体内掺入非天然氨基酸的正交翻译组分
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年10月27日提交的美国临时专利申请序列号No.60/622,738的优先权,出于所有目的该申请已通过引用全文纳入本文。
关于联邦政府资助下研究和开发所完成的本发明的权利声明
本发明是在政府支持下用能源部的基金No.ER45601和国立卫生研究院的基金No.GM62159完成的。因此政府对本发明享有一定的权利。
发明领域
本发明属于翻译生物化学领域。本发明涉及利用正交(orthogonal)tRNA、正交氨酰-tRNA合成酶及正交tRNA/正交氨酰-tRNA合成酶对将非天然氨基酸掺入蛋白质的组合物和方法。本发明还涉及用这种对在细胞内产生蛋白质的方法以及用这种方法产生的蛋白质。
发明背景
在历史上,对蛋白质结构和功能的研究依赖于利用天然氨基酸反应活性基团的特性和可得到的反应化学物质。不幸的是,从细菌到人类,每种已知生物(的蛋白质)都是由相同的二十种常见氨基酸编码的(罕见的例外是硒代半胱氨酸(参见,例如,A.Bock等,(1991),Molecular Microbiology 5:515-20)和吡咯赖氨酸(参见,例如,G.Srinivasan等,(2002),Science 296:1459-62)。R-基团的这种有限选择性限制了对蛋白质结构和功能的研究,所述研究经天然氨基酸的化学特性证实,例如,用天然氨基酸制备高度靶向(某氨基酸)的蛋白质修饰而不靶向蛋白质中所有其它氨基酸的能力有限。此外,天然氨基酸的功能活性,如荧光、金属螯合、氧化还原电势、光囚禁(photocaging)等能力也有限。
本领域目前使用的用于选择性修饰蛋白质的修饰反应大多数涉及在亲核和亲电子反应伴侣之间形成靶向蛋白质氨基酸侧链中天然发生的亲核残基的共价键,例如,α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。这些情况下中的选择性由蛋白质中亲核残基的数目和可达性决定。不幸的是,天然发生的蛋白质通常含有弱定位的(例如,不可接触的)反应位点或多个反应靶点(例如,赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基),这导致修饰反应的选择性弱、难以通过亲核/亲电子试剂制造高度寻靶的蛋白质修饰。此外,修饰位点通常限于赖氨酸、组氨酸或半胱氨酸天然发生的亲核侧链。其它位点的修饰是困难的或不可能的。
本领域需要的是将非天然氨基酸掺入蛋白质以便修饰和研究蛋白质结构和功能的新的策略,其中所述非天然氨基酸具有未在天然发生的氨基酸中发现的新的特性,例如,生物特性。这的确是本领域的需要,以便产生以高度选择性方式修饰蛋白质以及在生理条件下修饰蛋白质的蛋白质修饰反应的新的策略。本领域需要的是产生蛋白质修饰的新方法,其中所述修饰是高度特异的,例如,不使天然发生的氨基酸发生交叉反应或副反应的修饰。高度特异的蛋白质修饰策略的新化学可广泛用于研究蛋白质的结构和功能。
克服这些限制的一个策略是扩展遗传密码并加入相比生物所有组成成分(repertoire)具有不同物理、化学或生物特性的氨基酸。这种方法已被证实是可行的,可利用宿主细胞如真细菌大肠埃希氏菌(大肠杆菌)、酵母或哺乳动物细胞的体内蛋白质生物合成机制通过正交tRNA和相应的新正交氨酰-tRNA合成酶将非天然氨基酸加入蛋白质。这种方法描述于各种资料,例如,Wang等,(2001),
Science 292:498-500;Chin等,(2002)
Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027;Chin和Schultz,(2002),
ChemBioChem 11:1135-1137;Chin等,(2002),
PNAS United States of America 99:11020-11024;和Wang和Schultz,(2002),
Chem.Comm.,1-10。也可参见题为“产生正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶对的方法和组合物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OFORTHOGONAL TRNA-AMINOACYL TRNA SYNTHETASE PARIS)”的国际公开WO 2002/086075;题为“非天然氨基酸的体内掺入(IN VIVO INCORPORATION OFUNNATURAL AMINO ACIDS)”的WO 2002/085923;题为“真核遗传密码的扩展(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)”的WO 2004/094593;2004年7月7日提交的WO 2005/019415;2004年7月7日提交的WO 2005/007870;和2004年7月7日提交的WO 2005/007624。
本领域的确需要开发将非天然氨基酸掺入蛋白质的正交翻译组分,其中所述非天然氨基酸能被掺入规定位置,且其中所述非天然氨基酸赋予掺入它们的蛋白质新的生物特性。还需要开发掺入非天然氨基酸的正交翻译组分,所述非天然氨基酸具有能使该氨基酸成为特定修饰的靶以排除与蛋白质中其它位点的交叉反应或副反应的新化学特性。还特别需要能够产生含有显著量非天然氨基酸的蛋白质的蛋白质表达系统,所述含量能使该蛋白质用于治疗用途和生物医学研究。这里描述的本发明满足了这些需要以及其它需要,通过以下描述这是显而易见的。
发明概述
本发明提供了在体内(例如在宿主细胞内)响应选择者密码子(selector codon)如琥珀密码子将非天然氨基酸掺入产生的多肽链的组合物和方法。这些组合物包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA(O-tRNA)和正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)对。这就是说,宿主细胞内源性氨酰-tRNA合成酶不会将任何氨基酸(天然或非天然)加入到O-tRNA中。类似地,本发明提供的O-RS不以显著水平或者某些情况下是可检测水平用氨基酸(天然或非天然)加载任何内源性tRNA。这些新的组合物能够产生大量含有翻译掺入的非天然氨基酸的蛋白质。根据所掺入非天然氨基酸的化学特性,这些蛋白质具有广泛用途,包括例如用于治疗或生物医学研究。
一些方面,本发明提供了一种翻译系统。这些系统包含第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA(O-tRNA)和非天然氨基酸,其中所述第一O-RS用第一非天然氨基酸优先氨酰化第一O-tRNA。第一非天然氨基酸可选自p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素-丙氨酸、7-羟基-香豆素-丙氨酸、o-硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸或p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸。
该翻译系统可采用衍生自各种来源的组分。一实施方案中,第一O-RS衍生自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)氨酰-tRNA合成酶,例如,野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在其它实施方案中,O-RS衍生自大肠杆菌氨酰-tRNA合成酶,例如,野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶。用于该系统的O-RS包含选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-54、57、59-63以及那些序列的保守变体。一些实施方案中,O-tRNA是琥珀抑制基因tRNA。一些实施方案中,O-tRNA包含SEQID NO:1或2或由其编码。
一些方面,翻译系统还包含编码感兴趣蛋白质的核酸,其中所述核酸包含至少一种被所述O-tRNA识别的选择者密码子。
一些方面,翻译系统包含利用第二非天然氨基酸的第二正交对(即第二O-RS和第二O-tRNA),从而该系统现在能够在多肽的不同选定位置掺入至少两个不同的非天然氨基酸。在这种双重系统中,第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸优先氨酰化第二O-tRNA,且第二O-tRNA识别不同于被第一O-tRNA识别的选择者密码子的选择者密码子。
一些实施方案中,翻译系统位于宿主细胞中(并包括宿主细胞)。对所用宿主细胞没有特别限制,只要O-RS和O-tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。所述宿主细胞可以是真细菌细胞如大肠杆菌,或酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。所述宿主细胞可含有一种或多种编码包括O-RS或O-tRNA在内的该翻译系统组分的多核苷酸。一些实施方案中,编码O-RS的多核苷酸包含SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58的核苷酸序列。
本发明还提供了产生在所选位置上含有一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的方法。这些方法利用上述翻译系统。通常,这些方法开始于提供翻译系统的步骤,所述翻译系统包含:(i)选自以下的第一非天然氨基酸:p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素-丙氨酸、7-羟基-香豆素-丙氨酸、o-硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸和p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸;(ii)第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS);(iii)第一正交tRNA(O-tRNA),其中所述O-RS用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA;和(iv)编码所述蛋白质的核酸,其中所述核酸包含至少一种被所述第一O-tRNA识别的选择者密码子。该方法然后在所述蛋白质的翻译过程中响应所述选择者密码子将所述非天然氨基酸掺入所述蛋白质的所述所选位置,从而产生在所选位置含有所述非天然氨基酸的所述蛋白质。
该方法可用各种试剂和步骤广泛采用。一些实施方案中,提供了编码O-RS的多核苷酸。一些实施方案中,提供了衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶的O-RS,例如可提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在其它实施方案中,提供了衍生自大肠杆菌氨酰-tRNA合成酶的O-RS,例如可提供衍生自野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的O-RS。一些实施方案中,提供步骤包括提供含有以下氨基酸序列的O-RS:SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57、59-63所示氨基酸序列及其保守变体。
在这些方法的一些实施方案中,提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变突变野生型氨酰-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋,并选择用所述非天然氨基酸优先氨酰化所述O-tRNA的所得O-RS。所述选择步骤包括在定点诱变之后从含有许多所得氨酰-tRNA合成酶分子的集合中对所述O-RS进行阳性选择和阴性选择。一些实施方案中,提供步骤提供编码O-tRNA的多核苷酸,例如,O-tRNA是琥珀抑制基因tRNA,或者O-tRNA包含SEQ ID NO:1或2所示多核苷酸序列或由其编码。在这些方法中,提供步骤还包括提供含有被翻译系统利用的琥珀选择者密码子的核酸。
还可修饰这些方法以在蛋白质中掺入一个以上非天然氨基酸。在那些方法中,与第一翻译系统结合使用第二正交翻译系统,其中的第二系统具有不同的氨基酸和选择者密码子特异性。例如,提供步骤可包括提供第二O-RS和第二O-tRNA,其中的第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸优先氨酰化第二O-tRNA,且其中的第二O-tRNA识别核酸中不同于被第一O-tRNA识别的选择者密码子的选择者密码子。
产生具有非天然氨基酸的蛋白质的方法还可在宿主细胞内进行。此时需提供宿主细胞,其中的宿主细胞含有非天然氨基酸、O-RS、O-tRNA和核酸,且其中所述培养所述宿主细胞导致非天然氨基酸的掺入。一些实施方案中,提供步骤包括提供真细菌宿主细胞(例如,大肠杆菌)或酵母宿主细胞。一些实施方案中,提供步骤包括提供含有编码O-RS的多核苷酸的宿主细胞。例如,编码O-RS的多核苷酸可包含SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58所示的核苷酸序列。一些实施方案中,提供翻译系统的步骤通过提供细胞提取物完成。
一些方面,本发明提供了翻译系统,该系统用于掺入3-硝基-L-酪氨酸或p-硝基-L-苯丙氨酸。这些系统包含第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA(O-tRNA)和非天然氨基酸,其中的第一O-RS用第一非天然氨基酸优先氨酰化第一O-tRNA,其效率至少为含有所述第一非天然氨基酸、所述第一O-tRNA和含有选自SEQ ID NO:7-10的氨基酸序列的O-RS的翻译系统效率的50%。
该翻译系统可使用衍生自各种来源的组分。一些实施方案中,第一O-RS衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶,例如,野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。用于该系统的O-RS可包含选自SEQ ID NO:7-10所示氨基酸序列及其保守变体的氨基酸序列。一些实施方案中,O-tRNA是琥珀抑制基因tRNA。一些实施方案中,O-tRNA包含SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列或由其编码。
一些方面,翻译系统还包含编码感兴趣蛋白质的核酸,其中所述核酸具有至少一个被O-tRNA识别的选择者密码子。
一些方面,翻译系统包含利用第二非天然氨基酸的第二正交对(即第二O-RS和第二O-tRNA),从而该系统现在能够在多肽的不同选定位置掺入至少两个不同的非天然氨基酸。在这种双重系统中,第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸优先氨酰化第二O-tRNA,且第二O-tRNA识别不同于被第一O-tRNA识别的选择者密码子的选择者密码子。
一些实施方案中,翻译系统位于宿主细胞中(并包括宿主细胞)。对所用宿主细胞没有特别限制,只要O-RS和O-tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。所述宿主细胞可以是真细菌细胞如大肠杆菌。所述宿主细胞可含有一种或多种编码包括O-RS或O-tRNA在内的该翻译系统组分的多核苷酸。一些实施方案中,编码O-RS的多核苷酸包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
本发明还提供了产生在所选位置上含有一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的方法。这些方法利用上述翻译系统。通常,这些方法开始于提供含有翻译系统的宿主细胞的步骤,所述翻译系统包含:(i)第一非天然氨基酸,其为3-硝基-L-酪氨酸或p-硝基-L-苯丙氨酸;(ii)第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS);(iii)第一正交tRNA(O-tRNA),其中的O-RS用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA,其效率至少为含有所述非天然氨基酸、O-tRNA和含有选自SEQ ID NO:7-10的氨基酸序列的O-RS的宿主细胞效率的50%;和(iv)编码蛋白质的核酸,其中所述核酸含有至少一种被O-tRNA识别的选择者密码子。然后使宿主细胞生长,并在所述蛋白质的翻译过程中响应选择者密码子将所述非天然氨基酸掺入所述蛋白质的所选位置,其中,所述蛋白质中的所选位置对应于所述核酸中所述选择者密码子的位置,从而产生在所选位置含有所述非天然氨基酸的所述蛋白质。
这些方法可用各种试剂和步骤广泛采用。一些实施方案中,提供了编码O-RS的多核苷酸。一些实施方案中,提供了衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶的O-RS,例如可提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。一些实施方案中,提供步骤包括提供含有选自SEQ ID NO:7-10及其保守变体的氨基酸序列的O-RS。
在这些方法的一些实施方案中,提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变突变野生型氨酰-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋,并选择用所述非天然氨基酸优先氨酰化所述O-tRNA的所得O-RS。所述选择步骤包括在定点诱变之后从含有许多所得氨酰-tRNA合成酶分子的集合中对所述O-RS进行阳性选择和阴性选择。一些实施方案中,提供步骤提供编码O-tRNA的多核苷酸,例如,O-tRNA是琥珀抑制基因tRNA,或者O-tRNA包含SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列或由其编码。在这些方法中,提供步骤还包括提供含有被翻译系统利用的琥珀选择者密码子的核酸。
还可修饰这些方法以在蛋白质中掺入一个以上非天然氨基酸。在那些方法中,与第一翻译系统结合使用第二正交翻译系统,其中的第二系统具有不同的氨基酸和选择者密码子特异性。例如,提供步骤可包括提供第二O-RS和第二O-tRNA,其中的第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸优先氨酰化第二O-tRNA,且其中的第二O-tRNA识别核酸中不同于被第一O-tRNA识别的选择者密码子的选择者密码子。
产生具有非天然氨基酸的蛋白质的方法还可在宿主细胞内进行。在这些实施方案中,宿主细胞含有非天然氨基酸、O-RS、O-tRNA和核酸,且其中所述培养所述宿主细胞导致非天然氨基酸的掺入。一些实施方案中,提供步骤包括提供真细菌宿主细胞(例如,大肠杆菌)或酵母宿主细胞。一些实施方案中,提供步骤包括提供含有编码O-RS的多核苷酸的宿主细胞。例如,编码O-RS的多核苷酸可包含SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列。一些实施方案中,提供翻译系统的步骤通过提供细胞提取物完成。
本发明还提供了各种包含核酸和蛋白质的组合物。对该组合物的性质没有特别限制,只要该组合物含有规定的核酸或蛋白质。本发明的组合物可含有任何数量任何性质的额外组分。
例如,本发明提供了含有O-RS多肽的组合物,其中所述多肽含有SEQ IDNO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57、59-63或其保守变体,其中的保守变体多肽用非天然氨基酸氨酰化同源正交tRNA(O-tRNA),其效率至少为含有O-tRNA、非天然氨基酸和含有选自SEQ ID NO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-54、57或59-63的氨基酸序列的氨酰-tRNA合成酶的翻译系统效率的50%。本发明还提供了编码上述任何多肽的多核苷酸。一些实施方案中,这些多核苷酸可含有SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56和58。一些实施方案中,多肽在细胞中。
本发明还提供了含有SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58所示核苷酸序列的多核苷酸组合物。一些实施方案中,本发明提供了含有所述多核苷酸的载体,如表达载体。一些实施方案中,本发明提供了含有上述载体的细胞。
定义
在详细描述本发明前,需要说明本发明并不局限于某些特定的生物系统,本发明可以有各种变化。还应当说明本文所用的术语是为了描述特定的实施方案,并不意味着对本发明的限制。如本发明的说明书和附属权利要求中使用,除非特别指明,单数形式“一个”、“一种”和“这种”也包括复数。因此,例如,“一个细胞”包括两个或多个细胞;“一种多核苷酸”作为一种特定物质包括该多核苷酸的多个拷贝。
除了在此处和说明书的其余部分所定义的,本文所用的所有科技术语都与本发明所属领域普通技术人员共同理解的意义相同。
正交:本文所用的术语“正交”指一种分子(如正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))具有某细胞内源性组分的功能,但与该细胞或翻译系统内的相应内源性分子相比其效力低,或者不具有该细胞内源性组分的功能。就tRNA和氨酰-tRNA合成酶而言,正交是指正交的tRNA或正交的氨酰tRNA合成酶具有内源性tRNA或内源性tRNA合成酶的功能,但与内源性tRNA或内源性tRNA合成酶相比无能或效力低,如低于20%、10%、5%或1%。该正交分子缺乏细胞内内源性互补分子的正常功能。例如,与内源性tRNA被内源性RS氨酰化相比,细胞内的正交tRNA被细胞的内源性RS氨酰化时其效率降低,甚至为零。在另外一个实施例中,与内源性的RS氨酰化内源性tRNA相比,正交的RS在感兴趣细胞内氨酰化任何内源性tRNA时其效率降低,或者甚至为零。第二正交分子可以被引入到细胞内和第一正交分子一起发挥功能。例如,正交tRNA/RS对包括引入的互补组分,在细胞内一起行使功能时其效率与对照,如相应的内源性tRNA/RS对或活性正交对(如酪氨酰正交tRNA/RS对)相比可以达到45%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或更高。
正交酪氨酰-tRNA:本文所用的术语正交酪氨酰-tRNA(酪氨酰-O-tRNA)是与感兴趣翻译系统正交的tRNA,该tRNA:(1)与天然产生的酪氨酰tRNA相同或基本类似,(2)衍生自天然酪氨酰tRNA的天然突变或人工诱变,(3)由考虑到(1)或(2)的野生型或突变型酪氨酰tRNA序列的方法所产生,(4)与野生型或突变型亮氨酰或酪氨酰tRNA同源,(5)与表5中所列称为亮氨酰或酪氨酰tRNA合成酶底物的典型tRNA同源,或(6)是表5中称为亮氨酰或酪氨酰tRNA合成酶底物的典型tRNA的保守变体。亮氨酰或酪氨酰tRNA可以负载一个氨基酸,或非负载状态。还需要说明“酪氨酰-O-tRNA”或“亮氨酰-O-tRNA”可任选经相关合成酶加载(氨酰化)除赖氨酸或亮氨酸以外的氨基酸,如非天然氨基酸。应理解本发明的亮氨酰或酪氨酰-O-tRNA确实可优选用于在翻译时响应选择者密码子将任何必需的氨基酸,无论是天然的或是人工合成的,插入到正在延伸的多肽内。
正交酪氨酰氨基酸合成酶:本文所用的正交酪氨酰氨基酸合成酶(酪氨酰-O-RS)是一种可以在感兴趣翻译系统内用氨基酸优先氨酰化酪氨酰-O-tRNA的合成酶。被酪氨酰-O-RS加载到酪氨酰-O-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸,无论是天然的还是人工合成的,不限于本文所述的。该合成酶还任选可以与天然的酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源,或者与表5中称为酪氨酰-O-RS的合成酶相同或同源。例如,酪氨酰-O-RS可以是表5所列的酪氨酰-O-RS的保守变体,和/或与表5所列的酪氨酰-O-RS的序列至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性。
类似地,正交亮氨酰氨基酸合成酶(亮氨酰-O-RS)是一种在感兴趣翻译系统内能用氨基酸优先氨酰化亮氨酰-O-tRNA的酶。被亮氨酰-O-RS加载到亮氨酰-O-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸,无论是天然的还是人工合成的,不限于本文所述的。该合成酶还任选可以与天然的亮氨酰氨基酸合成酶相同或同源,或者与表5中称为亮氨酰-O-RS的合成酶相同或同源。例如,该O-RS可以是表5所列的亮氨酰-O-RS的保守变体,和/或与表5所列的O-RS的序列至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性。
同源(cognate):术语“同源”指能一起发挥功能的组分,如正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶。此种组分也称为互补组分。
优先氨酰化:在这里涉及正交翻译系统,当O-RS用氨基酸加载O-tRNA的效率比其加载表达系统中其它任何内源性tRNA的效率都高时O-RS“优先氨酰化”同源O-tRNA。也就是说,当O-tRNA和其它任何给定的内源性tRNA以大致相同摩尔比例同时存在于翻译系统内时,O-RS加载O-tRNA的频率要高于其加载内源性tRNA的频率。优选的是当O-tRNA和内源性tRNA以相同摩尔浓度存在于翻译系统内时,被O-RS所加载的O-tRNA与O-RS所加载的内源性tRNA的相对比例较高,其结果导致O-RS只加载、或者几乎只加载O-tRNA。当O-tRNA和O-RS以相同摩尔浓度存在时,被O-RS加载的O-tRNA和内源性tRNA之间的相对比例大于1∶1,优选至少约为2∶1,更优选的是5∶1,甚至10∶1、20∶1、50∶1、75∶1、95∶1、98∶1、99∶1、100∶1、500∶1、1,000∶1、5,000∶1或更高。
下述情况下所述O-RS“用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA”:(a)与内源性tRNA相比,O-RS更容易氨酰化O-tRNA,以及(b)与O-RS用任何天然氨基酸氨酰化O-tRNA相比,其中的氨酰化是非天然氨基酸特异性的。也就是说,当非天然氨基酸和天然氨基酸以等摩尔的量存在于含O-RS和O-tRNA的翻译系统中时,O-RS用非天然氨基酸加载O-tRNA的频率要高于用天然氨基酸加载O-tRNA的频率。优选的是非天然氨基酸加载的O-tRNA与天然氨基酸加载的O-tRNA之间的相对比例较高。更优选的是O-RS只用或者几乎只用非天然氨基酸加载O-tRNA。当非天然氨基酸和天然氨基酸以等摩尔的浓度存在于翻译系统中时,非天然氨基酸加载的O-tRNA与天然氨基酸加载的O-tRNA之间的相对比例高于1∶1,优选至少约为2∶1,更优选的是5∶1,甚至10∶1、20∶1、50∶1、75∶1、95∶1、98∶1、99∶1、100∶1、500∶1、1,000∶1、5,000∶1或更高。
选择者密码子:术语“选择者密码子”指在翻译过程中能被O-tRNA识别但通常不被内源性tRNA识别的密码子。O-tRNA反密码子环能识别mRNA上的选择者密码子并能在多肽的该位点掺入此氨基酸,例如非天然氨基酸。选择者密码子包括无义密码子,如终止密码子,例如琥珀密码子、赭石密码子和乳白密码子;四碱基或多碱基密码子;稀有密码子;天然或非天然碱基对产生的密码子等。
抑制基因tRNA:抑制基因tRNA是一种可在给定的翻译系统内改变信使RNA(mRNA)的阅读的tRNA,例如通过将氨基酸掺入到多肽链内以响应选择者密码子的机制。例如,抑制基因tRNA可通读终止密码子(例如,琥珀、赭石或乳白密码子)、四碱基密码子、稀有密码子等。
抑制活性:如本文采用的,术语“抑制活性”通常指tRNA(如抑制基因tRNA)翻译阅读通过某密码子(如为琥珀密码子或四碱基或多碱基密码子的选择者密码子)的能力,否则导致翻译终止或错译(如移码)。抑制基因tRNA的抑制活性可以表示为与第二抑制基因tRNA或与对照系统如缺乏O-RS的对照系统相比所观察到的翻译读通活性的百分数。
本发明提供了定量测定抑制活性的各种方法。特定O-tRNA和ORS对感兴趣的选择者密码子(如琥珀密码子)的抑制百分率指,与阳性对照构建物相比,位于编码某表达检测标记的核酸中的该给定表达检测标记(如LacZ),包括选择者密码子,在感兴趣翻译系统内的活性百分数,其中的感兴趣的翻译系统含有O-RS和O-tRNA,而阳性对照不含O-tRNA、O-RS和选择者密码子。因此,如果某缺乏选择者密码子的活性阳性对照标记构建物在一个给定翻译系统内的活性是X,那么含有选择者密码子的被检测构建物的抑制百分率为被检测构建物在与阳性对照标记基本相同的表达环境条件下所显示的X的百分比,其中该被检测标记构建物所表达的翻译系统也含有O-tRNA和O-RS。一般来说,表达被检测标记的翻译系统还包含能被O-RS和O-tRNA识别的氨基酸。任选地,抑制百分率的测定可以通过将该被检测标记与“背景”或“阴性”对照标记构建物比较而精细确定,后者含有与被检测标记相同的选择者密码子,但是该系统中不包含O-tRNA、O-RS和/或能被O-tRNA和/或O-RS识别的相关氨基酸。这种阴性对照可用于对该标记在感兴趣翻译系统中所产生的背景信号进行处理使抑制百分率测定标准化。
抑制效率可通过本领域熟知的多种方法测定。例如,可利用β半乳糖苷酶报告分子试验,如将衍生的lacZ质粒(该构建物在lacZ核酸序列中含有选择者密码子)和含有本发明的O-tRNA的质粒一起导入到合适生物(如可利用此正交组分的生物)的细胞内。也可导入相关合成酶(或者以多肽或编码相关合成酶的多核苷酸形式)。将这些细胞在培养基内培养到所需的密度,如OD600达到约0.5时,采用BetaFluorTM β-半乳糖苷酶检测试剂盒(Novagen)进行β半乳糖苷酶试验。抑制百分率可以计算为样品相对于可比较对照,如衍生的lacZ构建物所显示的活性的百分比,其中所述构建物在所需位置上含有相应的有义密码子而不是选择者密码子。
翻译系统:术语“翻译系统”指可以将氨基酸掺入到正在延伸的多肽链(蛋白)中的各组分。翻译系统的各组分包括:核糖体、tRNA、合成酶、mRNA等。本发明的O-tRNA和/或O-RS也可以加入到体外或体内的翻译系统中,或者作为翻译系统的一部分,如非真核细胞如细菌(如大肠杆菌)或真核细胞如酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞等的翻译系统。
非天然氨基酸:本文所用术语“非天然氨基酸”指20个常见天然氨基酸或硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸之外的任何氨基酸、修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物,如图1提供的17种非天然氨基酸。
衍生自:本文所用术语“衍生自”指从特定分子或生物、或者根据该特定分子或生物的信息分离的组分,或者利用该特定分子或生物的信息制备的组分。例如,衍生自第二多肽的多肽可包含与第二多肽的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。对多肽而言,可通过例如天然发生的诱变、人工定点诱变或人工随机诱变获得衍生的种类。用来衍生多肽的诱变可以是故意定点的或是故意随机的,或是这两者的混合。诱变多肽以形成衍生自第一多肽的不同多肽可以是随机事件(例如,由聚合酶失真(infidelity)造成),而衍生的多肽的鉴定可通过例如这里所述的合适的筛选方法完成。多肽的诱变通常需要操作编码多肽的多核苷酸。
阳性选择或筛选标记:本文所用的术语“阳性选择或筛选标记”指可通过其存在(例如表达、活化等)来鉴定含有该性状的细胞的标记,例如具有该阳性选择标记的细胞与不具有此性状的细胞相比较。
阴性选择或筛选标记:本文所用的术语“阴性选择或筛选标记”指可通过其存在(如表达、活化等)来鉴定不含有所选特性或性状的细胞(如,与具有该特性或性状的细胞相比较)。
报告分子:本文所用的术语“报告分子”是指可用于鉴定和/或筛选感兴趣系统内靶组分的组分。例如,报告分子可以包括蛋白质,如能赋予抗生素抗性或敏感性的酶(如β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)等)、荧光选择标记(如绿色荧光蛋白(如GFP)、YFP、EGFP、RFP等)、发光标记(如萤火虫荧光素酶蛋白)、亲和力筛选标记,或者阳性或阴性选择标记基因如lacZ、β-gal/lacZ(β-半乳糖苷酶)、Adh(乙醇脱氢酶)、his3、ura3、leu2、lys2等。
真核生物:本文所用的术语“真核生物”指属于真核生物界的生物。真核生物与原核生物的区别总体上在于它们通常是多细胞生物(但不排除单细胞生物,如酵母),存在膜包裹的核及其它膜包裹的细胞器,线形遗传物质(即线形染色体),无操纵子,存在内含子、加帽信使(message capping)和poly-A mRNA,以及其它生化特征,如可鉴别的核糖体结构。真核生物包括,例如,动物(如哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(如单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
原核生物:本文所用的术语“原核生物”指属于单虫无核原生动物(也称为Procarya)界的生物。原核生物与真核生物的区别通常在于,它们是单细胞生物,通过出芽或分裂进行无性生殖,缺乏膜包裹的核或其它膜包裹的细胞器,环形染色体,存在操纵子,无内含子、加帽信使和poly-A mRNA,以及其它生化特征,如可鉴别的核糖体结构。Prokarya包括真细菌和古菌(有时也称为“古细菌”)亚界。蓝细菌(蓝绿藻)和支原体有时是单虫无核原生动物界下的单独类型。
细菌:本文所用的术语“细菌”和“真细菌”指不同于古菌的原核生物。类似地,古菌指不同于真细菌的原核生物。可通过许多形态学标准和生化标准区分真细菌和古菌。例如,以下差异可用来将生物归为真细菌或古菌:核糖体RNA序列、RNA聚合酶结构、存在或不存在内含子、抗生素敏感性、存在或不存在细胞壁肽聚糖和其它细胞壁组分、膜脂为分支或不分支的结构、以及存在/不存在组蛋白和组蛋白样蛋白质
真细菌的例子包括大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)和嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)。古菌的例子包括詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Mj)、马氏微球菌(Methanosarcina mazei)(Mm)、热自养甲烷球菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mt)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyrus kandleri)、盐杆菌属如沃氏盐杆菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌NRC-1(Halobacterium species NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(Af)、激烈火球菌(Pyrococcus furious)(Pf)、超嗜热古菌(Ph)、超耐高温热棒菌(pyrobaculum aerophilum)、火球菌(Pyrococcus abyssi)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solftaricus)(Ss)、硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、Aeuropyrum pernix(Ap)、噬酸热原体(Thermoplasma acidophilum)和火山热原体(Thermoplasma volcanium)。
保守变体:本文所用术语“保守变体”就翻译组分而言指一种翻译组分,如保守变体O-tRNA或保守变体O-RS,其功能与基础组分O-tRNA或O-RS相似,但在序列上与参照O-tRNA或O-RS相比有所不同。例如,O-RS或保守变体O-RS可用非天然氨基酸如含有N-乙酰半乳糖胺部分的氨基酸氨酰化同源O-tRNA。在该例子中,所述O-RS及保守变体O-RS不具有相同的氨基酸序列。所述保守变体可具有,例如,一个、两个、三个、四个、五个或更多变异,只要保守变体与相应的O-tRNA或O-RS互补。
一些实施方案中,保守变体O-RS相比衍生出它的O-RS含有一个或多个保守性氨基酸取代。一些实施方案中,保守变体O-RS相比衍生出它的O-RS含有一个或多个保守性氨基酸取代,此外还保留了O-RS的生物学活性;例如,保守变体O-RS保留了衍生出它的亲本O-RS分子至少10%,或者至少20%,至少30%,或至少40%的生物学活性。在一些优选的实施方案中,所述保守变体O-RS保留了衍生出它的亲本O-RS分子至少50%的生物学活性。保守变体O-RS的保守性氨基酸取代可出现在该O-RS的任何结构域内,包括氨基酸结合口袋。
选择或筛选试剂:本文所用的术语“选择或筛选试剂”指可利用其存在从一群组分中选择或筛选某些特定组分的试剂。例如,选择或筛选试剂可包括但不限于营养素、抗生素、光的波长、抗体、表达的多核苷酸等。选择试剂可以使用不同的浓度、强度等。
响应:本文所用的术语“响应”指本发明的tRNA识别选择者密码子并介导将结合于tRNA的非天然氨基酸掺入正在生长的多肽链的过程。
编码:本文所用的术语“编码”指利用多聚大分子或序列符号串上的信息指导产生第二分子或序列符号串的过程,所述第二分子或序列符号串与第一分子或序列符号串不同。如本文所述,该术语的使用范围很宽,可用于许多方面。一方面,术语“编码”描述DNA的半保守性复制过程,其中双链DNA分子的一条链作为DNA依赖的DNA聚合酶的模板编码出新合成的一条互补姊妹链。
另一方面,术语“编码”指利用一个分子中的信息指导产生化学性质与第一分子不同的第二分子的过程。例如,DNA分子可编码RNA分子(如通过DNA依赖的RNA聚合酶参与的转录过程)。另外,RNA分子也可以编码多肽,例如在翻译过程中。当该术语用于描述翻译过程时,该术语也可以扩展到编码氨基酸的三联密码子。在某些方面,RNA分子也可编码DNA分子,例如通过RNA依赖的DNA聚合酶参与的反转录过程。在另一个方面,DNA分子可编码多肽,应当理解的是,在这种情况下,术语“编码”是指转录和翻译两个过程。
附图简述
图1A提供了各种非天然氨基酸的化学结构。
图2提供了在存在(泳道2)或不存在(泳道3)p-硝基-L-苯丙氨酸时累积的Z-结构域蛋白的染色SDS-PAGE分析照片。泳道1含有分子量标记。
图3提供掺入p-硝基-L-苯丙氨酸的Z-结构域蛋白的MALDI-TOF分析。预计质量:7958,7826(第一个甲硫氨酸除外);观察值:7958,7828。
图4A提供了22Trp GCN4p1突变体(实线)以及22Trp和22p-硝基-L-苯丙氨酸GCN4p1突变体混合物(虚线)的荧光光谱。图4B提供了55Trp GCN4p1突变体(实线)以及55Trp和22p-硝基-L-苯丙氨酸GCN4p1突变体混合物(虚线)的荧光光谱。
图5A提供了1,5-丹酰丙氨酸的化学结构。图5B提供了结合有1,5-丹酰丙氨酸-AMP-酰胺的嗜热栖热菌亮氨酰-tRNA合成酶(LRS)活性位点的模型。作为随机化区域一部分的突变体LRS克隆B8的活性位点残基用条状物表示。编号与大肠杆菌LRS相对应。
图6A和6B描述了突变体B8亮氨酰-tRNA合成酶编辑位点的再设计策略。图6A提供了与模拟荷电tRNA 3’-末端的2’-(L-正缬氨酰)-氨基-2’-脱氧腺苷复合的嗜热栖热菌亮氨酰-tRNA合成酶编辑位点的晶体结构。T252和V340用条状物表示。图6B提供了Ni-NTA纯化的hSOD的SDS-PAGE分析,它具有用亮氨酰-tRNA合成酶克隆B8在33位引入的丹酰丙氨酸和两个突变体V338A和T252A。上面的凝胶是考马斯染色的照片。下面的凝胶是在302nm激发、在520nm发射的荧光图象。L=分子量梯;UAA=非天然氨基酸。
图7A和7B描述了通过易错PCR和选择产生的大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6的增强的琥珀抑制效率。图7A提供了嗜热栖热菌亮氨酰-tRNA合成酶的晶体结构(Cusack等,EMBO J.,19(10):2351-2361[2000])。标出了G2-6克隆中存在的合成结构域、编辑结构域、同源大肠杆菌合成酶中随机化的氨基酸以及通过易错PCR改变的氨基酸。图7B提供了所表达的在33位含有o-硝基苄基丝氨酸的hSOD的考马斯染色SDS-PAGE分析,采用设计的可掺入o-硝基苄基半胱氨酸的大肠杆菌亮氨酰-tRNA突变体合成酶克隆3H11和用o-硝基苄基丝氨酸有效抑制所涉及的突变体大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6。L=分子量梯;UAA=非天然氨基酸(oNBS)。
图8提供了通过365nm照射将囚禁的酪氨酸分子O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸光致脱囚禁(photodecaging)(光活化)的示意图,导致切断苄基化CO-键和迅速形成脱囚禁的(decaged)氨基酸。
图9提供了浓度曲线试验,说明了观察到的囚禁中的(caged)酪氨酸分子O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的光致脱囚禁(光活化)。O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的光致脱囚禁可用手提UV灯(365nm,距离10mm)照射0.2mM氨基酸水溶液证实。在特定时间点取出等份溶液用LC/MS分析。显示了O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(正方形)和相应的脱囚禁酪氨酸(圆形)的浓度。
图10提供了在存在或不存在O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸时用三种不同突变体合成酶表达的肌球蛋白74TAG的Gelcode蓝染色的SDS-PAGE。
图11A和11B提供了74TAG突变体肌球蛋白的LC-MS/MS分析,显示了74位的酪氨酸(胰蛋白酶(水解)肽HGVTVLTALGYILK)。
图12A和12B提供了与图11A和11B类似的LC-MS/MS分析,但分析使用氚化的O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸,其中的J表示氚化的氨基酸(胰蛋白酶(水解)肽HGVTVLTALGJILK)。
图13提供了在THF和水中获得的对-氰基苯丙氨酸IR谱的叠加图。
图14A提供了与高斯曲线(虚线)拟合的对-氰基苯丙氨酸(实线)的本底减除谱。图14B提供了与高斯曲线(虚线)拟合的间-氰基苯丙氨酸(实线)的本底减除谱。
图15提供了p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的合成过程。
图16提供了在第七个位置上含非天然氨基酸的突变体Z结构域蛋白的MALDI-TOF质谱分析结果。所有通过试验获得的质量数据与含有硫酯或羧酸基团的完整蛋白质的计算质量极好吻合。
图17提供了通过化学结合标记的蛋白质的原理图。
图18A-18D提供了在340nm测得的LC/MS洗脱曲线(第一峰:3;第二峰:2)。图18A显示了使用3和2的1∶1甲醇混合物得到的曲线。图18B显示了使用3的PBS溶液得到的曲线(pH=7.4,反应时间:1周)。图18C显示了用3的PBS溶液得到的曲线(pH=3.9,反应时间:4天)。图18D显示了用稀硫酸溶液稀释的3得到的曲线(pH=1.9,反应时间:12小时)。所有反应都在室温下匀速搅拌进行。
图19提供了含有二酮基非天然氨基酸p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸的合成过程。
图20提供了在存在或不存在p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸时表达的Z结构域蛋白的Gelcode蓝染色的SDS-PAGE分析。分析显示了用荧光素酰肼体外标记含有p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸的突变体Z结构域蛋白。wt=野生型。
图21提供了含有二酮基部分的各种加合物的合成过程。
发明详述
本发明提供了受20种天然氨基酸限制的翻译系统固有局限性的解决方案。所述解决方案包括利用正交翻译系统将具有新型特性的非天然氨基酸程序性定点生物合成掺入到蛋白质中。我们在本文中描述了新的组合物(例如新的氨酰-tRNA合成酶)和新的方法,以便响应选择者密码子(例如,琥珀无义密码子、TAG)将各种非天然氨基酸高效率特异性地通过基因掺入到蛋白质中。
一些情况下,非天然氨基酸侧链可被特异性地并区域选择性地修饰。由于这些非天然氨基酸取代基的独特反应化学,可高度选择性地修饰要掺入它们的蛋白质。一些情况下,非天然氨基酸反应基的优点在于,它们对于体内系统是完全外来的,从而提高了反应选择性。一些方面,可用允许进行体外和体内蛋白质偶联反应并保留蛋白质生物学活性的相对温和的反应条件进行修饰反应。对与蛋白质中非天然氨基酸偶联的物质的特性没有特别限制,且可以是任何所需实体(entity),例如,染料、荧光团、交联剂、糖类衍生物、聚合物(例如,聚乙二醇衍生物)、光交联剂(photocrosslinker)、细胞毒化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠、第二蛋白或多肽(或其它)、多核苷酸(例如,DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。
其它方面,掺入的非天然氨基酸赋予掺入了它们的蛋白质新的生物特性。例如,非天然氨基酸可以是荧光氨基酸、光囚禁的(photocaged)或光可活化的(photoactivatable)氨基酸、可作为供体或受体参与FRET对的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、金属螯合氨基酸等。
一些方面,为证明(而非限制)本发明,这里公开的内容证实,非天然氨基酸部分可被掺入模型蛋白质。这并不是说所述非天然氨基酸只能被掺入这种模型蛋白质。从这里的公开内容显见,非天然氨基酸可掺入任何感兴趣的给定蛋白质,这对于用于治疗和研究目的的蛋白质而言是有利的。
我们开发了可在真细菌和酵母中发挥作用的新的正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶对,它们可响应选择者密码子位点特异性掺入非天然氨基酸(例如,图1提供的非天然氨基酸)。简言之,我们已经鉴定了分别在大肠杆菌宿主细胞或酵母宿主细胞中用非天然氨基酸选择性加载抑制基因tRNA的詹氏甲烷球菌(Methanococcus janaschii)酪氨酰-tRNA合成酶和大肠埃希氏菌亮氨酰-tRNA合成酶的新的突变体。
所涉及的这些tRNA-合成酶对可用来在蛋白质中位点特异性掺入各种非天然氨基酸。在蛋白质中掺入非天然氨基酸可以是程序性地,以便通过工程构造编码感兴趣蛋白质的多核苷酸而在任何所述位置进行掺入,所述多核苷酸含有作为掺入非天然氨基酸信号的选择者密码子。
正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶技术
理解与正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶对有关的活性有助于理解本发明的新的组合物和方法。有关正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶技术的讨论可见,例如,国际公开WO 2002/085923、WO 2002/086075、WO 204/09459、WO 2005/019415、WO2005/007870和WO 2005/007624。也可参见Wang和Schultz的“遗传密码的扩展”(Expanding the Genetic Code),Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34-66(2005),其内容通过引用全文纳入本文。
为在遗传密码中加入额外的反应性非天然氨基酸,需要含有氨酰-tRNA合成酶和适当tRNA的新的正交对,它们可在宿主翻译机制中有效发挥作用,但是否与翻译系统“正交”仍在讨论中,这意味着它可不依赖于翻译系统的内源性合成酶和tRNA发挥作用。正交对的所需特性包括,仅编码或识别特定密码子如选择者密码子的tRNA不由任何内源性tRNA编码,且氨酰-tRNA合成酶仅用一种特定的非天然氨基酸优先氨酰化(或“加载”)其同源tRNA。所述O-tRNA通常也不被内源性合成酶氨酰化。例如,在大肠杆菌中,正交对将包括不与任何内源性tRNA(例如,大肠杆菌中有40种)交叉反应的氨酰-tRNA合成酶和不被任何内源性合成酶(例如,大肠杆菌中有21种)氨酰化的正交tRNA。
这里描述的本发明提供了在真细菌如大肠杆菌或者酵母中进行遗传编码并将非天然氨基酸掺入蛋白质的正交对,其中所述正交组分不与宿主细胞翻译机制的内源性大肠杆菌或酵母组分交叉反应,但识别所需非天然氨基酸并响应选择者密码子(例如,琥珀无义密码子、TAG)将其插入蛋白质。本发明提供的正交组分包括衍生自詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶的正交氨酰-tRNA合成酶和突变体酪氨酰tRNACUA琥珀抑制基因,它们在真细菌宿主细胞中作为正交对。本发明还提供了衍生自大肠杆菌亮氨酰-tRNA-合成酶的正交组分和突变体大肠杆菌亮氨酰tRNACUA琥珀抑制基因,它们在酵母宿主细胞中作为正交对。在这些系统中,所述突变体氨酰-tRNA合成酶用其各自的非天然氨基酸而不用常见的20种氨基酸中的任何一种氨酰化所述抑制基因tRNA。
本发明提供了鉴定和产生其它正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶对,例如可用来将非天然氨基酸掺入蛋白质的O-tRNA/O-RS对的组合物和方法。本发明的O-tRNA/O-RS对能够介导将非天然氨基酸如图1所示的非天然氨基酸掺入由多核苷酸编码的蛋白质,其中所述多核苷酸含有例如在体外被O-tRNA识别的选择者密码子。所述O-tRNA的反密码子环识别mRNA上的选择者密码子并将其氨基酸(如图1所示的非天然氨基酸)掺入多肽的该位点上。通常,本发明的正交氨酰-tRNA合成酶仅用一种特定的非天然氨基酸优先氨酰化(或加载)其O-tRNA。
将非天然氨基酸(例如,图1中提供的非天然氨基酸)位点特异性掺入蛋白质的能力有利于蛋白质的研究以及能够工程构建具有新特性的蛋白质。例如,含有一种或多种非天然氨基酸的蛋白质的表达有助于通过特定的标记研究蛋白质,改变酶的催化功能,改变生物学活性或降低与基底的交叉反应性,将一种蛋白质与其它蛋白质、小分子或生物分子交联,降低或消除蛋白质降解,提高蛋白质的体内半衰期(例如,将引入的反应位点PEG化或进行其它修饰)等。
正交tRNA/正交氨酰-tRNA合成酶及它们组成的对
适合产生含有一种或多种非天然氨基酸的蛋白质的翻译系统通常描述于以下国际公开号中,例如,题为“METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTIONOF ORTHOGONAL tRNA-AMINO-tRNA SYNTHETASE PAIRS”的WO 2002/086075;题为“非天然氨基酸的体内掺入”的WO 2002/085923;2004年7月7日提交的题为“真核遗传密码的扩展”的WO 2005/019415;2004年7月7日提交的WO 2005/007870和2004年7月7日提交的WO 2005/007624。上述各申请通过引用全文纳入本文。还可参见Wang和Schultz的“遗传密码的扩展”,Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34-66(2005),其内容通过引用全文纳入本文。这种翻译系统一般都包括含有正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)以及非天然氨基酸的细胞(例如非真核细胞如大肠杆菌细胞或真核细胞如酵母细胞),其中O-RS可用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。本发明的正交对包括O-tRNA,如抑制基因tRNA、移码tRNA等,以及O-RS。本发明还提供了其它各组分。
通常,当正交对响应选择者密码子识别选择者密码子和加载氨基酸时,则该正交对被叫做“抑制”该选择者密码子。这就是说,不被翻译系统(例如细胞)的内源性机制识别的选择者密码子通常不翻译,这导致阻断了从核酸翻译产生多肽。本发明的O-tRNA识别选择者密码子,与包含或编码于这里列出的序列所示的多核苷酸序列的O-tRNA相比,在同源合成酶存在时,本发明的O-tRNA为了响应选择者密码子而产生的抑制效率至少可达45%、50%、60%、75%、80%、90%或更高。O-RS可用感兴趣的非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。细胞利用O-tRNA/O-RS对将非天然氨基酸掺入到正在延伸的多肽链内,例如通过包含编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸,该多核苷酸含有能被O-tRNA识别的选择者密码子。在本发明的某些实施方案中,所述细胞可包含额外的O-tRNA/O-RS对,所述额外的O-tRNA由额外的O-RS用不同的非天然氨基酸加载。例如,一种O-tRNA可识别四碱基密码子,而另一种可识别终止密码子。或者,多种不同的终止密码子或多种不同的四碱基密码子可特异性识别不同的选择者密码子。
在本发明的某些实施方案中,细胞如大肠杆菌细胞或酵母细胞含有正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和含有编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸,所述多核苷酸含有被O-tRNA识别的选择者密码子。该翻译系统也可以是无细胞系统,例如,任何市售的“体外”转录/翻译系统与这里所述的O-tRNA/ORS对和非天然氨基酸的组合。
一实施方案中,O-RS和O-tRNA联合在一起的抑制效率至少是缺少O-RS时O-tRNA的抑制效率的5倍、10倍、15倍、20倍、25倍或更高。在一方面,O-RS和O-tRNA联合在一起的抑制效率是本文序列表中所列正交合成酶对抑制效率的至少约35%、40%、45%、50%、60%、75%、80%、90%或更高。
如上所述,本发明任选可在细胞或其它翻译系统中包括多种O-tRNA/O-RS对,从而可以掺入一个以上的非天然氨基酸。例如,细胞还可以包含其它不同的O-tRNA/O-RS对和第二种非天然氨基酸,此另一种O-tRNA可识别第二选择者密码子,此另一种O-RS可用第二种非天然氨基酸优选氨酰化O-tRNA。例如,含有一种O-tRNA/O-RS对(其中O-tRNA可识别琥珀选择者密码子)的细胞还可以含有第二种正交对,其中第二O-tRNA可识别不同的选择者密码子,如乳白密码子、四碱基密码子等。理想的是,不同正交对衍生自不同来源,这样有助于识别不同的选择者密码子。
O-tRNA和/或O-RS可以是天然产生的,或可通过突变天然的tRNA和/或RS而产生,例如可从各种生物体之一产生tRNA库和/或RS库。例如,一种产生正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶对的策略涉及输入宿主细胞之外生物体或多种生物体来源的异源性(相对于该宿主细胞而言)tRNA/合成酶对到宿主细胞内。该候选异源合成酶的特性包括不能加载宿主细胞的任何tRNA,该候选异源tRNA的特性包括不能被宿主细胞的任何合成酶氨酰化。另外,该异源tRNA对于宿主细胞的合成酶而言是正交的。
产生正交对的第二种策略是产生突变库,然后从中筛选和/或选择O-tRNA或O-RS。这些策略也可联合使用。
正交tRNA(O-tRNA)
本发明的正交tRNA(O-tRNA)可以在体内或体外介导将非天然氨基酸掺入蛋白质内,所述蛋白质是由含选择者密码子的多核苷酸编码的,这种选择者密码子可被O-tRNA识别。在某些实施方案中,本发明的O-tRNA与包含或编码于这里所列序列的O-tRNA序列所示多核苷酸序列的O-tRNA相比,在相关合成酶存在的条件下,为了响应选择者密码子而产生的抑制效率至少可达45%、50%、60%、75%、80%、90%或更高。
抑制效率可通过本领域熟知的多种试验检测。例如,可以利用β半乳糖苷酶报告分子试验,如将衍生的lacZ质粒(该构建物含有选择者密码子和lacZ核酸序列)和含有本发明O-tRNA的质粒一起导入到含合适生物(如可利用正交组分的生物)的细胞内。也要导入相关合成酶(或者以多肽或编码该相关合成酶的多核苷酸形式)。将细胞在培养基内培养到所需密度,如OD600约0.5时,采用BetaFluorTM β-半乳糖苷酶检测试剂盒(Novagen)进行β半乳糖苷酶试验。抑制百分率可以计算为样品相对于可比较对照(如衍生的lacZ构建物所显示的活性值)的活性百分数,所述构建物在所需位置上含有有义密码子而不是选择者密码子。
本发明的O-tRNA的例子示于这里所列的序列。可参见本文表格、实施例和附图中所显示的典型O-tRNA和O-RS分子的序列。还可参见本文的“核酸和多肽序列及其变体”部分。该tRNA分子,如O-RS mRNA或O-tRNA分子中的胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)替换。也可以有其它的碱基修饰。
本发明还包括与这里的特定O-tRNA相对应的O-tRNA的保守变体。例如,O-tRNA的保守变体包括的那些与特定O-tRNA(如这里的序列表中列出的)功能类似,并由于适当的自身互补性而保留tRNA的L型结构,但不含有与例如这里的序列表、附图或实施例中所列相同的序列(需要的话还包括野生型tRNA分子之外的序列)。也可参见本文的“核酸和多肽序列及其变体”部分。
含O-tRNA的组合物还可以包含正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS),其中的O-RS用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA。在某些实施方案中,含有O-tRNA的组合物还可以包含翻译系统(如在体外或体内)。含有编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸,或者这些物质的一种或多种组合也可以存在于所述细胞内,其中所述多核苷酸含有能被O-tRNA识别的选择者密码子。参见本文的“正交氨酰-tRNA合成酶”部分。
产生正交tRNA(O-tRNA)的方法也是本发明的特征。用该方法产生的O-tRNA也是本发明的特征。在本发明的某些实施方案中,O-tRNA可通过构建突变体库来产生。突变体tRNA库可用本领域已知的各种诱变技术构建。例如,突变体tRNA可通过定点诱变、随机位点诱变、同源重组、DNA改组技术或其它递推诱变(recursivemutagenesis)方法、嵌合体构建、或者它们的组合来产生。
也可将其它的突变引入到特定位置上,如tRNA环或区域中的非保守区、保守区、随机区或者混合区,如反密码子环、接受臂、D臂或环、可变环、TΨC臂或环、tRNA分子的其它区域或其组合。一般来说,tRNA分子中的突变包括突变tRNA突变体库内各成员的反密码子环以使其能够识别选择者密码子。该方法还可包括将一个额外的序列(CCA)加到O-tRNA的末端。一般来说,O-tRNA对感兴趣生物的正交性相比起始材料(如tRNA序列群)有所改进,但保留了对所需RS的亲和力。
本发明的方法任选包括分析tRNA和/或tRNA合成酶序列的同源性以确定对特定生物具有正交性的潜在候选O-tRNA、O-RS和/或O-tRNA/O-RS对。可利用本领域已知的和本文所述的计算机程序都进行这种分析,如BLAST和pileup程序。在一个实施例中,为了筛选潜在的正交翻译组分用于原核生物大肠杆菌,可选择不显示与原核生物具有罕见同源性的合成酶和/或tRNA。
一般来说,可以通过阴性选择第一物种的细胞群来获得O-tRNA,该细胞可能含有O-tRNA群的成员。阴性选择可去除含有可被细胞内源性氨酰-tRNA合成酶(RS)氨酰化的O-tRNA库的成员细胞。这样就可以得到对第一物种细胞具有正交性的tRNA库。
在某些实施方案中,进行阴性选择时需要将选择者密码子引入到编码阴性选择标记的多核苷酸中,所述阴性选择标记例如有能赋予抗生素抗性的酶如β内酰胺酶,能产生可检测产物的酶如β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT),毒性产物如芽孢杆菌RNA酶引入到非必须位置上(还能产生功能性的芽孢杆菌RNA酶)等选择。筛选还可任选通过在存在选择试剂(比如抗生素,如氨苄青霉素)的培养基中培养细胞群来完成。在一个实施方案中,选择试剂的浓度是变化的。
例如,为测定抑制基因tRNA的活性,根据选择者密码子如无义密码子(如终止子)或移码突变的体内抑制使用一个选择系统,引入到编码负择标记的多核苷酸(如β内酰胺酶基因(bla))。例如,构建在某个位置上含有选择者密码子的多核苷酸变体如bla变体。用这些多核苷酸转化细胞,如细菌。如果存在无法被大肠杆菌内源性合成酶不能有效加载的正交tRNA,这种抗生素抗性如氨苄青霉素抗性应当或多或少使质粒不含转化细菌。如果该tRNA不是正交的,或者能加载tRNA的异源合成酶在此系统内共表达,应可观察到更高水平的抗生素抗性,如氨苄青霉素抗性。挑出那些无法在抗生素浓度约等于未用质粒转化的细胞的LB琼脂平板上生长的细胞,如细菌。
如果存在毒性产物(如RNA酶或芽孢杆菌RNA酶),当一群候选tRNA的成员被宿主(如大肠杆菌)的内源性合成酶氨酰化时(即对于宿主如大肠杆菌的合成酶来说不是正交的),选择者密码子被抑制,所产生的毒性多核苷酸产物可导致细胞死亡。而含有正交tRNA或非功能性tRNA的细胞存活下来。
在一个实施方案中,对能与所需生物正交的tRNA库进行阳性选择时,将选择者密码子置于阳性选择标记中,例如抗药性基因(如β内酰胺酶基因)编码的阳性选择标记中。在含有编码或包含能与细胞正交的tRNA库某成员的多核苷酸、编码阳性选择标记的多核苷酸和编码同源RS的多核苷酸的细胞内进行阳性选择。在某些实施方案中,第二群细胞含有阴性选择不能去除的细胞。由于该多核苷酸在细胞内表达,使细胞可在含选择试剂(如氨苄青霉素)的培养基内生长。然后选出能被共表达的相关合成酶氨酰化以及响应其选择者密码子而掺入氨基酸的tRNA。一般来说,这些细胞与含有非功能性tRNA或不能被感兴趣合成酶有效识别的tRNA的细胞相比,抑制效应显示升高。含有非功能性的tRNA或不能被感兴趣合成酶有效识别的tRNA的细胞对该抗生素敏感。因此那些(i)不是宿主(如大肠杆菌)内源性合成酶的底物;(ii)能被感兴趣合成酶氨酰化;以及(iii)在翻译过程中具有功能的tRNA可在两种筛选中保留下来。
因此,根据要筛选的内容,相同的标记可以是阳性或阴性标记。这就是说,如果要选择相同的标记就是阳性标记,而如果要选择相反的标记就是阴性标记。
在上面所述的方法中,所述选择(如阳性选择、阴性选择或者阳性和阴性选择)的严谨程度还包括改变筛选的严谨条件。例如,由于芽孢杆菌RNA酶是毒性很高的蛋白质,阴性选择条件的严谨程度可通过将不同数感兴趣选择者密码子引入到该酶基因内和/或通过使用可诱导启动子来加以调控。在另一个实施例中,选择试剂的浓度是可以改变的(如氨苄青霉素的浓度)。在本发明的一个方面,筛选条件的严谨程度是随时变化的,因为在前几轮筛选中感兴趣活性较低。因此,在前几轮中筛选标准的严谨程度较低,而在后几轮筛选中需要更严谨的筛选标准。在某些实施方案中,阴性选择、阳性选择或者阳性和阴性选择可重复多次。也可以使用多个不同的阴性选择标记、阳性选择标记或阳性和阴性选择标记。在某些实施方案中,阳性选择标记和阴性选择标记可以相同。
其它类型的选择/筛选方法也可用于本发明中以产生正交性翻译组分,如O-tRNA、O-RS和响应选择者密码子加载非天然氨基酸的O-tRNA/O-RS对。例如,阴性选择标记、阳性选择标记或阳性和阴性选择标记可以是在适当反应物存在时能发荧光或催化发光反应的标记。在另一个实施方案中,标记的产物可通过荧光激活的细胞分选法(FACS)或发光检测技术检测。另外,标记还可以是亲和选择标记。参见Francisco,J.A.等,(1993)《产生和用荧光激活细胞分选法筛选外表面表达功能性抗体片段的大肠杆菌》(Production and fluorescence-activated cell sorting ofEscherichia coli expressing a functional antibody fragement on the external surface).
Proc Natl Acad Sci USA.90:10444-8。
产生重组正交tRNA的其它方法见于题为“用于产生正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶对的方法和组合物”的国际专利申请WO 2002/086075和题为“真核遗传密码的扩展”的WO 2004/094593及2004年7月7日提交的WO 2005/019415。还见于Forster等,(2003)Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codesdesigned de novo
PNAS100(11):6353-6357;和Feng等,(2003),Expanding tRNArecognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change,
PNAS100(10):5676-5681。
正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)
本发明的O-RS在体外或体内能用非天然氨基酸优选氨酰化O-tRNA。可通过含O-RS的多肽和/或编码O-RS或其片段的多核苷酸将本发明的O-RS提供给翻译系统(如细胞)。例如,示范性的O-RS包含本文序列表和实施例中所列的氨基酸序列或其保守变体。在另一个实施例中,O-RS或其片段是由多核苷酸或其互补序列编码的,该多核苷酸编码含有本文序列表和实施例所列的氨基酸序列。参见本文表格和实施例中所列的示范性O-RS分子的序列。也可参见本文的“核酸和多肽序列及其变体”部分。
鉴定可与O-tRNA一起应用的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)的方法也是本发明的特征。例如,该方法包括选择,如阳性选择,第一物种的细胞群,该群中的个别细胞含有:1)一组氨酰-tRNA合成酶(RS)的一个成员(如这组RS可包括突变体RS、第一物种之外物种来源的RS,或包括这二者);2)正交tRNA(O-tRNA)(如一个或多个物种来源的);以及3)编码选择标记(如阳性选择标记)并含有至少一个选择者密码子的多核苷酸。筛选出那些与缺乏该组RS成员或RS成员数目少的细胞相比抑制效率升高的细胞。抑制效率可用本领域已知的和本文所述的方法测定。抑制效率升高的细胞所包含的活性RS可氨酰化O-tRNA。将来自第一物种的第一组tRNA被活性RS氨酰化的水平(体外或体内),与来自第二物种的第二组tRNA被活性RS氨酰化的水平相比较。氨酰化水平可通过检测底物(例如标记的非天然氨基酸)来确定。通常选出氨酰化第二组tRNA的效率比氨酰化第一组tRNA更高的活性RS,从而获得能与O-tRNA一起应用或更有效(优化)的正交氨酰-tRNA合成酶。用这种方法鉴定出的O-RS也是本发明的特征。
许多试验可用于确定氨酰化效率。这些方法可在体外或体内进行。例如,体外氨酰化试验的描述可见Hoben和Soll(1985)
Methods Enzymol.113:55-59中。氨酰化效率还可利用一个与正交翻译组分相连的报告分子,和检测能表达含有一个选择者密码子的多核苷酸编码的蛋白质的细胞在该报告分子的水平来确定。见题为“非天然氨基酸的体内掺入”的WO 2002/085923和题为“真核遗传密码的扩展”的WO2004/094593。
O-RS可以被进一步修饰以改变该合成酶的底物特异性,以使该O-RS只能将所需要的非天然氨基酸而不是其它任何常见的20种氨基酸加载到O-tRNA上。产生对非天然氨基酸具有底物特异性的正交氨酰tRNA合成酶的方法包括突变该合成酶,例如在该合成酶的活性位点、编机制位点上突变合成酶,在不同的位点上组合合成酶的不同结构域等,然后通过筛选过程进行选择。可用的一种策略是依据联用阳性选择然后阴性选择。在阳性选择过程中,抑制引入到阳性选择标记非必需位置上的选择者密码子,可使细胞在阳性选择压力下存活下来。在同时存在天然氨基酸和非天然氨基酸时,存活细胞编码的活性合成酶可利用天然或非天然氨基酸氨酰化正交的抑制基因tRNA。在阴性选择过程中,抑制引入到阴性选择标记非必需位置的选择者密码子,可去除具有天然氨基酸特异性的合成酶。经过阴性选择和阳性选择存活的细胞所编码的合成酶只能用非天然氨基酸来氨酰化(加载)正交的抑制基因tRNA。然后对这些合成酶进行进一步的诱变,如DNA改组或其它递推诱变方法。
突变体O-RS库可利用本领域已知的各种诱变技术来构建。例如,可通过定点诱变、随机位点突变、同源重组、DNA改组或其它递推诱变方法、嵌合构建、或者它们的组合来制备。例如,可从两个或多个其它较小的趋异性较低的“亚库”来构建突变体RS库。本发明还包括RS的嵌合库。应注意可任选构建各种生物(例如微生物如真细菌或古细菌)的tRNA合成酶库,如具有天然多样性的库(见Short等人的美国专利No.6,238,884;Schallenberger等人的美国专利No.5,756,316;Petersen等人的美国专利No.5,783,431;Thompson等人的美国专利No.5,824,485;Short等人的美国专利No.5,958,672)并筛选其中的正交对。
合成酶一旦通过阳性选择和阴性选择过程,可对这些合成酶进一步诱变。例如,分离编码O-RS的核酸;从该核酸产生一组编码突变的O-RS(如通过随机诱变、位点特异性诱变、重组或它们的组合)的多核苷酸;这些步骤的每一步或者这些步骤的组合都可以重复进行直到获得能够用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA的突变体O-RS。在本发明的一个方面,这些步骤可进行多次,如至少两次。
其它严谨程度的选择/筛选条件也可用于本发明的方法中以产生O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS对。选择或筛选条件的严谨程度在产生O-RS的一个步骤或两个步骤中可以不同。这包括改变所用选择/筛选试剂的浓度等。还可以进行额外轮次的阳性选择和/或阴性选择。选择或筛选还可以包括氨基酸渗透性的一种或多种改变,翻译效率的改变、翻译精确度的改变等。一般来说,所述一种或多种改变的基础是能利用正交的tRNA-tRNA合成酶对产生蛋白质的生物体的一种或多种基因中的突变。
产生O-RS以及改变该合成酶的底物特异性的其它通用细节可参见题为“产生正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶对的方法和组合物”的国际专利申请WO 2002/086075和题为“真核遗传密码的扩展”的WO 2004/094593。也可参见Wang和Schultz“遗传密码的扩展”Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34-66(2005),其内容通过引用全文纳入本文。
来源和宿主生物
本发明的正交翻译组分(O-tRNA和O-RS)可衍生自任何生物(或生物的组合)以用于任何其它种类的宿主翻译系统,条件是所述O-tRNA/O-RS组分和宿主系统以正交方式工作。不要求正交对的O-tRNA和O-RS衍生自相同生物。一些方面,正交组分衍生自古菌基因(即古细菌)以用于真细菌宿主系统。
例如,正交O-tRNA可衍生自古菌生物,例如,古细菌,如詹氏甲烷球菌、热自养甲烷球菌,嗜盐菌如沃氏盐杆菌和盐杆菌NRC-1,闪烁古生球菌,激烈火球菌,超嗜热古菌,Aeuropyrum pernix,海沼甲烷球菌,坎氏甲烷嗜热菌,马氏微球菌(Mm),超耐高温热棒菌,火球菌(Pyrococcus abyssi),硫磺矿硫化叶菌(Ss),硫化叶菌(Sulflobus tokodaii),噬酸热原体,火山热原体等,或者真细菌,如大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermphilus)等,正交的O-RS可衍生自非真核生物(或生物混合物),例如古细菌,如詹氏甲烷球菌、热自养甲烷球菌,嗜盐菌属如沃氏盐杆菌和盐杆菌NRC-1,闪烁古生球菌,激烈火球菌,超嗜热古菌,Aeuropyrum pernix,海沼甲烷球菌,坎氏甲烷嗜热菌,马氏微球菌,超耐高温热棒菌,火球菌(Pyrococcus abyssi),硫磺矿硫化叶菌,硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii),噬酸热原体,火山热原体等,或者真细菌,如大肠杆菌、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。在一个实施方案中,真核生物如植物、藻类、原生生物、真菌、酵母、动物(如哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等也可作为O-tRNA和O-RS的来源。
O-tRNA/O-RS对的各个组分可以衍生自同一生物,也可以衍生自不同生物。在一个实施方案中,O-tRNA/O-RS对衍生自同一生物。或者O-tRNA/O-RS对的O-tRNA和O-RS也可以衍生自不同生物。
可在体内或体外和/或所用的细胞(如真细菌细胞)中选择或筛选O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS对以产生出含非天然氨基酸的多肽。对所用真细菌细胞没有限制,例如可以是大肠埃希氏菌,嗜热栖热菌,嗜热脂肪芽孢杆菌等。含有本发明翻译组分的真细菌细胞组合物也是本发明的一个特征。
也可参见2004年4月16日提交的题为“真核遗传密码的扩展”的国际申请公开号WO 2004/094593,以在一种种类中筛选用于其它种类的O-tRNA和/或O-RS。
一些方面,可在体内或体外和/或所用的细胞(如真核细胞)中选择或筛选O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS对以产生出含有非天然氨基酸的多肽。对所用真核细胞没有限制,例如可使用任何合适的酵母细胞,如酿酒酵母(S.cerevisiae)等。含有本发明翻译组分的真核细胞组合物也是本发明的一个特征。
可选择酿酒酵母作为真核宿主种类,这种生物有许多优点。这种物种是单细胞的,具有快的世代时间,并在遗传上较好表征。参见,例如,D.Burke等,(2000)Methods in Yeast Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY。此外,由于真核生物的翻译机制高度保守(参见,例如,(1996)
Translational Control.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY;Y.Kwok,& J.T.Wong,(1980),《用氨酰-tRNA合成酶作为系统发生探针确定的嗜盐菌和真核生物之间的进化关系》(Evolutionary relationship between Halobacterium cutirubrum andeukaryotes determined by use of amino酰基-tRNA synthetases as phylogenetic probes),Canadian Journal of Biochemistry 58:213-218;和(2001)
The Ribosome.Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),可将掺入有在酿酒酵母中发现的非天然氨基酸的O-RS基因(例如,衍生自野生型大肠杆菌RS序列的O-RS基因)引入高级真核生物(例如哺乳动物细胞)中,并联用相关的tRNA(参见,例如,K.Sakamoto等,(2002)《在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质》(Site-specific incorporation of unnatural amino acid into proteins in mammaliancells),
Nucleic Acids Res.30:4692-4699;和C.Kohrer等,(2001),《将琥珀和赭石抑制基因tRNA引入哺乳动物细胞:将氨基酸类似物位点特异性掺入蛋白质的常规方法》(Import of amber and ochre suppressor tRNA into mammalian cells:a generalapproach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins),
Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.98:14310-14315)来掺入非天然氨基酸。
尽管正交翻译系统(例如,含有O-RS、O-tRNA和非天然氨基酸)可利用培养的宿主细胞产生含有非天然氨基酸的蛋白质,但并不是说本发明的正交翻译系统需要完整的有活力的宿主细胞。例如,正交翻译系统可利用含有细胞提取物的无细胞系统。实际上,使用无细胞的体外转录/翻译系统产生蛋白质是一种良好建立的技术。这些体外系统适用于用这里所述的正交翻译系统组分产生含有非天然氨基酸的蛋白质,这也包括在本发明的范围之内。
选择者密码子
本发明的选择者密码子扩大了蛋白质生物合成机的遗传密码框架。例如,选择者密码子包括独特的三碱基密码子,无义密码子如终止密码子,例如琥珀密码子(UAG)、或乳白密码子,非天然密码子,至少一个四碱基密码子,稀有密码子等。可将一些选择者密码子导入到所需基因内,如一个、两个、三个或三个以上选择者密码子。通过采用不同的选择者密码子,可利用多个正交tRNA/合成酶对通式位点特异性掺入多个非天然氨基酸(例如包括有至少一个非天然氨基酸)。
在一个实施方案中,本发明的方法包括利用终止密码子作为选择者密码子在体内将非天然氨基酸引入到细胞内。例如,产生可识别该终止密码子的O-tRNA,然后被O-RS用非天然氨基酸氨酰化。这种O-tRNA不能被天然产生的宿主氨酰-tRNA合成酶所识别。可利用常规的定点诱变技术将终止密码子引入到编码感兴趣多肽的多核苷酸的感兴趣位点上。参见Sayers,J.R.等,(1988),“5′,3′外切核酸酶在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定点诱变中的引用(5′,3′Exonuclease in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis)”
Nucleic Acids Rcs,791-802。当O-RS、O-tRNA和编码感兴趣多肽的核酸在体内组合时,非天然氨基酸因响应终止密码子而被掺入,产生在该特定位置上含非天然氨基酸的多肽。本发明的一个实施方案中,用作选择者密码子的终止密码子不是琥珀密码子UAG和/或乳白密码子UGA。一实施例中,将UAG和UGA都用作选择者密码子的遗传密码可编码22个氨基酸,同时保留赭石无义密码子UAA,UAA是最丰富的终止信号。
体内掺入非天然氨基酸对宿主细胞不会产生显著影响。例如,在非真核细胞如大肠杆菌内,由于UAG密码子的抑制效率依赖于O-tRNA(如琥珀抑制基因tRNA)和释放因子1(RF1)(RF1可结合UAG密码子,而引起正在延伸的肽链从核糖体上释放下来)之间的竞争,因此可通过提高O-tRNA(如抑制基因tRNA)的表达水平,或利用RF1缺陷株来调节抑制效率。在真核细胞内,由于UAG密码子的抑制效率依赖于O-tRNA(如琥珀抑制基因tRNA)和真核释放因子(如eRF)(eRF可结合终止密码子,引起正在延伸的肽链从核糖体上释放下来)之间的竞争,因此可通过提高O-tRNA(如抑制基因tRNA)的表达水平来调节抑制的效率。另外,也可存在其它化合物,例如还原剂二硫苏糖醇(DTT)。
非天然氨基酸也可以由稀有密码子编码。例如,当体外蛋白合成反应中的精氨酸浓度下降时,稀有的精氨酸密码子AGG被证实可通过丙氨酸酰化的合成tRNA有效地掺入丙氨酸。见Ma等,
Biochemistry,32:7939(1993)。在这种情况下,合成的tRNA可与天然的tRNAArg竞争,后者作为稀有成分存在于大肠杆菌内。另外,某些生物不能利用所有的三联密码子。藤黄微球菌(Micrococcus luteus)内的独立密码子AGA可用于在体外将氨基酸插入到转录/翻译提取物内。见Kowal和Oliver,
Nucl. Acid.Res.,25:4685(1997)。体内利用这些稀有密码子可以产生出本发明的各组分。
选择者密码子还包括扩充的密码子,例如四碱基或多碱基密码子,如四碱基、五碱基、六碱基或多碱基密码子。四碱基密码子的例子包括AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的例子包括AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的方法包括利用基于移码抑制的扩充密码子。四碱基或多碱基密码子可用于将一个或多个非天然氨基酸如非天然氨基酸掺入到同一个蛋白质内。在其它的实施方案中,反密码子环可以解码至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子、至少一个六碱基密码子等。由于有256个可能的四碱基密码子,因此,利用四碱基或多碱基密码子可在同一个细胞内编码多个非天然氨基酸。见Anderson等,(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237-244;以及Magliery,(2001)Expanding the GeneticCode:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli,
J.Mol.Biol.307:755-769。
例如,用体外生物合成方法利用四碱基密码子将非天然氨基酸掺入到蛋白质内。见Ma等,(1993)
Biochemistry,32:7939;和Hohsaka等,(1999)
J.Am.Chem. Soc.,121:34。用CGGG和AGGU与两个用化学方法酰化的移码抑制基因tRNA,体外将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时掺入到链亲和素内。见Hohsaka等,(1999)
J.Am.Chem.Soc.,121:12194。在一个体内研究中,Moore等人检查了tRNALeu衍生物和NCUA反密码子能否抑制UAGN密码子(N可以是U、A、G或C),发现四联密码子UAGA可被含UCUA反密码子的tRNALeu解码,其效率为13~26%,在0或-1框架处几乎不解码。见Moore等,(2000)
J.Mol.Biol.298:195。在一个实施方案中,基于稀有密码子或无义密码子的扩充密码子可用于本发明中,这些密码子可减少在其它不希望的位点发生错义通读和移码抑制。四碱基密码子已在各种正交系统中被用作选择者密码子。参见,例如,WO 2005/019415;WO2005/007870和WO 2005/07624。也可参见Wang和Schultz的“遗传密码的扩展”,Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34-66(2005),其内容通过引用全文纳入本文。尽管下面的例子采用了琥珀选择者密码子,但也可以使用四碱基或多碱基密码子,需要将这里的例子修改为包括四碱基O-tRNA和修饰过的合成酶以包括与之前描述过的各种非天然氨基酸O-RS类似的突变。
在一个给定的系统中,选择者密码子还包括一个天然的三碱基密码子,该内源系统不能利用(或很少利用)这种天然的三碱基密码子。例如,包括缺乏能识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子是稀有密码子的系统。
选择者密码子任选包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩充了现有的遗传字母表。一种额外的碱基对可将三联密码子的数目从64个增加到125个。三碱基对的特性包括稳定的选择性碱基配对、可有效地被聚合酶高度精确地掺入到DNA内、以及在新生非天然碱基对合成后继续有效地引物延伸。适合本发明方法和组合物的非天然碱基对的描述见Hirao等,(2002)An unnatural base pair for incorporatingamino acid analogues into protein,
Nature Biotechnology,20:177-182和Wu,Y.等,(2002)
J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关文献将在下文列出。
非天然核苷在用于体内时可以穿透生物膜,被磷酸化后形成相应的三磷酸盐形式。另外,所增加的遗传信息是稳定的,不含被细胞的酶破坏。Benner及其同事在先前曾尝试利用与经典的Watson-Crick碱基对不同的氢键模式,最值得注意的是iso-C:iso-G对。见Switzer等,(1989)
J.Am.Chem.Soc.,111:8322和Piccirilli等,(1990)
Nature,343:33;Kool,(2000)
Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602。一般来说,这些碱基会与天然碱基发生某种程度的错配,并且不能用酶学方法复制。Kool及其同事的研究证明碱基之间的疏水性包裹相互作用可代替氢键,驱使碱基对的形成。见Kool,(2000)
Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602,Guckian和Kool,(1998)
Angew.Chem. Int.Ed.Engl.,36,2825。为尝试开发出能满足上述所有要求的非天然碱基对,Schultz、Romesberg及其同事系统地合成和研究了一系列的非天然疏水碱基。发现PICS:PICS自身配对比天然碱基对更稳定,可被大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效掺入到DNA内。见McMinn等,(1999)
J.Am.Chem.Soc.,121:11586和Ogawa等,(2000)
J.Am.Chem.Soc.,122:3274。3MN:3MN自身配对可由KF合成,其效力和选择性足以使其行使生物学功能。见Ogawa等,(2000)
J.Am.Chem. Soc.122:8803。但是,这两个碱基的作用是进一步复制的链末端。最近已开发了一种可用于复制PICS自身对的突变型DNA聚合酶。另外,7AI自身对也可被复制。见Tae等,(2001)
J.Am.Chem.Soc.,123:7439。一种新型的金属碱基对Dipic:Py也被开发出来,该碱基对在结合Cu(II)时可形成稳定的碱基对。见Meggers等,(2000)J.Am.Chem.Soc.,122:1071。由于扩充的密码子和非天然密码子本来就是与天然密码子正交的,因此本发明的方法可利用这一特性来产生这些密码子的正交tRNA。
一种翻译旁路系统也可用于将非天然氨基酸掺入到所需多肽内。在翻译旁路系统中,可将一个大序列插入到基因内不能翻译成蛋白质。该序列含有一种可作为提示信号的结构,诱导核糖体跳过该序列恢复掺入序列的下游翻译。
非天然氨基酸
如本文所述,非天然氨基酸指除硒代半胱氨酸和/或吡咯赖氨酸和下列20种遗传密码编码的α氨基酸之外的所有氨基酸、修饰氨基酸或氨基酸类似物:α氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。α氨基酸的通用结构可用结构式I表示:
非天然氨基酸一般都具有结构式I的结构,其中R基团代表20种天然氨基酸中所用基团之外的任何取代基。见L.Stryer编的《生物化学》(
Biochemistry)(第三版,1988,Freeman and Company,New York)以了解20种天然氨基酸的结构。注意,本发明的非天然氨基酸可以是上述20种α氨基酸之外的天然化合物。
一般来说,因为本发明的非天然氨基酸在侧链上与天然氨基酸不同,因此非天然氨基酸可以与其它氨基酸(如天然或天然的)形成酰胺键,形成的方式与天然蛋白中的酰胺键一样。但是,非天然氨基酸含有与天然氨基酸可区别的侧链基团。
这里特别感兴趣的是图1提供的非天然氨基酸。例如,这些非天然氨基酸包括但不限于p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素氨基酸、7-羟基-香豆素氨基酸、硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸和p-硝基-L-苯丙氨酸。这些非天然氨基酸的L和D-对映体都可用于本发明。
除了图1的非天然氨基酸,其它非天然氨基酸可同时掺入感兴趣多肽,例如,与本发明提供的正交对一起使用合适的第二O-RS/O-tRNA对。许多这种额外的非天然氨基酸和合适的正交对是已知的。见这里引用的参考文献。例如,参见Wang和Schultz的“遗传密码的扩展”,Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34-66(2005),其内容通过引用全文纳入本文。
在其它的非天然氨基酸中,式I中的R基团可以是烷基-、芳基-、酰基-、肼、氰基-、卤代-、酰肼、烯基、炔基、醚、硼烷、硼酸基、磷、膦酰基、膦、烯酮、亚胺、酯、羟胺、胺等,或上述基团的组合。感兴趣的其它非天然氨基酸包括但不限于含光活化交联接头的氨基酸、自旋-标记氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、含有新官能团的氨基酸、能与其它分子共价或非共价反应的氨基酸、光囚禁的和/或光促异构的(photoisomerizable)氨基酸、含生物素或生物素类似物的氨基酸、含酮基氨基酸、糖基化氨基酸、侧链连有糖部分的氨基酸、含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学方法可切割或光可切割的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链的氨基酸(如超过约5个、约10个碳原子的聚醚或长链烃)、含碳连接糖的氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸、以及含一个或多个毒性结构部分的氨基酸。
在另一方面,本发明提供了具有下式IV所示通用结构的非天然氨基酸:
具有这种结构的非天然氨基酸通常可为任何结构,其中R1是20种天然氨基酸之一(例如,酪氨酸或苯丙氨酸)中所用的取代基,R2是取代基。因此,这种类型的非天然氨基酸可视为天然氨基酸衍生物。
非天然氨基酸除了可含图1所示的新型侧链以外,还任选可含有经修饰的骨架结构,如结构式II和III所示的结构:
式中,Z一般为OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′;X和Y可以相同或不同,一般包括S或O,R和R′可相同也可不同,一般选自与上述结构式I所示的非天然氨基酸的R基团相同的组成物以及氢。例如,本发明的非天然氨基酸还可以在结构式II和III所示的氨基或羧基上含有取代基。这种类型的非天然氨基酸包括但不限于含有20个常见氨基酸相应的侧链或非天然侧链的α-羟酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸。另外,α碳原子上的取代基还包括L,D或α-α-双取代的氨基酸,如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它的结构形式包括环形氨基酸,如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物,β和γ氨基酸,如取代的β丙氨酸和γ-氨基丁酸。
一些方面,本发明使用L-构型的非天然氨基酸。然而,这并不是说本发明仅限于使用L-构型的非天然氨基酸。应理解,这些非天然氨基酸的D-对映体也可用于本发明。
酪氨酸类似物包括对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸,这些酪氨酸取代基团包括:炔基、乙酰基、苯甲酰基、氨基、肼、羟氨基、巯基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃基、饱和或不饱和烃基、O-甲基、聚醚基、硝基等。另外,也可考虑多处取代的芳环。本发明的谷氨酰胺类似物包括但不限于:α-羟基衍生物、γ-取代衍生物、环状衍生物和酰胺基取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸类似物的例子包括但不限于:对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸,这些取代基包括:炔基、羟基、甲氧基、甲基、丙烯基、醛基、硝基、硫醇基或酮基等。非天然氨基酸的具体例子包括但不限于:p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素氨基酸、7-羟基-香豆素氨基酸、硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸和p-硝基-L-苯丙氨酸。还包括p-炔丙氧基苯丙氨酸、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(DHP)、3,4,6-三羟基-L-苯丙氨酸、3,4,5-三羟基-L-苯丙氨酸、4-硝基-苯丙氨酸、p-乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-丙稀基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、3-硝基-酪氨酸、3-巯基-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc β-丝氨酸、L-多巴、含氟苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、p-叠氮基-L-苯丙氨酸、p-酰基-L-苯丙氨酸、p-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、p-碘代-苯丙氨酸、p-溴代苯丙氨酸、p-氨基-L-苯丙氨酸以及异丙基-L-苯丙氨酸等。各种非天然氨基酸的结构显示在本文的图1中。也可参见题为“真核遗传密码的扩展”的公开的国际申请WO2004/094593。
非天然氨基酸的化学合成
上述许多非天然氨基酸都可以从Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,WI,USA)等公司购买到。那些不能从市场上购买到的非天然氨基酸可任选按照各种发表的或本领域技术人员已知的标准方法合成。有机合成技术可参见Fessendon和Fessendon的《有机化学》(
Organic Chemistry)(1982,第二版,Willard Grant Press,BostonMass.);March的《高级有机化学》(
Advanced Organic Chemistry)(第三版,1985,Wiley and Sons,New York);以及Carey和Sundberg的《高级有机化学》(
Advanced Organic Chemistry)(第三版,A和B部分,1990,Plenum Press,New York)。其它描述非天然氨基酸合成的文献包括:题为“非天然氨基酸的体内掺入”的国际专利申请WO 2002/085923;Matsoukas等,(1995)
J.Med.Chem.,38,4660-4669;King,F.E.和Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides ofGlutamic Acid from Phthylated Intermediates.
J.Chem.Soc.,3315-3319;Friedman,O.M.和Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substratesfor Anti-tumor Agents.
J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752;Craig,J.C.等(1988)AbsoluteConfiguration of the Enantiomers of 7-Chloro-4
[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).
J.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay,M.,Vilmont,M.和Frappier,F.(1991)Glutamine analoguesas Potential Antimalarials,
Eur.J.Med.Chem.26,201-5;Koskinen,A.M.P.和Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.
J.Org.Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.和Rapoport,H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization.
J.Org.Chem.1989:1859-1866;Barton等,(1987)Synthesis of Novelα-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-andD-α-Amino-Adipic Acids,L-α-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.
Tetrahedron Lett.43:4297-4308;以及Subasinghe等,(1992)Quisqualicacid analogues:synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives andtheir activity at a novel quisqualate-sensitized site.
J.Med.Chem.35:4602-7。还可参见2003年12月22日提交的题为“Protein Arrays(蛋白质阵列)”的国际专利申请WO2004/058946。
非天然氨基酸的细胞摄取
一般认为在设计和选择非天然氨基酸,如用于掺入到蛋白质中的非天然氨基酸时要考虑的一个问题是细胞对非天然氨基酸的摄取。例如,α氨基酸带有高密度电荷提示这些化合物不可能透过细胞膜。天然氨基酸是通过蛋白质转运系统的收集而摄入到细胞内,但是这些转运系统一般都有不同程度的氨基酸特异性。可进行一种快速筛选来评价哪种非天然氨基酸可被细胞摄取。见下列文献中的毒性试验:2003年12月22日提交的题为“Protein Arrays(蛋白质阵列)”的国际专利申请WO2004/058946;以及Liu和Schultz(1999)Progress toward the evolution of anorganism with an expanded genetic code.
PNAS 96:4780-4785。虽然用各种试验不难分析摄取情况,但是,设计易于进入细胞摄取通路的非天然氨基酸的另外一种方法是提供生物合成通路来体内产生氨基酸。
非天然氨基酸的生物合成
细胞内已经存在许多生物合成通路可产生氨基酸和其它化合物。虽然某种特定非天然氨基酸的生物合成方法在自然界中如在细胞内可能不存在,但本发明提供了这样的方法。例如,可以通过加入新的酶或者修饰现有的宿主细胞通路来产生非天然氨基酸的生物合成通路。加入的新酶可任选是天然产生的酶,或是人工改造的酶。例如,p-氨基苯丙氨酸(如上述WO 2002/085923实施例中提到的)的生物合成依赖于加入其它生物的已知酶的组合物。可用含有这些酶基因的质粒转化细胞而将这些酶的基因导入到细胞内。这些基因在细胞内表达时即提供了酶催化通路来合成所需要的化合物。可任选加入的这类酶的例子见下面实施例的描述。加入的酶的序列可在Genbank中找到。也可任选以同样方式将人工修饰的酶加入到细胞内。以这种方式操纵细胞合成机制和物质来产生非天然氨基酸。
许多方法确实都可用于在体外或体内产生生物合成通路所用的新型酶、改造现有的通路来产生非天然氨基酸。许多产生酶和生物合成通路其它组分的方法都可用于本发明来产生非天然氨基酸(或者产生具有新的底物特异性或其它感兴趣活性的合成酶)。例如,可任选利用DNA改组来产生新的酶和/或这种酶的通路以在体外或体内产生非天然氨基酸(或产生新的合成酶)。见Stemmer(1994),Rapid evolution of aprotein in vitro by DNA shuffling,
Nature 370(4):389-391;以及Stemmer,(1994),DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination formolecular evolution,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。一种有关改组相关基因(如同源基因)家族的方法可快速产生具有所需特性的酶。这种“家族基因改组”方法的一个例子见Crameri等(1998)DNA shuffling of a family of genes fromdiverse species accelerates directed evolution
Nature,391(6664):288-291中的描述。新型酶(不论生物合成通路的组分或合成酶)也可以通过DNA重组方法产生,这种方法称为“产生杂交酶的渐进式截短技术”(ITCHY),如Ostermeier等,(1999)″Acombinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology″
Nature Biotech 17:1205中所述。这种方法也可用于产生酶或其它通路变体库,这些酶或通路变体可作为一种或多种体外或体内重组方法的底物。见Ostermeier等(1999)″Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation,″Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:3562-67,和Ostermeier等(1999),″IncrementalTruncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts,″
Biological and Medicinal Chemistry,7:2139-44。另外一种方法采用指数整体诱变来产生酶或其它通路变体库,例如选出库中能够催化生物合成反应产生非天然氨基酸(或新的合成酶)的酶和通路变体。在这种方法中,感兴趣序列中的小组残基随机地用于平行鉴定位置发生改变从而导致产生功能性蛋白质的各个氨基酸。适合用于本发明产生新的酶来产生非天然氨基酸(或新的合成酶)的这种方法的例子见于Delegrave和Youvan(1993)
Biotechnology Research 11:1548-1552的描述。在另一种方法中,利用掺入的(doped)或退化的寡核苷酸进行随机或半随机诱变来改造酶和/或通路组分,例如采用Arkin和Youvan(1992)″Optimizing nucleotide mixtures to encode specificsubsets of amino acids for semi-random mutagenesis″
Biotechnology 10:297-300或Reidhaar-Olson等,(1991)″Random mutagenesis of protein sequences usingoligonucleotide cassettes″
Methods Enzymol.208:564-86所述的通用诱变方法。通常称为“非随机”诱变的另一种利用多核苷酸重新组装和位点饱和诱变方法可用来产生酶和/或通路组分,然后筛选能够自行一种或多种合成酶或生物合成通路的能(如在体内产生非天然氨基酸)的那些酶或组分。见Short的题为“基因疫苗和酶的非随机产生”的专利申请WO 00/46344。
这种突变方法的一种取代方法包括重组生物的整个基因组并选择产生的具有特定通路功能的子代(通常称为“全基因组改组”)。这种方法也可用于本发明,如通过基因组重组和选择能够产生出非天然氨基酸(或其中间体)的生物(如大肠杆菌或其它细胞)。例如,下列文献中所述的方法可用来设计通路以修饰细胞内现有的和/或新的通路,在体内产生非天然氨基酸:Patnaik等(2002)″Genome shuffling oflactobacillus for improved acid tolerance″
Nature Biotechnology,20(7):707-712;以及Zhang等(2002)″Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria″Nature,02-7,415(6872):644-646。
现在已有一些其它技术可用来改造生物和代谢通路来产生所需化合物,这些方法也可用于产生非天然氨基酸。描述这种通路改造方法的文献包括:Nakamura和White(2003)″Metabolic engineering for the microbial production of 1,3 propanediol″Curr.Opin.Biotechnol.14(5):454-9;Berry等(2002)″Application of MetabolicEngineering to improve both the production and use of Biotech Indigo″
J.Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127-133;Banta等(2002)″Optimizing an artificialmetabolic pathway:Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium2,5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis″
Biochemistry,41(20),6226-36;Selivonova等,(2001)″Rapid Evolution of Novel Traits inMicroorganisms″
Applied and Environmental Microbiology,67:3645等等。
一般来说,无论用什么方法,用本发明的经改造的生物合成通路所产生出的非天然氨基酸的浓度足以有效的生物合成蛋白质,例如可达到细胞内的天然含量,但对细胞的其它氨基酸的浓度不会产生显著影响,或不会耗竭细胞内资源。以这种方式体内产生的浓度一般约为10mM到0.05mM。一旦细胞经过改造产生了特异性通路和产生非天然氨基酸所需的酶后,任选用于体内选择以进一步优化用于核糖体蛋白合成和细胞生长的非天然氨基酸的产量。
用于掺入非天然氨基酸的正交组分
本发明提供了在体内响应选择者密码子,如琥珀终止密码子、无义密码子、四碱基或多碱基密码子等产生能将非天然氨基酸(例如图1中提供的非天然氨基酸)掺入到正在延伸的多肽链中的正交组分的方法和组合物。例如,本发明提供了正交-tRNA(O-tRNA)、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)及两者组成的对。这些正交对可用于将非天然氨基酸掺入到正在延伸的多肽链中。
本发明的组合物包含正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS),所述O-RS能利用以下氨基酸优先氨酰化O-tRNA:p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素丙氨酸、7-羟基-香豆素丙氨酸、o-硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸或p-硝基-L-苯丙氨酸。在某些实施方案中,O-RS包含含有SEQ ID NO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57和59-63及其保守变体中的任何一种的氨基酸序列。在本发明的某些实施方案中,O-RS用特定的非天然氨基酸优先氨酰化任何内源性tRNA中的O-tRNA,其中的O-RS对O-tRNA有偏向(bias),且其中加载有非天然氨基酸的O-tRNA与加载有相同非天然氨基酸的内源性tRNA的比例大于1∶1,更优选地,其中的O-RS排他性地或者几乎排他性地加载O-tRNA。
含有O-RS的组合物还可以任选含有正交tRNA(O-tRNA),该O-tRNA可识别选择者密码子。一般来说,与包含或编码于本文序列表(例如,SEQ ID NO:1)和实施例所列的多核苷酸序列的O-tRNA相比,在相关合成酶存在的条件下,本发明的O-tRNA为了响应选择者密码子而产生的抑制效率至少可达45%、50%、60%、75%、80%、90%或更高。在一个实施方案中,O-RS联合O-tRNA所产生的抑制效率至少比缺少O-RS的O-tRNA所产生的抑制效率高5倍、10倍、15倍、20倍、25倍或更高。一方面,O-RS联合O-tRNA所产生的抑制效率至少是詹氏甲烷球菌来源的正交酪氨酰-tRNA合成酶对或者衍生自大肠杆菌的正交亮氨酰-tRNA合成酶对所产生的抑制效率的45%。
包含O-tRNA的组合物还可以包含细胞(例如真细菌细胞如大肠杆菌细胞等,或真核细胞如酵母细胞)和/或翻译系统。
本发明也提供包含翻译系统的细胞(如真细菌细胞或酵母细胞),所述翻译系统包含正交-tRNA(O-tRNA);正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)和非天然氨基酸,例如图1所示的氨基酸。一般来说,O-RS能用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA超过内源性tRNA,该O-RS对O-tRNA有偏向,故其中加载有非天然氨基酸的O-tRNA与加载有相同非天然氨基酸的内源性tRNA的比例大于1∶1,更优选该O-RS排他性地或者几乎排他性地加载O-tRNA。O-tRNA可识别第一选择者密码子,O-RS能用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA。在一个实施方案中,O-tRNA含有SEQ ID NO:1,SEQID NO:2所示的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列,或者由这些序列编码。在一个实施方案中,该O-RS含有SEQ ID NO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57、59-63中任何一个或其保守变体所示的氨基酸序列。
本发明的细胞还可以包含其它不同的O-tRNA/O-RS对和第二种非天然氨基酸,例如,此O-tRNA可识别第二选择者密码子,此O-RS能用第二种非天然氨基酸优先氨酰化相应的O-tRNA。所述第二种氨基酸不同于第一非天然氨基酸。本发明的细胞可任选以包含含有感兴趣多肽编码多核苷酸的核酸,所述多核苷酸含有能被O-tRNA识别的选择者密码子。
在某些实施方案中,本发明的细胞是真细菌细胞(如大肠杆菌)或酵母细胞,细胞内含有正交-tRNA(O-tRNA)、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和含有感兴趣多肽编码多核苷酸的核酸,其中的多核苷酸含有能被O-tRNA识别的选择者密码子。在本发明的某些实施方案中,O-RS用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA,其效率大于O-RS氨酰化任何内源性tRNA的效率。
在本发明的某些实施方案中,本发明的O-tRNA含有本文序列表(例如,SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2)中和实施例中所示的多核苷酸序列或其互补的多核苷酸序列,或者被这些序列编码。在本发明的某些实施方案中,O-RS含有序列表中所示的氨基酸序列或其保守变体。在一个实施方案中,O-RS或其片段被编码本文序列表中和实施例中所示的氨基酸序列的多核苷酸序列或其互补的多核苷酸序列编码。
本发明的O-tRNA和/或O-RS可衍生自各种生物(如真核和/或非真核生物)。
多核苷酸也是本发明的特征。本发明的多核苷酸包括人工的(如人造的和非天然产生的)多核苷酸,其中含有编码本文序列表所示多肽的核苷酸序列,和/或与该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸还包括在高度严谨条件下能与上述多核苷酸在核酸全长上杂交的核酸。本发明的多核苷酸还包括与天然tRNA或其相应编码核酸的序列具有至少75%、80%、90%、95%、98%或更高相同性的多核苷酸(但是本发明的多核苷酸不是天然tRNA或其相应的编码核酸),所述tRNA可识别选择者密码子,如四碱基密码子。与上述任何多核苷酸序列至少有80%、90%、95%、98%或更高相同性的人工多核苷酸序列,和/或含上述序列保守变体的多核苷酸也包括在本发明的多核苷酸范围内。
含本发明的多核苷酸的载体也是本发明的特征。例如,本发明的载体可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒、表达载体等。含本发明的载体的细胞也是本发明的特征。
O-tRNA/O-RS对组分的产生方法也是本发明的特征。用这些方法产生的组分也是本发明的特征。例如,至少产生一种对细胞为正交的tRNA(O-tRNA)的方法包括制备突变体tRNA库;突变tRNA突变库每个成员的反密码子环使其能识别选择者密码子,从而提供潜在的O-tRNA库,用于阴性选择第一物种的第一细胞群,所述细胞含有O-tRNA库的成员。阴性选择可去除含潜在O-tRNA库成员的细胞,该潜在O-tRNA可被细胞内源性氨酰-tRNA合成酶(RS)氨酰化。由此提供了对第一物种的细胞为正交的tRNA库,从而至少提供一种O-tRNA。也提供用本发明方法产生的O-tRNA。
在某些实施方案中,本发明的方法还包括阳性选择第一物种的第二细胞群,其中的细胞含有与第一物种的细胞正交的tRNA库的成员、同源的氨酰-tRNA合成酶和阳性选择标记。通过阳性选择筛选出的那些细胞含有能被同源氨酰-tRNA合成酶氨酰化的tRNA库的成员,在阳性选择标记存在的情况下可出现预期的反应,从而可以获得O-tRNA。在某些实施方案中,第二细胞群含有没有被阴性选择去除的细胞。
本发明还提供了能用非天然氨基酸加载O-tRNA的正交-氨酰-tRNA合成酶的鉴定方法。例如,该方法包括筛选第一物种的细胞群,其中的细胞都含有1)一组氨酰-tRNA合成酶(RS)的成员(如一组RS可包括突变的RS、第一物种之外的物种来源的RS、或者二者都包括);2)正交-tRNA(O-tRNA)(如衍生自一个或多个物种);以及3)编码阳性选择标记并且至少包含一个选择者密码子的多核苷酸。
选择或筛选细胞(如宿主细胞)中与不含多种RS成员或所含成员数较少的细胞相比抑制效率提高的那些细胞。这些通过筛选得到的细胞含有能氨酰化O-tRNA的活性RS。用这种方法鉴定到的正交氨酰-tRNA合成酶也是本发明的特征。
在细胞(例如真细菌细胞如大肠杆菌细胞等,或在酵母细胞)内产生所选位置含有非天然氨基酸的蛋白质的方法也是本发明的特征。例如,一种方法是在适当的培养基内培养细胞,其中的细胞含有核酸,该核酸至少含有一个选择者密码子,编码一种蛋白,加入非天然氨基酸,在至少含有一个选择者密码子的核酸的翻译过程中非天然氨基酸掺入到蛋白质的特定位置上,从而产生该蛋白质。细胞还含有:在细胞内具有功能并且能识别选择者密码子的正交-tRNA(O-tRNA);以及用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)。用这种方法产生的蛋白质也是本发明的特征。
本发明还提供了含有蛋白质的组合物,其中所述蛋白质包含,例如,p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素氨基酸、7-羟基-香豆素氨基酸、硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸或p-硝基-L-苯丙氨酸。在某些实施方案中,蛋白质的氨基酸序列与已知蛋白如治疗蛋白、诊断蛋白、工业用酶的氨基酸序列或其部分至少75%相同性。另外,组合物还可以包含药学上可接受的载体。
核酶和多肽序列及其变体
如上文和下文所述,本发明提供了编码例如O-tRNA和O-RS及多肽氨基酸序列的多核苷酸序列,例如O-RS,以及包含所述多核苷酸或多肽序列的组合物、系统和方法。所述序列的例子,如O-tRNA和O-RS的氨基酸和核苷酸序列也在本文中列出(见表5,例如SEQ ID NO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57和59-63)。但是,本领域的技术人员应该了解本发明并不仅仅局限于这些序列,如实施例和列表中的序列。本领域的技术人员应当了解本发明还包括具有本文所述的功能,如编码本文所述O-RS的保守变体的多核苷酸和多肽的相关序列。
实施例1-16描述了能用非天然氨基酸(例如图1提供的非天然氨基酸)氨酰化O-tRNA的正交合成酶种类(O-RS)的构建和分析。这些实施例描述了能掺入以下非天然氨基酸的O-RS种类的构建和分析:p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素丙氨酸、7-羟基-香豆素丙氨酸、o-硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸;p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸;3-硝基-L-酪氨酸和p-硝基-L-苯丙氨酸。
本发明提供了多肽(O-RS)和多核苷酸,如O-tRNA、编码O-RS或其片段的多核苷酸,用于分离氨酰-tRNA合成酶克隆的寡核苷酸等。本发明的多核苷酸包括那些编码本发明的感兴趣蛋白或多肽的含有一个或多个选择者密码子的多核苷酸。另外,本发明的多核苷酸还包括含有SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56和58中所列核苷酸序列的多核苷酸;与它们互补的多核苷酸或者编码这些多核苷酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸还包括编码含有SEQ ID NO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57和59-63的O-RS氨基酸序列的多核苷酸。类似地,在高严谨条件下,可与上述多核苷酸在基本上全长核酸序列上杂交的人工核酸也包括在本发明的多核苷酸范围内。在一个实施方案中,组合物包含本发明的多肽和赋形剂(如缓冲液、水、药学上可接受的赋形剂等)。本发明还提供了可与本发明的多肽发生特异性免疫反应的抗体或抗血清。人工多核苷酸是人产生的,不是天然产生的多核苷酸。
本发明的多核苷酸还包括人工的多核苷酸,这种多核苷酸与天然tRNA(但是天然tRNA除外)至少有75%、80%、90%、95%、98%或更高的相同性。多核苷酸还包括与天然tRNA的多核苷酸至少有75%、80%、90%、95%、98%或更高相同性(但不是100%相同)的人工多核苷酸。
在某些实施方案中,载体(如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等)含有本发明的多核苷酸。在一个实施方案中,所述载体是表达载体。在另一个实施方案中,所述表达载体包含与本发明的一种或多种多核苷酸操作性相连的启动子。在另一个实施方案中,细胞包含携带本发明的多核苷酸的载体。
本领域的技术人员将明白本发明还包括所公开序列的多种变体。例如,产生功能相同序列的公开序列的保守变体也包括在本发明的范围内。认为核酸多核苷酸序列的一种公开序列杂交的变体也包括在本发明的范围内。本文公开序列的独特亚序列,例如可通过标准序列比较技术测定的独特亚序列,也包括在本发明的范围内。
保守变体
由于遗传密码的简并性,“沉默取代”(即核酸序列中不会导致编码多肽改变的取代)是编码氨基酸的每个核酸序列所具有的特性。类似地,氨基酸序列中的一个或有限数目的氨基酸发生“保守氨基酸取代”指用具有高度相似性能的不同氨基酸取代,也不难鉴定是否与公开的构建物高度相似。每一个公开序列的这种保守变体也是本发明的特征。
特定核酸序列的“保守变体”指那些编码相同或基本上相同氨基酸序列的核酸,或者指虽然不编码氨基酸序列、但序列基本上相同的核酸。本领域技术人员将认识到改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸(一般少于5%,更常见少于4%、2%或1%)是“保守修饰的变体”,所述改变可导致缺失氨基酸、加入氨基酸或以化学上相似的氨基酸取代原来的氨基酸。因此,本发明所列多肽序列的“保守变体”包括用具有相同保守取代基用的氨基酸取代小部分氨基酸,一般低于该多肽序列氨基酸总数的5%,更常见低于2%或1%。最后,加入序列不会改变核酸分子的编码活性,例如加入无功能的序列成为该基础氨基酸的保守变体。
可提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的,其中一个氨基酸残基被另一个具有相似化学特性(芳香族侧链或带正电荷的侧链)的氨基酸取代,因此不会在实质上改变多肽分子的功能。下面列出了几组具有相似化学特性的天然氨基酸,其中组内的取代都是“保守取代”。
表1
保守性氨基酸取代
非极性和/或脂肪族侧链 |
极性不带电荷侧链 | 芳香族侧链 |
带正电荷侧链 |
带负电荷侧链 |
甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸脯氨酸 |
丝氨酸苏氨酸半胱氨酸甲硫氨酸天冬酰胺谷氨酰胺 | 苯丙氨酸酪氨酸色氨酸 | 赖氨酸精氨酸组氨酸 | 天冬氨酸谷氨酸 |
核酸杂交
可用对比杂交鉴定本发明的核酸,包括本发明核酸的保守变体,这种对比杂交方法是一种区分本发明核酸的优选方法。另外,能在高、超高、超超高严谨条件下与SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56和58所代表的那些核酸杂交的靶核酸也是本发明的特征。这类核酸的典型例子包括那些与一个给定核酸序列相比发生一个或几个静默核酸取代或保守核酸取代的核酸。
当某测试核酸与某探针核酸杂交达到完全匹配靶核酸与探针的至少50%,即信噪比至少是探针与靶核酸杂交的一半,杂交条件为完全匹配的探针与完全匹配的互补靶核酸结合所产生的信噪比至少等于与不匹配靶核酸杂交所产生的信噪比的约5倍到10倍时,即说该测试核酸与该探针核酸特异性杂交。
当核酸相遇时发生杂交,一般是在溶液中。核酸杂交是由于各种特性已知的物理-化学作用力,如氢键、溶剂排斥、碱基堆积等所致。有关核酸杂交的全面指南见Tijssen(1993)的《生物化学和分子生物学实验技术-与核酸探针杂交》(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes)中第I部分第2章,“杂交原理和核酸探针试验概述(Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)”,(Elsevier,New York),以及《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology),Ausubel等编,《新编实验指南》(Current Protocols),Greene Publishing Associates,Inc.和JohnWiley & Sons,Inc.合作出版,(2004年增刊)(“Ausubel”);Hames和Higgins(1995)编的Gene Probes 1(基因探针1),牛津大学出版社IRL出版社,英国牛津(Hames和Higgins 1)以及Hames和Higgins(1995)编的
Gene Probes 2(基因探针2),牛津大学出版社IRL出版社,英国牛津(Hames和Higgins 2)详细描述了DNA和RNA,其中包括寡核苷酸的合成、标记、检测和定量方法。
在DNA印迹或RNA印迹中,含有100个以上互补残基的互补核酸在膜上杂交的严谨杂交条件的一个例子是50%甲醛、1mg肝素、42℃杂交过夜。严谨洗涤条件的一个例子是65℃用0.2×SSC洗涤15分钟(见上述Sambrook对SSC缓冲液的描述)。常先用低严谨洗涤再用高严谨洗涤去除背景探针信号。低严谨洗涤的一个例子是40℃用2×SSC洗涤15分钟。在特定杂交试验中检测到的信噪比高于无关探针所观察到的5倍(或更高),表明检测到特异性杂交。
“严谨的杂交洗涤条件”就核酸杂交试验如DNA印迹和RNA印迹而言是序列依赖性的,在不同的环境参数下该条件不同。有关核酸杂交的全面指南见上述的Tijssen(1993)和Hames和Higgins,1和2。任何测试核酸所用的严谨杂交和洗涤条件不难根据经验确定。例如,在确定严谨杂交和洗涤条件时,可以逐渐提高杂交和洗涤条件的严谨程度(如,在杂交或洗涤过程中通过升高温度、降低盐浓度、增加洗涤剂的浓度和/或增加有机溶剂如甲醛的浓度),直到满足了所选择的一组标准。例如,在高严谨杂交和洗涤条件下,逐渐增加杂交和洗涤条件直到探针与互补靶核酸完全匹配,所产生的信噪比至少是探针与不匹配靶核酸杂交所产生的信噪比的5倍。
对于一个特定探针来说,“十分严谨的”条件等于其热解链点(Tm)。Tm是指50%的被检测核酸与完全匹配的探针杂交时的温度。一般来说,在一定的离子强度和pH条件下,本发明所选择的“高严谨”杂交和洗涤条件比一个特定序列的Tm约低5℃。
“超高严谨程度”的杂交和洗涤条件是指杂交和洗涤条件的严谨程度逐渐升高,直到探针与完全匹配的互补靶核酸结合所产生的信噪比至少达到探针与不匹配核酸杂交所观察到的10倍。靶核酸在这种条件下与探针杂交,如果所产生的信噪比至少是完全匹配的互补靶核酸所产生的信噪比的1/2,那么就可以说靶核酸可以在超高严谨条件下与探针结合。
类似地,可通过逐渐提高有关杂交试验的杂交和/或洗涤条件来确定更高严谨水平。例如,提高杂交和洗涤条件的严谨性,直到探针与完全匹配的互补靶核酸结合所产生的信噪比至少高于探针与不匹配钯核酸杂交所观察到的10倍、20倍、50倍、100倍、500倍或更高。靶核酸在这种条件下与探针杂交,如果所产生的信噪比至少是完全匹配的互补靶核酸所产生的信噪比的1/2,那么就可以说靶核酸可以在超超高严谨条件下与探针结合。
如果核酸编码的多肽基本相同,即使在严谨条件下核酸不能彼此杂交,这两个核酸也基本相同。这种情况发生在利用遗传密码所允许的最大简并性产生核酸拷贝时。
独特的亚序列
一方面,本发明提供了含独特亚序列的核酸,这些亚序列位于选自本文所述的O-tRNA和O-RS序列的核酸内。与任何已知的O-tRNA或O-RS核酸序列相应的核酸相比,独特亚序列都是独特的。可利用BLAST进行核酸的排列,使用默认参数。任何独特亚序列都可作为探针用于鉴定本发明的核酸。
同样,本发明还包括含独特亚序列的多肽,这些独特亚序列位于选自本文所述的O-RS序列的多肽内。在这里,与任何已知的多肽序列相应的多肽相比,独特亚序列都是独特的。
本发明还提供了能在严谨条件下与独特编码寡核苷酸杂交的靶核酸,该寡核苷酸编码选自O-RS序列的多肽内的独特亚序列,其中的独特亚序列与任何对照多肽(如本发明的合成酶来源的亲本序列,如通过突变获得)相应的多肽相比都是独特的。独特序列可通过上述方法确定。
序列比较、相同性和同源性
术语“相同的”或“相同性百分比”用于两个或多个核酸或多肽序列的比较时是指两个或多个序列或亚序列排列对比并比较其最大相似性时,这两个或多个序列或亚序列是相同的,或者有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的,这种比较可利用下面所述的一种序列比较算法(或本领域技术人员所熟知的其它算法)或通过肉眼观察来完成。
术语“基本相同的”用于两个或多个核酸或多肽(如编码O-tRNA或O-RS的DNA,O-RS的氨基酸序列)的比较时是指两个或多个序列或亚序列排列对比并比较其最大相似性时,这两个或多个序列或亚序列至少有约60%、80%、90-95%、98%、99%或更多的核苷酸或氨基酸残基是相同的,这种比较可利用序列比较算法或通过肉眼观察来完成。不必参考其真实的祖先,一般认为这种“基本相同的”序列是“同源的”。“基本上相同”指在序列的一个区域内的比较,这个区域长度宜至少约为50个残基,更优选至少约100个残基,最优选二序列至少约含150个残基基本上相同,或者在两个序列的全长上进行比较。
当蛋白和/或蛋白序列衍生自共同的亲代蛋白或蛋白序列时,不论是天然的还是人造的,这些蛋白和/或蛋白序列是“同源的”。同样,当核酸和/或核酸序列衍生自共同的亲代核酸或核酸序列时,不论是天然的还人造的,这些核酸和/或核酸序列是“同源的”。例如,任何天然核酸都可用现有的诱变方法修饰使其包含一个或多个选择者密码子。当该诱变的核酸表达时,其编码的多肽含有一个或多个非天然氨基酸。当然,该突变过程可能改变一个或多个标准密码子,从而使产生的突变蛋白中也有一个或多个标准氨基酸的改变。同源性一般是根据两个或多个核酸或蛋白质(或其序列)的序列相同性推算出来的。用于确定序列之间同源性的相似性精确百分比随所比较的蛋白质和核酸而不同,但常规上至少有25%的序列相似才能确定同源性。更高水平的序列相同性,如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高,也可用于确定同源性。确定序列相同性百分比的方法(如BLASTP和BLASTN,使用默认参数)见本文的描述,这些方法都是现有的。
为了进行序列比较并确定其同源性,一般需要把一个序列看作参考序列,被检测序列与之比较。在使用序列比较算法时,将被测序列与参考序列输入到计算机内,如果需要,设定亚序列匹配值和序列算法程序的参数。序列比较算法就可以根据设定的程序参数计算出被测序列相对于参考序列的序列相同性百分比。
进行序列比较的理想序列排列对比方法可用下列算法完成:局部同源性算法,Smith & Waterman,
Adv.Appl.Math.2:482(1981);同源性排列对比算法,Needleman & Wunsch,
J.Mol.Biol.48:443(1970);相似性检索方法,Pearson &Lipman,
Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988),以及这些算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package内的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI),或者通过肉眼检查(见Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编,
Current Protocols,由GreenePublishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.合资出版,2004年增刊)。
适于确定序列相同性和序列相似性百分比的算法的一个例子是BLAST算法,该算法的描述见Altschul等,
J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。执行BLAST分析的软件公众可通过国家生物技术信息中心的网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载。这种算法包括先通过鉴定查询序列中长度为W的短字符来确定高评分序列对(HSP),所述短字符在与序列数据库中相同长度的字符排列对比时可匹配或满足某些正阈值评分T。T称为相邻字符评分阈值(Altschul等,同上)。这些初始的相邻字符采样数(hits)作为种子启动检索来寻找含有这些字符的HSP。然后字符采样数在每一序列的两个方向上扩展,直到累积排列对比评分升高。用参数M(匹配残基对的奖赏分数;总是大于0)和N(错配残基的惩罚分数;总是小于0)来计算核苷酸序列的累积评分。对于氨基酸来说,可利用计分矩阵来计算累积评分。字符采样数在每个方向上的延伸停止于下列时刻:累积排列对比评分从其曾达到的最大数值开始回落时;由于累积了一个或多个负评分残基排列对比使累积评分达到0或0以下时;或者达到序列的末端时。BLAST算法的参数W、T和X决定了算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)的默认参数为:字长(W)=11,期望值(E)=10,终止值=100,M=5,N=-4,两条链进行比较。对于氨基酸序列来说,BLASTP程序的默认参数为:字长(W)=3,期望值(E)=10,使用BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。
除了能够计算序列相同性百分比以外,BLAST算法还可以进行两个序列之间相似性的统计分析(见Karlin和Altschul,
Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一个相似性数据是最小总概率(P(N)),这一数据说明了两个核苷酸或氨基酸序列之间相匹配的可能性。例如,如果将被测核酸与参考核酸比较后得到的最小总概率约在0.1以下、优选约0.01以下、最优选的是约0.001以下,则这个核酸被认为与参考序列是相似的。
诱变和其它分子生物学技术
本发明的和用于本发明的多核苷酸和多肽可以用分子生物学技术进行操纵。描述分子生物学技术的综合性教科书包括:Berger和Kimmel的《分子克隆技术指南》(Guide to Molecular Cloning Techniques)第152卷“酶学方法”,Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger);Sambrook等人的《分子克隆实验手册》(MolecularCloning-A Laboratory Manual)(第三版)1-3卷,冷泉港实验室,纽约冷泉港,2001(″Sambrook″)和《现代分子生物学操作指南》(Current Protocols in Molecularbiology),F.M.Ausubel等人编,《现代操作指南》(Current Protocols),GreenePublishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.,共同投资出版,(2003年增补)(″Ausubel″)。这些教科书描述了诱变、载体的使用、启动子以及许多其它相关主题,如与基因产生有关的主题,包括可用于制备含有非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶和它们组成的正交对的选择者密码子。
本发明可利用各种类型的诱变来突变tRNA分子、产生tRNA库、产生合成酶库、将编码非天然氨基酸的选择者密码子掺入感兴趣蛋白或多肽中。这些技术包括但不限于定点诱变、随机位点诱变、同源重组、DNA重组或其它的递推诱变方法、嵌合体构建、利用含尿嘧啶的模板进行诱变、寡核苷酸定点突变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、利用缺口双链体DNA进行诱变等。其它合适的方法包括点错配修复、利用修复缺陷宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、全基因合成诱变、双链断裂修复等。涉及嵌合体构建的诱变也包括在本发明范围内。在一个实施方案中,可利用已知的有关天然分子或者改变的或突变的天然分子的信息,如序列、序列比较、物理特性、晶体结构等指导诱变。
宿主细胞可用本发明的多核苷酸或包含本发明多核苷酸的构建物(如本发明的载体)进行遗传工程改造(如转化、转导或转染),所述载体可以是克隆载体,也可以是表达载体。例如,可将正交tRNA、正交tRNA合成酶及其衍生蛋白质的编码区操作性连接于在所需宿主细胞内具有功能的基因表达调节元件。典型的载体包含转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列和用于调节特定靶核酸表达的启动子。载体任选包含基因表达盒,该盒中至少含有一个独立的终止子序列,允许表达盒在真核或原核宿主、或者二者内(如穿梭载体)复制的序列以及用于原核和真核系统的选择标记。载体应适合在原核或真核细胞内,优选在二者内表达和/或整合。见Giliman和Smith,
Gene 8:81(1979);Roberts等,
Nature,328:731(1987);Schneider,B.等,Protein Expr.Purif.6435:10(1995);Ausubel,Sambrook,Berger(这三篇文献同上)。载体可以是质粒、细菌、病毒、裸多核苷酸或偶联多核苷酸形式。可用以下标准方法将载体导入到细胞和/或微生物内,包括电穿孔(From等,
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82,5824(1985));病毒载体感染;用小珠或微粒基质中或表面上含核酸的小颗粒高速轰击穿透(Klein等,
Nature 327,70-73(1987))等。
开发了能在大肠杆菌中响应琥珀终止密码子(UAG)将非天然氨基酸位点特异性插入蛋白质的高度有效且通用的单质粒系统。在这种新的系统中,詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)抑制基因tRNAtyr(CUA)和酪氨酰-tRNA合成酶对由可与大多数大肠杆菌表达载体兼容的单个质粒编码。构建在proK启动子和终止子控制下的单顺反子tRNA操纵子以使二级结构和tRNA加工最佳。引入合成酶glnS启动子的突变形式导致抑制效率和保真度显著提高。通过tRNA基因的多拷贝以及通过该合成酶上的特定突变(D286R)也可提高抑制效率(Kobayashi等,“Structural basis for orthogonaltRNA specificities of tyrosyl-tRNA synthetases for genetic code expansion”,Nat.Struct.Biol.,10(6):425-432[2003])。高效且精确地掺入几种不同的非天然氨基酸也证实了最佳系统的通用性,所述非天然氨基酸在研究蛋白质功能和结构中的特有用途之前已被证实。
ATCC提供了可用于克隆的细菌和噬菌体的目录,如ATCC出版的《细菌和噬菌体的ATCC目录》(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1996),Gherna等(编)。用于测序、克隆和分子生物学其它方面的其它基础方法及其理论阐述见于Sambrook(同上)、Ausubel(同上)和Watson等(1992)科学美国人丛书第二版重组DNA(Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books),NY。另外,几乎所有核酸(以及几乎所有的标记核酸,无论是标准的还是非标准的)都可以从各个公司里购买或订购,如Midland Certified Reagent Company(Midland,TX mcrc.com)、The Great American Gene Company(Ramona,CA,网址是www.genco.com)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL,网址是www.expressgen.com)、Operon TechnologiesInc.(Alameda,CA)等。
经遗传改造的宿主细胞可用经过适当改变以便于进行下列操作的常规营养培养基进行培养:筛选、活化启动子或筛选转化子。这些细胞还可以培养成转基因生物。有关细胞分离和培养(如用于亚序列核酸分离)的其它有用文献包括Freshney(1994)《动物细胞培养-基本操作技术》(Culture of Animal Cells,a Manual ofBasic Technique),第三版,Wiley-Liss,New York及其引用的参考文献;Payne等(1992)《在液体系统中进行植物细胞培养和组织培养》(Plant Cell and Tissue Culture inLiquid Systems),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY;Gamborg和Phillips(编)(1995)《植物细胞、组织和器官培养》(Plant Cell,Tissue and OrganCulture),Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(BerlinHeidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)《微生物学培养基手册》(The Handbook ofMicrobiological Media)(1993),CRC Press,Boca Raton,FL。
感兴趣的蛋白和多肽
在细胞内产生特定位置上为非天然氨基酸的蛋白质的方法也是本发明的特征。例如,一种方法是在适宜的培养基内培养细胞,其中的细胞含有至少包含一个选择者密码子并能编码一个蛋白质的核酸;提供非天然氨基酸;其中的细胞还包含:在细胞内具有功能并能识别选择者密码子的正交-tRNA(O-tRNA)和用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)。用这种方法产生的蛋白也是本法发明的特征。
在某些实施方案中,相比任何内源性tRNA,O-RS在表达系统内倾向于氨酰化同源O-tRNA。当O-tRNA和O-RS以等摩尔浓度存在时,被O-RS加载的O-tRNA和内源性tRNA的相对比例大于1∶1,优选至少约2∶1,更优选5∶1,再优选10∶1,再优选20∶1,再优选50∶1,再优选75∶1,再优选95∶1、98∶1、99∶1、100∶1、500∶1、1,000∶1、5,000∶1或更高。
本发明还提供了含有蛋白质的组合物,其中所述蛋白质含有非天然氨基酸。在某些实施方案中,蛋白所包含的氨基酸序列与治疗蛋白、诊断蛋白、工业用酶或其片段的序列至少有75%的相同性。
本发明的组合物和利用本发明的方法产生出的组合物也可以存在于细胞内。因此本发明的O-tRNA/O-RS对或其单个组分可被用于宿主系统的翻译机制中,从而将非天然氨基酸掺入到蛋白质内。国际专利申请WO 2004/094593(申请日为2004年4月16日,名称为“真核遗传密码的扩展”)和WO 2002/085923(题为“非天然氨基酸的体内掺入”)描述了这一过程,本文已纳入作为参考。例如,当O-tRNA/O-RS对被引入到宿主如大肠杆菌细胞或酵母细胞内后,O-tRNA/O-RS对在体内响应选择者密码子后可将例如下述非天然氨基酸掺入到蛋白质内:p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素丙氨酸、7-羟基-香豆素丙氨酸、o-硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸或p-硝基-L-苯丙氨酸。加入系统的非天然氨基酸可以是合成的氨基酸,如苯丙氨酸或酪氨酸的衍生物,这是作为外源性物质加入到培养基内的。另外,本发明的组合物既可以用于体内翻译系统,也可以用于体外翻译系统。
利用本发明的细胞可以大规模地合成含非天然氨基酸的蛋白质。一方面,组合物可以包含至少10μg、50μg、75μg、100μg、200μg、250μg、500μg、1mg、10mg或更多含非天然氨基酸的蛋白质,或者含有蛋白质的量能够达到体内蛋白合成方法的要求(本文提供了重组蛋白产生和纯化方法的详细描述)。另一方面,组合物中所含的蛋白质浓度可以是每升细胞裂解物、缓冲液、药学上可接受的缓冲液或其它液体悬液中至少含10μg、50μg、75μg、100μg、200μg、250μg、500μg、1mg、10mg或更高(如以1nL到100L的体积)。在细胞内大量产生(例如大于其它方法,如体外翻译,在一般情况下所能达到的规模)至少含至少一个非天然氨基酸的蛋白质也是本发明的特征。
掺入非天然氨基酸可导致蛋白质结构和/或功能的确定变化,如大小、酸性、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶靶位点的易接近性、对基序的靶向性(如蛋白质阵列)掺入标记物或反应基团等。含有非天然氨基酸的蛋白质的催化或物理性能可能增强,或者获得全新的催化或物理性能。例如,下列特性可任选通过在蛋白质内掺入非天然氨基酸而改变:毒性、生物分布、结构特性、分光光度特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(如血清半衰期)、与其它分子反应的能力(共价或非共价)。包含至少携带一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物可用作新型治疗蛋白、诊断蛋白、催化酶、工业用酶、结合蛋白(如抗体)以及蛋白质结构和功能的研究。见Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure andFunction,
Current Opinion in Chemical Biology,4:645-652。
在本发明的一些方面,组合物所包含的蛋白质至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个非天然氨基酸。这些非天然氨基酸可以相同或不同,如在该蛋白质的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的位点上含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的非天然氨基酸。另一方面,组合物包含一个蛋白质,这个蛋白质至少有一个但不是全部的特定氨基酸被非天然氨基酸取代。对于一个给定的含多个非天然氨基酸的蛋白质来说,其中的非天然氨基酸可以是相同的,也可以是不同的(如蛋白质包含两个或多个不同类型的非天然氨基酸,或者包含两个相同的非天然氨基酸)。对于一个给定的含两个以上非天然氨基酸的蛋白质来说,其中的非天然氨基酸可以是相同的,也可以是不同的,或者其中有多个非天然氨基酸是相同的,但是至少有一个不同非天然氨基酸。
一般来说,包含非天然氨基酸(及任何相应的编码核酸,如包含一个或多个选择者密码子的核酸)的任何蛋白质都可用本发明的组合物和方法产生。不必尝试鉴定成千上万种已知蛋白质,任何蛋白质都可经修饰而含一个或多个非天然氨基酸的形式,例如可通过已建立的突变方法将一个或多个适合的选择者密码子掺入到相关的翻译系统中。已知蛋白质序列的常用数据库包括GenBank EMBL、DDBJ和NCBI。通过搜索互联网不难鉴定到其它数据库。
一般来说,本发明的蛋白质与已有的蛋白(如治疗蛋白、诊断蛋白、工业用酶,或其片段等)至少有60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或更高的相同性,其中包含一个或多个非天然氨基酸。可被修饰使其包含一个或多个非天然氨基酸的治疗蛋白、诊断蛋白以及其它蛋白可在下列文献中找到,但是又不仅仅局限于这些文献:2004年4月16日提交的题为“真核遗传密码的扩展”的国际专利申请WO2004/094593;以及WO 2002/085923,题为“非天然氨基酸的体内掺入”。可被修饰使其包含一个或多个非天然氨基酸的治疗蛋白、诊断蛋白以及其它蛋白包括但不限于α-1抗胰蛋白酶、血管他丁、抗溶血因子、抗体(有关抗体的详细描述见下文)、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子(如T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降钙素、CC趋化因子(如单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎症蛋白-1α、单核细胞炎症蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配基、C-kit配基、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制因子、补体受体1、细胞因子(如上皮细胞中性粒细胞活化肽-78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、MIP-1α、MIP-1δ、MCP-1)表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(EPO)、剥脱毒素A和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤连蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡萄糖脑苷脂酶、绒毛膜促性腺激素、生长因子、Hedgehog蛋白(如Sonic、Indian、Desert)、血红素、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、干扰素(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角质化细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、Neurturin、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、骨生成蛋白、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽类激素(如人生长激素、Pleiotropin、蛋白A、蛋白G、热原性外毒素A、B和C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体1、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原即葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE)、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克综合征毒素TSST-1)、胸腺素α1、组织纤溶酶原激活因子、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、血管内皮生长因子(VEGEF)、尿激酶等。
可以利用本发明的组合物和方法在体内产生出的含本文所述的非天然氨基酸的一类蛋白质是转录调节因子或其片段。转录调节因子的例子包括能调节细胞生长、分化、调控等的基因和转录调节蛋白。转录调节因子存在于原核细胞、病毒和真核生物如真菌、植物、酵母、昆虫和动物如哺乳动物,提供了一个大范围的治疗靶位。应当理解的是表达和转录活化因子调节转录的机制很多,如与受体结合、刺激信号转导级联、调节转录因子的表达、与启动子和增强子结合、与启动子和增强子结合的蛋白结合、解链DNA、剪接mRNA前体、多聚腺苷酸化RNA和降解RNA。
本发明的一类蛋白质(如携带一个或多个非天然氨基酸)的蛋白质)包括生物活性蛋白质,如细胞因子、炎症分子、生长因子及其受体、以及癌基因产物,如白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-8等)、干扰素、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1和hyalurin/CD44;信号转导分子和相应的癌基因产物,如Mos、Ras、Raf和Met;以及转录活化因子和抑制因子,如p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel,以及类固醇激素受体,如雌激素、孕酮、睾丸酮、醛固酮的受体、LDL受体的配基和皮质酮。
本发明还提供至少含有一个非天然氨基酸的酶(如工业用酶)或其片段。酶的例子包括但不限于酰胺酶、氨基酸消旋酶、酰基转移酶、脱卤素酶、二氧合酶、二芳基丙烷过氧化物酶、表位酶、环氧化物水解酶、酯酶、异构酶、激酶、葡萄糖异构酶、糖苷酶、葡萄糖酰基转移酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)、单加氧酶(如p450)、脂肪酶、木素过氧化物酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酯酶、枯草杆菌蛋白酶、转氨酶和核酶。
这些蛋白中有许多是可以从公司购买到的(见Sigma BioSciences的2002年产品目录和价目表),其相应的蛋白序列和基因及其变体通常都是已知的(见Genbank)。它们都可以按照本发明的方法通过掺入一个或多个非天然氨基酸来加以修饰,例如改变蛋白质的一种或多种治疗、诊断或酶催化特性。与治疗相关的特性包括血清半衰期、保存半衰期、稳定性、免疫原性、治疗活性、可检测性(如在非天然氨基酸中掺入报告基团(如标记物或标记结合位点))、LD50或其它负效应的降低、通过胃肠道进入体内的能力(如口服利用度)等。诊断特性的例子包括保存半衰期、稳定性、诊断活性、可检测性等。相关的酶催化特性的例子包括保存半衰期、稳定性、酶活性、产生能力等。
其它各种蛋白也可用本发明的组合物和方法修饰而含有一个或多个非天然氨基酸。例如,本发明可包括在一种或多种疫苗蛋白质中用非天然氨基酸取代一个或多个天然氨基酸,所述蛋白来自于传染性真菌,如曲霉属、念珠菌属真菌;细菌,特别是大肠杆菌,可以作为致病菌的模型,和医学上重要的细菌如葡萄球菌属(如金黄色葡萄糖球菌)或链球菌属(如肺炎链球菌)的细菌;原虫如孢子虫(如刚地弓形虫)、根足虫(如阿米巴原虫)和鞭毛虫(锥虫、利什曼原虫、毛滴虫、鞭毛虫等);病毒如(+)RNA病毒(例子包括痘病毒如痘苗病毒;细小核糖核酸病毒如脊髓灰质炎病毒;披膜病毒如风疹病毒;黄病毒如HCV;以及冠状病毒),(-)RNA病毒(如弹状病毒如VSV;副黏病毒如RSV;正粘病毒如流感病毒;布尼亚病毒;以及沙粒病毒),dsDNA病毒(如呼肠孤病毒),RNA到DNA的病毒,即逆转录病毒如HIV和HTLV,以及某些DNA到RNA的病毒如乙肝病毒。
与农业有关的蛋白质如昆虫抗性蛋白(如Cry蛋白)、淀粉和脂质生成酶、植物和昆虫毒素、毒素抗性蛋白、霉菌毒素脱毒蛋白、植物生长酶(如核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/氧合酶,″RUBISCO″)、脂肪加氧酶(LOX)、以及磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶也是非天然氨基酸修饰的适当靶标。
在某些实施方案中,本发明的方法和/或组合物中感兴趣蛋白或多肽(或其片段)是由核酸编码的。一般来说,这种核酸至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个选择者密码子。
感兴趣蛋白或多肽的编码基因可用本领域技术人员熟知的方法以及本文“突变和其它分子生物学技术”部分描述的方法加以突变使其包含用于掺入非天然氨基酸的一个或多个选择者密码子。例如,突变感兴趣蛋白的编码核酸使其含有一个或多个选择者密码子,因而可插入一个或多个非天然氨基酸。本发明包括任何蛋白的这种突变,如至少含有一个非天然氨基酸。同样,本发明还包括相应的核酸,即含有一个或多个编码一个或多个非天然氨基酸的选择者密码子的任何核酸。
为了使蛋白包含非天然氨基酸,需要使用适于通过正交tRNA/RS对在体内掺入非天然氨基酸的宿主细胞和生物。宿主细胞用一种或多种载体进行遗传改造(如转化、转导或转染),这些载体表达正交tRNA、正交tRNA合成酶和编码衍生蛋白的载体。这些组分可以位于同一个载体上,或者位于不同的载体上,或者两个组分位于一个载体上而第三个组分位于第二个载体上。载体可以是质粒、细菌、病毒、裸多核苷酸或偶联多核苷酸形式。
根据免疫活性定义多肽
由于本发明的多肽提供了各种新的多肽序列(如在本文翻译系统合成的蛋白中含有非天然氨基酸或者在新型合成酶、标准氨基酸的新型序列中含有非天然氨基酸),因此这些多肽也提供了能在免疫试验中被识别的新型结构特征。产生能特异性结合本发明多肽的抗血清以及这些抗血清结合的多肽也是本发明的特征。本文所用的术语“抗体”包括但不限于免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽,这些多肽能特异性识别并结合分析物(抗原)。例子包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和单链抗体等。免疫球蛋白的片段包括Fab片段和表达库包括噬菌体展示库产生的片段,也包括在本文所用的术语“抗体”之中。见Paul编的《基础免疫学》(FuncamentalImmunology),第四版,1999,Raven Press,New York,的抗体结构和术语。
为了产生用于免疫试验的抗血清,可如本文所述产生和纯化一种或多种免疫原性多肽。例如,可用重组细胞产生重组蛋白。纯系小鼠(可用于此试验中,因为这种小鼠遗传上实际相同,得到的结果重复性更高)用含标准佐剂如福氏完全佐剂的免疫原性蛋白按照标准的小鼠免疫方法免疫(见Harlow和Lane(1988),《抗体-实验室操作手册》(Antibodies,A Laboratory Manual)(冷泉港出版社,纽约)关于抗体产生、用于测定特异性免疫反应的免疫试验方法和条件的标准描述)。关于蛋白质、抗体、抗血清等的其它详细描述见题为“真核遗传密码的扩展”的国际公开号WO2004/094593;题为“非天然氨基酸的体内掺入”的WO 2002/085923;题为“糖蛋白的合成(GLYCOPROTEIN SYNTHESIS)”的WO 2004/035605;以及题为“蛋白质阵列(PROTEIN ARRAYS)”的WO 2004/058946。
O-TRNA和O-RS以及O-TRNA/O-RS对的应用
本发明的组合物和用本发明方法制备的组合物任选存在于细胞内。因而本发明的O-tRNA/O-RS对或其各个组分可为宿主系统的翻译机制所利用,结果导致将非天然氨基酸掺入蛋白质中。Schultz等人的国际公开专利“非天然氨基酸的体内掺入”(WO2002/085923)描述了这一过程,本文纳入作为参考。例如,当将O-tRNA/O-RS对导入到宿主如大肠杆菌或酵母时,O-tRNA/O-RS对可响应选择者密码子如琥珀无义密码子在体内将外源加入到培养基中的非天然氨基酸掺入到蛋白质如肌红蛋白或治疗蛋白中。本发明的组合物可任选用于体外翻译系统中,或体内细胞系统中。含非天然氨基酸的蛋白质的应用范围广泛,例如非天然氨基酸掺入的蛋白质可作为广泛修饰的靶标,如与其它蛋白质、与小分子如标记物或染料和/或生物分子偶联。通过这些修饰,掺入非天然氨基酸可产生改进的治疗蛋白,可用于改变或促进酶的催化功能。在其它方面,蛋白质中掺入非天然氨基酸和亚序列修饰有助于研究蛋白质的结构、与其它蛋白质的相互作用。
光可调节(PHOTOREGULATION)和光囚禁
光可调节的(Photoregulated)氨基酸(例如,光致变色的、光可剪切的(photocleavable)、光促异构的等)可用于在空间和时间上控制多种生物过程,例如,通过直接调节酶、受体、离子通道等的活性,或通过调节各种信号传导分子的胞内浓度。参见,例如,Shigeri等,Pharmacol.Therapeut.,2001,91:85;Curley等,Pharmacol.Therapeut.,1999,82:347;Curley等,Curr.Op.Chem.Bio.,1999,3:84;“囚禁的化合物(Caged Compounds)”
《酶学方法》(Methods in Enzymology),Marriott,G.编,Academic Press,NY,1998,V.291;Adams等,Annu.Rev.Physiol.,1993,55:755+;和Bochet等,J.Chem.Soc.,Perkin 1,2002,125。在本文各实施方案中,所述组合物和方法包含光调节的氨基酸。例如,本发明提供用于掺入光调节的非天然氨基酸o-硝基苄基-丝氨酸和O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的正交翻译系统(见图1和实施例8和9)。
“光可调节的氨基酸”通常是,例如,光敏氨基酸。光调节的氨基酸通常是那些可用光(例如,UV、IR等)以某些方式进行控制的氨基酸。因此,例如,如果光调节的氨基酸被掺入具有生物学活性的多肽,则通过光照可改变氨基酸,从而改变肽的生物学活性。一些光调节的氨基酸可包括“光囚禁的氨基酸”、“光敏氨基酸”、“光不稳定性氨基酸”、“光促异构的氨基酸”等。“囚禁的种类”,如囚禁的氨基酸或囚禁的肽,是那些陷入较大实体(如分子)并在特定光照下释放的种类。参见,例如,Adams等,Annu.Rev.Physiol.,1993,55:755-784。氨基酸的“囚禁”基团可能抑制或掩蔽(例如,通过打断通常用来稳定与靶分子之间相互作用的键,通过改变特定侧链的疏水性或离子特性,或通过空间位阻等)分子(如含有这种氨基酸的肽)的生物学活性。“光促异构的”氨基酸可由于光照而改变异构体的形式。掺入后,这种氨基酸的不同异构体可停止与蛋白质中其它侧链的各种相互作用。光调节的氨基酸因此可控制含有它们的肽的生物学活性(通过激活、部分激活、灭活、部分灭活、修饰激活等)。参见上述Adams的论文以及该部分的其它参考资料以了解光调节的氨基酸和分子进一步的定义和例子。
本领域已知许多光调节的氨基酸,且许多是可通过商业获得的。将光调节部分附加和/或关联到氨基酸的方法是已知的。这种光调节的氨基酸通常满足这里的各实施方案。应该理解,虽然这里列出了许多可能的光调节部分,例如光囚禁基团等,以及许多光调节的氨基酸,当这种例举不应视为限制。因此,本发明也适用于这里没有特别提到的光调节部分和光调节的氨基酸。
如上所述,许多方法都可用来产生光调节的氨基酸。因此,例如,光调节的氨基酸,例如,光囚禁的氨基酸可用诸如BOC(丁氧羰基)的化合物保护其α-氨基并用诸如叔丁酯的化合物保护α-羧基而产生。这种保护之后可使氨基酸侧链与反应性形式如如2-硝基苄基氯甲酸酯、α-羧基2-硝基苄基溴化物甲酯或2-硝基苄基重氮乙烷中的光不稳定性囚禁基如2-硝基苄基反应。加入光不稳定性囚禁基之后,可通过标准方法除去保护基。参见,例如,USPN 5,998,580。
另一个例子中,赖氨酸残基可用2-硝基苄基氯甲酸酯囚禁以衍生ε-赖氨酸氨基,从而除去正电荷。或者,就用α-羧基2-硝基苄氧基羰基囚禁基在肽(含有这种赖氨酸)中引入负电荷而囚禁赖氨酸。此外,可用1(2-硝基苯基)重氮乙烷处理磷酸氨基酸或磷酸肽而囚禁磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。参见,例如,Walker等,Meth Enzymol.172:288-301,1989。许多其它氨基酸也方便地适用于标准囚禁化学,例如丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。参见,例如,Wilcox等,J.Org.Chem.55:1585-1589,1990)。再者,应理解,例举特定光调节的氨基酸和/或那些能够转变为光调节形式的氨基酸不应视为限制。
也可用其它方式制备光调节的氨基酸残基(例如,光敏或光不稳定)。例如,可制备某些氨基酸残基,其中,光照将导致切断含有特定氨基酸残基的肽主链。例如,光不稳定性甘氨酸、2-硝基苯基甘氨酸可以这种方法发挥作用。参见,例如,Davis等,1973,J.Med.Chem.,16:1043-1045。照射含有2-硝基苯基甘氨酸的肽将切除2-硝基苯基甘氨酸的α碳和α氨基之间的肽主链。如果将2-硝基苄基插入α碳和α氨基之间,则这种切割策略通常适用于甘氨酸之外的氨基酸。
本领域已知系多光调剂基团,如囚禁基,和许多用来共价连接这种基团与其它分子(如氨基酸)的反应性化合物。光调节(例如,光不稳定、光囚禁)基团的例子包括,但不限于:o-硝基苄基-丝氨酸,O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸,硝基二氢吲哚;N-酰基-7-硝基二氢吲哚;苯酰基;羟基苯酰基;溴化7-羟基香豆素-4-基甲基(例如,Bhc);安息香酯;二甲氧基安息香;间-苯酚;2-硝基苄基;1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)乙基(DMNPE);4,5-二甲氧基-2-硝基苄基(DMNB);α-羧基-2-硝基苄基(CNB);1-(2-硝基苯基)乙基(NPE);5-羧基甲氧基-2-硝基苄基(CMNB);(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)氧)羰基;(4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧)羰基;脱氧安息香基等。参见,例如,Haugland和Gee(1997-1-3)的题为“α-羧基囚禁的化合物”的USPN5,635,608;Neuro 19,465(1997);J Physiol 508.3,801(1998);Proc Natl Acad SciUSA 1988 Sep,85(17):6571-5;J Biol Chem 1997 Feb 14,272(7):4172-8;Neuron20,619-624,1998;Nature Genetics,第28卷:2001:317-325;Nature,第392卷,1998:936-941;Pan,P.和Bayley,H.“囚禁的半胱氨酸和硫代膦酰肽”FEBSLetters 405:81-85(1997);Pettit等(1997)“化学双光子未囚禁:描绘谷氨酸盐受体的新方法(Chemical two-photon uncaging:a novel approach to mapping glutamatereceptors)”Neuron 19:465-471;Furuta等(1999)“Brominated7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls:novel photolabile protecting groups with biologicallyuseful cross-sections for two photon photolysis”Proc.Natl.Acad.Sci.96(4):1193-1200;Zou等“Catalytic subunit of peotein kinase A caged at the activating phosphothreonine”J.Amer.Chem.Soc.(2002)124:8220-8229;Zou等“Caged ThiophosphotyrosinePeptides”Angew.Chem.Int.Ed.(2001)40:3049-3051;Conrad II等“p-Hydroxyphenacyl Phototriggers:The reactive Excited State of PhosphatePhotorelease”J.Am.Chem.Soc.(2000)122:9346-9347;Conrad II等“NewPhototriggers 10:Extending the π,π* Absorption to Release Peptides in BiologicalMedia”Org.Lett.(2000)2:1545-1547;Givens等“A New Phototriggers 9:p-Hydroxyphenacyl as a C-Terminus Photoremovable Protecting Group forOligopeptides”J.Am.Chem.Soc.(2000)122:2687-2697;Bishop等“40-Aminomethyl-2,20-bipyridyl-4-carboxylic Acid(Abc)and Related Derivatives:Novel Bipyridine Amino Acids for the Solid-Phase Incorporation of a Metal CoordinationSite Within a Peptide Backbone”Tetrahedron(2000)56:4629-4638;Ching等“Polymers As Surface-Based Tethers with Photolytic triggers Enabling Laser-InducedRelease/Desorption of Covalently Bound Molecules”Bioconjugate Chemistry(1996)7:525-8;
生物探针手册(BioProbes Handbook),2002,Molecular Probes,Inc.;和
荧光 探针和研究产品手册(Handbook of Fluorescent Probes and Research Products),第9版或Web版,Molecular Probes,Inc,以及本文的参考文献。可通过商业获得许多用于囚禁各种分子的化合物、试剂盒等,例如,购自Molecular Probes,Inc。在以下文献中能找到其它参考资料,例如,Merrifield,Science 232:341(1986),Corrie,J.E.T.和Trentham,D.R.(1993)摘自Morrison,H.编的《光化学开关的生物应用》(Biological Applications of Photochemical Switches),John Wiley and Sons,Inc.NewYork,第243-305页。合适光敏囚禁基的例子包括,但不限于,2-硝基苄基、安息香酯、N-酰基-7-硝基二氢吲哚(nitindoline)、间-苯酚和苯酰基。
一些实施方案中,光调节(例如,囚禁)基团可任选含有可结合第二结合部分的第一结合部分。例如,市售的囚禁的亚磷酰胺[1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-5-(6-生物素氨基己酰氨基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰基乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(PC Biotin Phosphoramadite,获自Glen Research Corp.,www.glenres.com)包含光不稳定性基团和生物素(第一结合部分)。第二结合部分,例如,链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白,因此可与囚禁基结合、提高其膨松度(bulkiness)及囚禁效率。在某些实施方案中,囚禁的组分包含两个或多个囚禁基,它们分别含有第一结合部分和可同时结合两个或多个第一结合部分的第二结合部分。例如,囚禁的组分可含有至少两个生物素化的囚禁基;链霉抗生物素蛋白与多个囚禁的组分分子上多个生物素部分的结合将囚禁组分连接成巨大网络。切除附加到组分生物素上的光不稳定性基团导致该网络解散。
形成囚禁的多肽(包括例如肽和蛋白质,如抗体或转录因子)的常规方法包括,例如,使多肽与囚禁化合物反应或在多肽合成过程中掺入囚禁的氨基酸。参见,例如,Fay等的(1999-12-7)题为“光敏囚禁的大分子”美国专利No.5,998,580;Kossel等(2001)PNAS 98:14702-14707;Trends Plant Sci(1999)4:330-334;PNAS(1998)95:1568-1573;J.Am.Chem.Soc.(2002)124:8220-8229;Pharmacology &Therapeutics(2001)91:85-92;和Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(2001)40:3049-3051。光不稳定性多肽结合(例如,用于连接蛋白质转导结构域和传感器等)可以例如包含光不稳定性氨基酸,如美国专利No.5,998,580中描述的那些。
[0001]用光照射可例如释放氨基酸的侧链残基,该残基对于含有这种氨基酸的肽的活性是重要的。此外,一些实施方案中,未囚禁的氨基酸可切除含有这种氨基酸的肽的肽主链,因此例如可打开环肽而形成具有不同生物特性等的直线肽。
可通过精通本领域的技术人员已知的任何标准方法破坏光调节的氨基酸上的光敏囚禁基从而激活囚禁的肽。例如,可将光敏氨基酸暴露于合适的常规光源如激光(例如,在UV范围或红外范围发射)而进行去囚禁或激活。那些精通本领域的技术人员将了解并熟悉许多具有适当波长和能量的其它激光以及适用于光调节的氨基酸(如这里提到的那些)的合适的应用方法(例如,暴露时间等)。释放光调节的囚禁的氨基酸能够控制含有这种氨基酸的肽。这种控制可发生在空间上或时间上。例如,暴露于聚焦的激光可在一个位置去囚禁氨基酸,而不会去囚禁其它位置上的氨基酸。
那些精通本领域的技术人员将了解许多可用来评价光调节的氨基酸活性的试验,例如,本文实施例中描述的试验。可在将含有光调节的氨基酸引入细胞或组织之前和之后以及释放光调节的分子之后测试诸如细胞功能、组织功能等许多内容。
这里所述的组合物和方法可用于许多方面。例如,由于可通过靶定位的光照射使光调节的氨基酸激活/失活/等,因此光调节的氨基酸(例如,在肽中的)可将治疗化合物递送到机体的不同部位。应该了解,本发明的方法、结构和组合物可用于掺入/利用光调节的天然氨基酸(例如,连接/结合含光调节部分的氨基酸)。
可利用光致变色的和光可剪切的基团在空间和时间上调控各种生物过程,这可通过以下方式实现:直接调节酶活性(参见,例如,Westmark等,J.Am.Chem.Soc.1993,115:3416-19以及Hohsaka等,J.Am.Chem.Soc.1994,116:413-4)、受体活性(参见,例如,Bartels等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1971,68:1820-3;Lester等,Nature 1977,266:373-4:Cruz等,J.Am.Chem.Soc.,2000,122:8777-8;和Pollitt等,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1998,37:2104-7)或离子通道活性(参见,例如,Lien等,J.Am.Chem.Soc.1996,118:12222-3;Borisenko等,J.Am.Chem.Soc.2000,122:6364-70;和Banghart等,Nat.Neurosci.2004,7:1381-6),或调节各种信号分子的胞内浓度(参见,例如,Adams等,Annu.Rev.Physiol.1993,55:755-84)。通常,这要求用光反应性配体如偶氮苯或硝基苄基化学修饰蛋白质或小分子。在活生物中将光反应性氨基酸遗传直接掺入蛋白质预定位点的能力将显著扩大该技术的应用范围。参见,例如,Wu等,J.Am.Chem.Soc.2004,126:14306-7。
试剂盒
试剂盒也是本发明的特征。例如,本发明提供了用于在细胞内产生至少含一个非天然氨基酸的蛋白质的试剂盒,所述试剂盒包括一个盛有O-tRNA和/或O-tRNA编码多核苷酸序列、和/或O-RS编码多核苷酸序列、和/或O-RS的容器。在一个实施方案中,试剂盒还装有诸如p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素丙氨酸、7-羟基-香豆素丙氨酸、o-硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、联苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸;p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸;3-硝基-L-酪氨酸或p-硝基-L-苯丙氨酸的非天然氨基酸。在另一个实施方案中,试剂盒还装有关于产生蛋白质的说明书。
实施例
下面所提供的实施例只是为了说明,并不意味着对本发明权利要求的限制。本领域的技术人员应该认识到,只要不偏离本发明权利要求的范围,许多非关键的参数都可以改变。
实施例1
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入3-硝基-L-酪氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将3-硝基-L-酪氨酸(见图1)通过生物合成掺入蛋白质的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到的新型正交tRNA/合成酶对在大肠杆菌宿主细胞系统中具有功能。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA(SEQ ID NO:1)联用。这些新的正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。所得到的正交tRNA合成酶能选择性地用3-硝基-L-酪氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入3-硝基-L-酪氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG反应中运送非天然氨基酸。
用已报道的方法分离得到新型合成酶,参见Alfonta等,Journal of the AmericanChemical Society 125(48):14662-14663(2003);以及国际专利公开号WO 2005/038002,2005年4月28日公开。
通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库。野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶分子的氨基酸序列和多聚核苷酸序列见表5,分别为SEQ ID NOS:3和4。根据嗜热脂肪芽孢杆菌的同源酪氨酰tRNA合成酶晶体结构,诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变库内诸合成酶进行5轮正负筛选。选择得到了7株能用3-硝基-L-酪氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆,命名为克隆A到克隆G。对这些选出的合成酶克隆测序,确定其氨基酸序列如下:
表2
|
氨基酸位置 |
甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶 | 32 | 67 | 70 | 155 | 158 | 167 |
SEQ IDNO: |
野生型 |
Tyr |
Ala |
His |
Gln |
Asp |
Ala |
3 |
克隆A | |
Val |
Val | | | |
7 |
克隆B | |
Val |
Val | | | |
7 |
克隆C | |
Val |
Val | | | |
7 |
克隆D |
Ser |
Thr |
Asn | | |
Thr |
8 |
克隆E | |
Val |
Val | | | |
7 |
克隆F |
Ala |
Pro | | | |
Gly |
9 |
克隆G | |
Val |
Val | | | |
7 |
克隆A、B、C、E和G都为相同的突变体序列。克隆D和F显示具有不同的序列。这些突变体合成酶的氨基酸序列提供在表5中,为SEQ ID NOS:7-9。
实施例2
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入p-硝基-L-苯丙氨酸(NO2-Phe)
的正交翻译组分
本实施例描述了利用新型正交翻译系统将p-硝基-L-苯丙氨酸(见图1;也写成NO2-Phe)位点特异性用遗传工程程序性方法掺入到大肠杆菌蛋白质内。
非天然氨基酸NO2-Phe曾被用作光亲和标记探针来研究蛋白质-受体结构(Dong,Mol.Pharmacol.2005,69,1892),以及用作荧光淬灭剂来研究蛋白酶的活性(Wang,Biochem.Biophys.Res.Comm.1994,201:835)和蛋白质结构(Sisido,J.Am.Chem.Soc.1998,120:7520;2002,124:14586)。已采用三碱基(Schultz,Science 1989,244:182)、四碱基(M.Sisido)和五碱基(M.Sisido,Nucleic Acids Res.2001,29,3646)密码子通过体外生物合成方法将此种氨基酸位点特异性地掺入到蛋白质内。但是,这种方法所得到的蛋白量通常很低。另外,该方法因需要化学计量的酰化tRNA且不能再生氨酰tRNA而受到限制。考虑到这些局限性,我们开发了一种新型的体内正交翻译系统,可将非天然氨基酸直接掺入到蛋白质内,见下文所述。
为了在大肠杆菌内遗传编码NO2-Phe,须改变甲烷球菌正交酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS)的特异性,以使该合成酶能够特异性地用非天然氨基酸NO2-Phe加载突变体酪氨酸琥珀抑制型tRNA(mutRNACUA Tyr)。该突变体合成酶来源于对突变体MjTyrRS库的筛选。根据能选择性地用p-溴代苯丙氨酸加载mutRNACUA Tyr的突变体MjTyrRS的晶体结构分析选择突变体库中进行诱变的位置。
在1mM NO2-Phe存在或不存在下,用mutRNACUA Tyr和突变体MjTyrRS库进行几轮正负筛选后,产生了一个在高浓度氯霉素(90μg/mL)下存活依赖于NO2-Phe存在的克隆。另外,该选出的克隆只在NO2-Phe与T7/GFPuv报告基因存在时才能观察到绿色荧光,T7/GFPuv报告基因中的位点上含有琥珀选择密码子。此结果提示产生的该合成酶对NO2-Phe的特异性比对其它任何天然氨基酸更高。该克隆的测序结果表明在产生的此合成酶中存在下列突变:
Tyr32→Leu
Glu107→Ser
Asp158→Pro
Ile159→Leu
His160→Asn
Leu162→Glu
此克隆的核苷酸序列提供在表5中,为SEQ ID NO:11,其相应的氨基酸序列也提供在表5中,为SEQ ID NO:10。
为了检测产生的此合成酶(mutNO2-PheRS)和mutRNATyCUA Tyr能够将NO2-Phe选择性掺入到蛋白质内,将C末端含六个组氨酸尾的蛋白质Z区基因中允许的位点(Lys7)替换成琥珀终止密码子。将用mutNO2-PheRS、mutRNACUA Tyr和Z区基因转化的细胞在含1mM NO2-Phe的GMML基础培养基中培养。用Ni2+亲和柱纯化突变蛋白质,然后用SDS-PAGE(见图2)和MALDI-TOF(图3)分析。MALDI-TOF分析观察到的质量(m/e=7958)与掺入了NO2-Phe的Z区蛋白的预期质量(m/e=7958)相匹配。缺乏NO2-Phe(见图1)时没有观察到Z区蛋白,表面非天然氨基酸的掺入保真度很高。
下一步检测利用掺入的NO2-Phe作为荧光淬灭剂的可行性。从已报道的NO2-Phe的荧光团对应分子,如酪氨酸、色氨酸、1-pyrenylalanine和-氨茴酰-l-α,-二氨基丙酸中,挑选色氨酸/NO2-Phe对掺入到模型GCN4亮氨酸拉链中,形成一个平行的螺旋卷曲同型二聚体。GCN4基因的DNA结合区(676-840bp)不编码色氨酸,克隆酵母基因组中的该区将其插入到蛋白表达载体pET-26b中。然后用定点诱变在此蛋白特定位点上用色氨酸或NO2-Phe非天然氨基酸(由TAG选择密码子编码)替换该位置的氨基酸。将GCN4表达载体以及含mutNO2-PheRS和mutRNACUA Tyr的质粒共同转染到大肠杆菌BL21(DE3)细胞内,然后在含1mM NO2-Phe的GMML基础培养基内培养。用Ni2+亲和柱纯化积聚的GCN4p1突变蛋白,然后用SDS-PAGE和MALDI-TOF分析来验证。
测定该纯化的突变蛋白的稳态荧光光谱。图4A显示单用22Trp突变蛋白以及22Trp突变体和22NO2-Phe突变体混合物的荧光光谱,而图4B显示55Trp突变体以及55Trp和22NO2-Phe突变体混合物的荧光光谱。在22Trp/22NO2-Phe突变体对中观察到明显的荧光淬灭;另一方面,55Trp/22NO2-Phe突变体对没有获得明显的荧光淬灭。此结果清楚地表明Trp/NO2-Phe对之间的荧光团/淬灭剂相互作用是间距依赖性的。因此,本系统很容易应用于蛋白折叠和蛋白-蛋白相互作用的研究以及蛋白-配基相互作用的研究。
实施例3
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入氧化活性氨基酸3-氨基-L-酪氨酸(NO2-Phe)的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将3-氨基-L-酪氨酸(见图1,也写为NH2-YRS)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
这个非天然氨基酸的侧链易被氧化成为相应的半醌或醌,因此可用于探测和操作蛋白质内的电子转移过程。氧化产生的醌可通过hetero-Diels-Alder反应与丙烯酰胺有效偶联。这后一特性提供了另外一种用途,即该非天然氨基酸可作为蛋白质化学修饰的一个手柄。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,可与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA(SEQ ID NO:1)联用。这个新的正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。该得到的正交tRNA合成酶能选择性地用3-氨基-L-酪氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入3-氨基-L-酪氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TGA反应中运送非天然氨基酸。
用已报告的方法分离得到该新型合成酶。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库。根据其它氨酰tRNA合成酶的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变库内诸合成酶进行多轮正负筛选。选择得到了一个能用3-氨基-L-酪氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。此选出的合成酶克隆的氨基酸序列见表5,为SEQ ID NO:12;其多聚核苷酸序列也见表5,为SEQ ID NO:13。
实施例4
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入磷酸酰氨酸模拟氨基酸p-羧甲基-L-苯丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将p-羧甲基-L-苯丙氨酸(见图1,也写为pCMF)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
采用此非天然氨基酸侧链作为酪氨酸磷酸化的稳定模拟物。酪氨酸磷酸化在调节许多细胞过程中的细胞信号转导中发挥重要作用,如细胞生长、代谢调节、转录调节和增殖。酪氨酸磷酸化在体内是一种可逆的过程。内源性酪氨酸磷酸酶有使酪氨酸去磷酸化的趋向而干扰了对酪氨酸磷酸化效应的研究,因而会妨碍对这些研究的解释。氨基酸p-羧甲基-L-苯丙氨酸是磷酸酪氨酸的模拟物,可透入细胞,因而不能作为酪氨酸磷酸酶的底物。当将此非天然氨基酸掺入蛋白质内时可用于产生组成性活化的蛋白质。此非天然氨基酸还可用于噬菌体展示,来选择含p-羧甲基-L-苯丙氨酸的肽库中蛋白质酪氨酸磷酸酶的抑制剂。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA(SEQ ID NO:1)联用。这些新的正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。该得到的正交tRNA合成酶能选择性地用p-羧甲基-L-苯丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入p-羧甲基-L-苯丙氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源的tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG反应中运送非天然氨基酸。
搜索能用p-羧甲基-L-苯丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。此搜索所用的方法上面已有描述。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。选择得到了5个能用p-羧甲基-L-苯丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这些合成酶克隆测序确定其氨基酸序列,如表5所示,为SEQ ID NO:14、16、18、20和22。这些相同O-RS克隆的核苷酸序列为SEQ ID NO:15、17、19、21和23。
实施例5
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入疏水性非天然氨基酸联苯基丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将联苯基丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
非天然氨基酸联苯基丙氨酸含有大的芳香族侧链。疏水性相互作用是驱使蛋白质折叠和蛋白-蛋白相互作用的主要作用力之一(其它的主要作用力是静电相互作用、氢键和范得华力)。疏水性相互作用参与多种生物学过程,如蛋白质跨细胞膜转运、蛋白质凝集以及酶催化作用。联苯基丙氨酸的疏水性比常见的20种氨基酸高。在蛋白质内掺入联苯基丙氨酸是研究和修饰蛋白质的分子内和分子间疏水性相互作用的一种有用工具。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA联用。这些新型正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。所得到的正交tRNA合成酶能选择性地用联苯基丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入联苯基丙氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG反应中运送非天然氨基酸。
搜索能用联苯基丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。此搜索所用的方法上面已有描述。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。选择得到了7个能用联苯基丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这些合成酶克隆测序,如表5所示。这些O-RS克隆的氨基酸序列为SEQ ID NO:24、26、28、30、32、34和36。这些相同O-RS克隆的相应核苷酸序列为SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35和37。
实施例6
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入金属鳌合非天然氨基酸联吡啶基丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将联吡啶基丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
非天然氨基酸联吡啶基丙氨酸能鳌合金属离子。此氨基酸侧链的N,N-二齿鳌合基序对过渡态金属离子如Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+和Ru2+等是很强的螯合剂。此金属鳌合氨基酸可用于(1)将氧化还原活性的或亲电子的金属离子引入到蛋白质内,(2)形成发荧光的金属离子复合物如Ru(bpy)3,或者(3)介导含联吡啶基丙氨酸的蛋白质发生金属离子依赖性的二聚化。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA联用。这些新型正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。所得到的正交tRNA合成酶能选择性地用联吡啶基丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入联吡啶基丙氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG反应中运送非天然氨基酸。
搜索能用联吡啶基丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。此搜索所用的方法上面已有描述。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。选择得到了2个能用联吡啶基丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这些合成酶克隆测序,如表5所示。这些O-RS克隆的氨基酸序列为SEQ ID NO:38和40。这些相同O-RS克隆的相应核苷酸序列为SEQ ID NO:39和41。
实施例7
用于在酵母宿主细胞体内蛋白质中掺入发荧光非天然氨基酸1,5-丹酰基丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用酵母宿主细胞翻译机制将1,5-丹酰基丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从大肠杆菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在酵母宿主细胞系统内具有功能。
荧光因其灵敏度高和操作安全已成为生物技术中一种最重要的检测信号。另外,某些技术如荧光共振能量转移(FRET)或荧光偏振使实时分析生物分子的结合运动或构象变化成为可能。目前所用的研究体内蛋白质的荧光方法通常依赖于含大荧光蛋白质的融合构建体。另外,可用小的有机标记物来最大程度降低结构干扰,但其区域选择性差,这些小有机标记物有细胞毒性,或者需要引入染料结合蛋白基序,而限于(引入)蛋白质的表面。相反,荧光氨基酸不需要含有细胞毒性基团,其导入仅造成蛋白质结构的微小改变,而能够在体内蛋白质的任何位置上进行特异性标记。
本发明提供了能将荧光氨基酸即1,5-丹酰基修饰的丙氨酸(见图5A)掺入到酵母正在延伸的多肽链内的正交翻译系统组分。此非天然氨基酸还可以通过其IUPAC术语:2-氨基-3-(5-二甲氨基-萘-1-硫氨基)-丙酸来鉴定。丹酰发色团具有令人感兴趣的光谱特性,包括最大激发波长和最大发射波长间隔极大(>200nm)以及发射光强度高度依赖于环境的极性。这使其很适合于研究当蛋白质局部环境的极性受到影响时蛋白质的构象变化或结合。非天然氨基酸的合成可通过两步方法完成,包括用三乙胺的二氯甲烷溶液将N-Boc-氨基丙氨酸偶联于丹酰氯,然后用TFA的二氯甲烷溶液进行酸性脱保护。
采用以前报道的方法分离得到用于掺入1,5-丹酰基丙氨酸的新型合成酶,参见Wu等,Journal of the American Chemical Society 126:14306-14307(2004);以及Deiters等的国际专利申请PCT/US 2005/034002,申请日为2005年9月21日。从酵母宿主细胞系统内的随机大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶库中分离得到显示有初步加载活性的大肠杆菌突变体亮氨酰-tRNA合成酶克隆(克隆B8)。见表5和SEQ ID NOS:42和43。大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶库中的突变位点是M40、L41、Y499、Y527和H537。在整个库所有克隆中发现的其它突变(库构建过程导致的)是H67R、N196T、R262A和S497C。
然而,通过对表达的33位含有允许的琥珀密码子的模型蛋白质-人超氧化物岐化酶(hSOD-33TAG-His6)的MALDI TOF MS分析判断,B8突变大肠杆菌合成酶显示对一种或多种天然氨基酸的背景活性与亮氨酸相似。对丹酰基丙氨酸-AMP酰胺的理论停靠研究以及嗜热栖热菌(T.th.)的同源亮氨酰tRNA合成酶的晶体结构研究提示形成了扩展的结合袋,该结合袋主要通过疏水性相互作用而不需要对naphtyl基序的π堆积参与来结合配基(见图5B)。
大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶具有校对活性,因为所选出的突变体已产生了对1,5-丹酰基丙氨酸的活化活性和加载活性,设计的策略是通过重塑编辑位点来靶向选择性去除活化的或加载的天然氨基酸。认为如MALDI TOF MS所提示,观察到的背景活性是由于亮氨酸的掺入。T.th来源的同源亮氨酰tRNA合成酶的晶体结构和突变研究,提示简单地空间阻断非极性氨基酸靠近γ-甲基侧链就可以阻止活化的或加载的亮氨酸结合于水解位点(Lincecum等,Mol Cell.,4:951-963[2003])。
为了提高对亮氨酸的水解活性,大肠杆菌合成酶编辑区中的残基T252和V338可通过Quikchange诱变替换成丙氨酸以扩展结合袋(见图6A)。V338A合成酶(见表5,SEQ ID NOS:46和47)用模型蛋白人超氧化物岐化酶(hSOD)进行表达研究显示没有明显差异,而T252A合成酶(见表5,SEQ ID NOS:44和45)却显示背景活性明显降低(见图6B)。此突变体的高度选择性通过hSOD-33TAG-His6的MALDI TOF MS得到进一步确证。
因此,本发明提供了大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶来源的能够利用酵母(如酿酒酵母)宿主细胞翻译机制将1,5-丹酰基丙氨酸通过生物合成掺入到蛋白质内的新型突变体tRNA合成酶。
实施例8
用于在酵母宿主细胞体内蛋白质中掺入光囚禁的非天然氨基酸o-硝基苄基丝氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用酵母宿主细胞翻译机制将o-硝基苄基丝氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从大肠杆菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在酵母宿主细胞系统内具有功能。
对活的生物特定基因功能的研究主要依赖于其失活和活化以及对其所产生效应的研究。经典的基因敲除研究目标是DNA水平基因,基因敲除可导致灭活产生的编码蛋白质的所有突变体,却不能实时研究所产生的效应。最近几年,利用小的有机分子显著提高了基因灭活的特异性。用这些工具,可靶向单个蛋白质变体(或该变体的单一区域),在加入该分子后可实时研究所产生的效应。
将光囚禁的氨基酸引入到蛋白质内作为瞬时可活化敲除可进一步提高这种研究的精确度。用化学敲除策略,化合物向其靶蛋白扩散的时间是受速率限制的,因而只可能用于研究整个细胞。与此相反,特定氨基酸的光去囚禁可在较快的时间内完成,因此可利用脉冲和高聚焦激光来研究细胞内的特定区室。
先前已从构建在酵母宿主细胞中的大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶突变体库中产生了能特异性识别被囚禁的半胱氨酸衍生物o-硝基苄基半胱氨酸(也写为o-NBC)的大肠杆菌突变亮氨酰tRNA合成酶(见Wu等,Journal of the American Chemical Society126:14306-14307(2004);以及国际专利申请No.PCT/US 2005/034002,申请日为2005年9月21日,Deiters等)。为了扩展该方法的适应范围,经考虑产生了能特异性掺入o-硝基苄基丝氨酸(oNBS)的氨酰tRNA合成酶。当将此光囚禁的非天然氨基酸通过遗传方法掺入到蛋白质内时,该氨基酸可用于光调节丝氨酸残基所参与的功能,例如但不限于激酶导致的丝氨酸磷酸化,代表了信号转导通路中最重要的一个化学标记。可用NaH作为碱,然后在作为清除剂的三乙基甲硅烷存在下用TFA的二氯甲烷溶液进行酸性脱保护,使o-硝基苄基溴偶联于DMF配制的Boc-N-Ser-O-tBu而合成oNBS氨基酸,总产率为52%。
产生的用于掺入oNBC的大肠杆菌突变亮氨酰tRNA合成酶(克隆3H11见表5,SEQ ID NOS:48和49)已显示出某些有限的oNBS掺入活性,但其效率比oNBC氨基酸低两倍。为了产生更有效oNBS翻译系统,利用易错PCR和三种不同的诱变方法在每个基因中引入1、2或5个突变使所选出的克隆3H11合成酶多样化,共得到1×107个不同的克隆。亮氨酰tRNA合成酶中随机化目标的位置是M40、L41、Y499、Y527和H537。本文所用的方法是本领域所述的通用方法,如Wu等,Journal of theAmerican Chemical Society 126:14306-14307(2004);以及国际专利申请No.PCT/US2005/034002,申请日为2005年9月21日,Deiters等。
通过筛选新的突变合成酶库得到了oNBS掺入效率提高2倍的改进合成酶(克隆G2-6)。G2-6克隆经测序鉴定到该酶中与初始3H11原材料相比有5个额外突变(位置S31G,T247A,T248S,M617I和V673A)。全库的所有克隆中还发现以下额外突变(构建文库导致的):H67R、N196T、R262A和S497C。此合成酶分离物的完整氨基酸序列和核苷酸序列见表5,为SEQ ID NOs:50和51。图7A用示意图的形式描述了这个改良的突变合成酶,图7B用试验说明了G2-6合成酶突变体的oNBS掺入活性的提高。进一步通过MALDI MS用hSOD作为表达研究模型系统确证了oNBS的选择性掺入。
因此,本发明提供了大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶来源的能够利用酵母(如酿酒酵母)宿主细胞翻译机制通过生物合成将oNBS掺入到蛋白质内的新型突变tRNA合成酶。
实施例9
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入光囚禁的非天然氨基酸O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用古细菌合成酶和大肠杆菌宿主细胞翻译机制将O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
“被囚禁的蛋白质”指其生物活性受光控制的修饰蛋白质,通常是经光解转化从非活化形式转变为活化形式。这特别有用,因为光照在时间、位置和幅度上易于控制,能够对蛋白功能的细节进行研究(综述见Shigeri等,Pharmacol.Therapeut.2001,91:85;Curley and Lawrence Pharmacol.Therapeut.1999,82:347;Curley and Lawrence,Curr.Op.Chem.Bio.1999,3:84;“被囚禁的化合物”(″Caged Compounds″),《酶学方法》(Methods in Enzymology);Marriott,G.编辑;Academic Press:New York,1998;V.291;以及Adams and Tsien,Annu.Rev.Physiol.1993,55:755)。
最常用的囚禁基团是2-硝基苄基(见Bochet,J.Chem.Soc.,Perkin 1 2002,125;Givens等,Methods in Enzynology 1998,291,1;以及Pillai,Synthesis 1980,1),用该基团代替多肽或蛋白质的羟基、羧基、巯基或氨基,用非光损伤的紫外线照射时易于切断。以前通过化学修饰分离的蛋白质来制备囚禁蛋白,未对囚禁基团的位置进行控制,因此很可能掺入多个囚禁基团(如Self和Thompson,Nature Med.1996,2,817)。其它例子采用无义密码子抑制技术在体外掺入囚禁的氨基酸(见Philipson等,Am.J.Physiol.Cell.Physiol.2001,281,C195;Pollitt和Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.1998,37,2105;Cook等,Angew.Chem.Int.Ed.1995,34,1629)。由于氨酰化tRNA必须通过化学方法合成,因此只适用于少量蛋白质,体内研究受到限制。
利用正交翻译系统技术克服了这些技术的固有局限性。用细胞系统,通过在大肠杆菌翻译机制中加入新的组分可将非天然氨基酸以高度翻译保真度位点特异性地掺入到体内蛋白质(综述参见,如Wang和Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.2004,44,34;Cropp和Schultz,Trend.Gen.2004,20,625;以及Wang和Schultz,Chem.Commun.2002,1)。
本实施例描述了在大肠杆菌遗传密码内加入光囚禁酪氨酸O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(见图1)的方法。酪氨酸是蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶底物中的重要氨基酸,是几个酶活性位点中的必需残基,通常位于蛋白-蛋白界面上。
用365nm光照射O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(如Miller等,Neuron 1998,20,619所述从L-酪氨酸合成)诱导苄基CO键断裂,快速形成脱囚禁的氨基酸(t1/2=4min,见支持信息),如图8的示意图所述。
试验观察了O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的光照脱囚禁,图9显示了试验结果。如此图所示,利用手提式紫外灯(波长365nm,距离10mm)照射其0.2mM水溶液(六孔板上的一个孔)研究了O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的光照脱囚禁。在特定时间点采集等份样品,用LC/MS分析。O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(方块)和脱囚禁的O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(圆圈)的浓度显示在图中。在大约4分钟后获得50%脱囚禁。
用甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶(MjYRS)作为起点来制备能接受O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸,但不能以20种常见氨基酸中的任何一种作为底物的正交合成酶。MjYRS不能用酪氨酸氨酰化任何大肠杆菌内源性tRNA,但能氨酰化突变的酪氨酸琥珀抑制子(mutRNACUA)。为了改变MjYRS选择性识别O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的特异性,根据甲烷球菌YRS/tRNATyr-酪氨酸复合物的晶体结构,通过在酪氨酸结合袋内随机安置6个残基(Tyr32,Leu65,Phe108,Gln109,Asp158和Leu162)制备了约含109个YRS的突变体库(Zhang等,Prot.Sci.2005,14,1340;Kobayashi等,Nat.Struct.Biol.2003,10,425)。这六个残基的选择是依据它们密切靠近酪氨酸苯环的对位,其中Tyr32和Asp158与酪氨酸的羟基形成氢键。这些残基的突变预期能扩展该合成酶的底物结合袋而特异性识别O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸和其它非天然氨基酸。
分别利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)和芽孢杆菌报告系统进行正负筛选突变体MjYRS库中的活性合成酶变体。经过5轮的交替正负选择后,在存在或不存在O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的条件下筛选到96个表型不同的克隆。根据对CAT基因Asp112TAG密码子的抑制作用通过体内试验进一步鉴定了三个合成酶的特征。表达这三对MjYRS/mutRNACUA的大肠杆菌可在氯霉素存在下存活,在O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸存在或不存在时其IC50值分别为110mg/L或低于10mg/L。氯霉素耐药性的巨大差异提示在对琥珀密码子反应中选出的合成酶/tRNA对体内插入O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸的特异性明显高于所有20种天然氨基酸。
对编码这三种O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸-tRNA合成酶的核酸测序,并推测其氨基酸序列。这三个ONB Y合成酶克隆的完整氨基酸序列见表5,为SEQ ID NOs:52-54。测序结果见表3。
表3
合成酶种类 |
氨基酸位置(突变密码子) |
MjYRS |
32 |
65 |
108 |
109 |
158 |
162 |
野生型RS |
Tyr |
Leu |
Phe |
Gln |
Asp |
Leu |
ONBY RS-1 |
Gly(GGG) |
Gly(GGT) |
Ala(GCG) |
Arg(CGT) |
Glu(GAG) |
Tyr(TAT) |
ONBY RS-2 |
Ala(GCT) |
Gly(GGG) |
Cys(TGT) |
Asp(GAT) |
Ala(GCG) |
Gly(GGT) |
ONBY RS-3 |
Gly(GGG) |
Gly(GGT) |
Glu(GAG) |
Gln(CAG) |
Ser(TCG) |
Glu(GAG) |
可以想见,突变Tyr32→Gly32/Ala32和Asp158→Glu158、Ala158或Ser158可导致Tyr32、Asp158与天然底物酪氨酸之间的氢键丢失,因此不利于其结合。
为了测定这三种ONB-MjYRS的保真度和效率,在对C末端含6个组氨酸标记的突变抹香鲸精子肌红蛋白基因位置4的琥珀密码子的反应中掺入了O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸。为了表达重组蛋白,在合成酶/mutRNACUA对和O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(1mM)都存在的条件下,将质粒pBAD/JYAMB-4TAG(编码含阿拉伯糖启动子和rrnB终止子的突变抹香鲸精子肌红蛋白基因;lpp启动子和rrnC终止子上有酪氨酰tRNACUA;以及四环素抗性标记)和pBK载体(编码突变的合成酶和卡那霉素抗性基因)共转染到DH10B大肠杆菌内。在添加四环素925mg/mL)和卡那霉素(30mg/mL)的Luria-Bertani培养基(5mL)中扩增细胞,用磷酸盐缓冲液洗涤,然后接种到含合适抗生素、光囚禁酪氨酸(1mM)和阿拉伯糖(0.002%)的500mL液体甘油基础培养基(GMML;含0.3mM亮氨酸的甘油基础培养基)中。使细胞生长到饱和离心收获。
用Ni-NTA亲和层析获得纯化的突变肌红蛋白,产量约为2-3mg/L,用SDS-PAGE和Gelcode Blue染色判断其均一性>90%。此产量与用能抑制相同琥珀密码子的野生型MjYRS/mutRNACUA对所得到的肌红蛋白表达量相当。如果撤除非天然氨基酸或存在1mM的酪氨酸则检测不到肌红蛋白,说明所有三种合成酶对O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸都有很高的选择性(见图10)。
为了进一步确认位点特异性光囚禁蛋白的身份,在pONB-MjYRS-1、tRNACUA和O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸存在下表达Gly74为琥珀密码子(因其具有优良的质谱特性)的不同肌红蛋白突变体。在与4TAG突变体相同的条件下,在存在O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸(1mM)时利用合成酶pONB-1表达了肌红蛋白突变体74TAG,并用镍亲和柱纯化。通过SDS-PAGE凝胶的Gelcode Blue染色观察蛋白质条带,然后从聚丙烯酰胺凝胶上切下。将凝胶块剪成1.5mm方块,然后基本按照以前所述的方法(Shevchenko等,Anal.Chem.1996,68,850-858)进行胰蛋白酶水解。在配备NanosprayHPLC(Agilent 1100系列)的Finnigan LCQ Deca离子陷阱质谱仪(Thermo Finnigan)上通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析胰蛋白酶水解肽。与含非天然氨基酸(命名为J)的肽HGVTVLTALGJILK的单价和二价带电离子相对应的离子前体用离子陷阱质谱分离和破碎。LC-MS/MS分析表明74位为酪氨酸(胰蛋白酶水解肽HGVTVLTALGYILK)。此碎片离子的质量得以认定,表明74位上位点特异性地掺入了酪氨酸(3)(见图11A和11B)。检测到Tyr74很可能是因为MS分析时O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸中不稳定的二甲苯醚发生断裂。
为了确定上述掺入的被囚禁的氨基酸O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸,合成了其含氘的衍生物用于在相同条件下表达相同的肌红蛋白突变体。然后用胰蛋白酶水解该蛋白质,进行质谱分析。认定的碎片离子质量显示在肌红蛋白的74位为掺入的d2-酪氨酸,清楚地证明了非天然氨基酸2的掺入(见图12A和12B)。LC MS/MS分析未显示此位置有任何天然氨基酸掺入,进一步证明了所产生的合成酶的高保真度。
另外,含有O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸掺入的蛋白质的体内光化学活化可利用lacZ作为报告基因来证明。大肠杆菌β-半乳糖苷酶在503位上有一个必须的酪氨酸(Juers等,Biochemistry 2001,40,14781;Penner等,Biochem.Cell Biol.1999,77,229)。将其相应的密码子突变成琥珀终止密码子TAG以便于被囚禁的O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸掺入。监测酪氨酸脱囚禁前后的β-半乳糖苷酶。在体内照射后该β-半乳糖苷酶的活性恢复。
实施例10
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入非天然氨基酸p-氰基苯丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用古细菌合成酶和大肠杆菌宿主细胞翻译机制将p-氰基苯丙氨酸(见图1,也写作4-氰基苯丙氨酸)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
氰基是一种极佳的局部环境IR探针,因为在从疏水环境向亲水环境移动过程中其CN伸展振动(v2)以10个波数的数量级频繁转换(Getahun等,“利用腈衍生氨基酸作为局部环境的红外探针”(Using Nitrile-Derivatized Amino Acids as Infrared Probes ofLocal Environment),JACS 125,405-411[2003])。因此,对位(4-位)和间位(3-位)氰基苯丙氨酸可用于研究蛋白特性的分类,包括蛋白与蛋白结合,蛋白质的构象以及疏水折拢。
肽链中氰基苯丙氨酸的对位和间位形式可存在于极性和疏水环境中,它们对构象的影响可忽略不计。因此,两者可能和其所取代的蛋白质或肽中的野生型残基处于同一个环境中。另外,化合物的CN伸展振动(范围)窄,不会与其它任何蛋白吸收相重叠,在很大程度上与蛋白的其它振动脱离,并且对溶剂的极性相当敏感。基于这些理由,二者都是研究肽构象的极好工具。
芳香族腈可作为小肽局部环境的IR探针
Getahun及其同事(Getahun等,“利用腈衍生氨基酸作为局部环境的红外探针”,JACS 125,405-411[2003])已证明(见图13)对位氰基苯丙氨酸的氰伸展振动在水中比在THF中高10个波数。当突变14位残基为两性的肥大细胞脱颗粒肽(MPx),将对-氰基苯丙氨酸插入到其脂质结合区时,如果MPx结合于POPC脂双层上,那么氰伸展发生在2229.6cm-1。在水中,MPx PheCN突变的CN伸展振动发生在2235.7cm-1。总之,水合肽中的氰伸展与水中游离的对-氰基苯丙氨酸的氰伸展相似,而包埋肽中的PheCN氰伸展与THF中游离PheCN氰伸展类似(Tucker等,“一种测定膜结合肽的各侧链局部环境和方向的新方法”(A New Method for Determining the LocalEnvironment and Orientation of Individual Side Chains of Membrane-Binding Peptides),JACS 126 5078-5079[2004])。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA联用。此新型正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。所得到的正交tRNA合成酶能选择性地用p-氰基苯丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入p-氰基苯丙氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG反应中运送非天然氨基酸。
搜索能用p-氰基苯丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。此搜索所用的方法上面已有描述。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。选择得到了1个能用p-氰基苯丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这个合成酶克隆测序,确定了其氨基酸序列,如表5所示,为SEQ ID NOs:55和56。与野生型的合成酶序列相比,这个合成酶突变体具有下列取代:Tyr32Leu、Leu65Val、Phe108Trp、Gln109Met、Asp158Gly和Ile159Ala。
实施例11
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入非天然氨基酸m-氰基苯丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用古细菌合成酶和大肠杆菌宿主细胞翻译机制将m-氰基苯丙氨酸(见图1,也写作3-氰基苯丙氨酸)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
氰基是一种极佳的局部环境IR探针,因为在从疏水环境向亲水环境移动过程中其CN伸展振动(v2)以10个波数的数量级频繁转换(Getahun等,“利用腈衍生氨基酸作为局部环境的红外探针”,JACS 125,405-411[2003])。因此,对位(4-位)和间位(3-位)氰基苯丙氨酸可用于研究蛋白特性的分类,包括蛋白与蛋白结合,蛋白质的构象以及疏水折拢。
肽链中氰基苯丙氨酸的对位和间位形式可存在于极性和疏水环境中,它们对构象的影响可忽略不计。因此,两者可能和其所取代的蛋白或肽内的野生型残基处于同一个环境中。另外,化合物的CN伸展振动(范围)窄,不会与其它任何蛋白吸收相重叠,在很大程度上与蛋白的其它振动脱离,并且对溶剂的极性相当敏感。基于这些理由,二者都是研究肽构象的极好工具。
蛋白质中的芳香族腈
建立了直接产生的方法后,产生了一种新的甲烷球菌tRNATyrCUA-酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)对,在对琥珀TAG密码子的反应中该正交对可高保真度特异性地掺入间-氰基苯丙氨酸。此新型正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。所得到的正交tRNA合成酶能选择性地用m-氰基苯丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入m-氰基苯丙氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG反应中运送非天然氨基酸。
利用以前所述的方法构建能够用m-氰基苯丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。选择得到了1个能用m-氰基苯丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这个合成酶克隆测序,确定了其氨基酸序列(见表5,SEQ ID NOs:57和58)。与野生型的合成酶序列相比,这个合成酶突变体具有下列取代:Tyr32His、His70Ser、Asp158Ser、Ile159Ser和Leu162Pro。
我们试图在m-氰基苯丙氨酸和p-氰基苯丙氨酸都存在的条件下利用其各自的正交tRNA/合成酶对来抑制C末端为His6尾的Z区蛋白的Tyr7→TAG突变。在两种情况下,如果存在非天然氨基酸可产生全长蛋白,而在缺乏各自非天然氨基酸时,SDS-PAGE凝胶考马斯蓝染色未检测到任何产物。
另外,我们获得了在位置7上掺入有间位和对位氰基苯丙氨酸的蛋白质的IR光谱。扣除野生型Z区IR光谱背景后,我们所得到的光谱见图14A和14B所示。图14A显示在图13所示的两端之间对-氰基苯丙氨酸有单一吸收峰,提示7位残基位于该蛋白的表面,但不直接伸入溶液内。图14B显示间-氰基苯丙氨酸的光谱是两个正态分布的和,峰值在2236和2228cm-1处。该曲线的R2值大于0.99,曲线拟合极佳,图14B的数据提示m-氰基苯丙氨酸有两种构象。如2228cm-1处的峰所示看,一种构象是氰基位于该蛋白的疏水区内。2236cm-1处的峰提示另一种构象氰基位于水合环境内。
实施例12
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入非天然氨基酸p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用古细菌合成酶和大肠杆菌宿主细胞翻译机制将p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
采用生物物理探针、细胞毒制剂、交联剂和其它试剂进行蛋白质的位点特异性修饰已广泛用于分析蛋白质的结构和功能以及开发诊断、治疗试剂和高通量筛选。选择性修饰蛋白质的一种方法包括将N末端丝氨酸或苏氨酸氧化成相应的醛,然后与肼、烷氧胺或酰肼衍生物偶联。不幸的是,此方法有局限性,因为它只能用于修饰蛋白质的N末端位置。我们的方法是将2-氨基-1-羟乙基的关键性氨基醇功能基团置于靶蛋白的侧链上,从而克服只对蛋白质N末端进行选择性修饰的局限性,并且具有可控制蛋白质中氨基醇基团位置的优点。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA联用。此新型正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。所得到的正交tRNA合成酶能选择性地用p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸。这些tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG反应中运送非天然氨基酸。
搜索能用p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。此搜索所用的方法上面已有描述。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。选择得到了1个能用p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这个合成酶克隆测序,确定了其氨基酸序列(见表5,SEQ ID NOs:59)。与野生型甲烷球菌合成酶序列相比,这个合成酶突变体具有下列取代:
野生型甲烷球菌tRNA合成酶 |
Tyr 32 |
Leu 65 |
Phe 108 |
Gln 109 |
Asp 158 |
Leu 162 |
p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸特异性的突变合成酶(突变密码子) |
Asp(GAT) |
Glu(GAG) |
Arg(CGT) |
Gln(CAG) |
Gly(GGG) |
Asn(AAT) |
实施例13
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入非天然氨基酸p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用古细菌合成酶和大肠杆菌宿主细胞翻译机制将p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
制备半合成蛋白质的一种有用方法是天然的化学连接,其中两个完全未被保护的肽片段通过酰胺键在室温和温和的生理条件下连接在一起(Nilsson等,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.2005,34,91-118;Dawson等,Science 1994,266,776-779)。该方法经改良后称为表达蛋白连接,此发中通过重组方式制备一个或多个反应伙伴,用于合成含100个残基以上的蛋白质(Muir,Annu.Rev.Biochem 2003,72,249-289;David等,Eur.J.Biochem.2004,271,663-677)。实际上,这两种方法都需要C末端为α-硫酯,限制了这些方法用于肽片段C末端的修饰。如果将活性硫酯基团放置在细菌表达的肽/蛋白质的任意残基上,将显著扩展这些方法的应用范围,例如,可合成环状或分支结构,或者用生物物理探针、聚乙二醇或各种标记特异性修饰侧链。产生含硫酯侧链的蛋白质的方法可用于含硫酯侧链(蛋白质)所参加的后续体外及可能的体内化学连接反应(Camarero和Muir,J.Am.Chem.Soc.1999,121,5597-5598;Camarero等,Bioorg Med Chem.2001,9,2479-2484;Scott等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,96,13638-13643;Evans等,J.Biol.Chem.2000,275,9091-9094;Yeo等,Chem.Commun.2003,2870-2871)。
P-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的合成
p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸(结构1;也被称为4-(乙基硫代羰基)-L-苯丙氨酸)以商品化的α-溴-p-甲基苯甲酸(1a)和N-(二苯甲烯基)甘氨酸叔丁酯(1c)为起始材料分四步合成。这些步骤概述如下:
4-(溴代甲基)苯并硫代S-乙酯(S-ethyl 4-(bromomethyl)benzothioate)的合成(结构1b):在溶于THF(50ml)的1a溶液(2.15g,10.0mmol)中加入亚硫酰氯(2ml,28mmol),然后加入DMF(50μl),反应混合物在室温下搅拌5小时。在减压的情况下去除有机溶剂直到出现白色固体,再将其溶于THF(50ml)中,溶液冷却到0℃。以30分钟的时间滴加溶于THF(10ml)的乙硫醇(0.78ml,10.0mmol)和三乙胺(2ml,14mmol)溶液。反应混合物再搅拌4小时,去掉溶剂。加入水(100ml)和醚(200ml)。有机相用水(2×50mL)洗涤,用NaSO4干燥,在减压的情况下去除。粗产物通过硅胶(溶于乙烷中的80%的乙酸乙酯)上的快速层析纯化,得到1b(2.18g,78%),是一种无色油状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J=8.0Hz,2H),7.46(d,J=8.0Hz,2H),4.50(s,2H),3.07(q,J=7.6,15.2Hz,2H),1.35(t,J=9.2Hz,3H)。计算C10H11BrOS258.0/260.0的准确质量m/z,结果为(LC/MS)259.1/260.1。
2-(二苯基亚甲基氨基)-3-(4-乙基硫代羰基)苯基)丙酸叔丁酯(结构1d)的合成:将1b(0.455g,1.76mmol)、1c(0.47g,1.60mmol)、18-冠-6(0.42g,1.59mmol)和无水K2CO3(0.344g,2.50mmol)溶于无水CH3CN(10ml)中,在室温下搅拌24小时。在减压的情况下去除有机溶剂。加入水(100ml)和CH2Cl2(200ml)。有机相用水(2×50mL)洗涤,用NaSO4干燥,在减压的情况下去除。粗产物无需纯化直接用于下一步。计算C29H31NO3S 473.2的准确质量m/z,结果为(LC/MS)474.3。
(4-(乙基硫代羰基))苯丙氨酸(1)的合成:将上一步的1d(0.94g,2.0mmol)溶于三氟乙酸(8ml)和CH2Cl2(2ml)中,在室温下搅拌1小时。在减压的情况下完全去除有机溶剂以后,加入浓盐酸溶液(0.8ml)和MeOH(10ml),所得溶液在室温下搅拌1小时,然后去除所有溶剂,加入无水丙酮(10ml)。溶液过滤,回收的固体用无水MeOH(2ml)研磨成粉。过滤后,甲醇滤出液置于减压环境中得到白色固体1(>0.55g,95%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.85(d,J=8.0Hz,2H),7.44(d,J=8.0Hz,2H),4.21(t,J=6.4Hz,1H),3.06(q,J=14.8,17.2Hz,2H),3.00(s,2H),1.26(t,J=7.2Hz,3H)。计算C12H15NO3S 253.1的准确质量m/z,结果为(LC/MS)(LC/MS)254.2。
P-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸掺入的遗传程序
为了在大肠杆菌内遗传编码p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸,必须制备此氨基酸的特异性正交氨酰tRNA合成酶/tRNA对。根据甲烷球菌TyrRS-tRNA L-酪氨酸复合物的晶体结构(Kobayashi等,Nat.Struct.Biol.2003,10,425-432),随机突变了甲烷球菌TyrRS的酪氨酸结合位点中的六个残基(Tyr32,Leu65,Phe108,Gln109,Asp158和Leu162)。分别在p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸存在和不存在下对含109个TyrRS的突变体库进行3轮正筛选(根据对氯霉素乙酰转移酶中琥珀密码子的抑制)间以2轮负筛选(根据对芽孢杆菌RNA酶中三个琥珀密码子的抑制),得到了在氯霉素中存活依赖于p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的一些克隆。发现这些突变体中有一个在存在p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸时能支持细胞在120μg mL-1氯霉素环境中生长,而在p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸缺乏时只能支持细胞在10μg mL-1氯霉素环境中生长。
此克隆测序结果表明存在以下突变:Tyr32Ala、Leu65Phe、Phe108Trp、Gln109Ser、Asp158Ser和Leu162His(见表5,SEQ ID NO:60)。Tyr
32突变为Ala
32可能去除结合酪氨酸的酚酸羟基与Tyr
32之间的氢键。
野生型甲烷球菌-tRNA合成酶 |
Tyr 32 |
Leu 65 |
Phe 108 |
Gln 109 |
Asp 158 |
Leu 162 |
p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸特异性的突变合成酶(突变密码子) |
Ala(GCT) |
Phe(TTT) |
Trp(TGG) |
Ser(AGT) |
Ser(TCG) |
His(CAT) |
为了确认所观察到的表型是通过mutRNACUA-mutTyrRS对位点特异性地插入了p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸所引起的,将融合有C末端His6尾的Z区蛋白编码基因(Nilsson等,Protein Eng.1987,1,107-113)中第7位(Tyr)替换成琥珀密码子。在1mMp-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸存在或不存在下表达该蛋白并用Ni-NTA层析纯化。SDS-PAGE分析表明突变的Z区蛋白的表达完全依赖于p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的存在。该突变蛋白的表达量约为野生型Z区蛋白的10-30%(用含1%甘油、0.3mM亮氨酸、1mM的p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸以及合适抗生素的基础培养基培养约为8mg/L)。
通过基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析获得了p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸位点特异性掺入的其它证据。除了观察到完整的Tyr→p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸蛋白的实验平均质量为8006Da((M理论=8002Da,见图16)外,还检测到在乙酰化中不含第一甲硫氨酸残基的突变蛋白相对应的小峰(M实验=7913Da对M理论=7913Da)以及不含第一甲硫氨酸残基的突变蛋白相应的主要峰(M实 验=7871Da对M理论=7871Da)(图16)。存在的另外一个主峰7828Da对应于7位为游离羧酸基团而不是硫酯基序的Z区蛋白,计算其质子化形式的质量为7827Da。推测含羧酸和含硫酯的突变蛋白在质量检测条件下具有相同的离子化效率,它们相对应的质量峰面积的积分提示约有40%含硫酯的突变被水解。事实上,该突变合成酶在体内为水解形式不会掺入非天然氨基酸p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸,而p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸在体内和体外看来都是稳定的,提示硫酯水解成酸发生在其被硫酯特异性突变合成酶掺入到Z区蛋白之后。
为了确定gai突变蛋白的硫酯侧链是否能被选择性修饰,用20-60μg/ml含硫酯的粗提突变蛋白和10mM半胱氨酸乙酯进行了体外连接试验,其中半胱氨酸乙酯溶于pH为8.0含100mM二硫苏糖醇(DTT)和2M盐酸胍的磷酸盐缓冲液中。然后纯化所得到的修饰蛋白质用MALDI-TOF MS分析。测得的实验平均分子量分别为7956Da和7998Da,对应于用一个半胱氨酸分子修饰的含硫酯的蛋白质(M理论=7958Da对应于不含第一甲硫氨酸残基的蛋白质,M理论=8000Da对应于含第一甲硫氨酸残基的乙酰化形式的蛋白质)(图17)。用它们的质量峰面积积分定量估计标记效率超过85%。
如图16所示,主要表达的Z区蛋白不含第一甲硫氨酸残基。这种形式的未修饰含硫酯突变蛋白的分子量为7872,该分子量与乙酰化形式的含羧酸蛋白质的分子量重叠(M理论=7869Da)。因此,计算标记效率时,7867Da处的峰面积采用未修饰含硫酯蛋白的上限值,导致标记效率的估计值大于85%。
7825Da和7867Da(M理论=7827Da和7869Da)二峰表明存在7位含羧酸基团的Z区蛋白,该蛋白不与半胱氨酸乙酯反应。如预计的那样,野生型Z区蛋白未检测到标记产物,说明标记反应只发生在半胱氨酸分子和硫酯基团之间,而不会与野生型蛋白中存在的功能基团反应。另一方面,未观察到含硫酯突变蛋白中的硫酯基团和5个赖氨酸残基的ε-氨基参与了分子内侧链的环化或自身二聚化反应。因此这些数据证明硫酯手柄具有优良的选择性和反应性,可用于可靠和选择性地体外修饰蛋白质。
半胱氨酸乙酯和含硫酯Z区蛋白质之间的化学连接
37℃培养含有编码突变tRNA合成酶质粒和编码Z区蛋白基因(第7位为琥珀密码子,羧基端含His-6尾)表达载体pLEIZ的大肠杆菌DH10B细胞(60ml),在OD600=0.5时加入1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4小时。在沉淀的细胞团内加入1ml缓冲液(6M盐酸胍,100mM磷酸钠,200mM氯化钠,pH=8.0)。室温振荡该溶液1小时,超声破碎3分钟,离心去除所有细胞碎片。在澄清上清液中加入2ml磷酸盐缓冲液(100mM磷酸钠,200mM,氯化钠,0.01M半胱氨酸乙酯,pH=8.0)、150μl二硫苏糖醇溶液(2M)和60mg巯乙磺酸钠(MESNA)。室温振荡溶液混合物12小时。更换含修饰蛋白的溶液,浓缩至500μl缓冲液(8M尿素,100mM磷酸钠,10mM氨基丁三醇(Trizma),pH 8.0)。按照厂家提供的方法(Qiagen,Chatsworth,CA)用Ni2+亲和层析纯化修饰的蛋白质,用蒸馏水透析进行MALDI-TOF MS分析。
结论
总之,我们提供了一种甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶来源的新型正交合成酶。当与甲烷球菌抑制型tRNACUA联用时,这些试剂可在体内将非天然氨基酸p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸掺入到多肽链中。本研究阐明了一种利用细菌制备在确定位点上含有侧链硫酯手柄的蛋白质的生物合成方法。该方法可将各种配基高度选择性地有效地化学连接于与掺入到蛋白质中的p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸残基上的反应活性基团。
实施例14
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入二酮基非天然氨基酸p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将二酮基非天然氨基酸p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
对单用单酮基或β-二酮基功能基团与氨基丁烷能否形成亚胺以及所形成的亚胺在不同pH的磷酸盐缓冲液中是否稳定的比较研究证明,在pH 6.5-10.5的范围内,从β-二酮基更容易形成烯醇亚胺,其对pH 3.9酸性水解超级稳定。与此相比,在相同条件下,pH上升到10.5时,单酮基基本保持游离形式,未检测到亚胺形成。因此,合成了侧链含β-二酮基的非天然氨基酸并鉴定到能掺入此非天然氨基酸的正交tRNA-合成酶对。本发明提供了成功产生在体内能以高翻译效率和保真度将含有此二酮基的氨基酸特异性掺入到蛋白质内的突变合成酶。如下文所详细描述的那样,将生物素羟胺衍生物选择性偶联于此二酮基经遗传方法编码于Z区蛋白中,提示对正常生物化学来说反应性是正交的二酮基可作为高效化学手柄用于将各种外部特性带入到靶蛋白中。
以前曾证明,通过在大肠杆菌或酵母的翻译机制中加入新的组分,可在体外或体内用正交翻译组分将非标准氨基酸以高翻译保真度和效率位点特异性地掺入到蛋白质内。此法已用于将含酮基的氨基酸通过遗传方法掺入到蛋白质内,含酮基氨基酸可通过形成腙键和肟键偶联于具有各种生物和/或物理特性的非肽类分子(如聚乙二醇、生物素、糖类似物等)。虽然这些腙键和肟键在生理条件下是稳定的,但其缺点是需要同时存在常见20种氨基酸所没有的两种功能基团。如果一种是例如能够与赖氨酸的ε-氨基或α-氨基直接形成稳定的加合物的活性功能基团如硫酯或β-二酮基,那么就可以形成分子间或分子内蛋白交联。为此目的,我们最近报道了含二酮基的氨基酸2在大肠杆菌内的遗传编码。见图21。
要考虑到芳香二酮基2与脂肪族胺的交联产物可导致形成亚胺加合物3(图21),后者可异构成由六个分子间氢键稳定的相应的烯胺。这可导致形成在生理pH下稳定的加合物。为了用实验证实这一推理,我们开始测定一种简单模型系统的相对反应性,该系统包含氨基丁烷与用pH范围为6.5-10.5的100mM磷酸盐缓冲液配的芳香基一元酮1a和芳香基二酮2之间形成的一系列亚胺。用液相色谱和质谱(LC/MS)分析了各种加合物(1b和3a-3d)。见表4。该表描述了氨基丁烷(10mM)与用不同pH的PBS缓冲液(100mM K(PO4)i,500mM NaCl)配的芳香基一元酮1(1mM)或2(1mM)之间形成的亚胺的结果,反应在室温下进行一周。
表4
|
在不同pH下转化成其各自的亚胺加合物的百分率 | |
底物 |
pH 6.5 |
pH 7.4 |
pH 8.4 |
pH 9.5 |
pH 10.5 |
75%MeOH溶于H2O** |
1 |
0% |
0% |
0% |
0% |
0% |
>90% |
2 |
30% |
50% |
50% |
57% |
75% |
>90% |
**室温,反应时间为12小时
该分析表明,在pH上升到10.5时,1a基本保持游离形式,未检测剑1b的形成。相反,在pH为7.4时,50%的2已转变为3,在pH 10.5时,此百分率升高到令人惊叹的75%。
考虑到以前所观察到的在水溶液中酮型2b和烯醇-亚胺型3b占优势,超过其它相应的互变异构体(Iglesias,Curr.Org.Chem.2004,8,1-24;Patteux等,Org.Lett.2003,5,3061-3063;Aly,Tetrahedron 2003,50,1739-1747;Lopez等,Tetrahedron:Asymmetry 1998,9,3741-3744;Mazzone等,S.Eur.J.Med.Chem.1986,21,277-284;以及Kim和Ryu,Bull.Korean.Chem.Soc.1992,13,184-187),因而证实与1a相比,氢键导致稳定性缺失显著地促进了3的产生(主要是3b)。
为了进一步确证稳定的分子间氢键可赋予3对水解的稳定性高于单纯的亚胺1b,还在pH 1.9-9.4范围内对1b和3进行了LC/MS分析。如图1所示,3(假设是3b)在生理pH 7.4或以上基本保持完整。在pH降到3.9时,室温4天后,只有约40%的3转变为2。用更酸性的条件处理3可导致氨基完全丢失(uninstallation)(图18)。与此形成鲜明对比但如预料到的那样,1b甚至在pH 10.5下搅拌过夜也很容易被水解(数据未显示)。
非天然氨基酸的合成
受这些发现的鼓舞,我们希望建立衍生侧链含有β-二酮基的非天然氨基酸p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸的化学方法。我们的合成策略(见图19)从易于获得的p-乙酰-(±)-L-苯丙氨酸开始,用Boc化学物和酯化分别保护骨架氨基和羧酸基团。在含有叔-丁氧钾的混合溶剂(2∶3[v/v]醋酸甲酯∶THF)反应条件下进行第二个羰基的加入。用TFA去除Boc基团,然后碱水解,得到所需的p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸,总产率为40%。
正交翻译组分的鉴定
用已建立的方法构建新型正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对,用于在体内将p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸掺入到蛋白质中。根据甲烷球菌TyrRS-tRNA(Tyr)L-酪氨酸复合物的晶体结构(Kobayashi等,Nat.Struct.Biol.2003,10,425-432),随机突变甲烷球菌TyrRS酪氨酸结合位点周围的六个残基(Tyr32,Leu65,Phe108,Gln109,Asp158和Leu162)。按照我们已报道的方法,将产生的约含109个突变体的库依次经过3轮正选择和2轮负选择,得到了在氯霉素中存活依赖于p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸存在的许多克隆。根据对CAT基因中Asp112TAG密码子的抑制,用体内试验鉴定到两个TyrRS突变体。这两个突变体在p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸存在时能支持细胞在120μg mL-1的氯霉素中生长,在没有p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸时能支持细胞在10μg mL-1的氯霉素中生长。此结果提示所产生的这两个合成酶对p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸的活性比对其它天然氨基酸更高。这些突变体的DNA测序结果表明他们具有相同的序列(见表5,SEQ ID NO:61)。
将Tyr
32和Asp
158突变成Gly打断了结合酪氨酸的酚羟基与Tyr
32和Asp
158之间的氢键。Leu
65转变成Val
65可能能够提供更大的空间来容纳β-二酮基的延展骨架。因此,Phe108Thr和Leu162Ser突变以及保守的Gln
109可能表明他们参与了β-二酮基中的羰基氧的氢键结合。这些合成酶克隆的序列总结如下。
野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶 | Tyr 32 | Leu 65 | Phe 108 | Gln 109 | Asp 158 | Leu 162 |
p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸特异性的突变合成酶(突变密码子) |
Gly(GGT) |
Val(GTT) |
Thr(ACT) |
Gln(CAG) |
Gly(GGG) |
Ser(AGT) |
为了确认所观察到的表型是由于mutRNACUA Tyr-mutTyrRS对位点特异性地插入了p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸所致,在融合有C末端His6尾的Z区蛋白的编码基因(Nilsson等,Protein Eng.1987,1,107-113)第7位导入琥珀密码子以替换酪氨酸的密码子。在1mM p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸存在或不存在下表达蛋白用Ni-NTA层析纯化。SDS-PAGE分析表明有非天然氨基酸依赖的蛋白质的表达(图20)。加载到凝胶上的突变蛋白体积是野生型(WT)蛋白的三倍,其中野生型蛋白用酪氨酸残基取代了含二酮基的非天然氨基酸,结果表明与酪氨酸相比,p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸的掺入率约为30%。
p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸确实被掺入的更令人信服的证据获自于基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。除了观察到完整蛋白的实验平均分子量为7991Da(M理论=7997Da)之外,还检测到一个对应于不含第一甲硫氨酸残基的蛋白主峰(M实验=7867Da,M理论=7866Da)。信-噪比>400,提示要用所产生的mutRNACUA Tyr-mutTyrRS对掺入p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸的保真度高于99%。
用生物素羟胺衍生物(MW=331.39,购自Molecular Probes)体外标记表达的含二酮基蛋白质检验了能够用二酮基作为化学手柄对蛋白质进行位点特异性修饰以添加外部特性。在25℃用溶于pH 4.0磷酸盐缓冲液的2mM生物素羟胺处理纯化的突变Z区蛋白和野生型Z区蛋白12小时。用水透析去除剩余的生物素羟胺后用MALDI-TOF MS分析此二种蛋白。获得的实验平均分子量分别为8315Da(M理论=8310Da,生物素标记的完整突变蛋白),8182Da(M理论=8179Da,生物素标记的不含第一甲硫氨酸的突变蛋白)和8225Da(M理论=8221Da,生物素标记的不含第一甲硫氨酸的乙酰化形式的突变蛋白),证实生物素羟胺与突变Z区蛋白反应的摩尔比为1∶1。如预期的那样,未检测到野生型Z区蛋白的标记产物,说明标记反应只发生在羟胺与二酮基之间,羟胺不与野生型蛋白中的任何功能基团反应。考虑到在质谱中未观察到含二酮基的未标记突变蛋白,这些数据证明了利用二酮基手柄体外选择性修饰蛋白质有极佳的特异性和高反应活性。
本实施例证明用产生的高特异性正交翻译系统可在体内将β-二酮基手柄位点特异性地掺入到蛋白质内,其高保真度和效率与其天然系统相当。鉴于在较宽pH范围内3高度稳定并且易于制备,那么很可能通过在β-二酮基与赖氨酸残基的氨基之间形成希夫碱来改进蛋白-蛋白相互作用,尤其是当p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸位于合适的疏水环境中时。
实施例15
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入非天然氨基酸p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。发现此非天然氨基酸在掺入到蛋白质内时可作为翻译后修饰的靶标,此非天然氨基酸有更多的优点,因为该非天然氨基酸上的化学活性基因对细胞酶的水解活性具有抗性。
新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA联用。此新型正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。该得到的正交tRNA合成酶能选择性地用p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸。该tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对琥珀无义密码子TAG的反应中掺入非天然氨基酸。
搜索能用p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。此搜索所用的方法上面已有描述。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。经选择得到了1个能用p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这个合成酶克隆测序,确定其氨基酸序列(见表5,SEQ ID NO:62)。此合成酶突变体相对于野生型甲烷球菌合成酶序列显示有以下列取代:
野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶 | Tyr 32 | Leu 65 | Phe 108 | Gln 109 | Asp 158 | Leu 162 |
p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸特异性的突变合成酶(突变密码子) |
Gly(GGG) |
Cys(TGT) |
Cys(TGT) |
Met(ATG) |
Gly(GGT) |
Tyr(TAT) |
实施例16
用于在大肠杆菌体内蛋白质中掺入含香豆素的荧光非天然氨基酸的正交翻译组分
本实施例描述了利用大肠杆菌宿主细胞翻译机制将7-氨基-香豆素丙氨酸和7-羟基-香豆素丙氨酸(见图1)通过生物合成掺入到蛋白质内所用的组合物和方法。从甲烷球菌中分离得到新型正交合成酶/tRNA对,用于掺入此非天然氨基酸,该正交对在大肠杆菌宿主细胞系统内具有功能。
荧光是分子生物学中最敏感、最有用的一种技术。绿色荧光蛋白(GFP)的发现导致了细胞生物学的显著革新,使我们可直接观察活细胞中蛋白质的表达、定位、动力学和相互作用(Lippincott-Schwartz等,Nat.Rev.Mol.Cell Bio.(2001)2:444-456)。但是,由于GFP的大小使蛋白质相互作用和动力学不能精确到原子分辨水平。GFP还需要许多转录物来获得合适的信号,其折叠和荧光团的成熟也需要滞后时间。
与掺入完整荧光蛋白分子不同,掺入荧光氨基酸可以克服GFP荧光系统的某些局限性。位点特异性地掺入荧光氨基酸对宿主蛋白的干扰很小,因而可更精确地测定荧光共振能量转移(FRET)(Truong和Ikura,Curr.Opin.Struct.Bio.2001,11:573-578)。另外,采用荧光氨基酸可探测每个氨基酸所处的局部环境,通过改变荧光氨基酸在蛋白中的位置可以使我们精确地找到介导与其它细胞组分相互作用的残基。这对于研究蛋白的体外折叠也很有用(Lakowicz,J.R.,《荧光光谱学原理》(Principles of Fluorescence Spectroscopy),第2版;Kluwer Academic/Plenum Publishers:New York,1999),特别是在单分子系统中(Lipman等,Science 2003,301:1233-1235),因为一个蛋白分子通常含有多个色氨酸残基,用荧光探针特异性地化学标记蛋白质是十分困难的。
已化学合成了图1所示的香豆素丙氨酸。新型正交合成酶来源于甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶,与上述甲烷球菌抑制型酪氨酰tRNACUA联用掺入这些香豆素氨基酸。此新型正交对对任何常见氨基酸(即天然氨基酸)无亲和力或亲和力极低。该得到的正交tRNA合成酶能选择性地用7-氨基-香豆素丙氨酸和7-羟基-香豆素丙氨酸加载琥珀抑制型酪氨酰-tRNACUA。氨酰化的抑制型tRNA(即“负载的”tRNA)在转录时对TAG琥珀终止密码子(一种选择性密码子)的反应中可作为大肠杆菌内源性翻译装置的底物掺入7-氨基-香豆素丙氨酸和7-羟基-香豆素丙氨酸。该tRNA/合成酶对的正交性能可确保tRNA和合成酶都不会与大肠杆菌内源性tRNA或合成酶发生交叉反应,而只在对TAG的反应中掺入该非天然氨基酸。
搜索能用7-氨基-香豆素丙氨酸和7-羟基-香豆素丙氨酸特异性加载正交tRNA的正交合成酶。此搜索所用的方法上面已有描述。通过诱变野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶制备了甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶突变体库,根据其它氨酰tRNA合成酶分子的晶体结构诱变包含随机预测活性位点上的残基。该库含有约109种多样性。
诱变后,对突变体合成酶库进行多轮正负筛选。经选择得到了1个能用7-氨基-香豆素丙氨酸或7-羟基-香豆素丙氨酸加载O-tRNA的合成酶克隆。对这个合成酶克隆测序,确定其氨基酸序列(见表5,SEQ ID NO:63)。此合成酶突变体相对于野生型甲烷球菌酪氨酰tRNA合成酶序列显示有以下列取代:Y32R、L65A、H70M、D158N和L162T。
所获得的其它数据证明在包含分离的合成酶的正交翻译系统中香豆素丙氨酸氨基酸在对选择密码子的反应中已选择性地掺入到蛋白质中。这些数据包括(a)表达研究显示位置4为TAG选择密码子的肌红蛋白基因只有在该非天然氨基酸存在时才表达;(b)通过SDS-PAGE凝胶分析发现只有在该非天然氨基酸存在时合成的突变肌红蛋白才呈现荧光条带;以及(c)已结晶了该分离的突变合成酶,结果发现在该非天然氨基酸存在时此突变合成酶的共晶体结构具有荧光。
实施例17
用于掺入非天然氨基酸的O-RS和O-tRNA种类
各种O-tRNA都可用于本发明,本发明不限于使用任何特定的O-tRNA。例如,包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2核苷酸序列的O-tRNA都可用于本发明。如本文所述的,可构建其它种类的O-tRNA用于本发明。
类似地,本发明还提供了掺入非天然氨基酸方法中所用的O-RS(见表5),如选自以下的非天然氨基酸:p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸、1,5-丹酰基-丙氨酸、7-氨基-香豆素丙氨酸、7-羟基-香豆素丙氨酸、o-硝基苄基-丝氨酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、p-羧甲基-L-苯丙氨酸、p-氰-L-苯丙氨酸、m-氰-L-苯丙氨酸、、3-氨基-L-酪氨酸、联吡啶基丙氨酸、联吡啶基丙氨酸、p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨、3-硝基-L-酪氨酸和p-硝基-L-苯丙氨酸。本发明的O-RS多肽包括含有表5所列的氨基酸序列SEQ ID NOS:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57以及59-63的那些多肽。
本发明还提供编码O-RS或其片段的多聚核苷酸的例子。例如,编码本发明的O-RS分子的多聚核苷酸包括SEQ ID NOS:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、57、51、56、58。但是,这并不意味着本发明的多聚核苷酸仅限于表5所提供的那些。事实上,能编码本发明的O-RS氨基酸序列,如SEQ ID NOS:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57以及59-63的任何多聚核苷酸也是本发明的特征。
应理解,本文所述的实施例和实施方式只是为了说明的目的,本领域技术人员可以根据本文的构思作出各种修改和改变,这些也包括在本申请的构思和范围内以及附属权利要求的范围之内。
虽然为了阐明和理解的目的已经详细描述了本发明,但本领域的技术人员通过阅读本说明书应当知道,在不脱离本发明的真实范围下,可以在形式和细节上作出各种修改。例如,上面所述的所有技术和装置都可以不同组合来使用。本申请书所引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其它文献都已完整纳入本文作为参考,如同各个出版物、专利、专利申请和/或其它文献各自明确独立地纳入本文作为参考。
实施例18
核苷酸和氨基酸序列
本实施例分别提供了各种多聚核苷酸和多肽的核苷酸序列和氨基酸序列。下表5所提供的序列只是作为例子,并不意味着以任何方式将本发明限于表5所提供的序列。
表5
核苷酸和氨基酸序列
SEQ IDNO: |
描述 |
序列 |
1 |
詹氏甲烷球菌-抑制基因酪氨酰-tRNACUAmutRNACUA Tyr | CCGGCGGUAGUUCAGCAGGGCAGAACGGCGGACUCUAAAUCCGCAUGGCGCUGGUUCAAAUCCGGCCCGCCGGACCA |
2 |
大肠杆菌抑制基因tRNALeu5 CUA |
GCCCGGAUGGUGGAAUCGGUAGACACAAGGGAUUCUAAAUCCCUCGGCGUUCGCGCUGUGCGGGUUCAAGUCCCGCUCCGGGUACCA |
3 | 野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶(MjtyrRS)的氨基酸序列 |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAYIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNDIHYLGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
4 | 野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶(MjTyrRS)的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTTACATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATATTGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAATTCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGATATTCATTATTTAGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTA |
5 | 野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(EcLeuRS)的氨基酸序列 |
MQEQYRPEEIESKVQLHWDEKRTFEVTEDESKEKYYCLSMLPYPSGRLHMGHVRNYTIGDVIARYQRMLGKNVLQPIGWDAFGLPAEGAAVKNNTAPAPWTYDNIAYMKNQLKMLGFGYDWSRELATCTPEYYRWEQKFFTELYKKGLVYKKTSAVNWCPNDQTVLANEQVIDGCCWRCDTKVERKEIPQWFIKITAYADELLNDLDKLDHWPDTVKTMQRNWIGRSEGVEITFNVNDYDNTLTVYTTRPDTFMGCTYLAVAAGHPLAQKAAENNPELAAFIDECRNTKVAEAEMATMEKKGVDTGFKAVHPLTGEEIPVWAANFVLMEYGTGAVMAVPGHDQRDYEFASKYGLNIKPVILAADGSEPDLSQQALTEKGVLFNSGEFNGLDHEAAFNAIADKLTAMGVGERKVNYRLRDWGVSRQRYWGAPIPMVTLEDGTVMPTPDDQLPVILPEDVVMDGITSPIKADPEWAKTTVNGMPALRETDTFDTFMESSWYYARYTCPQYKEGMLDSEAANYWLPVDIYIGGIEHAIMHLLYFRFFHKLMRDAGMVNSDEPAKQLLCQGMVLADAFYYVGENGERNWVSPVDAIVERDEKGRIVKAKDAAGHELVYTGMSKMSKSKNNGIDPQVMVERYGADTVRLFMMFASPADMTLEWQESGVEGANRFLKRVWKLVYEHTAKGDVAALNVDALTENQKALRRDVHKTIAKVTDDIGRRQTFNTAIAAIMELMNKLAKAPTDGEQDRALMQEALLAVVRMLNPFTPHICFTLWQELKGEGDIDNAPWPVADEKAMVEDSTLVVVQVNGKVRAKITVPVDATEEQVRERAGQEHLVAKYLDGVTVRKVIYVPGKLLNLVVG |
6 | 野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(EcLeuRS)的核苷酸序列 |
ATGCAAGAGCAATACCGCCCGGAAGAGATAGAATCCAAAGTACAGCTTCATTGGGATGAGAAGCGCACATTTGAAGTAACCGAAGACGAGAGCAAAGAGAAGTATTACTGCCTGTCTATGCTTCCCTATCCTTCTGGTCGACTACACATGGGCCACGTACGTAACTACACCATCGGTGACGTGATCGCCCGCTACCAGCATATGCTGGGCAAAAACGTCCTGCAGCCGATCGGCTGGGACGCGTTTGGTCTGCCTGCGGAAGGCGCGGCGGTGAAAAACAACACCGCTCCGGCACCGTGGACGTACGACAACATCGCGTATATGAAAAACCAGCTCAAAATGCTGGGCTTTGGTTATGACTGGAGCCGCGAGCTGGCAACCTGTACGCCGGAATACTACCGTTGGGAACAGAAATTCTTCACCGAGCTGTATAAAAAAGGCCTGGTATATAAGAAGACTTCTGCGGTCAACTGGTGCCCGAACGACCAGACCGTACTGGCGAACGAACAAGTTATCGACGGCTGCTGCTGGCGCTGCGATACCAAAGTTGAACGTAAAGAGATCCCGCAGTGGTTTATCAAAATCAATGCTTACGCTGACGAGCTGCTCAACGATCTGGATAAACTGGATCACTGGCCAGACACCGTTAAAACCATGCAGCGTAACTGGATCGGTCGTTCCGAAGGCGTGGAGATCACCTTCAACGTTAACGACTATGACAACACGCTGACCGTTTACACTACCCGCCCGGACACCTTTATGGGTTGTACCTACCTGGCGGTACGTGCGGGTCATCCGCTGGCGCAGAAAGCGGCGGAAAATAATCCTGAACTGGCGGCCTTTATTGACGAATGCCGTAACACCAAAGTTGCCGAAGCTGAAATGGCGACGATGGAGAAAAAAGGCGTCGATACTGGCTTTAAAGCGGTTCACCCATTAACGGGCGAAGAAATTCCCGTTTGGGCAGCAAACTTCGTATTGATGGAGTACGGCACGGGCGCAGTTATGGCGGTACCGGGGCACGACCAGCGCGACTACGAGTTTGCCTCTAAATACGGCCTGAACATCAAACCGGTTATCCTGGCAGCTGACGGCTCTGAGCCAGATCTTTCTCAGCAAGCCCTGACTGAAAAAGGCGTGCTGTTCAACTCTGGCGAGTTCAACGGTCTTGACCATGAAGCGGCCTTCAACGCCATCGCCGATAAACTGACTGCGATGGGCGTTGGCGAGCGTAAAGTGAACTACCGCCTGCGCGACTGGGGTGTTTCCCGTCAGCGTTACTGGGGCGCGCCGATTCCGATGGTGACGCTGGAAGACGGTACCGTAATGCCGACCCCGGACGACCAGCTGCCGGTGATCCTGCCGGAAGATGTGGTAATGGACGGCATTACCAGCCCGATTAAAGCAGATCCGGAGTGGGCGAAAACTACCGTTAACGGTATGCCAGCACTGCGTGAAACCGACACTTTCGACACCTTTATGGAGTCCTCCTGGTACTATGCGCGCTACACTTGCCCGCAGTACAAAGAAGGTATGCTGGATTCCGAAGCGGCTAACTACTGGCTGCCGGTGGATATCTACATTGGTGGTATTGAACACGCCATTATGCACCTGCTCTACTTCCGCTTCTTCCACAAACTGATGCGTGATGCAGGCATGGTGAACTCTGACGAACCAGCGAAACAGTTGCTGTGTCAGGGTATGGTGCTGGCAGATGCCTTCTACTATGTTGGCGAAAACGGCGAACGTAACTGGGTTTCCCCGGTTGATGCTATCGTTGAACGTGACGAGAAAGGCCGTATCGTGAAAGCGAAAGATGCGGCAGGCCATGAACTGGTTTATACCGGCATGAGCAAAATGTCCAAGTCGAAGAACAACGGTATCGACCCGCAGGTGATGGTTGAACGTTACGGCGCGGACACCGTTCGTCTGTTTATGATGTTTGCTTCTCCGGCTGATATGACTCTCGAATGGCAGGAATCCGGTGTGGAAGGGGCTAACCGCTTCCTGAAACGTGTCTGGAAACTGGTTTACGAGCACACAGCAAAAGGTGATGTTGCGGCACTGAACGTTGATGCGCTGACTGAAAATCAGAAAGCGCTGCGTCGCGATGTGCATAAAACGATCGCTAAAGTGACCGATGATATCGGCCGTCGTCAGACCTTCAACACCGCAATTGCGGCGATTATGGAGCTGATGAACAAACTGGCGAAAGCACCAACCGATGGCGAGCAGGACCGCGCTCTGATGCAGGAAGCACTGCTGGCCGTTGTCCGTATGCTTAACCCGTTCACCCCGCACATCTGCTTCACGCTGTGGCAGGAACTGAAAGGCGAAGGCGATATCGACAACGCGCCGTGGCCGGTTGCTGACGAAAAAGCGATGGTGGAAGACTCCACGCTGGTCGTGGTGCAGGTTAACGGTAAAGTCCGTGCCAAAATCACCGTTCCGGTGGACGCAACGGAAGAACAGGTTCGCGAACGTGCTGGCCAGGAACATCTGGTAGCAAAATATCTTGATGGCGTTACTGTACGTAAAGTGATTTACGTACCAGGTAAACTCCTCAATCTGGTCGTTGGCTAA |
7 |
3-硝基-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶分离物-A、B、C、E和G的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),各自具有以下氨基酸变化:A67V,H70V | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAYIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLVDLVAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNDIHYLGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
8 |
3-硝基-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶分离物-D的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下氨基酸变化:Y32S,A67T,H70N,A167T | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSASIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLTDLNAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNDIHYLGVDVTVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
9 |
3-硝基-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶分离物-F的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下氨基酸变化: |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAYIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLPDLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNDIHYLGVDVGVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
|
Y32A,A67P,A167G | |
10 |
p-硝基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下氨基酸变化:Tyr32Leu,Glu107Ser,Asp158Pro,Ile159Leu,His160Asn,Leu162Glu | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLNYEGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
11 | p-硝基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCTGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATATTGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTTCGTTCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATCCTCTTAATTATGAGGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
12 |
3-氨基-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAQIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIELADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEGLLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNSIHYTGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
13 | 3-氨基-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCAGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGAGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAAGGTTTGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATTCTATTCATTATACTGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
14 |
p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#1的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIISLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSERNLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNSIHYHGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
15 | p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#1的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTGCGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATATCGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAACGTAATCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATTCTATTCATTATCATGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCA |
| |
ATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
16 |
p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#2的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSASIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIALADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSENYLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGIHYKGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
17 | p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#2的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTTCTATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGCTTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAAAATTATCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGTATTCATTATAAGGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
18 |
p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#3的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
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19 | p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#3的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTTCGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGCGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAACGTCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGTATTCATTATAAGGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
20 |
p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#4的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
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21 | p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#4的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTTCGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGCGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAAGCGCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGTATTCATTATAAGGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
22 |
p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#5的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
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23 | p-羧甲基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#5的核苷酸序列 |
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24 |
联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#1的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
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25 | 联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#1的核苷酸序列 |
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26 |
联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#2的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
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27 | 联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#2的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCTGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAACTTTGGCTGATTTATCTGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAATTCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGGGTGTTAATGTTATTCATTATCATGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
28 |
联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#3的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
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29 | 联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#3的核苷酸序列 |
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30 |
联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#4的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAHIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIVLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSESKLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGIHYLGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
31 | 联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#4的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCATATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGTTTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAATCGAAGCTTGATAAGGATTATACACTGA ATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGTATTCATTATCTTGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAG ATTATAA |
32 |
联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#5的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIVLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEADLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNSIHYRGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
33 | 联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#5的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTGGGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGTTTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCA ATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAAGCGGATCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATTCGATTCATTATCGTGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATTAA |
34 |
联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#6的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
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35 | 联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#6的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCATATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAA ATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGTTTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAAAGGCCTCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGTATTCATTATCTGGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTAATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
36 |
联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#7的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAHIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIHLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEWMLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGIHYKGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
37 | 联苯基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#7的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCATATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATACATTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAATGGATGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGGATTCATTATAAGGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
38 |
联吡啶基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#1的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAEIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIHLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEWMLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGHHYHGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
39 | 联吡啶基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#1的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTGAGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATACATTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGA ATGGATGCTTGATAAGG ATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGTCATCATTATCATGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
40 |
联吡啶基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#2的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIYLADLAAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMEVNGWHYSGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
41 | 联吡啶基丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆#2的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTGGTATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAA ATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATATATTTGGCTGATTTAGCTGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAATTCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTAATCCAATAATGGAGGTTAATGGTTGGCATTATAGTGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
42 | 1,5-丹酰丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆B8的氨基酸序列(衍生自野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶) |
MEEQYRPEEIESKVQLHWDEKRTFEVTEDESKEKYYCLSANPYPSGRLHMGHVRNYTIGDVIARYQRMLGKNVLQPIGWDAFGLPAEGAAVKNNTAPAPWTYDNIAYMKNQLKMLGFGYDWSRELATCTPEYYRWEQKFFTELYKKGLVYKKTSAVNWCPNDQTVLANEQVIDGCCWRCDTKVERKEIPQWFIKITAYADELLNDLDKLDHWPDTVKTMQRNWIGRSEGVEITFNVNDYDNTLTVYTTRPDTFMGCTYLAVAAGHPLAQKAAENNPELAAFIDECRNTKVAEAEMATMEKKGVDTGFKAVHPLTGEEIPVWAANFVLMEYGTGAVMAVPGHDQRDYEFASKYGLNIKPVILAADGSEPDLSQQALTEKGVLFNSGEFNGLDHEAAFNAIADKLTAMGVGERKVNYRLRDWGVSRQRYWGAPIPMVTLEDGTVMPTPDDQLPVILPEDVVMDGITSPIKADPEWAKTTVNGMPALRETDTFDTFMESCWIYARYTCPQYKEGMLDSEAANYWLPVDIGIGGIEHAIMTLLYFRFFHKLMRDAGMVNSDEPAKQLLCQGMVLADAFYYVGENGERNWVSPVDAIVERDEKGRIVKAKDAAGHELVYTGMSKMSKSKNNGIDPQVMVERYGADTVRLFMMFASPADMTLEWQESGVEGANRFLKRVWKLVYEHTAKGDVAALNVDALTENQKALRRDVHKTIAKVTDDIGRRQTFNTAIAAIMELMNKLAKAPTDGEQDRALMQEALLAVVRMLNPFTPHICFTLWQELKGEGDIDNAPWPVADEKAMVEDSTLVVVQVNGKVRAKITVPVDATEEQVRERAGQEHLVAKYLDGVTVRKVIYVPGKLLNLVVG |
43 | 1,5-丹酰丙氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆B8的核苷酸序列 |
ATGGAAGAGCAATACCGCCCGGAAGAGATAGAATCCAAAGTACAGCTTCATTGGGATGAGAAGCGCACATTTGAAGTAACCGAAGACGAGAGCAAAGAGAAGTATTACTGCCTGTCTGCTAATCCCTATCCTTCTGGTCGACTACACATGGGCCACGTACGTAACTACACCATCGGTGACGTGATCGCCCGCTACCAGCGTATGCTGGGCAAAAACGTCCTGCAGCCGATCGGCTGGGACGCGTTTGGTCTGCCTGCGGAAGGCGCGGCGGTGAAAAACAACACCGCTCCGGCACCGTGGACGTACGACAACATCGCGTATATGAAAAACCAGCTCAAAATGCTGGGCTTTGGTTATGACTGGAGCCGCGAGCTGGCAACCTGTACGCCGGAATACTACCGTTGGGAACAGAAATTCTTCACCGAGCTGTATAAAAAAGGCCTGGTATATAAGAAGACTTCTGCGGTCAACTGGTGTCCGAACGACCAGACCGTACTGGCGAACGAACAAGTTATCGACGGCTGCTGCTGGCGCTGCGATACCAAAGTTGAACGTAAAGAGATCCCGCAGTGGTTTATCAAAATCACTGCTTACGCTGACGAGCTGCTCAACGATCTGGATAAACTGGATCACTGGCCAGACACCGTTAAAACCATGCAGCGTAACTGGATCGGTCGTTCCGAAGGCGTGGAGATCACCTTCAACGTTAACGACTATGACAACACGCTGACCGTTTACACTACCCGCCCGGACACCTTTATGGGTTGTACCTACCTGGCGGTAGCTGCGGGTCATCCGCTGGCGCAGAAAGCGGCGGAAAATAATCCTGAACTGGCGGCCTTTATTGACGAATGCCGTAACACCAAAGTTGCCGAAGCTGAAATGGCGACGATGGAGAAAAAAGGCGTCGATACTGGCTTTAAAGCGGTTCACCCATTAACGGGCGAAGAAATTCCCGTTTGGGCAGCAAACTTCGTATTGATGGAGTACGGCACGGGCGCAGTTATGGCGGTACCGGGGCACGACCAGCGCGACTACGAGTTTGCCTCTAAATACGGCCTGAACATCAAACCGGTTATCCTGGCAGCTGACGGCTCTGAGCCAGATCTTTCTCAGCAAGCCCTGACTGAAAAAGGCGTGCTGTTCAACTCTGGCGAGTTCAACGGTCTTGACCATGAAGCGGCCTTCAACGCCATCGCCGATAAACTGACTGCGATGGGCGTTGGCGAGCGTAAAGTGAACTACCGCCTGCGCGACTGGGGTGTTTCCCGTCAGCGTTACTGGGGCGCGCCGATTCCGATGGTGACTCTAGAAGACGGTACCGTAATGCCGACCCCGGACGACCAGCTGCCGGTGATCCTGCCGGAAGATGTGGTAATGGACGGCATTACCAGCCCGATTAAAGCAGATCCGGAGTGGGCGAAAACTACCGTTAACGGTATGCCAGCACTGCGTGAAACCGACACTTTCGACACCTTTATGGAGTCCTGCTGGATTTATGCGCGCTACACTTGCCCGCAGTACAAAGAAGGTATGCTGGATTCCGAAGCGGCTAACTACTGGCTGCCGGTGGATATCGGTATTGGTGGTATTGAACACGCCATTATGACGCTGCTCTACTTCCGCTTCTTCCACAAACTGATGCGTGATGCAGGCATGGTGAACTCTGACGAACCAGCGAAACAGTTGCTGTGTCAGGGTATGGTGCTGGCAGATGCCTTCTACTATGTTGGCGAAAACGGCGAACGTAACTGGGTTTCCCCGGTTGATGCTATCGTTGAACGTGACGAGAAAGGCCGTATCGTGAAAGCGAAAGATGCGGCAGGCCATGAACTGGT |
| |
TTATACCGGCATGAGCAAAATGTCCAAGTCGAAGAACAACGGTATCGACCCGCAGGTGATGGTTGAACGTTACGGCGCGGACACCGTTCGTCTGTTTATGATGTTTGCTTCTCCGGCTGATATGACTCTCGAATGGCAGGAATCCGGTGTGGAAGGGGCTAACCGCTTCCTGAAACGTGTCTGGAAACTGGTTTACGAGCACACAGCAAAAGGTGATGTTGCGGCACTGAACGTTGATGCGCTGACTGAAAATCAGAAAGCGCTGCGTCGCGATGTGCATAAAACGATCGCTAAAGTGACCGATGATATCGGCCGTCGTCAGACCTTCAACACCGCAATTGCGGCGATTATGGAGCTGATGAACAAACTGGCGAAAGCACCAACCGATGGCGAGCAGGATCGCGCTCTGATGCAGGAAGCACTGCTGGCCGTTGTCCGTATGCTTAACCCGTTCACCCCGCACATCTGCTTCACGCTGTGGCAGGAACTGAAAGGCGAAGGCGATATCGACAACGCGCCGTGGCCGGTTGCTGACGAAAAAGCGATGGTGGAAGACTCCACGCTGGTCGTGGTGCAGGTTAACGGTAAAGTCCGTGCCAAAATCACCGTTCCGGTGGACGCAACGGAAGAACAGGTTCGCGAACGTGCTGGCCAGGAACATCTGGTAGCAAAATATCTTGATGGCGTTACTGTACGTAAAGTGATTTACGTACCAGGTAAACTCCTCAATCTGGTCGTTGGCTAA |
44 | 1,5-丹酰丙氨酸氨酰-tRNA合成酶T252A的氨基酸序列(衍生自野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶) |
MEEQYRPEEIESKVQLHWDEKRTFEVTEDESKEKYYCLSANPYPSGRLHMGHVRNYTIGDVIARYQRMLGKNVLQPIGWDAFGLPAEGAAVKNNTAPAPWTYDNIAYMKNQLKMLGFGYDWSRELATCTPEYYRWEQKFFTELYKKGLVYKKTSAVNWCPNDQTVLANEQVIDGCCWRCDTKVERKEIPQWFIKITAYADELLNDLDKLDHWPDTVKTMQRNWIGRSEGVEITFNVNDYDNTLTVYTTRPDAFMGCTYLAVAAGHPLAQKAAENNPELAAFIDECRNTKVAEAEMATMEKKGVDTGFKAVHPLTGEEIPVWAANFVLMEYGTGAVMAVPGHDQRDYEFASKYGLNIKPVILAADGSEPDLSQQALTEKGVLFNSGEFNGLDHEAAFNAIADKLTAMGVGERKVNYRLRDWGVSRQRYWGAPIPMVTLEDGTVMPTPDDQLPVILPEDVVMDGITSPIKADPEWAKTTVNGMPALRETDTFDTFMESCWIYARYTCPQYKEGMLDSEAANYWLPVDIGIGGIEHAIMTLLYFRFFHKLMRDAGMVNSDEPAKQLLCQGMVLADAFYYVGENGERNWVSPVDAIVERDEKGRIVKAKDAAGHELVYTGMSKMSKSKNNGIDPQVMVERYGADTVRLFMMFASPADMTLEWQESGVEGANRFLKRVWKLVYEHTAKGDVAALNVDALTENQKALRRDVHKTIAKVTDDIGRRQTFNTAIAAIMELMNKLAKAPTDGEQDRALMQEALLAVVRMLNPFTPHICFTLWQELKGEGDIDNAPWPVADEKAMVEDSTLVVVQVNGKVRAKITVPVDATEEQVRERAGQEHLVAKYLDGVTVRKVIYVPGKLLNLVVG |
45 | 1,5-丹酰丙氨酸氨酰-tRNA合成酶T252A的核苷酸序列 |
ATGGAAGAGCAATACCGCCCGGAAGAGATAGAATCCAAAGTACAGCTTCATTGGGATGAGAAGCGCACATTTGAAGTAACCGAAGACGAGAGCAAAGAGAAGTATTACTGCCTGTCTGCTAATCCCTATCCTTCTGGTCGACTACACATGGGCCACGTACGTAACTACACCATCGGTGACGTGATCGCCCGCTACCAGCGTATGCTGGGCAAAAACGTCCTGCAGCCGATCGGCTGGGACGCGTTTGGTCTGCCTGCGGAAGGCGCGGCGGTGAAAAACAACACCGCTCCGGCACCGTGGACGTACGACAACATCGCGTATATGAAAAACCAGCTCAAAATGCTGGGCTTTGGTTATGACTGGAGCCGCGAGCTGGCAACCTGTACGCCGGAATACTACCGTTGGGAACAGAAATTCTTCACCGAGCTGTATAAAAAAGGCCTGGTATATAAGAAGACTTCTGCGGTCAACTGGTGTCCGAACGACCAGACCGTACTGGCGAACGAACAAGTTATCGACGGCTGCTGCTGGCGCTGCGATACCAAAGTTGAACGTAAAGAGATCCCGCAGTGGTTTATCAAAATCACTGCTTACGCTGACGAGCTGCTCAACGATCTGGATAAACTGGATCACTGGCCAGACACCGTTAAAACCATGCAGCGTAACTGGATCGGTCGTTCCGAAGGCGTGGAGATCACCTTCAACGTTAACGACTATGACAACACGCTGACCGTTTACACTACCCGCCCGGACGCGTTTATGGGTTGTACCTACCTGGCGGTAGCTGCGGGTCATCCGCTGGCGCAGAAAGCGGCGGAAAATAATCCTGAACTGGCGGCCTTTATTGACGAATGCCGTAACACCAAAGTTGCCGAAGCTGAAATGGCGACGATGGAGAAAAAAGGCGTCGATACTGGCTTTAAAGCGGTTCACCCATTAACGGGCGAAGAAATTCCCGTTTGGGCAGCAAACTTCGTATTGATGGAGTACGGCACGGGCGCAGTTATGGCGGTACCGGGGCACGACCAGCGCGACTACGAGTTTGCCTCTAAATACGGCCTGAACATCAAACCGGTTATCCTGGCAGCTGACGGCTCTGAGCCAGATCTTTCTCAGCAAGCCCTGACTGAAAAAGGCGTGCTGTTCAACTCTGGCGAGTTCAACGGTCTTGACCATGAAGCGGCCTTCAACGCCATCGCCGATAAACTGACTGCGATGGGCGTTGGCGAGCGTAAAGTGAACTACCGCCTGCGCGACTGGGGTGTTTCCCGTCAGCGTTACTGGGGCGCGCCGATTCCGATGGTGACTCTAGAAGACGGTACCGTAATGCCGACCCCGGACGACCAGCTGCCGGTGATCCTGCCGGAAGATGTGGTAATGGACGGCATTACCAGCCCGATTAAAGCAGATCCGGAGTGGGCGAAAACTACCGTTAACGGTATGCCAGCACTGCGTGAAACCGACACTTTCGACACCTTTATGGAGTCCTGCTGGATTTATGCGCGCTACACTTGCCCGCAGTACAAAGAAGGTATGCTGGATTCCGAAGCGGCTAACTACTGGCTGCCGGTGGATATCGGTATTGGTGGTATTGAACACGCCATTATGACGCTGCTCTACTTCCGCTTCTTCCACAAACTGATGCGTGATGCAGGCATGGTGAACTCTGACGAACCAGCGAAACAGTTGCTGTGTCAGGGTATGGTGCTGGCAGATGCCTTCTACTATGTTGGCGAAAACGGCGAACGTAACTGGGTTTCCCCGGTTGATGCTATCGTTGAACGTGACGAGAAAGGCCGTATCGTGAAAGCGAAAGATGCGGCAGGCCATGAACTGGTTTATACCGGCATGAGCAAAATGTCCAAGTCGAAGAACAACGGTATCGACCCGCAGGTGATGGTTGAACGTTACGGCGCGGACACCGTTCGTCTGTTTATGATGTTTGCTTCTCCGGCTGATATGACTCTCGAATGGCAGGAATCCGGTGTGGAAGGGGCTAACCGCTTCCTGAAACGTGTCTGGAAACTGGTTTACGAGCACACAGCAAAAGGTGATGTTGCGGCACTGAACGTTGATGCGCTGACTGAAAATCAGAAAGCGCTGCGTCGCGATGTGCATAAAACGATCGCTAAAGTGACCGATGATATCGGCCGTCGTCAGACCTTCAACACCGCAATTGCGGCGATTATGGAGCTGATGAACAAACTGGCGAAAGCACCAACCGATGGCGAGCAGGATCGCGCTCTGATGCAGGAAGCACTGCTGGCCGTTGTCCGTATGCTTAACCCGTTCACCCCGCACATCTGCTTCACGCTGTGGCAGGAACTGAAAGGCGAAGGCGATATCGACAACGCGCCGTGGCCGGTTGCTGACGAAAAAGCGATGGTGGAAGACTCCACGCTGGTCGTGGTGCAGGTTAACGGTAAAGTCCGTGCCAAAATCACCGTTCCGGTGGACGCAACGGAAGAACAGGTTCGCGAACGTGCTGGCCAGGAACATCTGGTAGCAAAATATCTTGATGGCGTTACTGTACGTAAAGTGATTTACGTACCAGGTAAACTCCTCAATCTGGTCGTTGGCTAAGCGGCC |
46 | 1,5-丹酰丙氨酸氨酰-tRNA合成酶V338A的氨基酸序列(衍生自野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶) |
MEEQYRPEEIESKVQLHWDEKRTFEVTEDESKEKYYCLSANPYPSGRLHMGHVRNYTIGDVIARYQRMLGKNVLQPIGWDAFGLPAEGAAVKNNTAPAPWTYDNIAYMKNQLKMLGFGYDWSRELATCTPEYYRWEQKFFTELYKKGLVYKKTSAVNWCPNDQTVLAN EQVIDGCCWRCDTKVERKEIPQWFIKITAYADELLNDLDKLDHWPDTVKTMQRNWIGRSEGVEITFNVNDYDNTLTVYTTRPDTFMGCTYLAVAAGHPLAQKAAENNPELAAFIDECRNTKVAEAEMATMEKKGVDTGFKAVHPLTGEEIPVWAANFVLMEYGTGAVMAAPGHDQRDYEFASKYGLNIKPVILAADGSEPDLSQQALTEKGVLFNSGEFNGLDHEAAFNAIADKLTAMGVGERKVNYRLRDWGVSRQRYWGAPIPMVTLEDGTVMPTPDDQLPVILPEDVVMDGITSPIKADPEWAKTTVNGMPALRETDTFDTFMESCWIYARYTCPQYKEGMLDSEAANYWLPVDIGIGGIEHAIMTLLYFRFFHKLMRDAGMVNSDEPAKQLLCQGMVLADAFYYVGENGERNWVSPVDAIVERDEKGRIVKAKDAAGHELVYTGMSKMSKSKNNGIDPQVMVERYGADTVRLFMMFASPADMTLEWQESGVEGANRFLKRVWKLVYEHTAKGDVAALNVDALTENQKALRRDVHKTIAKVTDDIGRRQTFNTAIAAIMELMNKLAKAPTDGEQDRALMQEALLAVVRMLNPFTPHICFTLWQELKGEGDIDNAPWPVADEKAMVEDSTLVVVQVNGKVRAKITVPVDATEEQVRERAGQEHLVAKYLDGVTVRKVIYVPGKLLNLVVG |
47 | 1,5-丹酰丙氨酸氨酰-tRNA合成酶V338A的核苷酸序列 |
ATGGAAGAGCAATACCGCCCGGAAGAGATAGAATCCAAAGTACAGCTTCATTGGGATGAGAAGCGCACATTTGAAGTAACCGAAGACGAGAGCAAAGAGAAGTATTACTGCCTGTCTGCTAATCCCTATCCTTCTGGTCGACTACACATGGGCCACGTACGTAACTACACCATCGGTGACGTGATCGCCCGCTACCAGCGTATGCTGGGCAAAAACGTCCTGCAGCCGATCGGCTGGGACGCGTTTGGTCTGCCTGCGGAAGGCGCGGCGGTGAAAAACAACACCGCTCCGGCACCGTGGACGTACGACAACATCGCGTATATGAAAAACCAGCTCAAAATGCTGGGCTTTGGTTATGACTGGAGCCGCGAGCTGGCAACCTGTACGCCGGAATACTACCGTTGGGAACAGAAATTCTTCACCGAGCTGTATAAAAAAGGCCTGGTATATAAGAAGACTTCTGCGGTCAACTGGTGTCCGAACGACCA |
| |
GACCGTACTGGCGAACGAACAAGTTATCGACGGCTGCTGCTGGCGCTGCGATACCAAAGTTGAACGTAAAGAGATCCCGCAGTGGTTTATCAAAATCACTGCTTACGCTGACGAGCTGCTCAACGATCTGGATAAACTGGATCACTGGCCAGACACCGTTAAAACCATGCAGCGTAACTGGATCGGTCGTTCCGAAGGCGTGGAGATCACCTTCAACGTTAACGACTATGACAACACGCTGACCGTTTACACTACCCGCCCGGACACCTTTATGGGTTGTACCTACCTGGCGGTAGCTGCGGGTCATCCGCTGGCGCAGAAAGCGGCGGAAAATAATCCTGAACTGGCGGCCTTTATTGACGAATGCCGTAACACCAAAGTTGCCGAAGCTGAAATGGCGACGATGGAGAAAAAAGGCGTCGATACTGGCTTTAAAGCGGTTCACCCATTAACGGGCGAAGAAATTCCCGTTTGGGCAGCAAACTTCGTATTGATGGAGTACGGCACGGGCGCAGTTATGGCGGCGCCGGGGCACGACCAGCGCGACTACGAGTTTGCCTCTAAATACGGCCTGAACATCAAACCGGTTATCCTGGCAGCTGACGGCTCTGAGCCAGATCTTTCTCAGCAAGCCCTGACTGAAAAAGGCGTGCTGTTCAACTCTGGCGAGTTCAACGGTCTTGACCATGAAGCGGCCTTCAACGCCATCGCCGATAAACTGACTGCGATGGGCGTTGGCGAGCGTAAAGTGAACTACCGCCTGCGCGACTGGGGTGTTTCCCGTCAGCGTTACTGGGGCGCGCCGATTCCGATGGTGACTCTAGAAGACGGTACCGTAATGCCGACCCCGGACGACCAGCTGCCGGTGATCCTGCCGGAAGATGTGGTAATGGACGGCATTACCAGCCCGATTAAAGCAGATCCGGAGTGGGCGAAAACTACCGTTAACGGTATGCCAGCACTGCGTGAAACCGACACTTTCGACACCTTTATGGAGTCCTGCTGGATTTATGCGCGCTACACTTGCCCGCAGTACAAAGAAGGTATGCTGGATTCCGAAGCGGCTAACTACTGGCTGCCGGTGGATATCGGTATTGGTGGTATTGAACACGCCATTATGACGCTGCTCTACTTCCGCTTCTTCCACAAACTGATGCGTGATGCAGGCATGGTGAACTCTGACGAACCAGCGAAACAGTTGCTGTGTCAGGGTATGGTGCTGGCAGATGCCTTCTACTATGTTGGCGAAAACGGCGAACGTAACTGGGTTTCCCCGGTTGATGCTATCGTTGAACGTGACGAGAAAGGCCGTATCGTGAAAGCGAAAGATGCGGCAGGCCATGAACTGGTTTATACCGGCATGAGCAAAATGTCCAAGTCGAAGAACAACGGTAATCGACCCGCAGGTGATGGTTGAACGTTACGGCGCGGACACCGTTCGTCTGTTTATGATGTTTGCTTCTCCGGCTGATATGACTCTCGAATGGCAGGAATCCGGTGTGGAAGGGGCTAACCGCTTCCTGAAACGTGTCTGGAAACTGGTTTACGAGCACACAGCAAAAGGTGATGTTGCGGCACTGAACGTTGATGCGCTGACTGAAAATCAGAAAGCGCTGCGTCGCGATGTGCATAAAACGATCGCTAAAGTGACCGATGATATCGGCCGTCGTCAGACCTTCAACACCGCAATTGCGGCGATTATGGAGCTGATGAACAAACTGGCGAAAGCACCAACCGATGGCGAGCAGGATCGCGCTCTGATGCAGGAAGCACTGCTGGCCGTTGTCCGTATGCTTAACCCGTTCACCCCGCACATCTGCTTCACGCTGTGGCAGGAACTGAAAGGCGAAGGCGATATCGACAACGCGCCGTGGCCGGTTGCTGACGAAAAAGCGATGGTGGAAGACTCCACGCTGGTCGTGGTGCAGGTTAACGGTAAAGTCCGTGCCAAAATCACCGTTCCGGTGGACGCAACGGAAGAACAGGTTCGCGAACGTGCTGGCCAGGAACATCTGGTAGCAAAATATCTTGATGGCGTTACTGTACGTAAAGTGATTTACGTACCAGGTAAACTCCTCAATCTGGTCGTTGGCTAAGCGGCC |
48 | o-硝基苄基半胱氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆3H11的氨基酸序列(衍生自野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶) |
MEEQYRPEEIESKVQLHWDEKRTFEVTEDESKEKYYCLSWSPYPSGRLHMGHVRNYTIGDVIARYQRMLGKNVLQPIGWDAFGLPAEGAAVKNNTAPAPWTYDNIAYMKNQLKMLGFGYDWSRELATCTPEYYRWEQKFFTELYKKGLVYKKTSAVNWCPNDQTVLANEQVIDGCCWRCDTKVERKEIPQWFIKITAYADELLNDLDKLDHWPDTVKTMQRNWIGRSEGVEITFNVNDYDNTLTVYTTRPDTFMGCTYLAVAAGHPLAQKAAENNPELAAFIDECRNTKVAEAEMATMEKKGVDTGFKAVHPLTGEEIPVWAANFVLMEYGTGAVMAVPGHDQRDYEFASKYGLNIKPVILAADGSEPDLSQQALTEKGVLFNSGEFNGLDHEAAFNAIADKLTAMGVGERKVNYRLRDWGVSRQRYWGAPIPMVTLEDGTVMPTPDDQLPVILPEDVVMDGITSPIKADPEWAKTTVNGMPALRETDTFDTFMESCWIYARYTCPQYKEGMLDSEAANYWLPVDIAIGGIEHAIMGLLYFRFFHKLMRDAGMVNSDEPAKQLLCQGMVLADAFYYVGENGERNWVSPVDAIVERDEKGRIVKAKDAAGHELVYTGMSKMSKSKNNGIDPQVMVERYGADTVRLFMMFASPADMTLEWQESGVEGANRFLKRVWKLVYEHTAKGDVAALNVDALTENQKALRRDVHKTIAKVTDDIGRRQTFNTAIAAIMELMNKLAKAPTDGEQDRALMQEALLAVVRMLNPFTPHICFTLWQELKGEGDIDNAPWPVADEKAMVEDSTLVVVQVNGKVRAKITVPVDATEEQVRERAGQEHLVAKYLDGVTVRKVIYVPGKLLNLVVG |
49 | o-硝基苄基半胱氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆3H11的核苷酸序列 |
ATGGAAGAGCAATACCGCCCGGAAGAGATAGAATCCAAAGTACAGCTTCATTGGGATGAGAAGCGCACATTTGAAGTAACCGAAGACGAGAGCAAAGAGAAGTATTACTGCCTGTCTTGGTCGCCCTATCCTTCTGGTCGACTACACATGGGCCACGTACGTAACTACACCATCGGTGACGTGATCGCCCGCTACCAGCGTATGCTGGGCAAAAACGTCCTGCAGCCGATCGGCTGGGACGCGTTTGGTCTGCCTGCGGAAGGCGCGGCGGTGAAAAACAACACCGCTCCGGCACCGTGGACGTACGACAACATCGCGTATATGAAAAACCAGCTCAAAATGCTGGGCTTTGGTTATGACTGGAGCCGCGAGCTGGCAACCTGTACGCCGGAATACTACCGTTGGGAACAGAAATTCTTCACCGAGCTGTATAAAAAAGGCCTGGTATATAAGAAGACTTCTGCGGTCAACTGGTGCCCGAACGACCAGACCGTACTGGCGAACGAACAAGTTATCGACGGCTGCTGCTGGCGCTGCGATACCAAAGTTGAACGTAAAGAGATCCCGCAGTGGTTTATCAAAATCACTGCTTACGCTGACGAGCTGCTCAACGATCTGGATAAACTGGATCACTGGCCAGACACCGTTAAAACCATGCAGCGTAACTGGATCGGTCGTTCCGAAGGCGTGGAGATCACCTTCAACGTTAACGACTATGACAACACGCTGACCGTTTACACTACCCGCCCGGACACCTTTATGGGTTGTACCTACCTGGCGGTAGCTGCGGGTCATCCGCTGGCGCAGAAAGCGGCGGAAAATAATCCTGAACTGGCGGCCTTTATTGACGAATGCCGTAACACCAAAGTTGCCGAAGCTGAAATGGCGACGATGGAGAAAAAAGGCGTCGATACTGGCTTTAAAGCGGTTCACCCATTAACGGGCGAAGAAATTCCCGTTTGGGCAGCAAACTTCGTATTGATGGAGTACGGCACGGGCGCAGTTATGGCGGTACCGGGGCACGACCAGCGCGACTACGAGTTTGCCTCTAAATACGGCCTGAACATCAAACCGGTTATCCTGGCAGCTGACGGCTCTGAGCCAGATCTTTCTCAGCAAGCCCTGACTGAAAAAG |
| |
GCGTGCTGTTCAACTCTGGCGAGTTCAACGGTCTTGACCATGAAGCGGCCTTCAACGCCATCGCCGATAAACTGACTGCGATGGGCGTTGGCGAGCGTAAAGTGAACTACCGCCTGCGCGACTGGGGTGTTTCCCGTCAGCGTTACTGGGGCGCGCCGATTCCGATGGTGACGCTGGAAGACGGTACCGTAATGCCGACCCCGGACGACCAGCTGCCGGTGATCCTGCCGGAAGATGTGGTAATGGACGGCATTACCAGCCCGATTAAAGCAGATCCGGAGTGGGCGAAAACTACCGTTAACGGTATGCCAGCACTGCGTGAAACCGACACTTTCGACACCTTTATGGAGTCCTGCTGGATTTATGCGCGCTACACTTGCCCGCAGTACAAAGAAGGTATGCTGGATTCCGAAGCGGCTAACTACTGGCTGCCGGTGGATATCGCGATTGGTGGTATTGAACACGCCATTATGGGGCTGCTCTACTTCCGCTTCTTCCACAAACTGATGCGTGATGCAGGCATGGTGAACTCTGACGAACCAGCGAAACAGTTGCTGTGTCAGGGTATGGTGCTGGCAGATGCCTTCTACTATGTTGGCGAAAACGGCGAACGTAACTGGGTTTCCCCGGTTGATGCTATCGTTGAACGTGACGAGAAAGGCCGTATCGTGAAAGCGAAAGATGCGGCAGGCCATGAACTGGTTTATACCGGCATGAGCAAAATGTCCAAGTCGAAGAACAACGGTATCGACCCGCAGGTGATGGTTGAACGTTACGGCGCGGACACCGTTCGTCTGTTTATGATGTTTGCTTCTCCGGCTGATATGACTCTCGAATGGCAGGAATCCGGTGTGGAAGGGGCTAACCGCTTCCTGAAACGTGTCTGGAAACTGGTTTACGAGCACACAGCAAAAGGTGATGTTGCGGCACTGAACGTTGATGCGCTGACTGAAAATCAGAAAGCGCTGCGTCGCGATGTGCATAAAACGATCGCTAAAGTGACCGATGATATCGGCCGTCGTCAGACCTTCAACACCGCAATTGCGGCGATTATGGAGCTGATGAACAAACTGGCGAAAGCACCAACCGATGGCGAGCAGGACCGCGCTCTGATGCAGGAAGCACTGCTGGCCGTTGTCCGTATGCTTAACCCGTTCACCCCGCACATCTGCTTCACGCTGTGGCAGGAACTGAAAGGCGAAGGCGATATCGACAACGCGCCGTGGCCGGTTGCTGACGAAAAAGCGATGGTGGAAGACTCCACGCTGGTCGTGGTGCAGGTTAACGGTAAAGTCCGTGCCAAAATCACCGTTCCGGTGGACGCAACGGAAGAACAGGTTCGCGAACGTGCTGGCCAGGAACATCTGGTAGCAAAATATCTTGATGGCGTTACTGTACGTAAAGTGATTTACGTACCAGGTAAACTCCTCAATCTGGTCGTTGGCTAA |
50 | o-硝基苄基丝氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6的氨基酸序列(衍生自野生型大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶) |
MEEQYRPEEIESKVQLHWDEKRTFEVTEDEGKEKYYCLSWSPYPSGRLHMGHVRNYTIGDVIARYQRMLGKNVLQPIGWDAFGLPAEGAAVKNNTAPAPWTYDNIAYMKNQLKMLGFGYDWSRELATCTPEYYRWEQKFFTELYKKGLVYKKTSAVNWCPNDQTVLANEQVIDGCCWRCDTKVERKEIPQWFIKITAYADELLNDLDKLDHWPDTVKTMQRNWIGRSEGVEITFNVNDYDNTLTVYASRPDTFMGCTYLAVAAGHPLAQKAAENNPELAAFIDECRNTKVAEAEMATMEKKGVDTGFKAVHPLTGEEIPVWAANFVLMEYGTGAVMAVPGHDQRDYEFASKYGLNIKPVILAADGSEPDLSQQALTEKGVLFNSGEFNGLDHEAAFNAIADKLTAMGVGERKVNYRLRDWGVSRQRYWGAPIPMVTLEDGTVMPTPDDQLPVILPEDVVMDGITSPIKADPEWAKTTVNGMPALRETDTFDTFMESCWIYARYTCPQYKEGMLDSEAANYWLPVDIAIGGIEHAIMGLLYFRFFHKLMRDAGMVNSDEPAKQLLCQGMVLADAFYYVGENGERNWVSPVDAIVERDEKGRIVKAKDAAGHELVYTGISKMSKSKNNGIDPQVMVERYGADTVRLFMMFASPADMTLEWQESGVEGANRFLKRAWKLVYEHTAKGDVAALNVDALTENQKALRRDVHKTIAKVTDDIGRRQTFNTAIAAIMELMNKLAKAPTDGEQDRALMQEALLAVVRMLNPFTPHICFTLWQELKGEGDIDNAPWPVADEKAMVEDSTLVVVQVNGKVRAKITVPVDATEEQVRERAGQEHLVAKYLDGVTVRKVIYVPGKLLNLVVG |
51 | o-硝基苄基丝氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6的核苷酸序列 |
ATCTCGAAGCACACGAAACTTTTTCCTTCCTTCATTCACGCACACTACTCTCTAATGAGCAACGGTATACGGCCTTCCTTCCAGTTACTTGAATTTGAAATAAAAAAAAGTTTGCTGTCTTGCTATCAAGTATAAATAGACCTGCAATTATTAATCTTTTGTTTCCTCGTCATTGTTCTCGTTCCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTGAATTCAGTATGGAAGAGCAATACCGCCCGGAAGAGATAGAATCCAAAGTACAGCTTCATTGGGATGAGAAGCGCACATTTGAAGTAACCGAAGACGAGGGCAAAGAGAAGTATTACTGCCTGTCTTGGTCGCCCTATCCTTCTGGTCGACTACACATGGGCCACGTACGTAACTACACCATCGGTGACGTGATCGCCCGCTACCAGCGTATGCTGGGCAAAAACGTCCTGCAGCCGATCGGCTGGGACGCGTTTGGTCTGCCTGCGGAAGGCGCGGCGGTGAAAAACAACACCGCTCCGGCACCGTGGACGTACGACAACATCGCGTATATGAAAAACCAGCTCAAAATGCTGGGCTTTGGTTATGACTGGAGCCGCGAGCTGGCAACCTGTACGCCGGAATACTACCGTTGGGAACAGAAATTCTTCACCGAGCTGTATAAAAAAGGCCTGGTATATAAGAAGACTTCTGCGGTCAACTGGTGTCCGAACGACCAGACCGTACTGGCGAACGAACAAGTTATCGACGGCTGCTGCTGGCGCTGCGATACCAAAGTTGAACGTAAAGAGATCCCGCAGTGGTTTATCAAAATCACTGCTTACGCTGACGAGCTGCTCAACGATCTGGATAAACTGGATCACTGGCCAGACACCGTTAAAACCATGCAGCGTAACTGGATCGGTCGTTCCGAAGGCGTGGAGATCACCTTCAACGTTAACGACTATGACAACACGCTGACCGTTTACGCTTCCCGCCCGGACACCTTTATGGGTTGTACCTACCTGGCGGTAGCTGCGGGTCATCCGCTGGCGCAGAAAGCGGCGGAAAATAATCCTGAACTGGCGGCCTTTATTGACGAATGCCGTAACACCAAAGTTGCCGAAGCTGAAATGGCGACGATGGAGAAAAAAGGCGTCGATACTGGCTTTAAAGCGGTTCACCCATTAACGGGCGAAGAAATTCCCGTTTGGGCAGCAAACTTCGTATTGATGGAGTACGGCACGGGCGCAGTTATGGCGGTACCGGGGCACGACCAGCGCGACTACGAGTTTGCCTCTAAATACGGCCTGAACATCAAACCGGTTATCCTGGCAGCTGACGGCTCTGAGCCAGATCTTTCTCAGCAAGCCCTGACTGAAAAAGGCGTGCTGTTCAACTCTGGCGAGTTCAACGGTCTTGACCATGAAGCGGCCTTCAACGCCATCGCCGATAAACTGACTGCGATGGGCGTTGGCGAGCGTAAAGTGAACTACCGCCTGCGCGACTGGGGTGTTTCCCGTCAGCGTTACTGGGGCGCGCCGATTCCGATGGTGACTCTAGAAGACGGTACCGTAATGCCGACCCCGGACGACCAGCTGCCGGTGATCCTGCCGGAAGATGTGGTAATGGACGGCATTACCAGCCCGATTAAAGCAGATCCGGAGTGGGCGAAAACTACCGTTAACGGTATGCCAGCACTGCGTGAAACCGACACTTTCGACACCTTTATGGAGTCCTGCTGGATTTATGCGCGCTACACTTGCCCGCAGTACAAAGAAGGTATGCTG |
| |
GATTCCGAAGCGGCTAACTACTGGCTGCCGGTGGATATCGCGATTGGTGGTATTGAACACGCCATTATGGGGCTGCTCTACTTCCGCTTCTTCCACAAACTGATGCGTGATGCAGGCATGGTGAACTCTGACGAACCAGCGAAACAGTTGCTGTGTCAGGGTATGGTGCTGGCAGATGCCTTCTACTATGTTGGCGAAAACGGCGAACGTAACTGGGTTTCCCCGGTTGATGCTATCGTTGAACGTGACGAGAAAGGCCGTATCGTGAAAGCGAAAGATGCGGCAGGCCATGAACTGGTTTATACCGGCATAAGCAAAATGTCCAAGTCGAAGAACAACGGTATCGACCCGCAGGTGATGGTTGAACGTTACGGCGCGGACACCGTTCGTCTGTTTATGATGTTTGCTTCTCCGGCTGATATGACTCTCGAATGGCAGGAATCCGGTGTGGAAGGGGCTAACCGCTTCCTGAAACGTGCCTGGAAACTGGTTTACGAGCACACAGCAAAAGGTGATGTTGCGGCACTGAACGTTGATGCGCTGACTGAAAATCAGAAAGCGCTGCGTCGCGATGTGCATAAAACGATCGCTAAAGTGACCGATGATATCGGCCGTCGTCAGACCTTCAACACCGCAATTGCGGCGATTATGGAGCTGATGAACAAACTGGCGAAAGCACCAACCGATGGCGAGCAGGATCGCGCTCTGATGCAGGAAGCACTGCTGGCCGTTGTCCGTATGCTTAACCCGTTCACCCCGCACATCTGCTTCACGCTGTGGCAGGAACTGAAAGGCGAAGGCGATATCGACAACGCGCCGTGGCCGGTTGCTGACGAAAAAGCGATGGTGGAAGACTCCACGCTGGTCGTGGTGCAGGTTAACGGTAAAGTCCGTGCCAAAATCACCGTTCCGGTGGACGCAACGGAAGAACAGGTTCGCGAACGTGCTGGCCAGGAACATCTGGTAGCAAAATATCTTGATGGCGTTACTGTACGTAAAGTGATTTACGTACCAGGTAAACTCCTCAATCTGGTCGTTGGCTAAGCGGCC |
52 |
O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆ONBY-1的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIGLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEARLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNEIHYYGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
53 |
O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆ONBY-2的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIGLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSECDLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNAIHYGGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
54 |
O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸氨酰-tRNA合成酶克隆ONBY-3的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶) |
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIGLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEEQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNSIHYEGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
55 |
p-氰基苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下取代:Tyr32Leu,Leu65Val,Phe108Trp,Gln109Met,Asp158Gly,Ile159Ala | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIVLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEWMLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGAHYLGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
56 | p-氰基苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCTGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATAGTTTTGGCTGATTTACATGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAATGGATGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATGGTGCTCATTATCTTGGCGTTGATGTTGCAGTTGGGGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
57 |
m-氰基苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下取代:Tyr32His,His70Ser,Asp158Ser,Ile159Ser,Leu162Pro | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAHIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLSAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNSSHYPGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
58 | m-氰基苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列 |
ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTCATATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATATTGTTGGCTGATTTATCTGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAATTCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAGCAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATAGTTCGCATTATCCTGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTATAA |
59 |
p-(2-氨基-1-羟乙基)-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下取代:Tyr32Asp,Leu65Glu,Phe108Arg,Asp158Gly,Leu162Asn | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSADIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIELADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSERQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGIHYNGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
60 |
p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下取代:Tyr32Ala,Leu65Phe,Phe108Trp,Gln109Ser,Asp158Ser,Leu162His | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIFLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEWSLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNSIHYHGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
61 |
p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下取代:Tyr32Gly,Leu65Val,Phe108Thr,Asp158Gly,Leu162Ser | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIVLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSETQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGIHYSGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILLEPIRKRL |
62 |
p-异丙基硫代羰基-L-苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下取代:Tyr32Gly,Leu65Cys,Phe108Cys,Gln109Met,Asp158Gly,Leu162Tyr | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIICLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSECMLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGIHYYGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |
63 |
7-氨基-香豆素丙氨酸和7-羟基-香豆素丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列(衍生自野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶),具有以下取代:Y32R,L65A,H70M,D158N和L162T | MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSARIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIIALADLMAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNNIHYTGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNpIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL |