JP2010506591A - 哺乳動物細胞中の蛋白質への非天然アミノ酸の遺伝的組込み - Google Patents

哺乳動物細胞中の蛋白質への非天然アミノ酸の遺伝的組込み Download PDF

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Abstract

本発明は哺乳動物宿主細胞（例えば霊長類宿主細胞や齧歯類宿主細胞）で蛋白質に非天然アミノ酸を組込むことが可能なｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの直交対に関する。本発明は限定されないが、例えば宿主細胞（例えば霊長類又は齧歯類細胞）と、真正細菌シンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、直交ｔＲＮＡと、非天然アミノ酸を含む翻訳系を提供する。本発明は更に、哺乳動物宿主細胞系で少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ該当蛋白質を生産するための方法に関する。
【選択図】なし

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮出願第６０／８５３，００８号（出願日２００６年１０月１８日）及び第６０／９２３，４５８号（出願日２００７年４月１２日）の優先権を主張し、その開示内容全体を全目的で本明細書に援用する。
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は国立衛生研究所助成番号ＧＭ６２１５９として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
（発明の技術分野）
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明は非天然アミノ酸を蛋白質に組込む直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びその対を作製及び使用するための組成物と方法に関する。本発明は更に前記対を使用して細胞で蛋白質を生産する方法と前記方法により生産された蛋白質にも関する。
非天然アミノ酸を哺乳動物細胞中の蛋白質に部位特異的に組込むための方法は従来記載されている。化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが夫々ＣＨＯ細胞とニューロンにマイクロインジェクション又はエレクトロポレーションにより導入され、ナンセンスアンバー突然変異を一連の非天然アミノ酸で抑圧するために使用されている（Ｍｏｎａｈａｎら（２００３），“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０：５７３−５８０）。しかし、アミノアシル化ｔＲＮＡを化学量論的試薬として使用すると、生産可能な蛋白質の量は著しく制限される。
別法として、非天然アミノ酸を蛋白質に選択的に組込むために、宿主ｔＲＮＡ、ａａＲＳ又はアミノ酸と交差反応しない異種サプレッサーｔＲＮＡ／ａａＲＳ対（直交ｔＲＮＡ／ａａＲＳ）が構築されている。例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａらは３−ヨード−Ｌ−チロシンをＣＨＯ細胞中の蛋白質に組込むためにＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ（ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）と大腸菌チロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ）を改変している（Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００２），“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：４６９２−４６９９）。同様に、Ｚｈａｎｇらは５−ヒドロキシトリプトファンを高い忠実度で哺乳動物細胞中の蛋白質に組込むために直交枯草菌サプレッサーｔＲＮＡ／トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ対を構築した（Ｚｈａｎｇら（２００４），“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：８８８２−８８８７）。
しかし、側鎖が野生型基質と有意に異なるアミノ酸をアミノアシル化するａａＲＳ変異体を作製するために構造に基づく突然変異誘発を使用するには、先験的に予測しにくい複数の活性部位残基の突然変異が必要である（Ｚｈａｎｇら（２００２），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９：６５７９−６５８４；Ｔｕｒｎｅｒら（２００５），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ−ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２７：１４９７６−１４９７７；Ｔｕｒｎｅｒら（２００６），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：６４８３−６４８８）。更に、そのコグネイトｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡに３−ヨード−Ｌ−チロシンを負荷する突然変異体ａａＲＳのように、構築された突然変異体が依然として宿主アミノ酸を認識する場合もある（Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００２），“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：４６９２−４６９９；及びＫｉｇａら（２００２），“Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９：９７１５−９７２０）。
別法として、特異性を改変したａａＲＳを哺乳動物細胞で直接進化させるように試みることもできる。例えば、Ｗａｎｇらは光安定性と遠赤色発光を強化した単量体赤色蛍光蛋白質を直接進化させるために最近、ヒトＢ細胞株で体細胞過剰突然変異を使用している（Ｗａｎｇら（２００４），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｎｏｎａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１６７４５−１６７４９）。しかし、体細胞過剰突然変異は全長蛋白質にランダム突然変異を導入するものであり、基質特異性を改変した変異体を進化させる際に活性部位の標的突然変異誘発により導入される遺伝子多様性よりも効果が少ないと思われる。他方、後者の方法は哺乳動物細胞で大きな安定したライブラリーを作製しにくいという欠点がある。
直交翻訳技術
天然以外の物理的、化学的及び生物学的性質をもつ構造的に多様な非天然アミノ酸を原核生物と酵母中の蛋白質にｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的に組込むための一般手法が開発されている。これらの方法はｉｎ ｖｉｖｏポリペプチド翻訳中に所望の非天然アミノ酸を該当遺伝子の規定位置に挿入するために適切なセレクターコドンを認識する直交蛋白質翻訳成分に依存している。これらの方法はセレクターコドン（例えばナンセンスアンバーコドン）を認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を利用しており、対応する特定直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を特異的に負荷する。これらの成分は宿主生体中の内在ｔＲＮＡ又はＲＳのいずれとも交差反応しない（即ち構築されたｔＲＮＡとＲＳは直交でなければならない）。
大腸菌宿主系でこの技術を使用し、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡＴｙｒ／ＴｙｒＲＳ対、古細菌ｔＲＮＡＧｌｕ／Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉグルタミルｔＲＮＡシンテターゼ対、及び古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ／Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉリジルｔＲＮＡシンテターゼ対から機能的なアンバー及びフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡ／ａａＲＳ対が誘導されている。出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、対応する大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒ／ＴｙｒＲＳ及びｔＲＮＡＬｅｕ／ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ対から機能的なｔＲＮＡＣＵＡ／ａａＲＳ対が誘導されている。ポジティブ選択とネガティブ選択を併用してこれらのサプレッサーｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を誘導進化させると、多数の多様な非天然アミノ酸を大腸菌と出芽酵母に効率的で高度に選択的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことが可能になった。これらのアミノ酸としては、蛍光アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、金属イオン結合性アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、並びに新規化学的及び光化学的反応性をもつアミノ酸が挙げられる。この手法は蛋白質構造及び機能をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで検討し、新規又は強化された性質をもつ蛋白質（例えば治療用蛋白質）を作製するための強力なツールとなる。この手法を哺乳動物細胞（例えば霊長類及び齧歯類細胞株）に拡張すると、この手法の有用性は著しく広がると思われる。
１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ生産に適した直交翻訳系の使用方法は一般に当分野で公知である。例えば国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００６／１１０１８２（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」）参照。これらの出願は各々その開示内容全体を本明細書に援用する。
直交翻訳系の他の記載については、例えばＷａｎｇら（２００１），“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２），“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃｏｍｂ．）１：１−１１；Ａｌｆｏｎｔａら（２００３），“Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅｄｏｘ−Ａｃｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１４６６２−１４６６３；Ｓａｎｔｏｒｏら（２００３），“Ａｎ ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｎｄ ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：６７００−６７０９；Ｃｈｉｎら（２００３），“Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，９６４−９６７；Ｃｈｉｎら（２００３），“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０，５１１−５１９；Ｗｕら（２００４），“Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６，１４３０６−１４３０７；Ｓｕｍｍｅｒｅｒら（２００６），“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，”ＰＮＡＳ １０３（２６）：９７８５−９７８９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００４），“Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｃｏｄｏｎ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：７５６６−７５７１；Ｚｈａｎｇら（２００４），“Ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，３７１−３７３；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａ−９（６）：５４８−５５４（２００５）；Ｗａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９（２００６）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６），“Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７（１０）：７７５−７８２；Ｓｕｍｍｅｒｅｒら（２００６），“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３，９７８５−９７８９；Ｗａｎｇら（２００６），“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２８，８７３８−８７３９；及びＬｉｕ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６），“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（１１）：１４３６−１４４０も参照。これらの上記刊行物は各々その開示内容を本明細書に援用する。
所望の非天然アミノ酸を規定位置に組込むように、非天然アミノ酸を哺乳動物細胞宿主系（例えば霊長類又は齧歯類宿主細胞系）中の蛋白質に組込む改善型直交翻訳成分の開発が当分野で必要とされている。齧歯類細胞やヒト細胞等の哺乳動物細胞で機能することが可能な直交翻訳成分（例えば突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ酵素）をスクリーニング及び同定するための改善型方法も当分野で必要とされている。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
本発明は多様な物理化学的及び生物学的性質をもつ非天然アミノ酸を哺乳動物細胞（例えば齧歯類細胞や霊長類細胞）で遺伝的にコードさせることが可能な一般アプローチを提供する。先ず該当非天然アミノ酸を選択的に利用するように突然変異体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を酵母で進化させる。次に突然変異体ＲＳを真正細菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡと併用し、アンバーナンセンスコドンに応答して哺乳動物細胞中の蛋白質に非天然アミノ酸を部位特異的に組込む。１０種類の非天然アミノ酸（図１に示す非天然アミノ酸）がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト２９３Ｔ細胞で発現させたモデル蛋白質に細胞２×１０７個当たり蛋白質１μｇまでの効率で個々に組込まれた。質量分析によると、非天然アミノ酸の高い翻訳忠実度が確認された。この手法は細胞試験のために生物学的プローブを蛋白質に導入し易くすることができ、最終的に齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物細胞で非天然アミノ酸を組込んだ治療用蛋白質を合成し易くなると考えられる。
本発明は齧歯類宿主細胞や霊長類宿主細胞等の宿主細胞でセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）に応答して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ組込むための組成物と方法を提供する。これらの組成物は宿主細胞に加え、宿主細胞翻訳機構と相互作用しない直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の対を含む。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡは内在宿主細胞アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより（天然又は非天然）アミノ酸を負荷されない（又は有意レベルまで負荷されない）。同様に、本発明により提供されるＯ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに（天然又は非天然）アミノ酸を有意又は検出可能なレベルまで負荷しない。これらの新規組成物は哺乳動物宿主細胞系で翻訳により非天然アミノ酸を組込んだ大量の蛋白質の生産を可能にする。
所定側面において、本発明は翻訳系を提供する。これらの系は（ａ）齧歯類又は霊長類宿主細胞等の哺乳動物宿主細胞を含み、前記宿主細胞は、（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、（ｄ）第１の非天然アミノ酸を含み、第１のＯ−ＲＳは第１のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。非天然アミノ酸は限定されないが、
ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
α−アミノカプリル酸；
ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
１，５−ダンシルアラニン；及び
ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）とすることができる。
所定側面において、Ｏ−ＲＳは同一のＯ−ｔＲＮＡと、非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
翻訳系は各種起源に由来する成分を使用することができる。１態様において、第１のＯ−ＲＳは大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば野生型大腸菌チロシル又はロイシルｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導される。所定態様において、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号３を含むか又は前記配列によりコードされる。系で使用されるＯ−ＲＳは配列番号５７〜１０１のアミノ酸配列及び前記配列の保存変異体を含むことができる。所定側面において、宿主細胞はＯ−ＲＳやＯ−ｔＲＮＡ等の翻訳系の成分をコードする１種類以上のポリヌクレオチドを含むことができる。所定態様において、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号８〜５６から選択されるヌクレオチド配列を含む。
所定側面において、翻訳系は更に該当蛋白質をコードする核酸を含み、前記核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンをもつ。
所定側面において、翻訳系（即ち宿主細胞）は第２の非天然アミノ酸を利用する第２の直交対（即ち、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡ）を含み、従って、系はポリペプチド中の異なる選択部位に少なくとも２種類の異なる非天然アミノ酸を組込むことが可能になる。このデュアル系では、第２のＯ−ＲＳは第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なるセレクターコドンを認識する。
Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡがその宿主細胞環境でその直交性を維持する限り、翻訳系で使用される哺乳動物宿主細胞は特に限定されない。宿主細胞はマウス細胞やラット細胞等の齧歯類宿主細胞とすることができる。宿主細胞が霊長類細胞の場合には、細胞は例えばヒト宿主細胞、チンパンジー宿主細胞、ボノボ宿主細胞、ゴリラ宿主細胞、オランウータン宿主細胞、テナガザル宿主細胞、マカクザル宿主細胞、タマリン宿主細胞又はマーモセット宿主細胞とすることができる。宿主細胞は例えばＣＨＯ細胞又はヒト２９３Ｔとすることができる。
他の側面において、本発明は選択位置に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ該当蛋白質の生産方法を提供する。これらの方法は上記翻訳系を利用する。一般に、これらの方法は（ｉ）第１の非天然アミノ酸（例えば図１の非天然アミノ酸）と；（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、前記Ｏ−ＲＳは前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；（ｉｖ）該当蛋白質をコードし、第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を準備する段階から開始し、前記核酸中のセレクターコドンの位置は該当蛋白質中の選択位置に対応する。これらの全系成分は適切な宿主細胞（例えば齧歯類細胞又は霊長類細胞）に含まれる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法は一般に上記翻訳系の全成分の存在下で宿主細胞を培養する段階を含む。これらの方法において、非天然アミノ酸は（限定されないが）、
ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
α−アミノカプリル酸；
ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
１，５−ダンシルアラニン；及び
ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）から選択することができる。
これらの方法の所定態様において、Ｏ−ＲＳは同一のＯ−ｔＲＮＡと、非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
この方法は各種試薬を使用して広く応用することができる。前記方法の所定態様において、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号３を含むか又は前記配列によりコードされる。所定態様では、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを準備する。所定態様において、Ｏ−ＲＳは野生型大腸菌チロシル又はロイシルｔＲＮＡシンテターゼ等の大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される。所定態様において、前記準備段階は配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列及びその保存変異体を含むＯ−ＲＳを準備する段階を含む。これらの方法の所定側面では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する。例えば、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号８〜５６から選択されるヌクレオチド配列を含むことができる。
これらの方法の所定態様において、Ｏ−ＲＳを準備する段階は部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、その結果として得られるＯ−ＲＳとして、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを選択する段階を含む。前記選択段階は部位特異的突然変異誘発後に得られたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子のプールからＯ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含むことができる。
これらの方法は２種類以上の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むように改変することもできる。これらの方法では、第２の直交翻訳系を第１の翻訳系と併用し、第２の系は異なるアミノ酸及びセレクターコドン特異性をもつ。例えば、準備段階は第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを準備する段階を含むことができ、第２のＯ−ＲＳは第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する。
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「ポリヌクレオチド」と言う場合には実際問題として該当ポリヌクレオチドの多数のコピーを含む。
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル又はロイシルに由来する直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
直交チロシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交チロシルｔＲＮＡ（チロシルＯ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するチロシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡと相同であるか、（５）チロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）チロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。チロシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「チロシルＯ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより夫々チロシン以外のアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のチロシルＯ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
直交チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシルＯ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてチロシルＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシルＯ−ＲＳがチロシルＯ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは本明細書にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、Ｏ−ＲＳは図１６のチロシルＯ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は図１６のＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
直交ロイシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交ロイシルｔＲＮＡ（ロイシルＯ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するロイシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するロイシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体ロイシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体ロイシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）ロイシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）ロイシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。ロイシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「ロイシルＯ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより夫々ロイシン以外のアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のロイシルＯ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
直交ロイシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交ロイシルアミノ酸シンテターゼ（ロイシルＯ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてロイシルＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。ロイシルＯ−ＲＳがロイシルＯ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するロイシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは本明細書にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、Ｏ−ＲＳは図１６のロイシルＯ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は図１６のＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分又は所定の相互特異性側面をもつ成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は相補的であると言うこともできる。
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは一般にポリペプチドの翻訳中に終止コドンに応答してアミノ酸の組込み（即ち「読み飛ばし」）を可能にすることにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。所定側面において、本発明のセレクターコドンはサプレッサーコドンであり、例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等である。
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の方法を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたない陽性対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性陽性対照マーカー構築物が所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外は陽性対照マーカーが発現される環境条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「陰性」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精密化することができる。この陰性対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に誘導体化ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ誘導体化ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは、例えば哺乳動物細胞（例えば齧歯類細胞又は霊長類細胞）でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種類の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、図１に示す非天然アミノ酸参照。
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離された成分、あるいは特定分子もしくは生物又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に記載するような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、該当形質をもたない細胞からこの形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別するマーカーを意味する。
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）選択性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系の標的成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は真核生物界に属する生物を意味する。真核生物はその構成が一般に多細胞であり（但し、例えば酵母のように多細胞でないものもある）、膜結合核と他の膜結合オルガネラが存在し、遺伝物質が線状であり（即ち染色体が線状）、オペロンが存在せず、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ ｍＲＮＡが存在し、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に原核生物から区別できる。真核生物としては例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
原核生物：本明細書で使用する「原核生物」なる用語はモネラ界（別称原核生物界）に属する生物を意味する。原核生物はその構成が単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核生物から区別できる。原核生物は真正細菌及び古細菌亜界を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコプラズマをモネラ界の別々の分類にする場合もある。
真正細菌：本明細書で使用する「真正細菌」及び「細菌」なる用語は「古細菌」から区別できる原核生物を意味する。同様に、古細菌は真正細菌から区別できる原核生物を意味する。真正細菌と古細菌は多数の形態学的及び生化学的基準により区別することができる。例えば、リボソームＲＮＡ配列の相違、ＲＮＡポリメラーゼ構造、イントロンの有無、抗生物質感受性、細胞壁ペプチドグリカン及び他の細胞壁成分の有無、膜脂質構造の分岐の有無、並びにヒストン及びヒストン様蛋白質の有無を使用して生物を真正細菌又は古細菌に分類する。
真正細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。古細菌の例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍが挙げられる。
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ翻訳成分（例えば保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳ）を意味する。例えば、Ｏ−ＲＳ、又はこのＯ−ＲＳの保存変異体はコグネイトＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば図１の非天然アミノ酸）でアミノアシル化する。この例では、Ｏ−ＲＳと保存変異体Ｏ−ＲＳは同一アミノ酸配列をもたない。保存変異体はこの保存変異体が対応するコグネイトＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である（例えば協働する）限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
所定態様において、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含む。所定態様において、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含むと共に、更にＯ−ＲＳ生理活性を維持し、例えば保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも１０％を維持し、あるいは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％を維持する。所定の好ましい態様において、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも５０％を維持する。保存変異体Ｏ−ＲＳの保存アミノ酸置換はアミノ酸結合ポケットを含むＯ−ＲＳの任意ドメインに位置することができる。
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、例えば栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のＯ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。所定側面において、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードさせるための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
別の側面において、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることもできる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面において、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面において、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を意味する。
非天然アミノ酸ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）、ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）、ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）、α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）、１，５−ダンシルアラニン及びｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）の化学構造と名称を示す。これらの非天然アミノ酸の大半は本図に併記する種々の別名を使用して様々に呼称されている。 非天然アミノ酸ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）、ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）、ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）、α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）、１，５−ダンシルアラニン及びｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）の化学構造と名称を示す。これらの非天然アミノ酸の大半は本図に併記する種々の別名を使用して様々に呼称されている。
ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡとＥｃＴｙｒＲＳの直交対を使用してＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞で実施した全長ＧＦＰ発現のウェスタンブロット分析を示す。細胞にプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧ、ｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体及びｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを同時にトランスフェクトし、非天然アミノ酸の存在下又は不在下で増殖させた。第１レーンはｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰを一過的にトランスフェクトしたＴ−ｒｅｘ ＣＨＯ細胞における野生型ＧＦＰ発現である。第２レーンは野生型ＥｃＴｙｒＲＳとＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡの併用により抑圧したＧＦＰ３７ＴＡＧの全長発現である。第３レーン以下は非天然アミノ酸の存在下又は不在下でＥｃＴｙｒＲＳ変異体とＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡの併用により抑圧したＧＦＰ３７ＴＡＧの全長発現である。ｐＭｐａＲＳはｐＭｐａ−ｔＲＮＡシンテターゼを表し、他の略語も同様である。反応毎の細胞溶解液の４０μｇアリコート（第１レーンには細胞溶解液１０μｇを添加）を抗ｃ−ｍｙｃ抗体で分析した。蛋白質発現用に使用した非天然アミノ酸濃度はｐＭｐａ １０ｍＭ、ｐＡｐａ １０ｍＭ、ｐＢｐａ １ｍＭ、ｐＩｐａ ８ｍＭ、ｐＡｚｐａ ５ｍＭ及びｐＰｐａ １ｍＭとした。
図２で記載したようなＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡとＥｃＴｙｒＲＳの直交対を使用してＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞で実施した全長ＧＦＰ発現のウェスタンブロット分析を示す。反応毎の細胞溶解液の２０μｇアリコート（対照反応には５μｇ）を抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体で分析した。試薬、非天然アミノ酸濃度及びレーンの内容は図２で記載した通りとした。
図４ＡはｐＳＷＡＮ−ｐＭｐａＲＳのプラスミドマップである。
図４ＢはｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧのプラスミドマップである。
野生型ＧＦＰ及びＧＦＰ−ｐＭｐａペプチドのアミノ酸配列を示す。Ｙ＊は野生型ＧＦＰではチロシンを表し、ＧＦＰ−ｐＭｐａではｐＭｐａを表す。ペプチドＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ（配列番号１０３）の断片化中に発生したｙ型及びｂ型イオンを示す。
図５に示した野生型ＧＦＰペプチドＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ（配列番号１０３）の注釈付きタンデムＭＳスペクトルを示す。比較と明瞭にするために、存在量の多いＹ＊イオン系列と、ｐＭｐａを明白に３７位に位置付けるｂ１３イオンのみに注釈を付ける。蛋白質を抗ｍｙｃアフィニティーカラムにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＭＳ分析のためにＧＦＰバンドを切り出した。
ＧＦＰ−ｐＭｐａに由来するＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ（配列番号１０３）ペプチドの注釈付きタンデムＭＳスペクトルを示す。Ｙ＊イオン系列のタンデムＭＳスペクトルは１４Ｄａの予想質量シフトを示す。
アフィニティー精製したＧＦＰ−ｐＭｐａの無傷蛋白質ＥＳＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。（挿入図に示す）逆畳み込み電荷状態包絡線は修飾蛋白質からＮ末端メチオニンを差し引き、アセチル化を加えた予想質量（理論質量２９６９６．５２）と実験誤差内で一致する２９６９６Ｄａの１個の主成分を示す。小さいほうの２９６５４ＤａのピークはＧＦＰ−ｐＭｐａからＮ末端メチオニンを差し引いた値に帰属される。２個のサイドバンドは非特異的修飾によるものと思われる。
ｐＡｐａを含む突然変異体ＧＦＰのタンデムＭＳスペクトルを示す。Ｙ＊イオンは野生型ＧＦＰのスペクトルの同一イオンに対して２６Ｄａ質量シフトを示す。
ｐＢｐａを含む突然変異体ＧＦＰのタンデムＭＳスペクトルを示す。突然変異体ＧＦＰと野生型ＧＦＰの間には８６Ｄａの特徴的質量シフトが明白に認められる。
ｐＡｚｐａを含む突然変異体ＧＦＰのタンデムＭＳスペクトルを示す。ｐＡｚｐａの大部分は分解してｐＡｍｐａとなる（ｐ−アミノフェニルアラニン；トリプシン処理したｐＡｍｐａを含むフラグメントのタンデムＭＳスペクトルについては図１５参照）。しかし、野生型ＧＦＰのシグナルに比較すると、Ｙ＊イオンの２５Ｄａの特徴的質量シフトが依然として明白に認められる。
ｐＰｐａを含む突然変異体ＧＦＰのタンデムＭＳスペクトルを示す。ｐＰｐａフラグメントのシグナルは大半がバックグラウンドと重なっている。しかし、ＭＳＤＢに対するスペクトルのデータベース検索により依然として良好に識別される。より強いＹ＊イオンには３８Ｄａの特徴的質量シフトが認められる。
図１３Ａ及び１３Ｂはアンバー抑圧がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞とＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞のいずれにおいてもＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子とＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子の両方に依存することを例証する。図１３Ａは各種構築物を一過的にトランスフェクトしたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞の緑色蛍光画像のパネルを示す。第１のパネルでは、細胞にｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰをトランスフェクトした。第２のパネルでは、細胞にｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳとｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧをトランスフェクトした。第３のパネルでは、細胞にｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡとｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧをトランスフェクトした。第４のパネルでは、細胞にｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡとｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳとｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧをトランスフェクトした。図１３Ｂは各種構築物を一過的にトランスフェクトしたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞の緑色蛍光画像のパネルを示す。各パネルで使用した構築物は図１３Ａに示したものと同一とした。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞及び２９３細胞における６種類のＥｃＴｙｒＲＳ変異体の発現のウェスタンブロット分析を示す。反応毎の細胞溶解液の４０μｇアリコートを抗ｃ−ｍｙｃ抗体で分析した。ＥｃＴｙｒＲＳ変異体の発現は活性部位突然変異により影響されない。変異体はＴ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞株とＴ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞株の両者で同等に発現する。
ｐＡｚｐａを含む突然変異体ＧＦＰに由来するペプチドＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ（配列番号１０３）の注釈付きタンデムＭＳスペクトルを示す。Ｙ＊はｐＡｍｐａ（ｐ−アミノフェニルアラニン）を表す。明瞭にするために、Ｙ＊イオン系列のみに注釈を付ける。ｐＡｚｐａペプチドのシグナル強度は極めて弱く（図１１参照）、野生型ＧＦＰのフラグメントとｐＡｚｐａを含む突然変異体ＧＦＰのフラグメントの間に検出可能な１Ｄａの質量差があることから明らかなように、Ａｚｐａの大半は分解してｐＡｍｐａとなった。
ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
本発明は哺乳動物細胞宿主系で多様な物理化学的及び生物学的性質をもつ非天然アミノ酸を適切な直交サプレッサーｔＲＮＡに負荷することが可能な突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ酵素（ＲＳ）の迅速なスクリーニングと単離を可能にする一般手法を提供し、更に、前記スクリーニング方法は技術的に困難で時間のかかるスクリーニングを哺乳動物細胞で行う必要がない。これらの方法では、該当非天然アミノ酸を選択的に利用するように突然変異体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を酵母で進化させる。次に同一の突然変異体ＲＳをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡと併用し、セレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して哺乳動物細胞中の該当蛋白質に非天然アミノ酸を部位特異的に組込む。非天然アミノ酸の蛋白質組込みは非天然アミノ酸の組込みを指示するセレクターコドンを含むように該当蛋白質をコードするポリヌクレオチドを改変することにより任意所望位置で行われるようにプログラムされる。
本発明は従来想定されていなかった宿主細胞を含む新規翻訳系も提供する。例えば、本発明の翻訳系は、（ｉ）非天然アミノ酸と、（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、（ｉｉｉ）真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、一般に大腸菌ＲＳから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、（ｉｖ）これらの成分を含む哺乳動物宿主細胞を含み、哺乳動物宿主細胞は齧歯類細胞（例えばマウス細胞又はラット細胞）、又は霊長類細胞、即ちサル（類人猿、ヒト及び旧世界ザルを含む）、新世界ザル及び原猿（例えばキツネザル）と通称される群のいずれかに属する任意細胞とすることができる。本発明では特にヒト細胞を使用する。しかし、本発明では他の宿主細胞も使用するので、本発明は上記宿主細胞に限定されるものではない。
本発明は選択位置に少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法も提供し、前記方法は上記翻訳系を使用する。これらの方法では、蛋白質翻訳中にセレクターコドンの部位に非天然アミノ酸を組込むようにプログラムすることにより非天然アミノ酸を組込む。
本発明は（先ず出芽酵母で進化させた）突然変異体ＲＳを適切な真正細菌（例えばＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するアンバーサプレッサーと併用し、多様な非天然アミノ酸を齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物宿主細胞中の蛋白質に組込む一般アプローチを提供する。原理実証として、この手法を利用し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞とヒト２９３Ｔ宿主細胞でアンバーナンセンスコドンに応答して合計１０種類の異なる非天然アミノ酸を優れた忠実度と良好な効率でモデル蛋白質に部位特異的に組込むのに成功した。例えば、非天然アミノ酸はＣＨＯ細胞で発現させた緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）に細胞２×１０７個当たり蛋白質１μｇまでの効率で個々に組込まれた。質量分析によると、非天然アミノ酸の高い翻訳忠実度が確認された。この手法は細胞試験のために生物学的プローブを蛋白質に導入し易くするはずであり、最終的に哺乳動物細胞で非天然アミノ酸を組込んだ治療用蛋白質を合成し易くなると考えられる。
所定側面において、（限定されないが）本発明を実証するために、本明細書の開示は哺乳動物宿主細胞中の各種モデル蛋白質に非天然アミノ酸部分を組込むことができることを実証する。非天然アミノ酸の組込みは特定該当蛋白質に限定されるものではない。本明細書の開示から明らかなように、特定該当蛋白質への各種非天然アミノ酸の組込みは多様な蛋白質と多様な目的に有利である。
なお、酵母で進化させた突然変異体大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）とＯ−ｔＲＮＡの発現を制御する遺伝子を哺乳動物宿主細胞（例えば齧歯類又はヒト細胞）で直接使用することはできない。これらの遺伝子は哺乳動物細胞バックグラウンドでその発現を誘導するように適切な調節因子で再構築する必要がある。Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ遺伝子に元々関連する酵母転写調節因子は哺乳動物細胞で使用するには無効になる（又はひいき目に見ても最適にはならない）。この点は当業者に認められている。哺乳動物細胞遺伝子発現因子は十分に特性決定されており、その関連する遺伝子配列を最適化（例えば最大化）する目的で組換え構築物で容易に利用可能である。
本発明で使用される非天然アミノ酸
本発明は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを哺乳動物宿主細胞系（例えば霊長類及び齧歯類宿主細胞系）で生産することが可能な直交翻訳系を提供する。これらの翻訳系で利用される非天然アミノ酸は特に限定されない。一般に、本発明で使用される非天然アミノ酸は出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母宿主細胞系で対応する直交ｔＲＮＡを負荷するために大腸菌由来突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより利用可能なものである。例えば、本明細書で利用しているように、以下の非天然アミノ酸が本発明で使用される。
ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）
ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）
ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）
ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）
ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）
ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）。
これらの６種類の非天然アミノ酸の各々の構造を図１に示す。これらのアミノ酸は図１に併記する別称と種々の略称で呼称される場合もある。実施例に示すように、これらの６種類の非天然アミノ酸は先ず酵母宿主細胞系を使用してスクリーニング及び単離された大腸菌由来Ｏ−ＲＳ種を使用してヒト及び齧歯類宿主細胞中の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）に個々に組込まれた。
上記非天然アミノ酸に加え、本発明では他の非天然アミノ酸も使用される。以下の非天然アミノ酸は従来大腸菌由来直交ＲＳにより使用され、酵母宿主細胞系でＯ−ｔＲＮＡに負荷するのに成功している。これらの非天然アミノ酸を挙げると、
α−アミノカプリル酸
ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）
１，５−ダンシルアラニン
ｏ−ニトロベンジルセリン
である。これらの非天然アミノ酸の構造とその各種別称及び略称を図１に示す。
酵母宿主細胞におけるこれらの全非天然アミノ酸の使用の成功は例えばＣｈｉｎら（２００３），“Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７；Ｄｅｉｔｅｒｓら（２００３），“Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１１７８２−１１７８３；Ｓｕｍｍｅｒｅｒら（２００６），“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，”ＰＮＡＳ １０３（２６）：９７８５−９７８９；ＷＯ２００５／００３２９４、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら、発明の名称「反応性非天然アミノ酸遺伝コード付加（ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＲＥＡＣＴＩＶＥ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ ＡＤＤＩＴＩＯＮＳ）」、出願日２００４年４月１６日；ＷＯ２００６／０３４４１０、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら、発明の名称「遺伝コードへの光調節型アミノ酸の付加（ＡＤＤＩＮＧ ＰＨＯＴＯＲＥＧＵＬＡＴＥＤ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ ＴＯ ＴＨＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」、出願日２００５年９月２１日；及びＷＯ２００６／１１０１８２、出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」に記載されている。
本発明で使用される宿主細胞
本発明は従来想定されていなかった宿主細胞を利用する新規翻訳系を提供する。例えば、本発明の翻訳系は、（ｉ）非天然アミノ酸と、（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、（ｉｉｉ）大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、（ｉｖ）これらの成分を含む哺乳動物宿主細胞を含み、哺乳動物宿主細胞は齧歯類細胞（例えばマウス細胞又はラット細胞）、又は霊長類細胞、即ちサル（類人猿、ヒト及び旧世界ザルを含む）、新世界ザル及び原猿（例えばキツネザル）と通称される群のいずれかに属する任意細胞とすることができる。本発明では特にヒト細胞を使用する。本発明で使用される動物細胞株は動物の任意組織に由来することができる。本発明では他の宿主細胞も使用するので、本発明は上記宿主細胞に限定されるものではない。
本明細書で使用する「宿主細胞」なる用語は「細胞株」、この場合には「宿主細胞株」と通称される複数の個々の細胞も含む。
少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために使用される宿主細胞は任意種類の宿主細胞とすることができるが、特に所定の宿主細胞が使用される。例えば、組換え治療用ポリペプチドの生産に使用されるポリペプチドを生産するために所定の宿主細胞種を使用することができる。
宿主細胞が齧歯類細胞である場合には、齧歯類細胞の種類は特に限定されない。実施例に記載するように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を宿主細胞として使用することができる。ＣＨＯ細胞は広く応用されており、組換え蛋白質の発現用の定着システムである。しかし、本発明はこの齧歯類細胞種に限定されるものではない。実際に、組換え蛋白質生産用宿主細胞として使用可能な非常に多数の齧歯類細胞株が当業者に知られている。
齧歯類細胞株としては哺乳動物齧歯目に由来する任意細胞株が挙げられ、限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、シマリス、ビーバー及びリスが挙げられる。齧歯類細胞株としては、ハツカネズミＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓとその全系統に由来する細胞株が挙げられる。同様に、齧歯類細胞としてはラット、例えばＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ノルウェーラット）やＲａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ（クマネズミ）等のクマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ）の任意種とその全系統に由来する細胞株が挙げられる。
本発明の宿主細胞は霊長類細胞でもよい。霊長類細胞の種類は特に限定されない。実施例に記載するように、ヒト胎児腎細胞（別称ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３又は単に２９３）を宿主細胞として使用することができる。２９３細胞は広く応用されており、組換え蛋白質の発現用の定着システムである。しかし、本発明はこのヒト細胞種に限定されるものではない。実際に、組換え蛋白質生産用宿主細胞として使用可能な非常に多数のヒト及び他の霊長類細胞株が当業者に知られている。
霊長類細胞株としては哺乳動物霊長目に由来する任意細胞株が挙げられ、限定されないが、（ｉ）サル（旧世界ザル、ヒトを含む類人猿）、（ｉｉ）新世界ザル及び（ｉｉｉ）原猿（例えばキツネザル）が挙げられる。霊長類細胞株は任意霊長類種に由来することができる。例えば、限定されないが、霊長類細胞株はチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、マカクザル及びアフリカミドリザルに由来することができる（例えばＣＯＳ−１細胞株）。
下表は本発明で使用される細胞株が由来する霊長類種の非網羅的リストである。
これらの霊長類種に由来する細胞株は例えばＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＮＰＲＩＭＡＴ；Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）やＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＰＲＣ；Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，オランダ）のウェブサイトで閲覧できる。
組換えポリペプチドの生産にヒト細胞株を使用することは定着しており、本発明の範囲に含まれる。ヒト宿主細胞株は任意起源とすることができ、任意組織に由来することができる。組換え蛋白質の生産に適したヒト細胞株は広く知られており、当業者に周知の多数の商業的及び私的ソースから入手可能である。
更に、他の多様な哺乳動物種に由来する宿主細胞株も本発明の範囲に含まれる。これらの細胞株としてはウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウマ及びヤギ細胞株が挙げられる。これらの種に由来する細胞株は当分野で公知であり、当業者に容易に入手可能である。
齧歯類細胞株、霊長類細胞株、及び他の哺乳動物群に由来する多数の他の細胞株、並びにこれらの動物細胞株の培養に使用される材料と方法は当分野で定着しており、多数のソースから広く入手可能である。例えば、入手可能な細胞株の広範なリストについては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）参照。細胞用培地は各種ソースから入手可能であり、例えば、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ブランド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））細胞用培地や、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．製培地Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）が挙げられる。更に、少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ組換え蛋白質の生産用宿主細胞として新規細胞株（初代細胞株及び樹立細胞株）の新規樹立も本発明で使用される。
本発明で使用されるＯ−ＲＳ種
本発明は従来想定されていなかった哺乳動物宿主細胞（例えば霊長類及び齧歯類宿主細胞系）で非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産することが可能な新規翻訳系を提供する。本発明の翻訳系は、（ｉ）非天然アミノ酸と、（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、（ｉｉｉ）大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、（ｉｖ）これらの成分を含む哺乳動物宿主細胞を含み、哺乳動物細胞は例えば齧歯類細胞（例えばマウス細胞又はラット細胞）、又は霊長類細胞とすることができる（例えばヒト細胞又はマウス細胞）。本発明は選択位置に少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法も提供し、前記方法は上記翻訳系を使用する。これらの方法では、蛋白質翻訳中にセレクターコドンに非天然アミノ酸を組込むようにプログラムすることにより非天然アミノ酸を哺乳動物宿主細胞に組込む。
本発明で使用されるＯ−ＲＳ種は特に限定されないが、一般に次の性質をもつ。本発明で使用されるＯ−ＲＳは一般に野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＬｅｕＲＳ；配列番号４に記載のアミノ酸配列、及び配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列）や野生型大腸菌チロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ；配列番号６に記載のアミノ酸配列、及び配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列）等の大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される。本発明で使用される突然変異体Ｏ−ＲＳ種（例えば配列番号４又は６から誘導されるシンテターゼ）は出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母宿主細胞系で先ず進化及び選択される。
本発明で使用される多数のこのようなＯ−ＲＳ種が当分野で公知である。出芽酵母において、対応する大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒ／ＴｙｒＲＳ及びｔＲＮＡＬｅｕ／ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ対から機能的ｔＲＮＡＣＵＡ／ＲＳ対を誘導するのに成功した。例えば、Ｃｈｉｎら，“Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，９６４−９６７（２００３）；Ｃｈｉｎら，“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｔｏｗａｒｄ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０，５１１−５１９（２００３）；Ｄｅｉｔｅｒｓら（２００３），“Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１１７８２−１１７８３；Ｓｕｍｍｅｒｅｒら（２００６），“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，”ＰＮＡＳ １０３（２６）：９７８５−９７８９；及びＷｕら，“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６，１４３０６−１４３０７（２００４））参照。ＷＯ２００５／００３２９４、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら、発明の名称「反応性非天然アミノ酸遺伝コード付加（ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＲＥＡＣＴＩＶＥ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ ＡＤＤＩＴＩＯＮＳ）」、出願日２００４年４月１６日；ＷＯ２００６／０３４４１０、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら、発明の名称「遺伝コードへの光調節型アミノ酸の付加（ＡＤＤＩＮＧ ＰＨＯＴＯＲＥＧＵＬＡＴＥＤ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ ＴＯ ＴＨＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」、出願日２００５年９月２１日；及びＷＯ２００６／１１０１８２、出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」も参照。これらの文献は各々その開示内容全体を本明細書に援用する。当分野におけるこの教示は本発明で使用される他のＯ−ＲＳ種の構築の十分な手引きにもなる。
本発明で使用されるＯ−ＲＳ種の例を図１６に示す。Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号８〜５６に示す。対応するＯ−ＲＳポリペプチド配列を配列番号５７〜１０１に示す。なお、ＲＳが本発明で機能するために必ずしも全長Ｏ−ＲＳは必要ない。本発明で使用するには、図１６で所定の配列に示すように、ＲＳ活性部位フラグメントのみの発現で十分な場合もある。本明細書に引用する文献に記載されているように、図１６の各Ｏ−ＲＳ配列は当分野で公知である。
本発明は図１６に示すＯ−ＲＳの使用に限定されるものではない。例えば既存Ｏ−ＲＳ種内に保存アミノ酸置換を行うことにより、本発明で使用されるとして本明細書に記載する任意Ｏ−ＲＳ種を鋳型として使用し、本発明で使用可能な更に他のＯ−ＲＳ種を誘導することができる。新規に誘導されるＯ−ＲＳが対応するＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する生物活性を維持する限り、許容される置換数は限定されない。
Ｏ−ＲＳの生物活性は本発明で使用されるとして示される別の「参照」Ｏ−ＲＳの生物活性の百分率として表すことができる。例えば、本発明で使用されるＯ−ＲＳとしては、Ｏ−ｔＲＮＡと、非天然アミノ酸と、既知配列のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を含む「参照」翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳが挙げられる。閾値活性の選択は任意であり、「５０％」の値は単に１例に過ぎない。実際に、本発明で使用されるＯ−ＲＳとしては、「参照」翻訳系で観測される効率の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳが挙げられる。
本発明で使用されるＯ−ｔＲＮＡ種
本発明で使用される突然変異体Ｏ−ＲＳ種は先ず酵母宿主細胞系で進化及び選択される。酵母宿主細胞系で進化されるＯ−ＲＳ種はＯ−ＲＳにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される適切なＯ−ｔＲＮＡと共働する。例えば、酵母宿主系で機能するサプレッサーＯ−ｔＲＮＡ種は例えば配列番号１又は２のｔＲＮＡとすることができる。
他方、本発明の翻訳系は哺乳動物宿主細胞（例えば齧歯類細胞や霊長類細胞）で直交性の別のＯ−ｔＲＮＡを使用する。例えば、本発明で使用されるＯ−ｔＲＮＡは配列番号３に示すようなＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアンバーサプレッサーチロシルｔＲＮＡＣＵＡ（Ｂｓ−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）とすることができる。このｔＲＮＡ配列の変異体、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する他のｔＲＮＡ、及び他の生物（例えば他の真正細菌種）に由来するｔＲＮＡ種も想定されるので、本発明はこのただ１種のｔＲＮＡ種に限定されるものではない。
直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術
本発明の新規組成物及び方法を理解するには、直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に関連する活性を理解する必要がある。他の非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効率的に機能することができるが、翻訳系に内在性のシンテターゼ及びｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切なｔＲＮＡを含む新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡをただ１種類の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（ないし「負荷」）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは更に一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されない（又は低度にしかアミノアシル化即ち負荷されない）。例えば大腸菌宿主系では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種類の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種類の内在シンテターゼのいずれでもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系の一般原理と、直交翻訳系の一般作製方法は当分野で公知である。例えば、国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９２１０号（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」）；及び米国仮出願第６０／７８３，４９７号（発明の名称「真正細菌宿主細胞における直交翻訳成分の発現用システム（ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＩＮ ＥＵＢＡＣＴＥＲＩＡＬ ＨＯＳＴ ＣＥＬＬＳ）」、出願日２００６年３月１７日）参照。これらの出願は各々その開示内容全体を本明細書に援用する。非天然アミノ酸を組込む直交翻訳系と、その作製及び使用方法のその他の記載については、各々その開示内容全体を本明細書に援用するＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９（６）：５４８−５５４（２００５）；及びＷａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９（２００６）も参照。
直交翻訳系
直交翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸を含む細胞（例えば齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とコグネイトＯ−ＲＳを含むことができる。本発明の直交系は一般に宿主細胞内又は宿主細胞なしにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができる。多成分系に加え、本発明は個々の新規成分も提供し、例えば新規直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド（例えば配列番号５７〜１０１）や、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号８〜５６）が挙げられる。
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常負荷されないため、そうでなければ核酸から翻訳されるはずのポリペプチドの生産が阻止される。直交対系では、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。負荷されたＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに起因する翻訳阻止を抑圧する。
所定側面において、本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
所定態様において、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面において、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
宿主細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の好ましい側面において、細胞は１個以上の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方のＯ−ｔＲＮＡは終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンを同一のコーディング核酸で使用することもできる。
上記のように、所定態様では、２種類以上の非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むことができるように、細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が存在する。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対を含むことができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン（例えばオパールコドン、４塩基コドン等）を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンを認識し易くできるように異なる起源に由来することが望ましい。
所定態様において、系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（限定されないが、例えば齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物細胞）からなり、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と組み合わせることができる。
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための１つのストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの組込みを媒介することが望ましい。所定態様において、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に誘導体化ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ誘導体化ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
本発明で使用されるＯ−ｔＲＮＡの例を本明細書の配列表に記載する（例えば図１６及び配列番号３参照）。本明細書の開示は他の等価Ｏ−ｔＲＮＡ種の設計の手引きにもなる。Ｏ−ＲＳ ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。機能的にほぼ等価の分子を作製するように塩基に更に別の修飾を加えてもよい。
本発明は本明細書に記載する特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表又は図１６に記載する配列と同一配列をもたない分子が挙げられ、更に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい。
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様において、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に導入することができる。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも本発明の特徴である。本発明の所定態様において、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは例えば配列番号３のＯ−ｔＲＮＡの部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、アクセプターステム、Ｄアームもしくはループ、可変ループ、ＴＰＣアームもしくはループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡに付加配列を付加する段階を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性等を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物に対して直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を使用することができる。１例として、齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物細胞で使用するための潜在的直交翻訳成分を選択するためには、宿主生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ））をコードするポリヌクレオチドの（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）非必須位置等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドンのｉｎ ｖｉｖｏ抑圧に基づく選択システム（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス（例えば終止）又はフレームシフト突然変異）を使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観測される。プラスミドで形質転換されていない細胞とほぼ等しい抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交性であるとき）にセレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死をもたらす。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様において、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡを含む細胞に比較して抑圧効率の増加を示す。非機能的ｔＲＮＡ又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡが両者選択後に生存している。
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の所定側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングを使用することもできる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーが挙げられる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：１０４４４−８も参照。
組換え直交ｔＲＮＡのその他の作製方法も例えば国際出願公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ＰＮＡＳ １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明のＯ−ＲＳはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳの１例は配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、配列番号８〜５６のポリヌクレオチド参照。
Ｏ−ｔＲＮＡと併用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（例えばＯ−ＲＳ）の同定方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種類以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術及び本明細書に記載する方法により測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識非天然アミノ酸）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用する効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ ａｎｄ Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」も参照。
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種類の標準アミノ酸のいずれをも負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼに更に突然変異誘発法（例えばＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法）を実施することができる。
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２個以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングする。
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼに更に突然変異誘発法を実施することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の所定側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳの作製方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸透過性の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細については国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」に記載されている。その開示内容全体を本明細書に援用するＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。
資源及び宿主生物
本発明の直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物（又は生物組み合わせ）に由来することができる。直交対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。所定側面において、直交成分は哺乳動物宿主系（例えば齧歯類又は霊長類宿主系）で使用するために大腸菌遺伝子（即ち真正細菌）に由来する。
例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは古細菌生物、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物又は生物組み合わせ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの資源として使用することができる。
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様において、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物細胞）で使用することができる。使用される哺乳動物宿主細胞は特に限定されない。本発明の翻訳成分を含む哺乳動物細胞の組成物も本発明の特徴である。
別の種で使用するためにある種のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングする方法については、国際出願公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」（出願日２００４年４月１６日）も参照。
（例えば、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を含む）直交翻訳系は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明の直交翻訳系は無傷の生存宿主細胞を必要とするものではない。例えば、直交翻訳系は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を使用することは定着技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するようにこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ系を適応させることは十分に本発明の範囲に含まれる。
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、４個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
１態様において、本方法は非天然アミノ酸を細胞にｉｎ ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより非天然アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら，（１９８８），５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ ｖｉｖｏで併用すると、非天然アミノ酸は終止コドンに応答して組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドが得られる。本発明の１態様において、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンＵＡＧ及び／又はオパールコドンＵＧＡである。１例において、セレクターコドンとしてＵＡＧとＵＧＡの両者を使用する遺伝コードは最高頻度の終結シグナルであるオーカーナンセンスコドンＵＡＡを保存しながら２２種類のアミノ酸をコードすることができる。
非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞にさほど影響を与えずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、付加化合物、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤も加えてもよい。
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７９３９参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に利用されている。例えばＫｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様において、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種類が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ “Ｓｈｉｆｔｙ” Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ ｖｉｔｒｏで組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、４塩基ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。４塩基コドンは各種直交系でセレクターコドンとして使用されている。例えば、ＷＯ２００５／０１９４１５；ＷＯ２００５／００７８７０；及びＷＯ２００５／００７６２４参照。その開示内容全体を本明細書に援用するＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。下記実施例ではアンバーセレクターコドンを利用するが、各種非天然アミノ酸Ｏ−ＲＳについて従来記載されている突然変異と同様の突然変異を含むように改変したシンテターゼと４塩基Ｏ−ｔＲＮＡを含むように下記実施例を変更することにより、４塩基以上のコドンも使用することができる。
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、このような系としては、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝子アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、トリプレットコドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対に関する記載としては、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２が挙げられる。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連刊行物は以下に挙げる。
ｉｎ ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基もその後の複製のチェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種類の遺伝的にコードされた以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式Ｉ：

により表される。
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種類の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種類の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種類のα−アミノ酸以外の天然化合物でもよい。
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
本明細書に記載する実施例では図１に示す非天然アミノ酸に特に着目しているが、本発明はこれらの構造に厳密に限定されるものではない。実際に、その親構造（即ち図１に示す構造）の基本的特徴を保持しながら同様に本明細書に記載するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば配列番号５７〜１０１のＯ−ＲＳ）により特異的に認識される容易に誘導される構造的に近縁の各種類似体も容易に作製することができる。これらの近縁アミノ酸類似体も本発明の範囲に含むものとする。
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
別の側面において、本発明は下式ＩＶ：

により表される一般構造をもつ非天然アミノ酸を提供する。
この構造をもつ非天然アミノ酸は一般にＲ１が２０種類の天然アミノ酸の１種（例えば、チロシン又はフェニルアラニン）で使用される置換基であり、Ｒ２が置換基である任意構造である。従って、この種のアミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
図１に示す非天然アミノ酸構造に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：

の構造により表されるような修飾主鎖構造も含むことができ、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより示すようにアミノ基又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種類の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
所定側面において、本発明はＬ配置の非天然アミノ酸を利用する。しかし、本発明はＬ配置非天然アミノ酸の使用に限定されるものではない。これらの非天然アミノ酸のＤエナンチオマーも本発明で使用できると考えられる。
本発明で使用される非天然アミノ酸は図１に示す非天然アミノ酸に厳密に限定されない。当業者に自明の通り、天然アミノ酸の多種多様な非天然類似体が容易に誘導される。例えば、限定されないが、フェニルアラニン又はチロシンから誘導される非天然アミノ酸が容易に作製される。チロシン類似体としては、例えばパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、スルホチロシン、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリンアミノ酸、７−ヒドロキシ−クマリンアミノ酸、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。更に、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は本明細書に引用する文献に開示されている。国際出願公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９２１０、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」、出願日２００５年１０月２７日も参照。
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については、例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては、例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｋｉｄｄ，（１９４９）“Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ（１９５９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇら（１９８８）“Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ），”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙら（１９９１）“Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，（１９８９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）“Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照。
非天然アミノ酸の細胞取込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより、非天然アミノ酸の生合成経路を場合により宿主細胞で作製する。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３，前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として利用可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），“Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），“ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）」として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダムに突然変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｃｏｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ）」ＷＯ００／４６３４４参照。
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により、このアプローチを本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｃｉｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒａｐｉｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路改変技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路改変アプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １，３ ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｔｒａｉｔｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
使用する方法に関係なく、一般に本発明の改変生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然の細胞内の量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞内資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を改変し、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
非天然アミノ酸を組込むための直交成分
本発明はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖に図１に示す非天然アミノ酸を例えばｉｎ ｖｉｖｏで組込むための直交成分を作製するための組成物と方法を提供する。例えば、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために使用することができる。
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを図１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様において、Ｏ−ＲＳは配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列及びその保存変異体を含む。本発明の所定態様において、Ｏ−ＲＳは如何なる内在ｔＲＮＡよりも優先的にＯ−ｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと同一非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号３）及び実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様において、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上である。所定側面において、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は大腸菌に由来する直交ロイシル又はチロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は場合により宿主細胞（例えば齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物細胞）及び／又は完全翻訳系を含むことができる。
翻訳系を含む細胞（例えば齧歯類細胞又は霊長類細胞）も本発明により提供され、前記翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；図１に示す非天然アミノ酸を含む。一般にＯ−ＲＳは如何なる内在ｔＲＮＡよりも優先的にＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳは優先的にＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。１態様において、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。１態様において、Ｏ−ＲＳは配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列及びその保存変異体を含む。
本発明の細胞は場合により更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳは対応するＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のアミノ酸は第１の非天然アミノ酸と異なる。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
所定態様において、本発明の細胞は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む哺乳動物細胞（例えば齧歯類細胞又は霊長類細胞）であり、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様において、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率よりも高い効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
本発明の所定態様において、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号３）もしくは実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様において、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列表に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。１態様において、Ｏ−ＲＳ又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載するようなアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は非真核生物）の任意のものに由来することができる。
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号８〜５６）は本明細書の配列表に記載するようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドを含むか、及び／又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードする。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸のポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致するポリヌクレオチドを含み（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸以外のものである）、前記ｔＲＮＡはセレクターコドン（例えば４塩基コドン）を認識する。上記任意ポリヌクレオチド及び／又は上記任意ポリヌクレオチドの保存変異体を含むポリヌクレオチドと例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターとしてはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物が挙げられる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１種のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、セレクターコドンを認識できるように突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供する段階と、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の第１の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールが得られ、それにより少なくとも１種のＯ−ｔＲＮＡが得られる。本発明の方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも提供する。
所定態様において、前記方法は更に第１の種の第２の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すｔＲＮＡプールのメンバーを含む細胞を選択又はスクリーニングすることにより、Ｏ−ｔＲＮＡが得られる。所定態様において、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。
非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第１の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）のメンバーと；２）（例えば１種類以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。
複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞（例えば宿主細胞）を選択又はスクリーニングする。これらの選択／スクリーニング後の細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。この方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼも本発明の特徴である。
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を宿主細胞（例えば齧歯類細胞や霊長類細胞等の哺乳動物細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を準備する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
本発明は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様において、蛋白質は公知蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分）のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
本明細書に記載するように、本発明は例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列と、ポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、例えば前記ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を含む組成物、系及び方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳアミノ酸及びヌクレオチド配列）の例を本明細書に開示する（図１６、例えば配列番号３及び８〜１０１参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書、例えば実施例や配列表に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ多数の関連配列（例えば、本明細書に開示するＯ−ＲＳの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド）も提供する。酵母宿主細胞系でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化することが可能な直交シンテターゼ種（Ｏ−ＲＳ）を構築及び分析するための一般手法は当分野で公知である。
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号８〜５６から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に配列番号５７〜１０１から選択されるＯ−ＲＳアミノ酸配列をコードする任意ポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸（天然ポリヌクレオチド以外のもの）も本発明のポリヌクレオチドである。１態様において、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する（但し１００％は一致しない）人工ポリヌクレオチドも含む。
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様において、ベクターは発現ベクターである。別の態様において、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１個以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であると判断される配列も本発明に含まれる。
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中のアミノ酸１個又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換されたものが挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
核酸ハイブリダイゼーション
本発明の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好ましい１方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号８〜５６により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は少数のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも５０％の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）に記載されており、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄと、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的では、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件が挙げられる。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
所定側面において、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。例えば本発明の核酸又は関連核酸を同定するためのプローブとして任意ユニークサブ配列が有用である。
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定される。
配列比較、一致度及び相同度
２個以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は２個以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
２個以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２個以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１００残基長の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸を発現させると、１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２個以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に利用可能である。
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）参照）により実施することができる。
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）。
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２個のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーターに加え、例えば非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発法を使用する。これらの方法としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）に基づいて突然変異誘発を誘導することができる。
本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクターや発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４）、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３）、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージは当業者に広く公知であり、各種ソースから入手可能である。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎｎａｓａｓ，ＶＡ）及びＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）参照。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００６年補遺）；及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，第２版，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の企業等の各種商業ソースからほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合わせて適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えばその後の核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
特定位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を準備する段階を含み、細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
所定態様において、Ｏ−ＲＳは発現系において如何なる内在ｔＲＮＡよりもコグネイトＯ−ｔＲＮＡのアミノアシル化を優先する。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
本発明は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様において、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物を場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」、及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、本明細書に援用する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば齧歯類又は霊長類細胞）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（例えば図１の非天然アミノ酸）のｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。系に付加される非天然アミノ酸は合成アミノ酸（例えばフェニルアラニン又はチロシン誘導体）とすることができ、外部から増殖培地に添加することができる。場合により、本発明の組成物はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。所定側面において、組成物は場合により、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、又はそれ以上、あるいはｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面において、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば蛋白質少なくとも１０μｇ／ｌ、蛋白質少なくとも５０μｇ／ｌ、蛋白質少なくとも７５μｇ／ｌ、蛋白質少なくとも１００μｇ／ｌ、蛋白質少なくとも２００μｇ／ｌ、蛋白質少なくとも２５０μｇ／ｌ、蛋白質少なくとも５００μｇ／ｌ、蛋白質少なくとも１ｍｇ／ｌ、又は蛋白質少なくとも１０ｍｇ／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
非天然アミノ酸の組込みは例えばサイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット、ラベル又は反応基の組込み等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を適応させるために実施することができる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学的及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有結合的）反応性等の性質を改変する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
本発明の所定側面において、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだ１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面において、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個が非天然アミノ酸である蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸を組込んだほぼ任意蛋白質（又はその部分）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を作製することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように利用可能な任意突然変異法を調整することにより、１個以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１個以上の非天然アミノ酸を含む。１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばヒルジン、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、カスパーゼ、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロカスパーゼ３、プロカスパーゼ９、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ並びに他の多数の蛋白質が挙げられる。
本明細書に記載する非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して作製することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
本発明の蛋白質（例えば１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としてはヒルジン、サイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物等の生理活性蛋白質が挙げられ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓカタログと価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１個以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
他の各種蛋白質も本発明の組成物と方法を使用して１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１個以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
所定態様において、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば非天然アミノ酸を組込むために１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１個以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１個以上の非天然アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンを含む任意核酸も含む。
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を作製するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼを発現する１個以上のベクターと、誘導体化すべき蛋白質をコードするベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含むポリペプチド）を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより作製されたフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，１９９９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で作製することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細は国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０３５６０５、発明の名称「糖蛋白質合成（ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」；及びＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＲＲＡＹＳ）」に記載されている。
Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物を場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、本明細書に援用する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌又は酵母）に導入すると、前記対はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して外部から増殖培地に添加することができる非天然アミノ酸の蛋白質（例えばミオグロビン試験蛋白質又は治療用蛋白質）へのｉｎ ｖｉｖｏ組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、細胞内ｉｎ ｖｉｖｏ系に導入してもよい。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は多様な用途の任意のものに使用することができる。例えば、蛋白質に組込まれた非天然部分は例えば、他の蛋白質、小分子（例えばラベルや色素）及び／又は生体分子との架橋をはじめとする多様な修飾の任意のもののターゲットとして利用することができる。これらの修飾により、非天然アミノ酸の組込みの結果、治療用蛋白質を改善することができ、更に酵素の触媒機能を改変又は改善するために使用することもできる。所定側面において、非天然アミノ酸の蛋白質組込みとその後の修飾は蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用等の研究を助長することができる。
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を齧歯類又は霊長類細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳポリペプチドを収容する少なくとも１個の容器を含む。１態様において、キットは更に非天然アミノ酸を含む。別の態様において、キットは更に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するための説明書を含む。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により特許請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。特許請求の範囲に記載する発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に認識されよう。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
哺乳動物細胞における非哺乳動物翻訳成分によるナンセンス抑圧の技術的限界
哺乳動物細胞で非天然アミノ酸を遺伝的にコードさせるための１つのストラテジーは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又は出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主系で作製されている既存突然変異体ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を適応させる方法であろう。大腸菌におけるｔＲＮＡＴｙｒ識別成分は可変アームとアクセプターステムのＧ１：Ｃ７２塩基対を含み、哺乳動物細胞における識別成分と異なる（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００４），“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４４：３４−６６；及びＢｏｎｎｅｆｏｎｄら（２００５），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）／ＴｙｒＲＳ ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８７：８７３−８８３）ため、細菌で使用されているｔＲＮＡ／ａａＲＳ対は残念ながら真核細胞では直交性になると思われない。他方、出芽酵母と哺乳動物細胞におけるｔＲＮＡは同様にプロセシングされ、同一識別成分をもつ（Ｂｏｎｎｅｆｏｎｄら（２００５），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）／ＴｙｒＲＳ ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８７：８７３−８８３）。更に、出芽酵母の翻訳機構も高等真核生物の翻訳機構と相同であるため、出芽酵母で進化させた改変型直交ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を哺乳動物細胞に導入できると考えられる。実際に、Ｙｏｋｏｙａｍａらはｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＢｐａ）をＣＨＯ細胞でヒトＧｒｂ２蛋白質に組込むためにこの光反応性アミノ酸を受容するように出芽酵母で進化させたＥｃＴｙｒＲＳ変異体を使用した（Ｈｉｎｏら（２００５），“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２，２０１−２０６）。残念ながら、機能的に活性な大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡは哺乳動物細胞では十分に発現しないので、突然変異体蛋白質の収率は著しく制限される（Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００２）“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：４６９２−４６９９）。
哺乳動物細胞における新規ナンセンス抑圧システムの創製
上記直交ｔＲＮＡ発現の欠点を解決するために、本発明は酵母で進化させた突然変異体サプレッサーｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を哺乳動物細胞で使用できるように導入することが可能な一般システムを提供する。本実施例ではこの方法と新規直交システムが齧歯類ＣＨＯ宿主細胞と霊長類（ヒト）２９３Ｔ宿主細胞の両者で多数の非天然アミノ酸を緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）に効率的に導入することを実証する。これらの２種類の細胞型を実験的に使用したが、本発明は多様な種に由来する哺乳動物宿主細胞に広く適用可能である。
新規哺乳動物ナンセンス抑圧システムの創製
真核生物におけるｔＲＮＡは２つの保存された遺伝子内転写調節因子、即ちＡボックスとＢボックスを認識するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写される（Ｓｐｒａｇｕｅ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ，ＡＭＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；１９９４）。大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒはＢボックス因子しかもたず、偽Ａボックスを導入すると、ＥｃＴｙｒＲＳにより認識されない非機能的ｔＲＮＡとなることが示されている（Ｓａｋａｍｏｔｏら，“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：４６９２−４６９９（２００２））。大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒと異なり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するｔＲＮＡＴｙｒ（同様の識別成分をもち、ＥｃＴｙｒＲＳにより負荷される；Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ，“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）ｂｙ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，”Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２，５８９−５９８（１９９０））は天然の内部Ａ及びＢボックスをもつ。従って、このｔＲＮＡはＥｃＴｙｒＲＳと共働し、哺乳動物細胞で直交ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対として機能することができる（Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００２），“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：４６９２−４６９９）。
アンバーサプレッサー直交ｔＲＮＡの構築と発現
アンバーサプレッサーＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを得るために、ＢｓｔＲＮＡＴｙｒの３塩基アンチコドンをＣ（３４）ＵＡに置換した。原核ｔＲＮＡＴｙｒのＧ３４はＴｙｒＲＳの弱い識別成分に過ぎない（Ｈｏｕ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ（１９８９），“Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：４９４２−４９４７）ので、Ｇ３４Ｃ突然変異はＥｃＴｙｒＲＳとＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡの結合にさほど影響を与えないはずである。更に、哺乳動物ゲノムではＴＡＧ終止コドンの頻度が低い（ヒトではＴＡＧ，２３％；ＴＡＡ，３０％；ＴＧＡ，４７％）ため、哺乳動物細胞ではナンセンスアンバー抑圧のほうがオパール又はオーカー抑圧よりも良好に許容されるはずである。真核生物におけるＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子の抑圧は５’フランキング配列にも依存するので、哺乳動物細胞におけるその転写を強化するためにヒトｔＲＮＡＴｙｒの５’フランキング配列をＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡに付加した。ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡの転写を更に増加するために、ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子の３個のタンデム反復を含む遺伝子クラスターを構築し、この遺伝子クラスターをｐＵＣ１８プラスミドに挿入し、ｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを得た。ｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から単離した全ｔＲＮＡのノーザンブロット分析によると、ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ１コピーしか含まないｐＵＣ１８プラスミドをトランスフェクトした細胞に比較して２倍のＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ濃度であることが判明した。
直交シンテターゼの発現
次に、野生型ＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡに挿入し、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）による制御下のＣＭＶプロモーターにより発現を制御されるｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳを得た。誘導発現を使用したのは、哺乳動物細胞におけるＥｃＴｙｒＲＳの異種発現により生じる可能性のある毒性を低下させるためであった。
機能的ＥｃＴｙｒＲＳ／ＢｓｔＲＮＡ Ｔｙｒ ＣＵＡ 直交対の実証
得られたサプレッサーＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＥｃＴｙｒＲＳ対がモデル蛋白質である緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ（ＧＦＰ３７ＴＡＧ）のＹ３７位のアンバーコドン突然変異を効率的に抑圧する能力を哺乳動物細胞でアッセイした。Ｙ３７はＧＦＰの表面に位置し、フルオロフォアから遠位にあるので、非天然アミノ酸をこの位置に導入しても蛋白質の折り畳み及び蛍光特性に影響しないと予想される（Ｏｒｍｏら（１９９６），“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２−１３９５）。更に、ＧＦＰ３７ＴＡＧのアンバー抑圧の結果、全長ＧＦＰが発現され、アンバー抑圧効率の迅速な定量的アッセイとなる。突然変異体ＧＦＰ３７ＴＡＧ遺伝子をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡに挿入し、ＧＦＰがＣ末端のｍｙｃ及び６×Ｈｉｓエピトープに融合され、Ｔｅｔ制御下のプロモーターの制御下におかれたｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧを得た。
ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＥｃＴｙｒＲＳ対がＧＦＰ３７ＴＡＧのナンセンスアンバーコドンを抑圧する能力をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）齧歯類ＣＨＯ細胞及びヒト２９３細胞の両者で試験した。どちらの細胞株もテトラサイクリンリプレッサーを構成的に発現し、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡプラスミドを使用して蛋白質をＴｅｔの調節下に発現させるのに適している。細胞を８０〜９０％コンフルエントまで増殖させ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞は１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０μｇ／ｍｌブラスチシジンを添加したＦ１２培地で増殖させ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞は１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び５μｇ／ｍｌブラスチシジンを添加したＤＭＥＭ中で増殖させ）、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ製品ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６を使用して細胞２×１０６個当たりプラスミド３μｇを一過的にトランスフェクトした（ｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ ０．５μｇ、ｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳ ０．５μｇ、及びｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧ ２μｇをトランスフェクトし、ｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ又はｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳが存在しない場合には同量のｐＵＣ１８で代用した）。トランスフェクションから６時間後にテトラサイクリン１μｇ／ｍｌを添加して蛋白質発現を誘導し、細胞を３７℃で２日間増殖させた。どちらの細胞株でも全長ＧＦＰの発現はＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子とＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子の両者に依存する（図１３Ａ及び１３Ｂ参照）。ｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧとｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳ又はｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ単独をトランスフェクトした場合には、細胞は緑色蛍光を示さなかった。これらの実験から実証されるように、ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡはＥｃＴｙｒＲＳのみにより負荷され、ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＥｃＴｙｒＲＳ対は霊長類細胞及び齧歯類細胞でナンセンスアンバーコドンを抑圧するように効率的に機能することができる。
６種類の非天然アミノ酸を使用した系普遍性の実証
この直交系の普遍性を試験した。この試験系では、ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡと６種類のＥｃＴｙｒＲＳ変異体が対応する非天然アミノ酸をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞株及び２９３細胞株の両者でＧＦＰ３７ＴＡＧに組込む能力を試験した。６種類のＥｃＴｙｒＲＳ変異体は以下の非天然アミノ酸：
ｐ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＭｐａ）
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｐａ）
ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＢｐａ）
ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＩｐａ）
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）
ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）
をコードするように予め出芽酵母で進化させた。
これらの非天然アミノ酸の構造を図１、構造１〜６に示す。シンテターゼ変異体の選択と単離については例えばＣｈｉｎら（２００３），“Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７；Ｄｅｉｔｅｒｓら（２００３），“Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１１７８２−１１７８３；ＷＯ２００５／００３２９４、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら、発明の名称「反応性非天然アミノ酸遺伝コード付加（ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＲＥＡＣＴＩＶＥ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ ＡＤＤＩＴＩＯＮＳ）」、出願日２００４年４月１６日；及びＷＯ２００６／０３４４１０、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら、発明の名称「遺伝コードへの光調節型アミノ酸の付加（ＡＤＤＩＮＧ ＰＨＯＴＯＲＥＧＵＬＡＴＥＤ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ ＴＯ ＴＨＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」、出願日２００５年９月２１日に記載されている。
６種類のＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子を各々ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡに挿入し、ｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳ誘導体を得、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞及び２９３細胞におけるａａＲＳの発現をウェスタンブロット分析により確認した（図１４）。全６種類のＥｃＴｙｒＲＳ変異体はＴ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞株とＴ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞株の両者で同等の発現レベルを示す。
次に６種類のＥｃＴｙｒＲＳ変異体がＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡと共働してＧＦＰ３７ＴＡＧでアンバーコドンを抑圧する能力を増殖培地中で非天然アミノ酸の存在下と不在下に試験した。野生型ＥｃＴｙｒＲＳについて記載したように、細胞にプラスミドを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションから６時間後に、テトラサイクリン１μｇ／ｍｌと対応する非天然アミノ酸（ｐＭｐａ，１０ｍＭ；ｐＡｐａ，１０ｍＭ；ｐＢｐａ，１ｍＭ；ｐＩｐａ，８ｍＭ；ｐＡｚｐａ，５ｍＭ；又はｐＰｐａ，１ｍＭ）を添加した新鮮な培地に培地を交換した。その後、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞株では２４時間、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞株では４８時間、細胞を増殖させた後に回収した。図２及び図３に示すように、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞及び２９３細胞のいずれにおいても全長ＧＦＰ３７ＴＡＧの発現は増殖培地中の非天然アミノ酸の存在に依存した。非天然アミノ酸の不在下ではＧＦＰ発現は検出されず（＜１％）、ＥｃＴｙｒＲＳ変異体はＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡにそのコグネイト非天然アミノ酸を高い忠実度で特異的に負荷することが分かった。Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞ではｐＩｐａを含有するＧＦＰの発現レベルは低く、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞ではｐＩｐａを含有するＧＦＰ発現は検出されなかったが、これは恐らくｐＩｐａの細胞毒性によるものと思われる（８ｍＭ ｐＩｐａの存在下で、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞は６時間で死滅する）。
ｐ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニンを組込むための直交成分の発現用改善型プラスミド発現システム
ｐ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＭｐａＲＳ）の異種発現は使用した増殖条件下で明白な細胞毒性を示さなかったので、（ａ）ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子の３個のタンデム反復と、（ｂ）ｐＭｐａＲＳ遺伝子をコードするように、ｐＭｐａＲＳ遺伝子を含むプラスミドを改変した（図４ＡのｐＳＷＡＮ−ｐＭｐａＲＳ）。
ｐＭｐａＲＳの効率的連続発現のために非制御下のＣＭＶプロモーターの直後にｐＭｐａＲＳ遺伝子を挿入した。ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子の３個のタンデム反復とＧＦＰ３７ＴＡＧ遺伝子を含む別のプラスミド（図４ＢのｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧ）も構築した。哺乳動物細胞における内在アンバー抑圧に起因するナンセンスアンバーコドンの潜在的読み飛ばしを最小限にするために、Ｔｅｔ制御下のＣＭＶプロモーターの後にＧＦＰ３７ＴＡＧをコードする遺伝子を挿入した。次にこれらの２種類のプラスミドの抑圧効率をアッセイした。どちらのプラスミドもＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子の３個のタンデム反復を含んでいるので、抑圧レベルを上げるためにこれらの２種類のプラスミドの比を変えても細胞にトランスフェクトされるＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子の総量は変化しないと予想される。最適化トランスフェクション条件下（細胞２×１０６個当たりｐＳＷＡＮ−ｐＭｐａＲＳ ０．５μｇ及びｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧ ２．５μｇ）において、抑圧レベルは３種類のプラスミドｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ、ｐｃＤＮＡ４−ｐＭｐａＲＳ、及びｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧを使用した場合の約２倍になる（抑圧レベルは蛍光細胞数により測定した）。細胞を誘導後１〜２日間増殖させ、回収まで生存可能に維持した。ｐＭｐａを含む突然変異体ＧＦＰ（ＧＦＰ−ｐＭｐａ）の収率も定量した。増殖培地中に１０ｍＭ ｐＭｐａの存在下では、２×１０７個の接着性Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞から１μｇの突然変異体ＧＦＰを得ることができる。
質量分析と忠実度分析
ＧＦＰ−ｐＭｐａを更に特性決定するために、ｐＳＷＡＮ−ｐＭｐａＲＳとｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧの両者を一過的にトランスフェクトしたＴ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞で突然変異体蛋白質を発現させた。抗ｍｙｃ抗体アガロースカラムを使用して蛋白質を精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのＧＦＰ−ｐＭｐａバンドをトリプシンで消化し、ナノスケール逆相液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析（ｎａｎｏ−ＲＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析した。同時に、ｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰをトランスフェクトした細胞から野生型ＧＦＰを精製し、同一分析に付した。
突然変異体蛋白質からのＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ（図５及び配列番号１０３参照）（配列中、Ｙ＊はチロシン又はｐＭｐａを表す）のフラグメントを含むトリプシン処理Ｙ３７のタンデム質量スペクトルは強いｐＭｐａピークを示し、ｐＭｐａの効率的な組込みが判明した（図６及び図７参照）。Ｙ＊を含有するイオン（ｙ３〜ｙ１４）はいずれも野生型ＧＦＰに比較して１４Ｄａの質量シフトがあり、これはチロシンとｐＭｐａの質量差に厳密に一致する。ｙイオン系列の質量シフトに加え、図７にｂ１３イオンの同一質量シフトが認められることから、明らかにｐＭｐａ組込み部位はＧＦＰの３７位であると判断される。
ｐＭｐａ含有ペプチドとチロシン含有ペプチドのＭＳピークの比も得た。ＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ（図５及び配列番号１０３参照）の前駆イオンのシングルイオンクロマトグラムの積分によると、ｐＭｐａの組込みの忠実度は高いと思われる（＞９９．９％）。タンデムＭＳデータにおいて最も存在量の多い３個のフラグメントイオン（ｙ９，ｙ１１，及びｙ１２）のモニターに基づく推定値は更に高純度を示唆している（９９．９３％）。親蛋白質の質量を獲得するために、抗ｍｙｃ抗体カラムにより精製した突然変異体蛋白質をＥＳＩ ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。Ｎ末端メチオニンをもたないアセチル化突然変異体蛋白質の理論質量は２９，６９６．００Ｄａであり、図８の荷電状態逆畳み込みＥＳＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトルに認められる２９，６９６．０Ｄａの主成分に良好に一致する。２９，６５４．０Ｄａの小さいほうのピークはＮ末端アセチル化のないＧＦＰ−ｐＭｐａの質量に帰属される。野生型ＧＦＰ又は複数のｐＭｐａの組込みを示すシグナルは検出されなかった。この結果はｐＭｐａがＧＦＰの３７位に選択的に組込まれることを更に裏付けるものである。
ｐＡｐａ、ｐＢｐａ、ｐＩｐａ、ｐＡｚｐａ及びｐＰｐａを組込む直交成分の発現用改善型プラスミド発現システム
各種シンテターゼ変異体をコードする遺伝子をサブクローニングすることによりプラスミドを再構築し、他のｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体２プラスミドシステムを得た。これらのシンテターゼ変異体は以下の通りである。
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＡｐａＲＳ）
ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＢｐａＲＳ）
ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＩｐａＲＳ）
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＡｚｐａＲＳ）
ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＰｐａＲＳ）。
Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞及び２９３細胞にｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体とｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧ（細胞２×１０６個当たりｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体０．５μｇ及びｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧ ２．５μｇ）を一過的にトランスフェクトした処、いずれもｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ、ｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体及びｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧの３種類のプラスミドの約２倍の抑圧レベルが得られた（但し、ｐＩｐａ特異的変異体は除く）。ｐＡｐａ、ｐＢｐａ、ｐＡｚｐａ又はｐＰｐａを含む突然変異体ＧＦＰもｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体とｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧをトランスフェクトしたＴ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞で発現させ、対応する非天然アミノ酸（ｐＡｐａ，１０ｍＭ；ｐＢｐａ，１ｍＭ；ｐＡｚｐａ，５ｍＭ；又はｐＰｐａ，１ｍＭ）を添加した培地で１〜２日間増殖させ、抗ｍｙｃ抗体カラムを使用して精製した。ｐＡｐａとｐＡｚｐａを含む突然変異体蛋白質の収率はｐＭｐａの場合の収率に近く（細胞２×１０７個当たり〜１μｇ）、ｐＢｐａとｐＰｐａを含む突然変異体蛋白質の収率は多少低かった（細胞２×１０７個当たり〜０．７μｇ）。Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞におけるＥｃＴｙｒＲＳ変異体の発現レベルも同様であることから、ｐＢｐａとｐＰｐａを含む突然変異体蛋白質のレベルが低いのは培地中の非天然アミノ酸濃度が低いためであると思われる。
突然変異体ＧＦＰ蛋白質を更にｎａｎｏ−ＲＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に付し、ＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ（図５及び配列番号１０３）のトリプシン処理フラグメントのタンデムＭＳを得た。
タンデムＭＳデータ（図９〜１２）はＧＦＰの３７位における非天然アミノ酸の組込みを明白に示した。ｐＡｚｐａを含む突然変異体ＧＦＰは弱くしか検出できなかった。データを精査した処、その代わりにｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡｍｐａ）を含むペプチドが存在していることが判明した（図１５）が、アジド基の化学反応性と光不安定性を考慮すると、これは意外ではない（ｐＡｍｐａはｐＡｚｐａを含むペプチドのＭＳ分析から従来観測されている；Ｃｈｉｎら（２００３），“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０，５１１−５１９）。ｐＢｐａサンプルには微量の野生型ペプチドが検出されたが、ｐＢｐａ／チロシン比を正確に定量するにはシグナルが弱過ぎた。ｐＡｐａ、ｐＡｚｐａ、及びｐＰｐａサンプルでは野生型シグナルを検出することができなかった。全５種類の突然変異体蛋白質からのデータは非天然アミノ酸組込みの高い選択性と忠実度を示している。
考察／結論
哺乳動物ゲノムでは、大腸菌（７％）に比較してアンバー終止コドンの頻度が高い（ヒトでは２３％）。従って、必須蛋白質が正しく終結されない場合にはアンバー抑圧は細胞に対して毒性になる可能性がある。Ｙｏｋｏｙａｍａらは、そのコグネイトｔＲＮＡに３−ヨード−Ｌ−チロシンを負荷する突然変異体ＥｃＴｙｒＲＳを誘導発現させると、３−ヨード−Ｌ−チロシンの不在下の突然変異体ａａＲＳによる内在チロシンのバックグラウンド組込みにより生じる可能性のある細胞毒性を最小限にできることを示した。本明細書に記載する本発明はこの問題の解法を提供する。全ＥｃＴｙｒＲＳ変異体を出芽酵母で２段階ポジティブ／ネガティブ選択スキームから進化させ、内在アミノ酸を組込むａａＲＳ変異体を排除した。ｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体とｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧを細胞に同時にトランスフェクトすると、非天然アミノ酸の不在下ではＧＦＰ３７ＴＡＧにおけるナンセンスアンバーコドンの読み飛ばしは認められず、ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対は非天然アミノ酸の不在下では天然ＴＡＧ終止コドンを効率的に抑圧しないことが示唆された。従って、ｔＲＮＡ及びａａＲＳ蛋白質を安定に発現する細胞株は非天然アミノ酸の不在下で生存可能であると思われる。内在アンバー抑圧は認められないので、非天然アミノ酸を含む標的蛋白質の発現に誘導は不要である。ｔＲＮＡ、ａａＲＳ及び標的蛋白質遺伝子を維持する安定な細胞株が創製されるならば、細胞に非天然アミノ酸を添加したときに非天然アミノ酸を含む標的蛋白質を効率的に生産することが可能になろう。本実施例に記載する原理実証実験では、宿主哺乳動物細胞は非天然アミノ酸の添加後、３日間生存したが、この期間は組換え蛋白質発現に十分であると思われる。
１，５−ダンシルアラニン、ｏ−ニトロベンジルシステイン及びα−アミノカプリル酸を含む他の非天然アミノ酸にこれらの試験を拡張するのに成功した。本発明は本明細書に記載する細胞株又は非天然アミノ酸に限定されるものではない。
哺乳動物細胞における光調節型蛋白質配列
本発明の翻訳系及び方法の所定態様において、非天然アミノ酸はｏ−ニトロベンジルセリン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、α−アミノカプリル酸等の光調節型アミノ酸である。例えば酵素、受容体、イオンチャネル等を直接調節するか又は各種シグナル伝達分子の細胞内濃度を調節することにより、各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御するために光調節型アミノ酸（例えばフォトクロミックアミノ酸、光分解性アミノ酸、光異性化可能なアミノ酸等）を使用することができる。例えばＳｈｉｇｅｒｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，２００１，９１：８５＋；Ｃｕｒｌｅｙら．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，１９９９，８２：３４７＋；Ｃｕｒｌｅｙら．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．，１９９９，３：８４＋；“Ｃａｇｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ．Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｇ．，Ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９８，Ｖ．２９１；Ａｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，５５：７５５＋；及びＢｏｃｈｅｔら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ １，２００２，１２５＋参照。
大腸菌ｔＲＮＡＬｅｕに由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡの転写レベルを増加するために、サプレッサーｔＲＮＡをヒト開始ｔＲＮＡＭｅｔの５’及び３’フランキング配列の制御下に置いた。過剰転写されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡをｏ−ニトロベンジルシステインに特異的な突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼと併用し、チャイニーズハムスター卵巣細胞とヒト２９３Ｔ細胞内のヒトプロカスパーゼ３活性部位にこの非天然アミノ酸を部位特異的に組込んだ。ｏ−ニトロベンジルシステインの存在下で蛋白質を発現させた後、紫外線を５分間照射した処、細胞死が開始し、紫外線は非天然システイン残基からニトロベンジル基の開裂を誘導し、プロカスパーゼ３の活性を回復し、その結果、細胞アポトーシスが開始したものと思われた。
本実験は、例えば紫外線を使用することにより例えば蛋白質活性を空間的に制御するために、哺乳動物生細胞中の蛋白質においてｏ−ニトロベンジルシステインによる活性部位システインの選択的置換を利用できることを裏付けるものである。各種反応部位基をもつ蛋白質でも同様の結果を得ることができる（例えば、セリンプロテアーゼの活性部位残基でのｏ−ニトロベンジルセリンの利用）。フォトケージドアミノ酸又は光調節型アミノ酸に関する更に詳細については、その開示内容全体を本明細書に援用するＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０３４４１０、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら（２００６年３月３０日）、発明の名称「遺伝コードへの光調節型アミノ酸の付加（Ａｄｄｉｎｇ Ｐｈｏｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ）」に記載されている。
材料と方法：哺乳動物細胞トランスフェクションとウェスタンブロット分析
Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞とＴ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））はいずれもｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡプラスミドに挿入された遺伝子の発現を調節するテトラサイクリンリプレッサーを構成的に発現する。５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下にＦ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、１０％ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、及び１０μｇ／ｍｌブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））中で３７℃にてＴ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞を増殖させ、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下にＧｉｂｃｏ Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び５μｇ／ｍｌブラスチシジン中で３７℃にてＴ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞を増殖させた。Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）６ウェル細胞培養クラスターで細胞を８０〜９０％コンフルエントまで増殖させた後、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してプラスミドをトランスフェクトした（ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）９μｌ＋プラスミド３μｇ）。トランスフェクションから６時間後にテトラサイクリン１μｇ／ｍｌを添加した新鮮な培地に培地を交換した。
その対応する非天然アミノ酸の存在下におけるＥｃＴｙｒＲＳ変異体のアンバー抑圧を試験するために、新鮮な培地に非天然アミノ酸も添加した。培地中の非天然アミノ酸の濃度はｐＭｐａ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ）１０ｍＭ、ｐＡｐａ（Ｓｙｎｃｈｅｍ，Ｉｎｃ）１０ｍＭ、ｐＢｐａ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ）１ｍＭ、ｐＩｐａ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ）８ｍＭ、ｐＡｚｐａ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ）５ｍＭ、及びｐＰｐａ １ｍＭとした。従来記載されているようにキラル純ｐＰｐａを合成した（Ｄｅｉｔｅｒｓら（２００３），“Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１１７８２−１１７８３）。テトラサイクリンの添加後２４時間Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞を増殖させた後、回収し、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞は４８時間培養後に回収した。
ウェスタンブロット分析に備え、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）の１００倍希釈液を添加したＲＥＰＡ緩衝液（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に回収した細胞を溶解した。上清を変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、０．４５μｍニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に転写した。Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞では、一次抗体として抗ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）；５０００倍希釈液）、二次抗体として抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を使用し、膜に固定化した蛋白質をプローブした。次にＰＩＥＲＣＥ ＥＣＬウェスタンブロット基質で化学発光を検出した。Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）２９３細胞では、膜を抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）；５０００倍希釈液）でプローブした後、ＰＩＥＲＣＥ ＥＣＬウェスタンブロット基質で検出した。
材料と方法：細菌細胞トランスフェクション
プラスミドのクローニング、維持及び増幅にはＴｏｐ １０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にはＰｆｘ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を使用した。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をトランスフェクション試薬として使用した。全プラスミドをシーケンシングにより確認した。
材料と方法：プラスミド構築
ｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡ Ｔｙｒ ＣＵＡ
ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子は４種類のオリゴデオキシヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）をアニールすることにより構築した。この遺伝子はヒトｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子の３’−ＣＣＡと５’フランキング配列：
ＡＧＣＧＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＣ（配列番号１０４）
を欠失する対応するｔＲＮＡ配列から構成される。
５’末端のＥｃｏＲＩと３’末端のＢａｍＨＩの２個の制限部位を合成ＤＮＡ２本鎖に組込んだ後、ｐＵＣ１８に挿入し、ｐＵＣ１８−ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを得た。次にｐＵＣ−ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡにおけるＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。５’末端のＢｇｌＩＩ制限部位と３’末端のＢａｍＨＩ部位を含む増幅後のＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡをｐＵＣ１８−ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡのＢａｍＨＩ制限部位に挿入し、ｐＵＣ１８−２ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを得た。プラスミドｐＵＣ１８−２ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡに含まれるただ１個のＢａｍＨＩ制限部位を使用してＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡの別のコピーを組込み、ｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを得た。ＥｃＴｙｒＲＳとその６種類の変異体をいずれもｐＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ（Ｃｈｉｎら（２００３），“Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７）からＰＣＲにより増幅した後、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＸｂａＩ及びＡｐａＩ部位に挿入し、ｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳベクターを得た。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）細胞株でテトラサイクリン制御下の遺伝子発現を可能にする２個のテトラサイクリンオペレーター配列とＣＭＶプロモーターの後にＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子を配置した。更にウェスタンブロット分析に備えてｃ−ｍｙｃエピトープに連結した。６種類のＥｃＴｙｒＲＳ変異体の突然変異は以下の通りとした。
ｐＭｐａＲＳ：Ｙ３７Ｖ／Ｄ１８２Ｓ／Ｆ１８３Ｍ
ｐＡｐａＲＳ：Ｙ３７Ｉ／Ｄ１８２Ｇ／Ｆ１８３Ｍ／Ｌ１８６Ａ
ｐＢｐａＲＳ：Ｙ３７Ｇ／Ｄ１８２Ｇ／Ｆ１８３Ｙ／Ｌ１８６Ｍ
ｐＩｐａＲＳ：Ｙ３７Ｉ／Ｄ１８３Ｓ／Ｆ１８３Ｍ
ｐＡｚｐａＲＳ：Ｙ３７Ｌ／Ｄ１８２Ｓ／Ｆ１８３Ｍ／Ｌ１８６Ａ
ｐＰｐａＲＳ：Ｙ３７Ｓ／Ｄ１８２Ｔ／Ｆ１８３Ｍ／Ｌ１８６Ｖ。
ｐｃＤＮＡ４−ＥｃＴｙｒＲＳ及びｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧ
野生型強化型ＧＦＰ遺伝子をベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡのＸｂａＩ及びＡｐａＩ部位に挿入することによりｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰを作製した。ｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰでは、発現される蛋白質のウェスタンブロット分析とアフィニティー精製に備え、ＧＦＰ遺伝子をＣ末端のｍｙｃエピトープと６×Ｈｉｓタグにライゲーションした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、Ｙ３７の３塩基コドンをＴＡＧアンバーコドンに突然変異させたプラスミドｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧを作製した。
ｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体及びｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧ
ｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体を作製するために、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素を使用してｐＵＣ１８−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡから３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを単離し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ部位に挿入し、ｐｃＤＮＡ−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを得た。次に６種類のＥｃＴｙｒＲＳ変異体をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ−３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡのＸｂａＩ及びＡｐａＩ部位に挿入し、ｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体を得た。ｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧを作製するために、ｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳベクターを増幅し、ＭｌｕＩ及びＰｃｉＩ制限酵素で消化した。消化したフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含むフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））により精製した。ＣＭＶプロモーターからＢＧＨ ｐｏｌｙＡ部位までのｐｃＤＮＡ４−ＧＦＰ３７ＴＡＧフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＭｌｕＩ及びＰｃｉＩ制限酵素で消化した後、３ＢｓｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含むｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳフラグメントにライゲーションし、ｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧ（〜４０００ｂｐ）を得た。
材料と方法：蛋白質発現及び精製
ｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ変異体とｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧを使用して非天然アミノ酸を組込んだ突然変異体ＧＦＰを発現させた。Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で８０〜９０％コンフルエントまで増殖させ、６０μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６を使用してｐＳＷＡＮ−ＥｃＴｙｒＲＳ ２μｇとｐＳＷＡＮ−ＧＦＰ３７ＴＡＧ １０μｇをトランスフェクトした。一晩インキュベーション後、非天然アミノ酸（ｐＭｐａ，１０ｍＭ；ｐＡｐａ，１０ｍＭ；ｐＢｐａ，１ｍＭ；ｐＡｚｐａ，５ｍＭ；及びｐＰｐａ，１ｍＭ）とテトラサイクリン１μｇ／ｍｌを添加した新鮮な培地に培地を交換した。細胞を１〜２日間３７℃で増殖させた後に回収し、次いでＲＩＰＡ溶解用緩衝液で溶解した。細胞溶解液からの上清をＰＢＳ緩衝液で透析及び平衡化した後、抗ｍｙｃ抗体アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ）にロードした。カラムをＰＢＳ緩衝液１５カラム容量で洗浄後、０．１Ｍ水酸化アンモニウムで溶出させた。精製した蛋白質を０．１Ｍ酢酸で中和し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。質量分析のために、ＧＦＰに対応するバンドを切り出した。収率を測定し、無傷蛋白質質量スペクトルを獲得するために、溶出後に蛋白質を〜０．１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
材料と方法：蛋白分解
１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）中の推定蛋白質濃度に対して１０：１（ｗｔ／ｗｔ）の基質／酵素比を使用して蛋白質をシーケンシンググレード修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下に３７℃で一晩インキュベートすることにより、アフィニティー精製蛋白質の蛋白分解を実施した（野生型及びｐＢｐａサンプルに実施）。改変ＥＭＢＬ法（ＥＭＢＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐのウェブサイト参照）に従ってゲル内消化を実施した（ｐＭｐａ，ｐＡｚｐａ，ｐＡｐａ及びｐＰｐａサンプルに実施）。要約すると、ゲルスライスを約１ｍｍ×１ｍｍ立方体に切り出し、５分間水洗し、１５分間アセトニトリルで洗浄し、減圧遠心機で乾燥後、５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）中１２．５ｎｇ／μｌのシーケンシンググレード修飾トリプシンにより０℃で３０分間再水和した。過剰の緩衝液を除去し、５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）２０μｌをゲルスライスに添加後、３７℃で一晩インキュベートした。プロトコールに記載されているようにペプチドをゲルスライスから抽出した。
材料と方法：ｎａｎｏ−ＲＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
ＨＰＬＣポンプ、オートサンプラー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）及びＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してｎａｎｏ−ＲＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳを実施した。５μｍ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｃ１８粒子（Ｃｏｌｕｍｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）を４ｃｍまで充填した内径７５μｍのプレカラムにトリプシン消化物を加圧ボンベで流速約２μｌ／分にてロードした。次にプレカラムをＨＰＬＣポンプに接続し、溶媒Ａで数分間洗浄後、一体型エミッタチップを備える分析用カラム（外径３６０μｍ×内径７５μｍ；５μｍ Ｃ１８を１０ｃｍ，〜５μｍチップ）を直列接続した。クロマトグラフィープロファイルは４０分で１００％溶媒Ａ（０．１％酢酸水溶液）→５０％溶媒Ｂ（０．１％酢酸アセトニトリル溶液）とし、分析用カラムの流速は約１００ｎｌ／分とした。
データ依存実験に備え、まず高解像度Ｏｒｂｉｔｒａｐスキャン、次いでフルスキャンイオントラップスペクトルを記録するように質量分析計をプログラムした（ｍ／ｚ５００〜２，０００）。その後、イオントラップスキャンから開始して１０個のデータ依存ＭＳ／ＭＳスキャン（相対衝突エネルギー＝３５％；３Ｄａ単離ウィンドウ）を採取し、最終的に２個の標的ＭＳ／ＭＳスキャンを採取した。第１のＭＳ／ＭＳスキャンは予想非天然アミノ酸修飾ペプチド（ＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹ＊ＧＫ；配列番号１０３）の二重荷電前駆イオンを単離及び断片化するように設定した。
第２の標的ＭＳ／ＭＳスキャンは常に野生型ペプチド（ＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫ；配列番号１０２）のｍ／ｚ７５２．３の二重荷電前駆イオンを単離及び断片化するように設定した。蛋白質同定のためと、可変修飾として非天然アミノ酸を組込んだ標的ペプチドを含むスキャンを検出するために、ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を使用して生データをＭＳＤＢデータベースに対して検索した。ＧＦＰ−ｐＭｐａのＹ＊３７における忠実度を推定するために、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアパッケージ（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してシングルイオンクロマトグラム（野生型ではｍ／ｚ７５２．３、ｐＭｐａでは７５９．３の二重荷電前駆イオン）と選択したイオンクロマトグラム（ｙ９，ｙ１１，及びｙ１２）を積分した。
オートサンプラー付きキャピラリーＬＣとＱＴＯＦ２質量分析計から構成される自動ＬＣ／ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で無傷蛋白質質量スペクトルを獲得した。ＧＦＰ−ｐＭｐａ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を逆相蛋白質Ｃａｐｔｒａｐ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）にロードし、０．１％酢酸水溶液で脱塩し、質量分析計のＥＳＩソースに８０％アセトニトリル／０．１％酢酸を５μｌ／分で供給することにより溶出させた。ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ソフトウェアパッケージを使用してＭａｘＥｎｔ１アルゴリズムによるスペクトルの加算、平滑化及び逆畳み込みを実施した。
哺乳動物転写用プロモーター
哺乳動物細胞におけるｔＲＮＡ転写の強力なプロモーターとしては、大腸菌サプレッサーｔＲＮＡＬｅｕ５（ＣＵＡ）用の５’フランキング配列ＧＡＴＣＣＧＡＣＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣ（配列番号１０５）と大腸菌サプレッサーｔＲＮＡＬｅｕ５（ＣＵＡ）用の３’フランキング配列ＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号１０６）が挙げられる。
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。本明細書に引用する全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で本明細書に援用し、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で本明細書に援用すると個々に記載しているものとみなす。
米国仮出願第６０／８５３，００８号 米国仮出願第６０／９２３，４５８号 ＷＯ２００２／０８６０７５ ＷＯ２００２／０８５９２３ ＷＯ２００４／０９４５９３ ＷＯ２００５／０１９４１５ ＷＯ２００５／００７８７０ ＷＯ２００５／００７６２４ ＷＯ２００６／１１０１８２
Ｍｏｎａｈａｎら（２００３），"Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，"Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０：５７３−５８０ Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００２），"Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：４６９２−４６９９ Ｚｈａｎｇら（２００４），"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：８８８２−８８８７ Ｚｈａｎｇら（２００２），"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９：６５７９−６５８４ Ｔｕｒｎｅｒら（２００５），"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ−ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，"Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２７：１４９７６−１４９７７ Ｔｕｒｎｅｒら（２００６），"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：６４８３−６４８８ Ｋｉｇａら（２００２），"Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９：９７１５−９７２０ Ｗａｎｇら（２００４），"Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｎｏｎａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１６７４５−１６７４９ Ｗａｎｇら（２００１），"Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００ Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２），"Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，"Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃｏｍｂ．）１：１−１１ Ａｌｆｏｎｔａら（２００３），"Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅｄｏｘ−Ａｃｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１４６６２−１４６６３ Ｓａｎｔｏｒｏら（２００３），"Ａｎ ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｎｄ ｔＲＮＡ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：６７００−６７０９ Ｃｈｉｎら（２００３），"Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，９６４−９６７ Ｃｈｉｎら（２００３），"Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，"Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０，５１１−５１９ Ｗｕら（２００４），"Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，"Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６，１４３０６−１４３０７ Ｓｕｍｍｅｒｅｒら（２００６），"Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，"ＰＮＡＳ １０３（２６）：９７８５−９７８９ Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００４），"Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｃｏｄｏｎ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：７５６６−７５７１ Ｚｈａｎｇら（２００４），"Ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，３７１−３７３ Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ "Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，"Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５） Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，"Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（３）：２２７−２３８（２００５） Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，"Ａｄｄｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａ−９（６）：５４８−５５４（２００５） Ｗａｎｇら，"Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，"Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９（２００６） Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６），"Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７（１０）：７７５−７８２ Ｗａｎｇら（２００６），"Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，"Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２８，８７３８−８７３９ Ｌｉｕ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６），"Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，"Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（１１）：１４３６−１４４０。

Claims (29)

  1. （ａ）ｉ）ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
    ｉｉ）ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
    ｉｉｉ）ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
    ｉｖ）ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
    ｖ）ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
    ｖｉ）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
    ｖｉｉ）α−アミノカプリル酸；
    ｖｉｉｉ）ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
    ｉｘ）１，５−ダンシルアラニン；及び
    ｘ）ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）
    から構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
    （ｂ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
    （ｃ）真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導され、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、齧歯類細胞と霊長類細胞から選択される宿主細胞を含む翻訳系。
  2. 前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１に記載の翻訳系。
  3. 前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
  4. 前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
  5. 前記第１のＯ−ＲＳが配列番号５７〜１０１に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体の群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
  6. 前記宿主細胞が該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
  7. 前記宿主細胞が第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸と、第２のＯ−ＲＳと、第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸によりコードされるセレクターコドンを認識する請求項６に記載の翻訳系。
  8. 前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の翻訳系。
  9. 前記ポリヌクレオチドが配列番号８〜５６に記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項８に記載の翻訳系。
  10. 前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の翻訳系。
  11. 前記齧歯類宿主細胞がラット宿主細胞とマウス宿主細胞から選択される請求項１に記載の翻訳系。
  12. 前記霊長類宿主細胞がヒト宿主細胞、チンパンジー宿主細胞、ボノボ宿主細胞、ゴリラ宿主細胞、オランウータン宿主細胞、テナガザル宿主細胞、マカクザル宿主細胞、タマリン宿主細胞及びマーモセット宿主細胞から構成される群から選択される請求項１に記載の翻訳系。
  13. 前記齧歯類宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞である請求項１に記載の翻訳系。
  14. 前記霊長類宿主細胞が２９３Ｔ宿主細胞である請求項１に記載の翻訳系。
  15. 選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質の生産方法であって、
    （ａ）（ｉ）Ａ）ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
    Ｂ）ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
    Ｃ）ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
    Ｄ）ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
    Ｅ）ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
    Ｆ）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
    Ｇ）α−アミノカプリル酸；
    Ｈ）ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
    Ｉ）１，５−ダンシルアラニン；及び
    Ｊ）ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）
    から構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
    （ｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
    （ｉｉｉ）前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
    （ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸（但し、前記核酸におけるセレクターコドンの位置は前記蛋白質における選択位置に対応する）と；
    （ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含み、齧歯類細胞と霊長類細胞から選択される宿主細胞を準備する段階と；
    （ｂ）前記非天然アミノ酸、Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの存在下で前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
  16. 前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１５に記載の方法。
  18. 第１のＯ−ＲＳを準備する段階が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む請求項１５に記載の方法。
  19. 前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１５に記載の方法。
  20. 前記第１のＯ−ＲＳが配列番号５７〜１０１に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体の群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１５に記載の方法。
  21. 第１のＯ−ＲＳを準備する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む請求項１５に記載の方法。
  22. 前記ポリヌクレオチドが配列番号８〜５６に記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項２１に記載の方法。
  23. 第１のＯ−ＲＳを準備する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、その結果として得られるＯ−ＲＳとして、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項１５に記載の方法。
  24. 前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記第１のＯ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項２３に記載の方法。
  25. 第１のＯ−ｔＲＮＡを準備する前記段階が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む請求項１５に記載の方法。
  26. 前記蛋白質が前記第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を含み、前記方法が前記第２の非天然アミノ酸と第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを準備する段階を更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項１５に記載の方法。
  27. 前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１５に記載の方法。
  28. 前記第１の非天然アミノ酸がフォトケージドアミノ酸を含み、前記方法が宿主細胞に紫外線を照射する段階を更に含む請求項１５に記載の方法。
  29. 宿主細胞に紫外線を照射する段階が宿主細胞における蛋白質活性の空間制御を提供する請求項２９に記載の方法。
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