CN113388654A - 一种基于线形模板无细胞体系非天然氨基酸嵌入方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种用于无细胞基因表达体系非天然氨基酸嵌入的方法，其特征在于，所述无细胞基因表达体系中包括以线形模板的形式添加的目标蛋白、外源正交翻译体系组分正交的tRNA、正交氨酰tRNA合成酶。本申请的方法基于线形模板无细胞基因表达体系的UNAA嵌入能够有效提高无细胞体系内UNAA的嵌入效率以及灵活性，从而提高体系对关键表达元件的筛选效率，扩大无细胞基因表达体系在非天然蛋白质合成方面的应用范围。

Description

一种基于线形模板无细胞体系非天然氨基酸嵌入方法
技术领域
本发明属于合成生物学蛋白合成领域，具体涉及一种用于无细胞基因表达体系非天然氨基酸嵌入的方法。
背景技术
无细胞基因表达体系在生命科学中用作基础研究工具已有五十多年的历史。近几年来，无细胞合成体系经过优化得到了快速发展，并且具有体系开放、反应迅速、便于调控反应过程等重要优势。因为这些优势，无细胞基因表达体系在表达重组蛋白质药物、后修饰药物、非天然蛋白质药物、便携式生物传感器以及体外诊断等表达出巨大应用潜力。
非天然氨基酸/UNAA位点特异性嵌入蛋白质已成为蛋白质工程的一项重要技术。超过100种UNAA被用于不同的目的，如与荧光探针、聚合物和药物的结合。随着当前合成生物学领域研究方法的飞速发展，UNAA嵌入蛋白质的方法也得以快速发展。目前较成熟和研究较多的方法包括两大体系，即含有天然正交翻译元件在内的天然翻译体系和含有非天然正交翻译元件在内的正交翻译体系OTSs。OTSs组分包括：某种UNAA和与其正交的tRNA(o-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶(o-aaRS)、正交的延伸因子(o-EF-Tu)以及正交的核糖体(o-Ribosome)。为了确保UNAA的高效嵌入，必须提高OTSs的正交性，即OTSs元件只识别和结合一种UNAA，而不识别任何一种天然氨基酸(NAA)，OTSs元件通常来源于那些亲缘关系远的生物，并且通常通过定向进化来改善它们与非天然氨基酸的兼容性，实现特异位点嵌入。但由于OTSs在不同嵌入方法和不同UNAA的适应性不同，UNAA的嵌入效率仍然较低。因此，为提高UNAA的嵌入效率，OTSs内的几种元件需要被更有效地进化。此外，细胞生长过程中aaRS、tRNA和补充的UNAA自身的过表达会对细胞产生毒性，UNAA的嵌入受细胞膜屏障和细胞生长限制。
尽管已经有研究实现OTSs在无细胞基因表达体系内的应用。但目前UNAA的嵌入效率仍十分有限，且缺乏足够的灵活性，不能满足生产高产量特异性非天然蛋白质的需求。因此需要开发一种更加灵活且高效的无细胞基因表达体系UNAA嵌入方法。而以线形DNA为表达模板的无细胞基因表达体系在UNAA嵌入中的重要作用仍未被挖掘。线形DNA作为表达模板为外源OTSs元件的设计和添加提供了一种更为灵活高效的解决方案，能够实现对OTSs的精准调控，并快速筛选出高效的OTSs元件，大大提高UNAA嵌入效率，拥有广阔的研究前景。
发明内容
一方面，本申请提供了一种用于无细胞基因表达体系非天然氨基酸嵌入的方法，其特征在于，所述无细胞基因表达体系中以线形DNA为表达模板。
进一步地，无细胞基因表达体系包括以线形模板的形式添加的目标蛋白、外源正交翻译体系组分正交的tRNA、正交氨酰tRNA合成酶。
进一步地，所述线性DNA通过以质粒模板进行聚合酶链式反应获得。
进一步地，所述线性DNA两端添加有保护序列atgcaggtcatccgaggggt(SEQ IDNO.1)。
进一步地，所述无细胞基因表达体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系，其中额外添加有外源正交翻译体系组分UNAA、o-EF-Tu和o-Ribosome。
进一步地，所述无细胞因表达体系的反应温度为15-37℃。
进一步地，所述无细胞因表达体系的反应时间为0.1-24h。
进一步地，所述非天然氨基酸为pPaF，所述无细胞基因表达体系为EcAR7ΔAΔSer粗细胞提取物。
进一步地，所述非天然氨基酸为pBpF，所述外源正交翻译体系组分正交的tRNA为pPa-tRNA，所述正交氨酰tRNA合成酶pBpRS。
另一方面，本申请提供了上述方法在无细胞基因表达体系粗细胞提取物筛选、正交翻译体系元件筛选或正交翻译体系元件添加时机选择中的应用。
有益效果：
本方法中目标蛋白，o-tRNA和o-aaRS以线形模板形式添加到无细胞基因表达体系内，使得UNAA的嵌入和OTSs元件筛选更为高效和灵活。本方法在线形模板两端添加保护序列能够进一步提高线形模板在无细胞基因表达体系内的稳定性。本方法实现的基于线形模板无细胞基因表达体系的UNAA嵌入能够有效提高无细胞体系内UNAA的嵌入效率以及灵活性，从而提高体系对关键表达元件的筛选效率，扩大无细胞基因表达体系在非天然蛋白质合成方面的应用范围，推动其发展。
附图说明
图1为粗细胞提取物筛选实验结果图；
图2为OTSs正交元件筛选实验结果；
图3为OTSs组分添加时间优化实验结果；
图4为基于线形模板无细胞基因合成体系UNAA嵌入流程图。
具体实施方式
本方法利用线形模板在无细胞基因表达体系内实现UNAA嵌入。这一成果可以应用在各类基于无细胞基因表达体系的UNAA嵌入体系中。下面结合具体实例对本发明提供的一种基于线形模板大肠杆菌无细胞基因表达体系的用于UNAA的方法进行详细地描述和进一步说明，为了使技术人员能够更好地理解本发明，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本方法提供的基于线形模板大肠杆菌无细胞UNAA嵌入体系可以用于无细胞基因表达体系粗细胞提取物筛选，以筛选出更适合目标UNAA嵌入的粗细胞提取物。以下表中14种粗细胞提取物为例，进行无细胞基因表达体系粗细胞提取物筛选。
Figure BDA0003101427640000031
Figure BDA0003101427640000041
将反应所需组分(2μL 10X salt，1.6μL PEP，0.8μL NTPs，0.8μL 19AA，0.8μLGSSG，0.2μL GSH，0.2μL T7 RNA聚合酶，0.4μL Mg，2.5μL PEG8000，5mM UNAA，5μL粗细胞提取物)放置于冰上解冻，而后按上述比例混合无细胞体系，加入而后加入300ng线形目标蛋白模板，700ng线形o-aaRS模板和1500ng o-tRNA模板，并用ddH2O将体系体积补至20μL。置于30℃培养箱中反应6-8小时，得到目标蛋白。实验中使用绿色荧光蛋白sfGFP作为目标蛋白，使用p-propargyloxy-l-phenylalanine(pPaF)作为目标UNAA进行验证。图1的结果显示EcAR7ΔAΔSer更适合作为粗细胞提取物用于pPaF在无细胞基因表达体系内嵌入sfGFP。
实施例2
本方法提供的基于线形模板大肠杆菌无细胞UNAA嵌入体系可以用于无细胞基因表达体系OTSs正交元件筛选。以4种UNAA及其o-tRNA和o-aaRS为例。4种UNAA为p-propargyloxy-l-phenylalanine(pPaF)、p-azyl-phenylalanine(pAzF)、p-acetyl-l-phenylalanine(pAcF)和p-benzoyl-l-phenylalanine(pBpF)。将反应所需组分(2μL 10Xsalt，1.6μL PEP，0.8μL NTPs，0.8μL 19AA，0.8μL GSSG，0.2μL GSH，0.2μL T7 RNA聚合酶，0.4μL Mg，2.5μL PEG8000，5mM UNAA，5μL EcAR7ΔAΔSer粗细胞提取物)放置于冰上解冻，而后按上述比例混合无细胞体系，加入而后加入300ng线形目标蛋白模板，700ng线形o-aaRS模板和1500ng o-tRNA模板，并用ddH2O将体系体积补至20μL。置于30℃培养箱中反应6-8小时，得到目标蛋白。实验中使用绿色荧光蛋白sfGFP作为目标蛋白。图2的筛选结果表明pPaF对应的pPa-tRNA和pPaRs有较好的正交性。而pAzF和pAcF的筛选结果表明实验中使用的各组tRNA和aaRS对于这两种UNAA均没有较好的正交性。对于pBpF来说，pPa-tRNA和pBpRS的组合拥有比报道的pBp-tRNA和pBpRS的组合更好的正交性。这些结果说明本方法在OTSs元件筛选上拥有较大的应用前景。
实施例3
本方法提供的基于线形模板大肠杆菌无细胞UNAA嵌入体系可以用于OTSs组分添加时间的优化。以UNAA、aaRS、tRNA和DNA的添加时间为例，下表展示了实验中16组平行实验。其中“0”表示该组分的添加时间为无细胞基因表达反应开始时，“1”表示该组分在无细胞基因表达反应开始后1小时添加。
Figure BDA0003101427640000051
对图3的实验结果进行正交实验分析可知，当所有组分在反应开始时添加，UNAA的嵌入效率最高。其中UNAA和aaRS的添加时间对无细胞基因表达体系的UNAA嵌入效率影响较大，tRNA和DNA的添加时间对无细胞基因表达体系的UNAA嵌入效率影响较小。
最后应说明的是：以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种基于线形模板无细胞体系非天然氨基酸嵌入方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
atgcaggtca tccgaggggt 20

Claims (8)

1.一种用于无细胞基因表达体系非天然氨基酸嵌入的方法，其特征在于，所述无细胞基因表达体系中以线形DNA为表达模板。
2.根据权利要求1所述的方法，其中无细胞基因表达体系包括以线形模板的形式添加的目标蛋白、外源正交翻译体系组分正交的tRNA、正交氨酰tRNA合成酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述线性DNA通过以质粒模板进行聚合酶链式反应获得。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述线性DNA两端添加有保护序列atgcaggtcatccgaggggt(SEQ ID NO.1)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述无细胞基因表达体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系，其中额外添加有外源正交翻译体系组分UNAA、o-EF-Tu和o-Ribosome。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述无细胞因表达体系的反应温度为15-37℃。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述无细胞因表达体系的反应时间为0.1-24h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法在无细胞基因表达体系粗细胞提取物筛选、正交翻译体系元件筛选或正交翻译体系元件添加时机选择中的应用。
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