存。试样解冻后用96孔点印迹仪转移到硝酸纤维素膜上。接下来用5％BSA在TBS/0.05％ Tween 20中的溶液进行封闭，膜与1∶500稀释的抗CTT兔血清孵育，该血清是通过用偶联匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)(Sigma)的CTT蛋白免疫而制备得到的。所固定的抗CTT抗体利用1∶2000稀释度的过氧化酶偶联抗兔抗体测定增强的化学发光来检测。
氨基酸类似物。DL-乙硫氨酸(Eth)，DL-正亮氨酸(Nle)，4-重氮-DL-亮氨酸(Ale)，5-羟-L-色氨酸(5OH)，5-氟-DL-色氨酸(5FW)，6-氟-DL-色氨酸(6FW)以及DL-7-重氮色氨酸(7AW)来自Sigma-Aldrich或者ICNBiomedicals。
氨基酸类似物掺入噬菌体颗粒。用于展示CTT肽的丝状噬菌体fUSE5在MB5F或MB64F株中培养，所用的化学成分明确的M9培养基补充了0.2％葡萄糖，0.1mM CaCl2，2mM MgCl2，0.01mM FeSO4，20μg/ml四环素，25μg/ml卡那霉素，10μg/ml氯霉素，1mM硫胺素，鸟苷、尿嘧啶、腺嘌呤、胸苷各0.2mM，所有二十种氨基酸浓度为0.1-0.8mM(Neidhardt et al.，1974)。氨基酸类似物的掺入是通过培养基替换流程完成的。简单说，将细菌(OD600＝0.7-1.0)离心后悬浮于新鲜的缺少要替换的氨基酸的M9培养基中。加入类似物使终浓度为0.5-2mM(为L-异构体)，将细菌培养过夜。
噬菌体定量。制备系列稀释的噬菌体上清液，将其用于依照标准技术(Koivunen et al.，1999b)感染大肠杆菌K91/kan株。10μl等份试样的感染物按一式三份在含有40μg/ml四环素和10μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上铺板。孵育过夜后，计数细菌菌落。
制备含氟噬菌体文库。用CX7C，CX8C，和X9C文库(Koivunen et al.，1999a，Koivunent et al.，2001)的15μl等份试样感染培养在Terrific Broth中的MB5F株。噬菌体感染导致0.5×109个克隆。孵育过夜后，细菌在1升M9培养基中进一步培养过夜。依上述的方法进行培养基替换，将5FW和6FW类似物同时加入至终浓度为0.5mM。第二天将得到的噬菌体用聚乙二醇(PEG)/NaCl沉淀两次(Koivunen et al.，1999b)。
用含氟噬菌体文库进行的生物淘选。将总数为2.5×105的Eahy926细胞(Koivunnen et al.，1999a，Koivunen et al.，2001)悬浮在含150μl 1％牛血清白蛋白的DMEM培养基中，与1份含氟噬菌体文库(1×109转导单位)在+4℃孵育4h。细胞经小牛血清梯度离心(Williams et al.，2002)，得到的噬菌体上清感染2.5×105的KS1767细胞，在+4℃孵育4h。试样再次经血清梯度离心，细胞团用于感染MB5F细菌。细菌生长过夜，在有氟色氨酸的情况下再培养一天。收集噬菌体，用于第二轮的Eahy926细胞除杂和KS1767细胞选择。
结果
利用内含肽载体进行的肽生物合成
我们选择具有C-末端裂解活性的Ssp DnaB mini-内含肽用于制备肽，因为该内含肽仅含有154个氨基酸，并且C末端蛋白融合通常可以有效表达。另外，该内含肽的裂解活性被pH和温度变化所诱导，变化范围是pH8.5和4℃至pH7.0和22℃。这样我们就可以避免硫醇诱导的内含肽裂解，它会干扰二硫键并干扰肽的活性。利用内含肽制备末端含有半胱氨酸的肽的一个有利之处是，半胱氨酸是导致高裂解效率的有利于催化的氨基酸(Paulus，2000)。
我们的研究始于检验内含肽介导的十个残基长的明胶酶抑制肽CTT的制备，该肽仅在环状二硫化物形式有活性。基本上所有的内含肽-CTT融合蛋白都可在包含体中发现，并可经尿素溶解后回收。收获的肽在柱上经过裂解反应后纯度可达70-90％。经最终的HPLC纯化，每升细菌培养物最多可产生2mg肽。内含肽融合衍生的CTT(iCTT)自发环化，在质谱分析中具有含二硫健的CTT肽的预期表观分子量(表1)。接着，对CTT进行丙氨酸扫描诱变来鉴定明胶酶抑制活性所必需的氨基酸残基。得到丙氨酸取代的肽，其产量与iCTT近似。质谱分析确认每种环肽的性质(表1)。
             表1.通过内含肽系统制备的重组肽
   肽     序列        分子量，Da
 计算分子量*   表观分子量
 iCTTT1→AT2→AH→AW→AG→AF→AT3→AL→A5OH-CTT5F-CTT6F-CTT  CTTHWGFTLCCATHWGFTLCCTAHWGFTLCCTTAWGFTLCCTTHAGFTLCCTTHWAFTLCCTTHWGATLCCTTHWGFALCCTTHWGFTACCTTH(5OHW)GFTLCCTTH(5FW)GFTLCCTTH(6FW)GFTLC     1166.41136.31136.31100.31051.21180.41090.31136.31124.31182.41184.41184.4     1166.51136.41136.41100.51051.41180.51090.41136.51124.41182.41184.31184.2
*分子量以氧化的环化形式计算
明胶酶抑制肽的功能分析
在几项实验中，发现iCTT的明胶酶抑制活性与化学合成的CTT相同。在明胶降解试验中，iCTT与CTT表现出近似的剂量依赖性，对于MMP-2和MMP-9抑制的IC50都是20μM(图1A，数据未显示)。非环化的合成对照肽STTHWGFTLS(STT)的活性比iCTT要差好几倍。
在明胶降解实验中分析Ala-取代的肽，结果显示，色氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸的改变显著降低了明胶酶抑制活性(图1B)。W→A，G→A和F→A突变肽的活性分别为野生型肽的17±12，53±7和36±7％。在所有其它位置的Ala-取代对明胶酶抑制活性的影响不明显。例如，具有H→A替换的肽保留了野生型活性的约80％。在产荧光MMP-2底物试验中对这些肽进行比较，得到的结果相似(数据未显示)。
含有色氨酸类似物的肽的生物合成
在证实了内含肽表达用于肽合成的能力之后，我们试验了将非天然氨基酸掺入内含肽衍生肽的可能性。我们将研究的重点集中在对CTT中单独的色氨酸进行修饰，因为它最有可能调节肽的活性和稳定性。有效掺入非天然的色氨酸类似物所必需的色氨酸营养缺陷型大肠杆菌是利用体外装配的噬菌体Mu DNA转座复合物进行诱变来制备的。一个命名为ER2566/Trp82的克隆被分离出来，我们发现它是色氨酸营养缺陷型。转座子插入位点的基因组位置位于核苷酸1315340-44，这里的编号是基于全部测序后的大肠杆菌K12株。这样，Mu转座特有的五个正确的碱基对靶位点就被鉴定出来(Lamberg et al.，2002)。插入肽位于编码色氨酸合成酶β亚基的trpB基因内部，与观察到的表型一致。
Er2566/Trp82克隆被用于在加入5-羟色氨酸，5-氟色氨酸，6-氟色氨酸，7-重氮色氨酸的细菌培养基中表达CTT内含肽融合体(图2A)。之前，这些色氨酸类似物已被掺入利用色氨酸营养缺陷型大肠杆菌制备的数种蛋白中(Minks et al.，1999；Mohammadi et al.，2001；Ross et al.，1997)。在表达的内含肽融合蛋白中有七个色氨酸残基，三个位于几丁质结合域，三个位于内含肽中，一个位于CTT肽中。我们观测了所有四种色氨酸类似物掺入内含肽融合蛋白的情况(图2B)。在SDS-PAGE上，含有氟色氨酸类似物的内含肽融合蛋白比含有正常色氨酸的蛋白迁移得快。另一方面，极性更强的5OH-Trp和7A-Trp残基导致融合蛋白迁移变慢。与野生型蛋白相比，融合蛋白的产率轻微减少(5OH-Trp，5F-Trp，6F-Trp)或显著减少(7A-Trp)。值得注意的是，5F-Trp和6F-Trp并未显著破坏内含肽的裂解活力，含有氟色氨酸的CTT肽的产率大约是每升基本培养基0.3mg。5OH-Trp残基影响内含肽裂解，导致肽产量降低。含有7A-Trp的肽的产量不足以进行活力测定。质谱分析证实，每种肽都含有所期望的非天然色氨酸类似物(表1)。在含氟肽制剂中仅有少量的野生型CTT肽出现，而在5OH-CTT制剂中完全未检测到野生型肽(数据未显示)。经修饰的肽的性质可通过紫外吸收和荧光光谱进一步证实。含有5OH-色氨酸的CTT肽具有特征性的吸收图谱，其中有第二个明显偏向红外光波长范围的吸收最大值(图2C)。所有经修饰的肽的荧光发射光谱与野生型肽的都有差异(图2D)。
修饰的CTT肽的明胶酶抑制活性经β-酪蛋白降解实验(图3A)和凝胶降解实验(数据未显示)进行测定。在这些实验中未发现明胶酶抑制活性有显著差异。浓度为100μM的含有5OH-Trp，5F-Trp，和6F-Trp的肽抑制MMP-2的效率与iCTT接近，并且几乎完全抑制酪蛋白降解。由于氨基酸类似物可以影响这些肽的蛋白酶敏感性，我们接下来研究这些肽在正常人血清中孵育时的稳定性。为了确定肽水平，我们使用能够识别含有5F-Trp的肽的抗-CTT抗体。与半衰期为0.5小时的野生型CTT肽相比，含有5F-Trp的肽在血清中更稳定，半衰期为3小时(图3B)。我们无法确定含有5OH-Trp和6F-Trp的肽的半衰期，因为抗CTT抗体在血清存在的情况下对这些肽的识别非常微弱。CTT抗体特异性非常强，因为环化的对照肽CERGGLETSC和CPCFLLGCC与抗CTT抗体不反应。在补充了10％加热灭活的胎牛血清的细胞培养基中CTT和含有5F-Trp的肽的稳定性没有差异(数据未显示)。
在细胞侵入实验中，当细胞在存在10％加热灭活的胎牛血清的情况下培养时，含有5F-Trp和6F-Trp的肽表现出的活性与iCTT接近(图4A)。然而，当HT-1080细胞在10％未加热灭活的人血清存在的情况下培养时，含有5F-Trp的肽表现出比iCTT明显更好的抑制细胞侵入的活性(图4B)，其与血清稳定性数据相关。这种效应对于色氨酸在5-位发生氟取代是特异性的，因为含有6F-Trp的肽与野生型肽没有活性差异。
制备亲水性内含肽文库
为了给CTT肽加上放射性碘标记，通过化学合成制备出带有额外酪氨酸的肽。但是，这些肽不溶于水，尽管CTT肽本身是水溶性的。于是，我们利用内含肽系统制备了肽文库以筛选水溶性的含酪氨酸的CTT肽。我们用具有编码极性氨基酸的随机化氨基酸的简并寡核苷酸来强力增强含有酪氨酸的CTT肽的溶解性。得到的文库编码肽GRXXYXGCTTHWGFTLC，其中X是任意亲水氨基酸。首先设计了寡核苷酸5’-GGTGGTTGC-TCTTCCAACGGCCGCCVAVVAVTATVAVGGCTGTACCACCCATTTACTTTATGTTAACTGCAGGCG-3’，然后用寡核苷酸合成仪通过组合式合成进行制备。该寡核苷酸含有三个VAV密码子(其中V是G或A或C)，其编码亲水性氨基酸。
该寡核苷酸通过PCR制成双链。PCR产物以PstI和SapI消化，并克隆入也用PstI和SapI消化的TWIN2内含肽载体(New England Biolabs)。该DNA构建体电穿孔入MC1061感受态细胞。得到的文库中含有CTT肽的216种变异形式。从包含最少216个独立的MC1061克隆的合并物中提取质粒载体。将这些质粒电穿孔至能产生内含肽的ER2566细胞中。携带这些质粒的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基上铺板。将10个独立的克隆合并。这10个克隆的合并物经培养，肽被表达并经几丁质亲和柱和反相C18柱纯化。测试每份肽合并物的活性和在PBS中的溶解性。将两份合并物中具有截然不同活性并且具有较好溶解性的两个克隆进行培养，按前述方法纯化肽。这些肽中的一个(具有序列GRENYHGCTTHWGFTLC)比原始的肽具有更好的在水中或PBS中的溶解性，而且它是有活性的(图5)。将编码该肽的质粒测序，并用化学合成法合成该肽。
为了证明以内含肽融合形式表达任意噬菌体展示肽的一般性策略的有效性，用通用引物扩增来自经选择可结合proMMP-9的噬菌体肽。来自特异性结合proMMP-9的噬菌体克隆的插入肽经三轮的噬菌体筛选后被扩增，并克隆入内含肽载体。使这些肽表达，并经HPLC纯化。结合proMMP-9的噬菌体的特异性以及这些肽的性质通过噬菌体ELISA来证实。内含肽系统表达的这些肽只阻断具有相同插入肽的噬菌体的结合，但不会与携带其它插入肽的噬菌体的结合竞争(图6)。
将氨基酸类似物掺入噬菌体颗粒
为了高水平产生噬菌体，同时又能有效掺入氨基酸类似物，我们使一般用于制备噬菌体展示库的大肠杆菌MC1061株突变。按照Lambert等在2002年公开的方法，利用体外装配的噬菌体Mu DNA转座复合物通过随机插入诱变分离出色氨酸和甲硫氨酸的营养缺陷型衍生物。亲代MC1061株没有噬菌体感染力所需要的F菌毛，于是我们将来自大肠杆菌NK5468株的F’菌毛转移至新分离出的营养缺陷型株。这样就得到了命名为MB5F的色氨酸营养缺陷型株和甲硫氨酸营养缺陷型MB64F。图7表现了获得用于肽展示系统的细菌株的策略。新的菌株是有功能的，因为它们可以被丝状噬菌体感染，尽管其感染只有K91/kan宿主的10％。
首先测试以下色氨酸类似物掺入噬菌体颗粒的效力：商品化的色氨酸类似物5-羟-L-色氨酸(5OH)，5-氟-DL-色氨酸(5FW)，6-氟-DL-色氨酸(6FW)以及DL-7-重氮色氨酸(7AW)(图8)。将携带有CTTHWGFTLC肽的fUSE5噬菌体感染色氨酸营养缺陷型MB5F株。感染的细菌首先在合成培养基中培养，然后转移至含有待测试的氨基酸类似物的培养基中。对照实验中，细菌被转移到缺乏色氨酸或类似物的培养基中。过夜培养后，培养基上清液中CTT-fUSE5噬菌体的滴度通过感染大肠杆菌K91/kan来测定。用5FW和6FW获得的感染性颗粒的数目与用色氨酸获得的大致相同。5FW与6FW联用也高效地产生噬菌体颗粒。作为明显对照的是，5OH和7AW支持极低水平的噬菌体颗粒产生(图9A)。
利用MB64F株对甲硫氨酸类似物乙硫氨酸和正亮氨酸的掺入效率进行了类似的测试。在这些实验中，正亮氨酸(Nle)可以高效掺入，但乙硫氨酸(Eth)不行(图9B)。亮氨酸类似物正缬氨酸(Nva)和4-重氮亮氨酸(Ale)也进行了测试，因为MC1061株是天然的亮氨酸营养缺陷型。然而，掺入这些类似物的尝试没有成功(数据未显示)。
对类似物的掺入效率的研究不能通过色氨酸类似物在SDS-PAGE中的不同迁移来进行，因为不能充分分辩主要衣壳蛋白pVIII，它只有50个氨基酸，分子量大约5200。为了证明氟色氨酸类似物已经确实掺入到噬菌体颗粒中，我们利用氟取代物可以改变蛋白质中色氨酸的固有荧光性质这一事实。在有5FW和6FW时培养的噬菌体用PEG/NaCl离心四次以除去任何未掺入的氟色氨酸。得到的噬菌体(2×109噬菌体/ml)用SDS变性并记录其荧光光谱。观察到的发射荧光主要来自主要衣壳蛋白pVIII中的单个色氨酸，这种衣壳蛋白有约2800拷贝/病毒颗粒，而其它的外壳蛋白仅有2-5个拷贝。当试样在295nm波长被激发时，含有5FW和6FW的噬菌体的荧光量子的产量大大增强，与这些类似物的已有数据相一致(Minks et al.，1999)。另外，含有6FW的噬菌体制备物的发射光最大波长与野生型噬菌体的339nm发射光最大波长相比，移动了6nm，变为345nm(图10)。这些结果说明这些类似物的明显掺入，尽管还不可能对掺入水平进行定量分析。
为了证明含有非天然氨基酸的噬菌体文库可以制备并可用于生物淘选，我们制备了含有5FW和6FW的CX7C，CX8C，和X9C文库。这些文库是通过用野生型的CX7C，CX8C，和X9C库(Koivunen et al.，1999a；Koivunenet al.，2001)感染MB5F株，之后在5FW和6FW存在的情况下培养这些被噬菌体感染的细菌得到的。扩增后的噬菌体用人卡波西瘤细胞KS1767进行淘选，以分离出可以识别这些肿瘤细胞，但不能识别内皮细胞系Eahy926的肽。KS1767特异性肽在扣除(subtract)结合Eahy926细胞的肽文库之后获得(图11)。经过两轮的生物淘选富集2.2倍，考虑到噬菌体颗粒在化学成分确定的培养基中形成较慢，这是很有意义的。
序列表说明
关于SEQ.ID.No.1-4：
人工序列的描述：寡核苷酸引物
关于SEQ.ID.No.5：
人工序列的描述：寡核苷酸引物
在26，28，29，31，35和37位的v为a，c或g
关于SEQ.ID.No.6-7：
人工序列的描述：寡核苷酸引物
关于SEQ.ID.No.8-11：
未知生物的描述：未知
关于SEQ.ID.No.12-19：
人工序列的描述：CTT肽的Ala取代物
关于SEQ.ID.No.20：
人工序列的描述：在位置5含有色氨酸类似物的CTT肽
位置5的Xaa是5-OH-Trp，5-F-Trp或者6-F-Trp
关于SEQ.ID.No.21-22：
人工序列的描述：对照序列
关于SEQ.ID.No.23：
人工序列的描述：带有额外的亲水氨基酸的CTT肽
3，4和6位的Xaa是任何亲水氨基酸
关于SEQ.ID.No.24：
人工序列的描述：带有额外的亲水氨基酸的CTT肽
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                        序列表
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<120>设计肽的方法
<130>40263
<140>
<141>
<160>24
<170>PatentIn Ver.2.1
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸引物
<400>6
atcagcggcc gcgatcc                                                     17
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸引物
<400>7
ttattcggtc gaaaaggatc c                                                21
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>8
 Ala Asp Gly Ala
   1
<210>9
<211>4
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>9
Gly Ala Ala Gly
  1
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>10
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys
  1               5                  10
<210>11
<211>10
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物的描述：未知
<400>11
Ser Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Ser
  1               5                  10
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>12
Cys Ala Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys
  1               5                  10
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>13
Cys Thr Ala His Trp Gly Phe Thr Leu Cys
  1               5                  10
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>14
Cys Thr Thr Ala Trp Gly Phe Thr Leu Cys
  1               5                  10
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>15
Cys Thr Thr His Ala Gly Phe Thr Leu Cys
  1               5                  10
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>16
Cys Thr Thr His Trp Ala Phe Thr Leu Cys
  1               5                  10
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>17
 Cys Thr Thr His Trp Gly Ala Thr Leu Cys
   1               5                  10
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>18
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Ala Leu
  1               5
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽的Ala取代
<400>19
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Ala Leu Cys
  1               5                  10
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽且位置5具有色氨酸类似物
<220>
<221>SITE
<222>(5)
<223>Xaa at position 5 is 5-OH-Trp，5-F-Trp或6-F-Trp
<400>20
Cys Thr Thr His Xaa Gly Phe Thr Leu Cys
  1               5                  10
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：对照序列
<400>21
Cys Glu Arg Gly Gly Leu Glu Thr Ser Cys
  1               5                  10
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：对照序列
<400>22
Cys Pro Cys Phe Leu Leu Gly Cys Cys
  1               5
<210>23
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>SITE
<222>(3)..(6)
<223>位置3，4和6的Xaa是任何亲水氨基酸
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽且具有额外的亲水氨基酸
<400>23
Gly Arg Xaa Xaa Tyr Xaa Gly Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu
  1               5                  10                  15
Cys
<210>24
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CTT肽且具有额外的亲水氨基酸
<400>24
Gly Arg Glu Asn Tyr His Gly Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu
  1               5                  10                  15
Cys

Claims (23)

1、一种产生具有至少一个二硫桥的肽的方法，包含以下步骤：
-提供编码包含目的肽的多肽的核酸分子，
-将所述的核酸分子掺入表达载体作为与内含肽的融合体，
-表达所述肽-内含肽融合体，并且
-利用温度和pH变化诱导所述肽裂解。
2、权利要求1所述的方法，进一步包含以下步骤：
-用亲和柱纯化所述肽。
3、权利要求1所述的方法，该方法是在宿主系统活体内进行的。
4、权利要求3所述的方法，其中的宿主系统包括大杨杆菌细胞。
5、权利要求1所述的方法，该方法是在体外进行的。
6、权利要求1所述的方法，其中的核酸分子是合成的核酸分子，它包括编码目的肽的核苷酸序列，和能使该核酸分子掺入表达载体的元件。
7、权利要求1所述的方法，其中提供的核酸分子是PCR扩增的、源自噬菌体展示载体的核酸分子。
8、权利要求7所述的方法，其中被噬菌体展示载体编码的肽包含氨基酸类似物。
9、权利要求7所述的方法，该方法用于制备经噬菌体展示筛选的任意肽，其中提供的核酸分子是利用一对侧翼连接编码目的肽的核苷酸序列的寡核苷酸引物获得的PCR扩增物，并且包含将所述序列掺入表达载体时所需的元件。
10、权利要求9所述的方法，其中的寡核苷酸引物对由具有序列CCT TTCTGC TCT TCC AAC GCC GAC GGG GCT的正向引物，和具有序列ACTTTC AAC CTG CAG TTA CCC AGC GGC CCC的反向引物组成。
11、权利要求1所述的方法，该方法用于构建亲水肽文库，其中提供的核酸分子进一步包含至少一个要加入目的肽的亲水氨基酸的密码子。
12、权利要求11的方法，其中制备得到肽GRENYHGCTTHWGFTLC。
13、权利要求1所述的方法，该方法用于构建亲水肽文库，其中提供的核酸分子进一步包含至少一个亲水氨基酸的密码子，该亲水氨基酸用于替换对目的肽的活性不起决定作用的氨基酸。
14、权利要求1所述的方法，该方法用于制备肽合并物，其中提供的核酸分子包含编码多个目的肽的多个核苷酸序列。
15、权利要求14所述的方法，进一步包含在获得的肽合并物中筛选改进的溶解度的步骤。
16、权利要求1所述的方法，该方法用于产生具有非天然氨基酸的肽，其中该方法进一步包括以下步骤：
-提供一种针对天然氨基酸的营养缺陷型宿主细胞，该天然氨基酸是要被所述的非天然氨基酸替换的氨基酸，
-在氨基酸类似物存在的情况下，在所述的营养缺陷型宿主细胞内表达所述肽-内含肽融合体。
17、权利要求16所述的方法，其中制备得到肽CTTH(5-氟-W)GFTLC。
18、权利要求16所述的方法，其中制备得到肽CTTH(6-氟-W)GFTLC。
19、在血清中稳定性提高的CTTH(5-氟-W)GFTLC肽。
20、在水中溶解度提高的GRENYHGCTTHWGFTLC肽。
21、肽CTTH(5-氟-W)GFTLC，它是通过权利要求16的方法获得的。
22、肽GRENYHGCTTHWGFTLC，它是通过权利要求11法获得的。
23、一种制备带有非天然氨基酸的肽的方法，该方法包含以下步骤：
-利用营养缺陷型宿主在噬菌体表面表达含有氨基酸类似物的肽文库，
-在营养缺陷型宿主中利用噬菌体展示来选出含有氨基酸类似物的目的肽，
-将编码所述肽的核酸转移到内含肽载体中，并且
-按权利要求16的方法表达目的肽。
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