CN113388655B - 基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统 - Google Patents
基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113388655B CN113388655B CN202110626553.8A CN202110626553A CN113388655B CN 113388655 B CN113388655 B CN 113388655B CN 202110626553 A CN202110626553 A CN 202110626553A CN 113388655 B CN113388655 B CN 113388655B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cfps
- artificial sequence
- protein synthesis
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000014616 translation Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 241000983708 Corynebacterium glutamicum MB001 Species 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 47
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 abstract description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 31
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 abstract description 30
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 abstract description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 11
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 10
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 9
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 241000607365 Vibrio natriegens Species 0.000 description 28
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108091005946 superfolder green fluorescent proteins Proteins 0.000 description 11
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N Glutamine Chemical compound OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241001249119 Bacillus vallismortis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 1
- 201000001718 Roberts syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000012474 Roberts-SC phocomelia syndrome Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000002265 redox agent Substances 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005001 rutherford backscattering spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本申请提供了一种基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统，所述细菌底盘为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸芽孢杆菌或需钠弧菌细胞提取物；本申请还提供了各种底盘适合的密码子优化、感受态细胞、质粒浓度、RBS序列、无细胞体系试剂组分浓度等。本申请的体系都具有产生治疗性蛋白，例如SARS‑CoV‑2受体结合域蛋白的潜力。不同细菌底盘的无细胞蛋白质合成体系不仅可以扩大体外蛋白质生产的潜在选择，还可以通过扩大无细胞蛋白质合成平台来扩展体系的应用范围。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学蛋白合成领域，具体涉及一种基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统。
背景技术
无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis，CFPS)是一种快速体外蛋白质合成的方法。基于提取物的CFPS体系作为工具，促进了基础生物学和应用生物学的发展。它们为蛋白质的生产和应用提供了一些独特的优势。例如，反应的开放环境允许用户直接添加或合成精确浓度的新成分，允许它们以更快、更方便、更可控的方式针对不同产品进行设计、测试和优化。较高的耐受性有利于有毒蛋白质产品的产生。此外，CFPS体系可以以冻干形式保存长达1年，显示出更大的稳定性。这些优势使CFPS体系成为路径设计、蛋白质生产和个性化药物的理想选择。因此，它们越来越多地被用于生产低表达率、聚集性、毒性和体内溶解性差的复杂蛋白产品。CFPS体系也具有广阔的应用前景，已用于DNA调节元件、逻辑体系的快速成型设计和生物传感器设备。
近年来，利用细胞生物合成的多样性，导致不同CFPS体系使用的宿主物种数量增加。理论上，任何生物都可以作为CFPS的基础。CFPS体系主要分为真核体系和原核体系。酵母、小麦胚芽、兔网织红细胞和昆虫细胞常被用作无细胞体系的真核宿主。真核细胞作为安全的宿主细胞，具有复杂的翻译后修饰功能，可以产生更复杂的蛋白质。然而，真核细胞培养成本高、过程复杂、批反应蛋白产率低，使得人们更倾向于研究原核宿主细胞CFPS体系。与真核体系相比，原核体系提取液制备更方便，蛋白质得率更高，下游加工要求更低，成本更低。目前，大肠杆菌是最流行和应用最广泛的原核CFPS体系。此外，采用不同模式菌株的原核宿主的无细胞体系，如弧菌、假单胞菌和芽孢杆菌近年来也开始发展。然而，这些研究只是建立了相关的体系，并没有对不同的CFPS体系进行比较分析。因此，需要进一步进行深入的探索和比较分析，以更好地指导体系的应用。
CFPS的发展需要集中在常见和有价值的典型底盘细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌是实验室研究和工业生产的可靠和强大的基础微生物。他们有不同的特点，可以成为CFPS平台的重点研究对象。大肠杆菌作为目前CFPS体系的首选宿主细胞，具有明显的优势，如培养条件和细胞裂解方法操作简单，蛋白质产量最高可达数毫克/毫升，细胞培养成本低。枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏好，可以避免密码子优化，广泛应用于工业蛋白质生产。谷棒芽孢杆菌具有最小的蛋白酶活性，这使该菌株具有表达蛋白酶敏感蛋白的强大潜力。此外，枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌均属于革兰氏阳性菌株，为非致病性微生物，内毒素较少，可安全用于食品和制药蛋白的生产。需钠弧菌的倍增时间是大肠杆菌的两倍，能产生大量的核糖体来支持其健壮的转录体系的快速增长，使需钠弧菌有可能在高水平蛋白质表达领域获得卓越的生产力。上述特点使人们对基于这些菌株的CFPS体系的开发和使用产生了新的兴趣。
尽管有些CFPS体系(如大肠杆菌CFPS体系)发展较为完善，但是关于其他原核CFPS体系，如枯草芽孢杆菌、谷氨酸芽孢杆菌和需钠弧菌CFPS体系的相关研究还是很少。
发明内容
为了提高无细胞蛋白质合成体系平台的效率，扩大平台的范围以及体外蛋白生产的潜在选择，生产出高表达量的多种结构和功能蛋白质。本发明构建基于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌的四种高效CFPS平台，并利用不同种类细菌底盘细胞的体外蛋白质合成体系各自的特点，对体系进行了优化。为了验证CFPS体系的适用性，本发明使用这四种CFPS体系来表达治疗性SARS-CoV-2RBD蛋白，并检测其活性特征。希望通过在不同基底细胞中开发CFPS体系，来扩大体外蛋白生产的平台范围和潜在选择，生产多种高表达的结构和功能蛋白，应用于药物蛋白等领域。
一方面，本申请提供了一种基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统，所述细菌底盘为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸芽孢杆菌或需钠弧菌细胞提取物。
进一步地，所述系统还包括能量再生体系、氨基酸成分、无机盐和其他辅因子。
进一步地，所述蛋白质为sfGFP，所述细菌底盘为大肠杆菌细胞提取物，sfGFP基因序列为SEQ ID NO.2；所述蛋白质为sfGFP，所述细菌底盘为枯草芽孢杆菌细胞提取物，sfGFP基因序列为SEQ ID NO.3；或者所述蛋白质为sfGFP，所述细菌底盘为谷氨酸芽孢杆菌和需钠弧菌细胞提取物，sfGFP基因序列为SEQ ID NO.4。
进一步地，大肠杆菌底盘感受态细胞和质粒浓度为DH5α和300ng/μL；枯草芽孢杆菌底盘感受态细胞和质粒浓度为XL1-Blue和700ng/μL；谷氨酸芽孢杆菌感受态细胞和质粒浓度为XL1-Blue和1200ng/μL；需钠弧菌感受态细胞和质粒浓度为XL1-Blue和600ng/μL。
进一步地，大肠杆菌底盘RBS序列为SEQ ID NO.11；枯草芽孢杆菌底盘RBS序列为SEQ ID NO.17；谷氨酸芽孢杆菌RBS序列为SEQ ID NO.23；需钠弧菌RBS序列为SEQ IDNO.29。
进一步地，所述蛋白质为SARS-CoV-2受体结合域蛋白，所述细菌底盘为谷氨酸芽孢杆菌细胞提取物。
进一步地，使用的SARS-CoV-2受体结合域蛋白基因序列为SEQ ID NO.30。
另一方面，本申请还提供了上述系统在生产蛋白中的应用。
进一步地，其中蛋白为治疗用蛋白。
本申请中的能量再生体系优选磷酸烯醇式丙酮酸，氨基酸成分优选19种氨基酸。
上述系统中还包含Mg2+、PEP、NTPs、19AAs、GSSG/GSH和PEG8000，其中用量可取实施例4和图4中所列的各具体值。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS体系中密码子对蛋白质表达的影响柱状图；
图2为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS体系中质粒来源和质粒浓度对蛋白质表达的影响柱状图；
图3为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS体系中RBS对蛋白质合成的影响柱状图；
图4为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、需钠弧菌CFPS体系中Mg2+、PEP、NTPs、19AAs、GSSG/GSH和PEG8000对蛋白质表达的影响柱状图；
图5为450nm波长下不同稀释倍数的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS体系RBD-Foldon蛋白样品的吸光度图；
图6为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS无细胞原体系和添加Brij-35体系产生的RBD-Foldon蛋白的免疫印迹分析图；
图7为利用RBS设计基因电路示意图；
图8为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌无细胞体系进行无细胞体系试剂组分优化的流程；
图9为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌无细胞体系表达RBD-Foldon蛋白并进行ELISA活性验证的流程；
图10为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌无细胞蛋白质合成体系构建、优化、应用的总示意图。
具体实施方式
所用菌株情况如下表1所示：
表1 所用菌株情况
使用的无细胞体系是基于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸芽孢杆菌和需钠弧菌四种细胞提取物的体系来提供转录翻译所需的组合酶系，另外添加能量再生体系(磷酸烯醇式丙酮酸)，19种氨基酸，无机盐及其余辅因子组成蛋白质合成体系。
实施例1 密码子优化对sfGFP表达效果的影响
蛋白质表达或生产的生物都有不同程度的偏爱部分密码子，密码子的使用很可能影响重组蛋白的表达。所以通过密码子优化，利用生物体偏爱的密码子并避免极少利用的或稀有的密码子来对基因进行重新设计，可以使生产体系进行高水平的蛋白表达。本发明为各种底盘设计密码子优化的sfGFP基因序列，如下表2所示：
表2 sfGFP原始DNA序列和根据不同宿主密码子优化后的DNA序列
表达结果如图1所示：密码子优化对需钠弧菌和枯草芽孢杆菌CFPS体系影响不大，可能因为该菌本身没有明显的密码子偏爱性。但是对于谷氨酸棒状杆菌CFPS体系来说，密码子优化对体系影响较大，优化后体系蛋白质表达量可以提高近30-40％。
实施例2 感受态细胞和质粒对表达效果的影响
质粒转录受宿主背景的影响，受宿主因子的调控。宿主背景的差异会影响质粒骨架和辅助基因的转录模式。宿主的限制性修饰系统能够识别和破坏外源DNA。例如，Dam+和Dcm+的甲基化会干扰大肠杆菌中克隆和繁殖的DNA的裂解，也会影响质粒转化的效率。此外，宿主重组系统可以催化重组分子的重排，影响DNA的完整性。宿主中的某些基因(如Lon)编码特异性蛋白酶，导致重组蛋白降解，减少蛋白产量。在四种表达体系中，利用七个常见的大肠杆菌感受态细胞(JM110、JM109、DH10B、DH5α、TOP10、Turbo、XL1-Blue)对质粒进行提取，测试其对最终对体系蛋白质合成水平的影响程度。
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS体系中质粒来源和质粒浓度对蛋白质表达的影响见图2。
结果表明：CFPS体系中存在质粒浓度饱和点，体系的荧光值先随着质粒浓度的增大而提高，但到饱和点后荧光值会趋于稳定。大肠杆菌CFPS体系筛选出最优的感受态细胞和质粒浓度为DH5α和300ng/μL。枯草芽孢杆菌CFPS体系的最优感受态细胞也是XL1-Blue，并在提供700ng/μL的质粒DNA作为模板时，体系的荧光值达到峰值。对于谷氨酸棒状杆菌CFPS体系来说，XL1-Blue感受态细胞也是最佳的选择对象，然而体系的荧光值在所选的质粒浓度范围中一直处于上升趋势，为了保证无细胞体系体积的稳定，最终选择所选质粒浓度范围的最高值1200ng/μL作为最佳浓度。需钠弧菌CFPS体系，最优的感受态细胞和质粒浓度为XL1-Blue和600ng/μL。
实施例3 RBS对表达效果的影响
翻译的启动作为限速步骤影响着翻译速率。基因表达中的每个限速步骤都为合理调节蛋白质表达水平提供了机会。在细菌中，核糖体结合位点(RBS)序列用于翻译起始有效的控制元件。通过改变调控元件的序列来控制其蛋白质编码序列的表达水平，达到优化遗传体系的功能。所以，RBS序列通常被突变以优化遗传回路，代谢途径和重组蛋白的表达。
本发明为每种CFPS体系选择了6个RBS序列，这6个序列是根据RBS文库计算机(DeNovo DNA:RBS Library Calculator)按照不同宿主进行预测的。其中sfGFP的预测表达水平范围很广，本研究按照初始翻译率从小到大均匀选择了六个序列进行测试(RBS1-RBS6)，并通过定点突变取代T7启动子序列和sfGFP起始基因之间的原始RBS序列。通过定量体系的荧光强度，筛选不同翻译起始率的RBS。菌种和序列信息见表1-3；详细基因电路设计图见图7。
表3 由RBS文库计算器设计的RBS序列
结果如图3所示。
实施例4 无细胞体系中的其他因素对表达效果的影响
由于自然界中的需钠弧菌，谷氨酸棒状杆菌，枯草芽孢杆菌与大肠杆菌存在于不同的环境中，因此本研究推断枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒状杆菌，需钠弧菌与大肠杆菌的细胞裂解物可能有不同的对小分子和其他试剂的需求。所以本发明探索了几种重要的无细胞体系试剂组分(包括Mg2+，PEP，NTPs，氨基酸，氧化还原剂以及PEG8000)对四种CFPS体系模式蛋白表达的影响。本发明根据已知参考文献的体系组分，改变了几个关键成分的浓度，设计了均匀的梯度。同时，在单一组分优化过程中CFPS中其他组分的浓度保持恒定。通过修改已知的试剂组分组合，使其具有更特异性的组分组成，可以提高四种体系的产率，达到最优产量，筛选出了适合于四种CFPS体系的最优组分组合。
DNA浓度是影响CFPS反应中蛋白质产量的关键因素。质粒DNA浓度的增加可以提供更多的转录元件来支持转录和翻译过程，可能导致蛋白质产量的增加。
在CFPS反应中，镁离子(Mg2+)是特别重要的试剂，因为它是正确组装核糖体所需的关键阳离子。在CFPS反应中，Mg2+不仅参与转录和翻译，而且还充当诸如RNA聚合酶和氨酰基tRNA合酶之类的酶的激活剂。
分子拥挤可以通过体积排他效应影响生化动力学，而体积排他效应会降低扩散速率并提高大分子的结合速率，从而对细胞功能产生根本性的影响。在无细胞体系中分子拥挤会对分子动力学产生很大的影响，比如会影响T7 RNAP与T7启动子的结合等。为了模拟活细胞的拥挤环境，可以添加一些拥挤剂(聚乙二醇，海藻糖甘油，肉碱，乳糖，棉子糖等)来增加无细胞体系的分子密度，本发明使用的大分子拥挤剂是PEG8000。
体系中的氧化环境也是影响蛋白质合成的关键因素，因为它会影响体系的催化性能，也会影响某些蛋白质中二硫键的形成。本发明中的氧化还原环境受氧化还原性谷胱甘肽(GSSG和GSH)调控。
PEP是糖酵解后期的次要代谢产物，是能量再生体系中ATP的主要来源。部分ATP的供应通常是由添加到反应中的辅助能源产生的。
ATP被大量的细胞过程所利用，并且在无细胞体系中，ATP会被非生产性的副途径消耗到一定程度，因此，所有无细胞反应的一个普遍要求是提供ATP以驱动翻译或转录和翻译过程组合。
氨基酸作为蛋白质的单体结构单元，是关键的CFPS反应试剂。除了它们主要参与蛋白质合成外，某些氨基酸还是中心代谢途径的活跃参与者。
基础无细胞体系基本组分在冰上按照浓度进行组装混匀，并且加入不同细胞提取物及设计的目的基因表达模板等，在30℃培养箱13h进行蛋白质表达。
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、需钠弧菌CFPS体系中Mg2+、PEP、NTPs、19AAs、GSSG/GSH和PEG8000对蛋白质表达的影响见图4；
整体来说，从四种CFPS体系不同试剂组分的显著性分析结果(表4)可以看出，六种试剂组分对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌CFPS体系蛋白质合成的影响都是极显著的(P<0.01)。对于需钠弧菌CFPS体系来说，氧化还原环境对体系蛋白质合成影响不显著(P>0.05)，分子拥挤程度对体系蛋白质合成影响程度没有其他四种组分影响大(0.05>P>0.01)。对谷氨酸棒状杆菌CFPS体系来说，氨基酸对体系蛋白质合成的影响也没有其他组分影响大(0.05>P>0.01)。通过对不同CFPS体系的影响因素进行优化和比较，可以提高体系的蛋白质合成水平，筛选出影响大的某几种因素进一步进行针对性优化，省去优化无效因素，提高优化效率。
表4 四种CFPS体系不同试剂组分的显著性分析
表5 优化后四种CFPS体系中各试剂组分浓度
实施例5 不同底盘中SARS-CoV-2受体结合域蛋白的表达效果
RBD-Foldon-His序列如下表6所示：
表6 RBD-Foldon-His的DNA序列
在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌无细胞中分别可实现130.2mg/L、79.7mg/L、95.4mg/L、75.mg/L的RBD-Foldon全蛋白产量，并采用ELISA来对四种CFPS体系产生的RBD-Foldon全蛋白进行活性验证。
需钠弧菌，谷氨酸棒状杆菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌四种CFPS体系都可以成功的合成RBD-Foldon蛋白。并且通过ELISA检测四种CFPS体系产生的RBD-Foldon蛋白都具有功能活性，相对来说，需钠弧菌和谷氨酸棒状杆菌CFPS体系产生的蛋白的活性更大一些。具体见图5
表面活性剂可能会影响CFPS体系合成的蛋白质的可溶性。尝试多种表面活性剂后发现Brij-35表面活性剂可以明显的增加这四种CFPS体系的RBD-Foldon蛋白的可溶性。具体见图6。
不同体系的细胞提取物具有不同的内毒素含量。内毒素低的体系对于生产治疗性蛋白来说更安全，具有更大的蛋白设计和生产潜力。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、需钠弧菌CFPS体系提取物的内毒素检测结果如下表5所示：
表5 内毒素检测结果
| 细胞提取物 | 内毒素浓度(U/mL) |
| 大肠杆菌 | 325.5±15.0 |
| 枯草芽孢杆菌 | 0.0±0.0 |
| 谷氨酸棒状杆菌 | 15.4±1.3 |
| 需钠弧菌 | 46.6±4.1 |
在相同体积的四种细胞提取物中，枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌细胞提取物的内毒素显著低于大肠杆菌。因此，枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS系统更安全的生产治疗性蛋白。与大肠杆菌CFPS体系相比，枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和需钠弧菌CFPS体系具有更大的设计和生产潜力。
最后应说明的是：以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统
<130> aaaaaa
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 974
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac 60
tttaagaagg agatatacat atgcgtaaag gcgaagagct gttcactggt gtcgtcccta 120
ttctggtgga actggatggt gatgtcaacg gtcataagtt ttccgtgcgt ggcgagggtg 180
aaggtgacgc aactaatggt aaactgacgc tgaagttcat ctgtactact ggtaaactgc 240
cggtaccttg gccgactctg gtaacgacgc tgacttatgg tgttcagtgc tttgctcgtt 300
atccggacca tatgaagcag catgacttct tcaagtccgc catgccggaa ggctatgtgc 360
aggaacgcac gatttccttt aaggatgacg gcacgtacaa aacgcgtgcg gaagtgaaat 420
ttgaaggcga taccctggta aaccgcattg agctgaaagg cattgacttt aaagaagacg 480
gcaatatcct gggccataag ctggaataca attttaacag ccacaatgtt tacatcaccg 540
ccgataaaca aaaaaatggc attaaagcga attttaaaat tcgccacaac gtggaggatg 600
gcagcgtgca gctggctgat cactaccagc aaaacactcc aatcggtgat ggtcctgttc 660
tgctgccaga caatcactat ctgagcacgc aaagcgttct gtctaaagat ccgaacgaga 720
aacgcgatca tatggttctg ctggagttcg taaccgcagc gggcatcacg catggtatgg 780
atgaactgta caaacatcac catcaccatc attaagtcga caagcttgcg gccgcactcg 840
agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt 900
tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct 960
tgaggggttt tttg 974
<210> 2
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcgtaaag gtgaagaact gtttaccggt gtggttccga ttctggttga actggatggc 60
gatgttaatg gtcataaatt ttcagtgcgc ggcgaaggtg aaggcgatgc caccaatggc 120
aaactgaccc tgaaattcat ttgcaccacc ggtaaactgc cggtgccgtg gccgaccctg 180
gtgacaaccc tgacctatgg cgtgcagtgt tttgcccgct atccggatca tatgaaacag 240
catgatttct ttaagagcgc aatgccggaa ggttatgtgc aggaacgtac cattagtttt 300
aaagatgatg gtacctataa gacccgtgca gaagtgaaat ttgaaggtga caccctggtg 360
aatcgcattg aactgaaagg cattgatttt aaagaggatg gtaatattct gggccataaa 420
ctggaatata attttaatag ccacaacgtt tacatcaccg ccgataaaca gaaaaatggt 480
attaaggcaa acttcaaaat ccgtcataat gttgaagatg gtagcgtgca gctggcagat 540
cattatcagc agaatacccc gattggtgac ggtccggttc tgctgccgga taatcattat 600
ctgagtaccc agagtgttct gagcaaagat ccgaatgaaa aacgtgatca tatggttctg 660
ctggaatttg ttaccgccgc aggcattacc catggtatgg atgaactgta taaa 714
<210> 3
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcgcaaag gcgaagaact gttcacgggc gtcgtcccga ttcttgttga acttgacggc 60
gacgttaacg gccacaaatt cagcgtcaga ggcgaaggcg aaggagacgc cacaaatggc 120
aagctgacgc tgaagttcat ctgcacgacg ggcaaactgc cggttccgtg gccgacgctt 180
gtcacgacgc tgacatatgg cgtccagtgt tttgctcgct acccggacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagagcgc catgccggaa ggctacgtcc aagaacgcac gatctccttc 300
aaggacgacg gcacgtacaa aacgcgcgcc gaggtcaaat tcgagggaga cacgctggtt 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaagaggacg gcaacattct tggccacaag 420
ctggagtaca acttcaacag ccacaatgtc tacatcacgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac gtcgaagatg gcagcgtcca gcttgccgat 540
cactaccagc agaacacacc gatcggcgat ggcccggtcc ttcttccgga caatcactat 600
ctttccacac agtccgttct ttccaaagac ccgaacgaga aacgcgacca tatggttctt 660
ctggagtttg tcacggctgc cggcatcacg catggcatgg atgagctgta caagcaccac 720
caccatcatc actaa 735
<210> 4
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcgtaagg gcgaggaact gtttaccggc gtcgtgccaa ttctggtgga gctggacggc 60
gacgtcaacg gccacaagtt ttccgtgcgc ggtgaaggcg aaggcgacgc taccaacggc 120
aagctgactc tgaagttcat ctgtaccacc ggcaagctgc cagtgccttg gccaactctg 180
gtcaccaccc tcacctacgg cgtgcagtgt ttcgctcgct acccagatca catgaagcag 240
cacgactttt tcaagtccgc tatgccagag ggctacgtgc aagaacgcac catctccttc 300
aaggacgacg gcacctacaa gacccgtgca gaggtgaagt tcgagggcga tactctggtc 360
aaccgtatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaagacg gcaacattct gggtcacaag 420
ctggagtaca acttcaactc ccacaacgtc tacatcaccg ctgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggcta acttcaagat ccgccacaac gtggaggacg gttccgtcca gctggcagat 540
cactaccagc agaacacccc aatcggcgac ggtccagtgc tgctgccaga caaccactat 600
ctgtccaccc agtctgtgct gtccaaggat ccaaacgaga agcgcgatca catggtgctg 660
ctggagttcg tgaccgcagc tggcatcacc catggcatgg atgagctgta caagcaccac 720
caccaccatc actaa 735
<210> 5
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggag 7
<210> 6
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgauggga ucacgcaucu aagg 24
<210> 7
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uccgaugcga caaggcaggu ccua 24
<210> 8
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uccgauggga caaggcagau ccua 24
<210> 9
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccgaugcga ucaaggaucu aagg 24
<210> 10
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccgauggga ucaagaaugu aagg 24
<210> 11
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
uccgauggga caaaggaggu ugua 24
<210> 12
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uuauagacau uggacaguuc cucguua 27
<210> 13
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
uuauagacau ugggaaguuc cuccuua 27
<210> 14
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
uuauagacau uggaaaguua cuccuua 27
<210> 15
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acauagacau uggaaaguua cuucua 26
<210> 16
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgauguagu gaagggguua cuuaua 26
<210> 17
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acaauguagu gaagggggua cuuauu 26
<210> 18
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
uucgguuuac uaaacgcgcc cuuau 25
<210> 19
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ugcgguuuac uaaacggacc cuuau 25
<210> 20
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ugcgguuuac uaaaagcacc cauau 25
<210> 21
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
uucaguuggu aaagggaacc cauau 25
<210> 22
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gucagauggu aaaaaggagu uaaucc 26
<210> 23
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
uaauagucac uuuaaggagg uuuau 25
<210> 24
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccguauuuuu ucgacgccgg uauccu 26
<210> 25
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cagucuuuuu ucagcgcagg uaaaca 26
<210> 26
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccguauuuuu ucaaggccgg uaacau 26
<210> 27
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccguauuuuu ucaauggcgg uaauau 26
<210> 28
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccguauuuuu ucuacggagg uauucu 26
<210> 29
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccguauuuuu ucaagggagg uuauau 26
<210> 30
<211> 1036
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60
tgtttaactt taagaaggag atatacatat gcgcgttcag cctacagaat caattgttcg 120
ctttcctaac attacaaacc tttgtccttt cggcgaagtc ttcaatgcga cacgctttgc 180
ttcagtttat gcttggaacc gcaaacgcat ttcaaactgt gttgctgatt attcagttct 240
ttataactca gcttcattct cgacgtttaa atgttatggc gtttcaccta caaagctaaa 300
tgatctttgt ttcactaatg tttatgctga ttcatttgtt attcgcggcg atgaagttcg 360
ccagattgct cctggccaga caggcaagat agcggattat aactataaac ttcctgatga 420
tttcacggga tgtgttattg cttggaactc aaacaacctt gattcaaagg tgggtggtaa 480
ttataactat ctttatcgcc tgttccggaa gtcaaacctt aaacctttcg agagagatat 540
ttcaacagaa atttatcagg ctggctcaac accttgtaac ggcgttgaag gctttaactg 600
ttatttccca ctgcagtctt atggctttca gcctacaaac ggcgttggct atcagcctta 660
tcgcgttgtt gttctttcat ttgaacttct tcatgctcct gctacagttt gtggccctaa 720
gaagtcgacc aaccttgtta agaataagtg tgttaacttt ggctcaggct atattcctga 780
agctcctcgc gatggccagg cttatgttcg caaagatggc gaatgggttc ttctttcaac 840
atttcttggc catcaccacc atcatcatca ccatcaccat taaaagcttg cggccgcact 900
cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga 960
gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 1020
cttgaggggt tttttg 1036
Claims (3)
1.基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，所述无细胞蛋白质合成系统采用的细菌底盘为谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)细胞提取物，所采用的质粒模板中使用的RBS序列为SEQ ID NO.23，并且所述无细胞蛋白质合成系统的组成如下所示：
2.根据权利要求1所述的基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，用于表达质粒模板的感受态细胞为XL1-Blue。
3.根据权利要求1或2的基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统在生产SARS-CoV-2受体结合域蛋白中的应用，其特征在于，编码所述SARS-CoV-2受体结合域蛋白的DNA序列为SEQ ID NO.30。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110626553.8A CN113388655B (zh) | 2021-06-04 | 2021-06-04 | 基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110626553.8A CN113388655B (zh) | 2021-06-04 | 2021-06-04 | 基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113388655A CN113388655A (zh) | 2021-09-14 |
| CN113388655B true CN113388655B (zh) | 2022-07-19 |
Family
ID=77618423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110626553.8A Active CN113388655B (zh) | 2021-06-04 | 2021-06-04 | 基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113388655B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109792A (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-27 | 清华大学 | 一种基于大肠杆菌的无细胞反应体系及其应用 |
| CN115851558B (zh) * | 2023-02-27 | 2023-05-30 | 百葵锐(天津)生物科技有限公司 | 一种新的原核无细胞蛋白质合成系统及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107043756A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-08-15 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法 |
| CN108396034A (zh) * | 2017-02-06 | 2018-08-14 | 武汉臻智生物科技有限公司 | 一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法 |
| CN111378708A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 康码（上海）生物科技有限公司 | 一种优化的体外无细胞蛋白合成体系及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4441170B2 (ja) * | 2002-11-28 | 2010-03-31 | 独立行政法人理化学研究所 | Ｓ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌細胞抽出液及びそれを用いる無細胞系によるタンパク質の製造方法 |
| KR100733712B1 (ko) * | 2006-02-17 | 2007-06-29 | 충남대학교산학협력단 | 무세포 단백질 합성용 세포 추출액 제조 및 이를 이용한단백질 합성법 |
| BR112019013694A2 (pt) * | 2016-12-30 | 2020-02-04 | Ntxbio Llc | sistema de expressão isento de células tendo nova regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico |
-
2021
- 2021-06-04 CN CN202110626553.8A patent/CN113388655B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107043756A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-08-15 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种通过无细胞蛋白合成系统制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法 |
| CN108396034A (zh) * | 2017-02-06 | 2018-08-14 | 武汉臻智生物科技有限公司 | 一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法 |
| CN111378708A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 康码（上海）生物科技有限公司 | 一种优化的体外无细胞蛋白合成体系及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens;Jurek Failmezger等;《Frontiers in Microbiology》;20180601;第9卷;文章编号1146 * |
| Development and comparison of cell-free protein synthesis systems derived from typical bacterial chassis;Liyuan Zhang等;《Bioresour Bioprocess》;20210706;第8卷;文章编号58 * |
| Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements;Richard Kelwick等;《Metabolic Engineering》;20160930;第38卷;第370-381页 * |
| 体外合成生物学:无细胞蛋白合成系统研究进展;刘阳等;《科学通报》;20170927;第62卷(第33期);第3851-3860页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113388655A (zh) | 2021-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rix et al. | Scalable continuous evolution for the generation of diverse enzyme variants encompassing promiscuous activities | |
| Lajoie et al. | Overcoming challenges in engineering the genetic code | |
| Sitaraman et al. | A novel cell-free protein synthesis system | |
| CN113388655B (zh) | 基于细菌底盘的无细胞蛋白质合成系统 | |
| Rosenblum et al. | Engine out of the chassis: cell-free protein synthesis and its uses | |
| Link et al. | Reassignment of sense codons in vivo | |
| Hibi et al. | Reconstituted cell-free protein synthesis using in vitro transcribed tRNAs | |
| Hoesl et al. | In vivo incorporation of multiple noncanonical amino acids into proteins | |
| Voloshchuk et al. | Incorporation of unnatural amino acids for synthetic biology | |
| CN107075525B (zh) | 改变多肽表达的方法 | |
| Pezo et al. | Binary Genetic Cassettes for Selecting XNA‐Templated DNA Synthesis In Vivo | |
| Cui et al. | Semisynthetic tRNA complement mediates in vitro protein synthesis | |
| US20200270665A1 (en) | Cell-free protein synthesis platforms derived from clostridia extracts | |
| Kostinski et al. | Ribosome composition maximizes cellular growth rates in E. coli | |
| Choi et al. | Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratory evolution of Corynebacterium glutamicum | |
| Fujino et al. | An amino acid-swapped genetic code | |
| Chemla et al. | Expanding the genetic code of a photoautotrophic organism | |
| Albayrak et al. | Using E. coli-based cell-free protein synthesis to evaluate the kinetic performance of an orthogonal tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pair | |
| US20160115487A1 (en) | Cell-free synthetic incorporation of non-natural amino acids into proteins | |
| De Capitani et al. | The long road to a synthetic self-replicating central dogma | |
| Tittle et al. | Impact of queuosine modification of endogenous E. coli tRNAs on sense codon reassignment | |
| Pütz et al. | Diversity and similarity in the tRNA world: overall view and case study on malaria-related tRNAs | |
| Schwark et al. | The influence of competing tRNA abundance on translation: Quantifying the efficiency of sense codon reassignment at rarely used codons | |
| Biddle et al. | Directed evolution pipeline for the improvement of orthogonal translation machinery for genetic code expansion at sense codons | |
| Fu et al. | Improving the efficiency and orthogonality of genetic code expansion |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |