PT1315826E - Síntese in vitro melhorada de proteínas activas contendo ligações dissulfureto - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Síntese in vitro melhorada de proteínas actívas contendo ligações dissulfureto"

ANTECEDENTES DO INVENTO A Escherichia coli é um organismo largamente utilizado para a expressão de proteínas heterólogas. Cresce facilmente até uma densidade celular elevada em substratos pouco dispendiosos, proporcionando excelente produtividade volumétrica e económica. 0 facto de existirem técnicas genéticas bem estabelecidas e vários vectores de expressão justifica adicionalmente a utilização de Escherichia coli como um hospedeiro de produção. No entanto, embora seja necessária uma elevada taxa de síntese de proteínas, não é de modo algum suficiente para a produção eficaz de biomoléculas activas. Para ser activa biologicamente, a cadeia polipeptídica tem que adquirir um dobramento ("folding”) que origine a estrutura tridimensional nativa correcta, incluindo a formação adequada de ligações dissulfureto.

Em muitos casos, verificou-se que os polipéptidos recombinantes são sequestrados dentro de grandes agregados refractivos denominados corpos de inclusão. As proteínas activas podem ser recuperadas a partir dos corpos de inclusão através de um ciclo de solubilização de agregados induzido por desnaturantes, seguido por remoção do desnaturante em condições que favorecem o re-dobramento. Embora a formação de corpos de inclusão possa em certos casos facilitar a purificação das proteínas expressas, na maior parte dos casos o re-dobramento das proteínas agregadas é ainda um problema.

Foram efectuadas várias tentativas para melhorar o dobramento de proteínas heterólogas no citoplasma bacteriano. Além dos métodos tradicionais, incluindo diminuição da temperatura da cultura, o aumento do conhecimento sobre os mecanismos e efectores do dobramento de proteínas permitiu novas abordagens para resolver o problema da agregação.

Os estudos in vitro demonstraram que, para a grande maioria dos polipéptidos, o dobramento é um processo 2 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ espontâneo dirigido pela sequência de aminoácidos e pelas condições do solvente. No entanto, embora o estado nativo seja favorecido termodinamicamente, a escala de tempo para o dobramento pode variar desde milissegundos até dias. São introduzidas barreiras cinéticas, por exemplo, pela necessidade de alinhamento de subunidades e subdominios. Em particular para proteínas eucarióticas, devem ocorrer reacções covalentes para se formar a proteina com dobramento correcto. Este último tipo de reacções inclui formação de pontes de dissulfureto, isomerização cis/trans da cadeia polipeptidica em torno de ligações peptidicas de prolina, processamento de pré-proteina e a ligação de grupos prostéticos. Estas limitações cinéticas resultam na acumulação de intermediários com dobramento parcial, que contêm superfícies hidrófobas "pegajosas" expostas que promovem auto-associação e formação de agregados. A expressão de proteínas de mamifero é mais complicada do que a de proteínas bacterianas porque a maior parte delas necessita de ligações dissulfureto intramoleculares para a sua actividade. Assim, são necessários efectores adicionais, tais como "foldases" e um potencial redox adequado para atingir as suas estruturas nativas. Embora o espaço periplasmático da Escherichia colí proporcione um ambiente oxidante, bem como proteínas de dobramento tais como Dsb A, B, C e D, em muitos casos, a simples excreção de proteínas complexas para o espaço periplasmático não é suficiente para que se formem as ligações dissulfureto correctas.

Verificou-se que proteínas acessórias denominadas "foldases” e "chaperones” ajudam no dobramento correcto de proteínas in vivo. As foldases têm uma actividade catalítica que serve para acelerar as etapas covalentes limitantes da velocidade de dobramento. As chaperones, por seu lado, desempenham várias funções, sendo a mais importante proporcionar um ambiente para que as proteínas em formação se dobrem sem competição do processo de auto-associação. Além das chaperones moleculares bem caracterizadas, tais como as proteínas GroEL e DnaK, foram identificadas várias proteínas citoplasmáticas adicionais que afectam o dobramento de proteínas heterólogas. 3 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ

Após a identificação de numerosas foldases bacterianas ou eucarióticas e dos seus papéis específicos na oxidação e isomerização de ligações dissulfureto, foram efectuadas muitas tentativas para utilizar essas proteínas no espaço periplasmático ou mesmo no citoplasma de Escherichia coli (consultar, por exemplo, Bessette et al. (1999)).

Demonstrou-se que a co-expressão de chaperones moleculares resolve parcialmente o problema da formação de corpos de inclusão na expressão de determinadas proteínas recombinantes (consultar, por exemplo, Richardson et al. (1998) Trends Biochem. Sei. 23:138-143; e Bukau et al. (1998) Cell 92:351-366) .

No entanto, o efeito das chaperones moleculares é bastante específico do produto e a co-expressão de cada chaperone molecular com as proteínas alvo é frequentemente complicada. Além disso, em alguns casos, a expressão de uma chaperone molecular é prejudicial ou mesmo perniciosa para o crescimento celular. Apesar dos avanços recentes, a expressão de proteínas de mamífero com dobramento correcto em Escherichia coli ainda permanece um grande desafio. Tal é principalmente devido às dificuldades de controlar os parâmetros chave para a formação de ligações dissulfureto incluindo o potencial redox dentro das células.

Durante várias décadas, a síntese de proteínas in vitro foi uma ferramenta eficaz para a expressão à escala laboratorial de materiais genéticos clonados ou sintetizados. Nos últimos anos, a síntese de proteínas in vitro tem sido considerada uma alternativa à tecnologia de ADN recombinante convencional, devido às desvantagens associadas à expressão celular. In vivo, as proteínas podem ser degradas ou modificadas por várias enzimas sintetizadas durante a cultura da célula e, após a síntese, podem ser modificadas por processamento pós-tradução, tal como glicosilação, desamidação ou oxidação. Além disso, muitos produtos inibem os processos metabólicos e a sua síntese tem que competir com outros processos celulares necessários para reproduzir a célula e para proteger a sua informação genética.

Dado que é essencialmente isenta da regulação celular da expressão génica, a síntese de proteínas in vitro apresenta 4 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ vantagens na produção de proteínas citotóxicas, instáveis ou insolúveis. A sobre-produção de proteína além de uma concentração predeterminada pode ser difícil de obter in vivo, porque os níveis de expressão são regulados pela concentração de produto. A concentração de proteína acumulada na célula em geral afecta a viabilidade da célula, de modo que a sobre-produção da proteína pretendida é difícil de obter. Num processo de isolamento e purificação, muitos tipos de proteínas são insolúveis ou instáveis e são degradadas por proteases intracelulares ou agregam em corpos de inclusão, de modo que a taxa de perdas é elevada. A síntese in vitro evita muitos destes problemas (consultar Kim e Swartz (1999) Biotechnol. Bioeng. 66:180-188; e Kim e Swartz (2000) Biotechnol. Prog. 16:385-390). Além disso, através da expressão simultânea e rápida de várias proteínas numa configuração multiplexada, esta tecnologia pode proporcionar uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de matrizes combinatórias para investigação e para rastreio de proteínas. Além disso, podem incorporar-se eficazmente vários tipos de aminoácidos não naturais nas proteínas para objectivos específicos (Noren et al. (1989) Science 244:182-188) .

Merk et al., 1999, J. Biochem., Vol. 125, p. 328-333, descrevem a síntese de dois anticorpos anti-lisozima em cadeia simples num sistema de expressão de E. coli isento de células na presença de glutationa reduzida e oxidada, proteína-dissulfureto-isomerase (PDI) e chaperones.

Qu e Green, 1995, DNA and Cell Biology, Vol. 14, N.° 9, p. 741-751, descrevem o dobramento e montagem de uma molécula do MHC de classe II humana num sistema isento de células.

Ryabova et al., 1997, Nature Biotech., Vol. 15, p. 79-84, descrevem a produção de fragmentos scFv funcionais num sistema de tradução de E. coli isento de células incluindo proteína-dissulfureto-isomerase (PDI).

Contrariamente à expressão génica in vivo, a síntese de proteínas isenta de células utiliza a maquinaria de tradução isolada em vez das células inteiras. Consequentemente, este 5 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ método elimina a necessidade de manter a fisiologia celular e permite o controlo directo de vários parâmetros para optimizar a sintese/dobramento de proteínas alvo. É de particular interesse o problema da síntese isenta de células de proteínas de mamífero biologicamente activas contendo múltiplas ligações dissulfureto. 0 presente invento refere-se a síntese acoplada a dobramento de proteínas de mamífero através do controlo do potencial redox durante a síntese de proteínas.

SUMÁRIO DO INVENTO

Proporcionam-se métodos para a síntese in vitro melhorada de moléculas de proteína, por optimização das condições de oxidação-redução na mistura reaccional, tal como definido nas reivindicações. Inclui-se um tampão redox na mistura reaccional para manter o ambiente oxidante adequado para a formação de ligações dissulfureto correctas, por exemplo pela inclusão de glutationa numa razão adequada das formas oxidada e reduzida. A mistura reaccional é, de preferência, modificada adicionalmente para diminuir a actividade de moléculas no extracto, e.g. enzimas endógenas que têm actividade reduzida. Tais moléculas são inactivadas quimicamente antes da síntese de proteínas isenta de células, e.g. por tratamento dos extractos com iodoacetamida (IAA) ou outros compostos que inactivam irreversivelmente os grupos sulfidrilo livres. A presença de enzimas endógenas com actividade reduzida pode ser diminuída adicionalmente pela utilização de extractos preparados a partir de células modificadas geneticamente com mutações inactivantes de tais enzimas, por exemplo tiorredoxina-redutase, glutationa-redutase, etc.

Além de estabilizar o potencial redox da mistura reaccional, a síntese in vitro pode ser melhorada adicionalmente pela inclusão de proteínas acessórias que auxiliam o dobramento correcto das proteínas in vivo. É de particular interesse a inclusão de foldases, proteínas com uma actividade catalítica que serve para acelerar as etapas covalentes limitantes da velocidade de dobramento, e.g. PDI, dsbC, etc. 6 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS A figura 1 apresenta o reactor utilizado para as reacções em modo semi-contínuo. A figura 2 é um gráfico que representa a sintese de uroquinase e a sua actividade enzimática durante uma reacção semi-continua. A figura 3 é um gráfico de barras representando a variação do potencial redox durante a sintese semi-continua. A figura 4 é uma variação temporal da redução de glutationa numa reacção de síntese em modo descontínuo. A figura 5 apresenta a redução de glutationa na presença de extractos de diferentes estirpes bacterianas. A figura 6 é um gráfico de barras representando a expressão de uroquinase em extractos de controlo e tratados com IAA. A figura 7 apresenta as variações temporais da redução de glutationa e de actividade enzimática de produto nos extractos de controlo e tratados com IAA. A figura 8 é uma variação temporal da síntese de uroquinase na presença de PDI ou dsbC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES

Proporcionam-se métodos para a síntese in vitro melhorada de proteínas activas biologicamente, em particular proteínas compreendendo uma ou mais ligações dissulfureto, tal como definido nas reivindicações. A mistura reaccional para a sintese de proteínas in vitro é modificada para melhorar o dobramento da proteína e a formação de ligações dissulfureto. Inclui-se um tampão redox na mistura reaccional para manter o ambiente oxidante adequado, por exemplo pela inclusão de glutationa numa razão adequada das formas oxidada e reduzida. Esse tampão redox é estabilizado adicionalmente por inactivação de reacções por oxidorredutases endógenas. A 7 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ inclusão de um tampão redox permite a produção de proteínas bioactivas que requerem a formação de uma ou mais ligações dissulfureto intramoleculares para actividade.

As moléculas endógenas que reduzem o tampão redox são inactivadas quimicamente antes da síntese, e.g. por tratamentos dos extractos com compostos tais como iodoacetamida (IAA), que inactivam irreversivelmente os grupos sulfidrilo livres.

Em alguns métodos da síntese de proteínas in vitro utilizam-se enzimas endógenas para a geração ou reabastecimento de fontes de energia utilizadas na reacção (consultar, por exemplo, pedido de patente co-pendente 091270 814). Em determinadas circunstâncias, tais enzimas endógenas são inactivadas pela etapa de inactivação química descrita anteriormente e, nesse caso, pode ser desejável reabastecer estas enzimas a partir de uma fonte exógena antes ou durante a síntese. Por exemplo, caso se pretenda utilizar fontes de energia secundárias não tradicionais tais como intermediários glicolíticos precoces (por exemplo, glucose-6-fosfato), a actividade de gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase pode ser restabelecida por qualquer de vários métodos conhecidos na especialidade. A presença de enzimas endógenas com actividade reduzida pode ser diminuída adicionalmente pela utilização de extractos preparados a partir de células modificadas geneticamente com mutações inactivantes de tais enzimas, por exemplo tiorredoxina-redutase, glutationa-redutase, etc.

Além do tamponamento do potencial redox da mistura reaccional, a síntese in vitro pode ser melhorada adicionalmente pela inclusão de proteínas acessórias que auxiliam o dobramento correcto de proteínas in vivo. É de particular interesse a inclusão de foldases, proteínas com uma actividade catalítica que serve para acelerar as etapas covalentes limitantes de velocidade do dobramento, e.g. PDI, dsbC, etc.

Estes métodos são aplicáveis a reacções em modo contínuo, semi-contínuo e descontínuo. No sistema semi-contínuo, mesmo 8 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ quando as enzimas redutoras endógenas não são inactivadas, o nível de oxidação do tampão redox recuperará substancialmente após uma incubação prolongada. A recuperação do ambiente oxidante na câmara reaccional permite que a proteína sintetizada adquira ligações dissulfureto e actividade. No entanto, os extractos com oxidorredutases inactivadas proporcionam formação mais rápida de proteínas bioactivas.

Para algumas reacções de síntese, e.g. reacções multiplexadas, é preferível utilizar modo descontínuo em vez de um sistema semi-contínuo. Para métodos de síntese em modo descontínuo, a mistura reaccional é de preferência modificada de modo a diminuir a actividade de moléculas no extracto, e.g. enzimas endógenas, que têm actividade redutora.

DEFINIÇÕES

Deve entender-se que este invento não está limitado à metodologia, protocolos, linhas celulares, espécies ou géneros animais e reagentes descritos em particular, dado que podem variar. Deve também entender-se que a terminologia aqui utilizada é somente para o objectivo de descrever determinadas concretizações e não se pretende que limite o âmbito do presente invento, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Tal como aqui utilizadas, as formas no singular "um(a)", "e" e "o/a" incluem as suas homólogas no plural salvo quando o contexto indica claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e a referência a "a proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e seus equivalentes conhecidos dos peritos na especialidade, etc. Todas as expressões técnicas e científicas aqui utilizadas têm o significado que é normalmente entendido pelo perito na especialidade a que se refere este invento, salvo óbvia indicação em contrário.

Dobramento, tal como aqui utilizado, refere-se à estrutura tridimensional de polipéptidos e proteínas, em que as interacções entre resíduos de aminoácidos actuam para estabilizar a estrutura. Embora as interacções não covalentes sejam importantes para determinar a estrutura, usualmente os 9 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ péptidos e proteínas de interesse terão ligações covalentes intramoleculares e/ou intermoleculares formadas por dois resíduos de cisteínas. Para proteínas e polipéptidos de ocorrência natural ou seus derivados e variantes, o dobramento correcto é tipicamente o arranjo que resulta em actividade biológica óptima e pode ser monitorizado convenientemente por ensaios de actividade, e.g. ligação de ligando, actividade enzimática, etc.

Em alguns casos, por exemplo quando o produto pretendido é de origem sintética, os ensaios com base na actividade biológica serão menos significativos. 0 dobramento correcto de tais moléculas pode ser determinado com base em propriedades físicas, considerações energéticas, estudos de modelação e semelhantes. Síntese in vitro: tal como aqui utilizada refere-se à síntese de polipéptidos isenta de células numa mistura reaccional de polipéptidos compreendendo extractos biológicos e/ou reagentes definidos. A mistura reaccional compreenderá pelo menos ATP, uma fonte de energia; um molde para produção da macromolécula, e.g. ADN, ARNm, etc. aminoácidos e tais cofactores, enzimas e outros reagentes que sejam necessários para a síntese, e.g. ribossomas, ARNt, polimerases, factores de transcrição, etc. Tais sistemas de reacção sintética são bem conhecidos na especialidade e têm sido descritos na literatura. A reacção de síntese isenta de células pode ser efectuada em modo descontínuo, em caudal contínuo ou em caudal semi-contínuo, tal como conhecido na especialidade.

Tampão redox. A mistura reaccional para a síntese no presente invento é modificada pela adição de um tampão redox, compreendendo um ou mais de glutationa, ditiotreitol, ditioeritritol, β-mercaptoetanol, tioglicolato e cisteína. A concentração de agente redutor e a razão das formas oxidadas e reduzidas necessárias para atingir a potência redutora pretendida para o tempo de reacção seleccionado variarão de acordo com a força do agente redutor, o nível de 02 no sistema e a duração do tempo de reacção.

Numa concretização preferida, utiliza-se glutationa como agente de tamponamento redox e é adicionada a uma concentração 10 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ de pelo menos cerca de 1 mM e não mais do que cerca de 25 mM, de preferência a uma concentração de cerca de 5 a 10 mM. O tampão redox pode compreender tanto a forma oxidada, como a forma reduzida do composto sulfidrilo, por exemplo numa razão entre cerca de 10:1 e 1:1 de forma oxidada:reduzida, usualmente numa razão entre cerca de 5:1 e 2:1 e pode ser numa razão de 4:1.

Extractos biológicos. Para os objectivos deste invento, os extractos biológicos são qualquer preparação compreendendo os componentes de uma maquinaria de síntese de proteínas, usualmente um extracto de células bacterianas, em que tais componentes são capazes de expressar um ácido nucleico que codifica uma proteína pretendida. Assim, um extracto bacteriano compreende componentes que são capazes de traduzir ácido ribonucleico mensageiro (ARNm) que codifica uma proteína pretendida e, opcionalmente, compreende componentes que são capazes de transcrever adn que codifica uma proteína pretendida. Tais componentes incluem, por exemplo, ARN-polimerase dirigida por ADN (ARN-polimerase), quaisquer activadores de transcrição necessários para iniciação da transcrição do ADN que codifica a proteína pretendida, ácidos ribonucleicos de transferência (ARNt), aminoacil-ARNt-sintetases, ribossomas 70S, N10-formiltetra-hidrofolato, formilmetionina-ARNtfMet-sintetase, peptidil-transferase, factores de iniciação tais como if-1, if-2 e IF-3, factores de alongamento, tais como EF-Tu, EF-Ts e EF-G, factores de libertação, tais como RF-1, RF-2 e RF-3 e semelhantes.

Numa concretização preferida do invento, a mistura reaccional compreende extractos de células bacterianas, e.g. extractos de E. coli S30, tal como é conhecido na especialidade. Por razões de conveniência, o organismo utilizado como uma fonte de extractos pode ser denominado como organismo fonte. Os métodos para produzir extractos activos são conhecidos na especialidade, por exemplo podem ser encontrados em Pratt (1984), Coupled transcription-translation in prokaryotic cell-free Systems, p. 179-209, em Hames, B.D. e Higgins, S.J. (ed.), Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press, New York. Kudlicki et al. (1992) Anal Biochem 206(2):389-93 modificaram o extracto 11 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ isento de células de E. colí S30 por recolha da fracção ribossómica de S30 por ultracentrifugação. Embora tais extractos sejam uma fonte útil de ribossomas e outros factores necessários para a síntese de proteínas, podem também conter pequenas quantidades de enzimas responsáveis por reacções secundárias indesejáveis, que não estão relacionadas com a síntese de proteínas mas que modulam o ambiente oxidante da reacção e que podem reduzir os grupos do polipéptido nascente e do tampão redox.

Extractos optimizados para oxidação-redução. Os extractos biológicos para os presentes métodos são de preferência optimizados para eliminar substancialmente enzimas e outras biomoléculas presentes no extracto que reduzem o tampão redox. As enzimas indesejáveis podem ser removidas ou de outra forma inactivadas na mistura reaccional.

As moléculas endógenas com grupos sulfidrilos livres são inactivadas antes do início da síntese por tratamento com um composto que bloqueia quimicamente os sulfidrilos por alquilação ou acetilação do sulfidrilo livre. 0 composto de inactivação é então removido da mistura reaccional, e.g. por diálise, etc.

Os agentes de inactivação úteis incluem iodoacetamida, N-etilmaleimida, iodoacetato, N-iodoacetil-N'-(5-sulfónico-1-naftil)etilenodiamina, etc., tal como conhecido na especialidade; especialmente os compostos incluindo iodoacetamidas, maleimidas, halogenetos benzílicos e bromometilcetonas. A concentração do agente de inactivação e a duração da reacção serão determinadas pelo composto específico que é seleccionado. 0 agente de inactivação é adicionado a uma concentração que elimina substancialmente a actividade de redução de sulfidrilos endógenos, mantendo a actividade sintética do extracto. Ambas as actividades são facilmente determinadas por métodos ilustrados nos exemplos listados. Usualmente será mantida pelo menos cerca de 50% da actividade sintética, mais usualmente pelo menos cerca de 75% e, de preferência, pelo menos cerca de 90%. Como exemplo, quando o agente de inactivação é iodoacetamida, pode adicionar-se a uma concentração de cerca de 1 a 10 mM e incuba-se entre 15 a 60 minutos. 12 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ

Além da utilização de um agente de inactivação para pré-tratar os extractos biológicos, a actividade de redução do extracto pode ser modificada adicionalmente pela modificação genética da estirpe fonte para silenciar ("knock-out”) ou inactivar geneticamente as enzimas com esta actividade indesejável. Tais enzimas podem incluir tiorredoxina-redutase, glutationa-redutase e semelhantes. A sequência de codificação para a enzima é silenciada ("knocked-out”) ou de outra forma inactivada no cromossoma do organismo fonte, por deleção de toda ou parte da sequência de codificação; inserção de desvio de quadro; mutações negativas dominantes, etc. Os genomas de vários organismos, incluindo E. coli, foram completamente sequenciados, facilitando assim as modificações genéticas. Por exemplo, descreve-se um método de uma estratégia de silenciamento ("knockout") sem marcação em Arigoni et al. (1998) Nat Biotechnol 16(9):851-6.

Descreve-se um método preferido para inactivar genes alvo em Hoang et al. (1998) Gene 212:77-86. Neste método, utilizam-se vectores de substituição de gene que contêm um gene de resistência a tetraciclina e um gene que codifica levano-sacarase (sacB) como marcadores de selecção para recombinação. 0 gene alvo é primeiramente clonado e mutado, de preferência por deleção de uma parte significativa do gene. Este gene é então inserido por ligação num vector concebido para facilitar a substituição do gene cromossómico. As células de E. coli são então transformadas com esses vectores. Seleccionam-se as células que incorporaram o plasmideo no cromossoma no local do gene alvo, seguidamente força-se a saida do plasmideo do cromossoma, cultivando as células em sacarose. A sacarose é tóxica quando o gene sacB está localizado no cromossoma. Selecciona-se a estirpe com a mutação correcta com base no seu fenótipo de sensibilidade a tetraciclina e resistência a sacarose. A análise por PCR ou sequenciação de adn confirma seguidamente a alteração genética pretendida. A enzima pode ser removida do extracto celular após ruptura das células e antes de utilização. Podem ser utilizados quaisquer de vários meios conhecidos na 13 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ especialidade de purificação de proteínas, incluindo técnicas de purificação por afinidade, tal como a utilização de anticorpos ou fragmentos de anticorpos com afinidade específica para as enzimas alvo; a utilização de marcadores de afinidade expressos como parte das enzimas alvo para facilitar a sua remoção do extracto celular; e métodos de purificação convencionais.

Por exemplo, selecciona-se um anticorpo ou fragmento de anticorpo (e.g., Fab ou scFv) para afinidade específica à enzima alvo utilizando disposição de fagos ou outras técnicas bem desenvolvidas. Esse anticorpo ou fragmento de anticorpo é então imobilizado em qualquer de várias pérolas, resinas ou membranas de purificação utilizando qualquer de várias técnicas de imobilização. Põe-se o anticorpo imobilizado em contacto com o extracto celular para ligar a enzima alvo e seguidamente remove-se o complexo anticorpo imobilizado/enzima por filtração ou centrifugação suave.

Noutro exemplo, a sequência de codificação da proteína alvo pode ser modificada para incluir um marcador, tal como uma extensão Flag® (desenvolvido por Immunex Corp. e comercializada por Stratagene) ou uma cauda de poli- histidinas. Foram publicados muitos outros exemplos e são conhecidos dos peritos na especialidade. As proteínas marcadas são então removidas por passagem por uma matriz ou coluna de afinidade adequada. A extensão dos aminoácidos e o parceiro de ligação são seleccionados de modo a que ocorra apenas ligação específica em condições compatíveis com a estabilidade do extracto celular e sem alterar significativamente a composição química do extracto celular.

Ainda num outro exemplo, a enzima ou enzimas alvo são separadas por qualquer de vários métodos usualmente utilizados para purificação de proteínas, tal como cromatografia de afinidade de substrato, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrófoba, separação electroforética ou outros métodos praticados na especialidade de purificação de proteínas.

Adição de enzimas de dobramento. A mistura reaccional do presente invento pode ser modificada adicionalmente pela 14 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ inclusão de uma ou mais enzimas que melhoram o dobramento e a formação de ligações dissulfureto, i.e. foldases, chaperoninas, etc. Numa concretização do invento, adiciona-se uma foldase bacteriana à mistura reaccional. Por exemplo, foram caracterizadas várias cisteina oxidorredutases que catalisam a formação de ligações dissulfureto em E. coli. As enzimas ou chaperoninas de interesse incluem DsbA, DsbC, PDI, GroEL, DnaK, DnaJ, GroEL/ES, GrpE, BIP, PPI ou outras ciclofilinas, etc. A(s) enzima(s) de dobramento é(são) adicionada(s) numa concentração eficaz para melhorar a actividade global da proteina alvo de interesse, que pode ser determinada empiricamente por titulação da actividade biológica do produto de proteina expresso. É de particular interesse a inclusão de DsbC, uma enzima solúvel com actividade de oxidase e isomerase que catalisa o rearranjo ou isomerização de ligações dissulfureto incorrectas. 0 emparelhamento incorrecto de resíduos de cisteina ocorre facilmente quando a cadeia polipeptídica não dobrada é primeiramente oxidada. DsbC facilita a ruptura de ligações dissulfureto incorrectas e a formação subsequente das que ocorrem no estado nativo. É também de interesse a utilização da enzima solúvel DsbA, que é o catalisador principal da formação de pontes dissulfureto. A identificação do gene DsbC é descrita por Missiakas et al. (1994) EMBO J 13:2013-2020, em que se demonstra que tem uma actividade semelhante à de DsbA na redução de insulina dependente de ditiotreitol in vitro. Consultar também Chen et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605. A utilização de DsbA ou DsbC para melhorar o dobramento periplasmático é discutida em Joly et al. (1998) p.n.a.s. 95:2773-2777.

Alternativamente às enzimas bacterianas, podem utilizar-se enzimas eucarióticas. Por exemplo, a PDI eucariótica não só é um catalisador eficaz da oxidação de cisteina em proteínas e isomerização de pontes dissulfureto, como também apresenta actividade de chaperone. A co-expressão de PDI pode mesmo facilitar a produção de proteínas activas com múltiplas ligações dissulfureto. A razão por que PDI é tão eficaz a melhorar o dobramento de proteínas recombinantes em bactérias é presumivelmente porque contém um subdomínio de ligação de 15 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ péptido que permite que interactue com proteínas heterólogas mais facilmente do que as enzimas bacterianas. A inclusão de PDI de mamífero proporciona um excelente catalisador da isomerização de ligações dissulfureto in vitro.

As expressões "proteína pretendida" ou "proteína seleccionada" são utilizadas indiferentemente e referem-se na generalidade a qualquer péptido ou proteína com mais de cerca de 5 aminoácidos. Os polipéptidos podem ser homólogos ou de preferência exógenos, significando que são heterólogos, i.e., alheios à bactéria da qual é derivado o extracto bacteriano isento de células, tal como uma proteína humana ou uma proteína de levedura produzida no extracto bacteriano isento de células. De preferência, utilizam-se polipéptidos de mamífero, i.e. polipéptidos codificados num genoma de mamífero.

Os exemplos de polipéptidos de mamífero incluem, entre outros, moléculas tais como renina; hormonas de crescimento, incluindo hormona de crescimento humana; hormona de crescimento bovina; factor de libertação de hormona de crescimento; hormona paratiróide; hormona estimulante da tiróide; lipoproteínas; alfa-l-antitripsina; cadeia A de insulina; insulina; pró-insulina; hormona folículo-estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como factor VIIIC, factor IX, factor de tecidos e factor de von willebrand; factores anticoagulantes tal como proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; um activador de plasminogénio, tal como activador de plasminogénio do tipo uroquinase ou activador de plasminogénio urinário ou activador de plasminogénio do tipo tecidular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crescimento hemopoiético; factor alfa e factor beta de necrose tumoral; encefalinase; RANTES e outras quimioquinas; proteína inflamatória de macrófago humano (MIP-la) ; uma albumina de soro tal como albumina de soro humana; substância inibidora da mulleriana; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; pró-relaxina; péptido associado a gonadotropina de ratinho; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; ADNase; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; integrina; proteína A ou 16 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ D; factores reumatóides; um factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, neurotrofina-4, neurotrofina-5 ou neurotrofina-6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento de nervos tal como NGF-β; factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crescimento de fibroblastos tal como aFGF e pFGF; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento por transformação (TGF) tal como TGF-α e TGF-β, incluindo TGF-βΙ, TGF^32, TGF-p3, TGF-βί ou TGF^5; factor I e factor II de crescimento do tipo insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação de factor de crescimento do tipo insulina; proteínas CD tais como CD-3, CD-4, CD-8 e CD-19; eritropoietina; factor osteoindutor; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferão tal como interferão α, β e γ; factores de estimulação de colónias (CSF), e.g., M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (IL), e.g., IL-1 a IL-18; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor de aceleração do decaimento; antigénio virai tal como, por exemplo, uma parte do invólucro de SIDA; proteínas de transporte; receptores de retorno; adressinas; proteínas reguladoras; anticorpos; e fragmentos de qualquer dos polipéptidos listados anteriormente.

MÉTODOS PARA MELHORAR A SÍNTESE IN VITRO O sistema em causa é útil para síntese in vitro de proteínas activas biologicamente, em particular proteínas que necessitem de formação correcta de uma ou mais ligações dissulfureto para actividade biológica. As reacções de síntese podem incluir a transcrição de ARN a partir de moldes de ADN ou ARN. As reacções podem utilizar um reactor de larga escala, pequena escala, ou podem ser multiplexadas para efectuar várias sínteses simultaneamente. As reacções contínuas utilizarão um mecanismo de alimentação para introduzir um fluxo de reagentes e pode isolar-se o produto final como parte do processo. Os sistemas descontínuos são também de interesse, em que se podem introduzir reagentes adicionais para prolongar o período de tempo para a síntese activa. Um reactor pode operar em qualquer modo tal como descontínuo, descontínuo com extensão, semi-descontínuo, semi-contínuo, contínuo e descontínuo com alimentação ("fed-batch") e o modo será 17 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ seleccionado de acordo com os objectivos da aplicação pretendida. É de particular interesse a tradução de ARNm para produzir proteínas, tradução essa que pode ser acoplada à síntese in vitro de ARN a partir de um molde de ADN. Tal sistema isento de células conterá todos os factores necessários para a tradução de ARNm, por exemplo ribossomas, aminoácidos, ARNt, aminoacil-sintetases, factores de alongamento e factores de iniciação. Os sistemas isentos de células conhecidos na arte incluem extractos de gérmen de trigo (Roberts et al. (1973) P.N.A.S. 70:2330), extractos de reticulócitos (Pelham et al. (1976) Eur. J. Biochem. 67:247), extractos de E. coli, etc., que podem ser tratados com uma nuclease adequada para eliminar a actividade de ARNm endógeno activo.

Além dos componentes anteriores, tais como extracto isento de células, molde genético, aminoácidos e fontes de energia, podem ser adicionados à reacção materiais especificamente necessários à síntese de proteínas. Estes materiais incluem sal, compostos poliméricos, AMP cíclico, inibidores de enzimas de degradação de proteínas ou ácidos nucleicos, inibidor ou regulador de síntese de proteínas, ajustador de oxidação/redução, tensioactivo não desnaturante, componente de tampão, espermina, espermidina, etc.

Os sais incluem de preferência sais de potássio, magnésio, amónio e manganês de ácido acético ou de ácido sulfúrico e alguns destes podem ter aminoácidos como contra-iões. O composto polimérico pode ser polietilenoglicol, dextrano, dietilaminoetilo, aminoetilo quaternário e aminoetilo. O ajustador de oxidação/redução pode ser ditiotreitol, ácido ascórbico, glutationa e/ou os seus óxidos. De igual modo, pode utilizar-se um tensioactivo não desnaturante tal como Triton X—100 a uma concentração de 0-0,5 M. Podem utilizar-se espermina e espermidina para melhorar a capacidade de síntese de proteínas e pode utilizar-se ampc como um regulador da expressão génica.

Quando se muda a concentração de um determinado componente do meio reaccional, pode mudar-se a concentração de outro componente da reacção em conformidade. Por exemplo, as 18 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ concentrações de vários componentes, tais como nucleótidos e compostos fontes de energia, podem ser controladas simultaneamente de acordo com a alteração das concentrações dos outros componentes. De igual modo, o nivel de concentração de componentes no reactor pode ser variado ao longo do tempo.

De preferência, mantém-se a reacção na gama de pH de 5-10 e uma temperatura de 20-50°C e, com maior preferência, na gama de pH 6-9 e uma temperatura de 25-40°C.

Quando se utiliza um modo de isolar uma proteína num modo de operação contínuo, a saída de produto do reactor flui através de uma membrana para o meio de isolar a proteína. Num modo de operação semi-contínuo, a superfície exterior ou externa da membrana é posta em contacto com soluções predeterminadas que são mudadas ciclicamente de uma forma predeterminada. Estas soluções contêm substratos tais como aminoácidos e nucleótidos. Nesta altura, o reactor é operado em modo de diálise, modo descontínuo de diafiltração ou modo semi-contínuo com alimentação escalonada. Pode proporcionar-se uma solução de alimentação ao reactor através da mesma membrana ou de uma unidade de injecção independente. A proteína sintetizada é acumulada no reactor e seguidamente é isolada e purificada de acordo com o método usual para purificação de proteínas após terminar a operação do sistema.

Nos casos em que há um fluxo de reagentes, a direcção do fluxo de líquido pode ser perpendicular e/ou tangencial à membrana. O fluxo tangencial é eficaz para reciclar ATP e para evitar entupimento da membrana e pode ser sobreposto a um fluxo perpendicular. O fluxo perpendicular à membrana pode ser provocada ou efectuado por uma bomba de pressão positiva ou uma bomba de sucção de vácuo. A solução em contacto com a superfície exterior da membrana pode ser mudada ciclicamente e pode ser um fluxo tangencial estável relativamente à membrana. O reactor pode ser agitado interna ou externamente através de meios de agitação adequados.

Durante a síntese de proteínas no reactor, os meios de isolar a proteína para isolar selectivamente a proteína pretendida podem incluir uma unidade empacotada com partículas revestidas com moléculas de anticorpo ou outras moléculas 19 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ imobilizadas com um componente para adsorver a proteína pretendida sintetizada e uma membrana com poros de tamanhos adequados. De preferência, os meios de isolar proteína incluem duas colunas para utilização alternada. Alternativamente, o produto de proteína pode ser adsorvido utilizando cromatografia em leito expandido, caso em que se pode utilizar ou não uma membrana. A quantidade de proteína produzida numa reacção de tradução pode ser medida de várias formas. Um método baseia-se na disponibilidade de um ensaio que meça a actividade da proteína particular a ser traduzida. Um exemplo de um ensaio para medir a actividade de proteína é um sistema de ensaio de luciferase ou o sistema de ensaio de cloranfenicol-acetiltransferase. Estes ensaios medem a quantidade de proteína funcionalmente activa produzida na reacção de tradução. Os ensaios de actividade não medirão proteína completa que é inactiva devido a dobramento de proteína incorrecto ou ausência de outras modificações pós-tradução necessárias para actividade de proteína.

Outro método de medir a quantidade de proteína produzida nas reacções de transcrição e tradução acopladas in vitro é efectuar as reacções utilizando uma quantidade conhecida de aminoácido marcado radioquimicamente, tal como 35S-metionina ou 3H-leucina, e subsequentemente medir a quantidade de aminoácido marcado radioquimicamente incorporado na proteína traduzida de novo. Os ensaios de incorporação medirão a quantidade de aminoácido marcado radioquimicamente em todas as proteínas produzidas na reacção de tradução in vitro incluindo produtos truncados de proteína. A proteína marcada radioquimicamente pode ser separada adicionalmente num gel de proteína e pode confirmar-se por autorradiografia se o produto tem o tamanho correcto e se não foram produzidos produtos proteicos secundários.

Em concretizações que utilizam um molde de ADN para dirigir transcrição/tradução in vitro, alguns componentes do sistema de transcrição e/ou tradução no extracto bacteriano podem ser suplementados vantajosamente para aumentar a disponibilidade de tais componentes na mistura reaccional. Numa concretização preferida, a mistura reaccional contém um 20 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ ou mais dos seguintes: (1) uma concentração inicial de GTP, UTP e CTP de cerca de 0,5 mM a cerca de 2,0 mM e de preferência cerca de 0,85 mM; (2) uma concentração inicial de atp de cerca de 0,5 mM a cerca de 2,5 mM e, de preferência, cerca de 1,22 mM; (3) uma concentração inicial de PEP de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM e, de preferência, cerca de 27,0 mM; (4) uma concentração de piruvato quinase de cerca de 0,05 unidades/ml a cerca de 0,5 unidades/mL e de preferência cerca de 0,2 unidades/mL; (5) uma concentração inicial de ARNt de cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 0,3 mg/mL e de preferência cerca de 0,17 mg/mL; (6) uma concentração inicial de todos os 19 aminoácidos (todos os aminoácidos excepto metionina) de cerca de 0,2 mM a cerca de 0,6 mM e de preferência cerca de 0,35 mM; e (7) uma concentração inicial de metionina de cerca de 0,6 micromoles/litro (μΜ) a cerca de 2,0 mM e de preferência cerca de 4,3 μΜ a cerca de 2,0 mM e com maior preferência cerca de 0,1 mM a cerca de 2,0 mM e com a maior preferência cerca de 1,0 mM a cerca de 2,0 mM.

Deve entender-se que este invento não é limitado à metodologia, protocolos, linhas celulares, espécies ou géneros animais, construções e reagentes específicos descritos, dado que estes podem obviamente variar. Deve também entender-se que a terminologia aqui utilizada é para o objectivo de descrever apenas concretizações específicas e que não se pretende que limite o âmbito do presente invento, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Salvo indicação em contrário, todas as expressões técnicas e científicas aqui utilizadas têm o significado usual entendido pelos peritos na especialidade à que se refere este invento. Embora possam ser utilizados na prática ou ensaio do invento quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, são agora descritos os métodos, dispositivos e materiais preferidos.

Todas as publicações aqui mencionadas são para o objectivo de descrever e revelar, por exemplo, as linhas celulares, construções e metodologias que são descritas nas publicações que podem ser utilizadas em relação com o invento presentemente descrito. As publicações discutidas anteriormente e ao longo do texto apresentam-se apenas para a 21 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ sua revelação antes da data de apresentação do presente pedido.

Os seguintes exemplos apresentam-se para proporcionar uma revelação e descrição completa de como preparar e utilizar o invento em questão aos peritos na especialidade e não se pretende que limitem o âmbito do que é considerado o invento. Tentou-se assegurar exactidão no que se refere aos números utilizados (e.g. quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas devem ser considerados alguns erros e desvios experimentais. Salvo indicação em contrário, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio, a temperatura é em graus centígrados; e a pressão é a pressão atmosférica ou perto da pressão atmosférica.

PARTE EXPERIMENTAL

Expressão do domínio de serina protease de uroquinase murina num sistema isento de células A mistura reaccional padrão para a síntese de proteína isenta de células consiste dos seguintes componentes: Hepes-KOH 57 mM (pH 8,2), ATP 1,2 mM, GTP, UTP e CTP cada a 0,85 mM, AMPc 0,64 mM, glutamato de potássio 200 mM, NH4(OAc) 80 mM, Mg(OAc)2 15 mM, ácido folínico a 34 pg/ml, plasmídeo a 6,7 pg/ml, ARN-polimerase T7 a 33 pg/ml, cada um dos 20 aminoácidos não marcados a 500 μΜ e [3H]-leucina (0,27 GBq/mmol), PEG 8000 a 2%, PEP (fosfoenolpiruvato) 33 mM, glutationa reduzida (GSH) 1 mM, glutationa oxidada (GSSG) 4 mM e 0,24 volumes de extracto de S30. Para a expressão do domínio de serina protease de uroquinase murina, utilizou-se o plasmídeo pK7UK que contém a sequência de codificação sob o promotor de T7.

Em determinadas experiências adicionou-se dsbC de E. coli ou proteína PDI humana em diferentes concentrações. PDI foi comprada a Pierce, Inc. e dsbC foi purificada a partir de cultura de E. coli estirpe BL21DE3 (pETdsbChisC). Preparou-se ARN-polimerase T7 a partir de cultura de E. coli estirpe BL21 (pARl219) de acordo com os procedimentos ligeiramente modificados de Davanloo et al. (1984) P.N.A.S. 81:2035-2039. 22 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ

Também se utilizou E. coli estirpe FA113 que transporta mutações em trxB e gor.

Preparou-se extracto S30 a partir de E.coli K12 (estirpe A19) de acordo com os procedimentos relatados em Pratt (1984) Coupled Transcription-Translation in Prokaryotic Cell-free Systems, p. 179-209, em Hames, B.D. e Higgins, S.J. (ed.), Transcription and Translation: a Practical Approach. IRL Press, New York. Para tratamento adicional do extracto S30, misturou-se o extracto com 0,1 volumes de iodoacetamida (IAA) 20 mM e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para remover IAA ou sulfito de sódio residual, o extracto foi dialisado contra 200 volumes de tampão S30 (Tris-Cl 10 mM, pH 7,8, Mg(OAc)2 14 mM, K(OAc) 60 mM) a 4°C durante 4 horas.

Para a expressão de proteína no sistema semi-contínuo, incubou-se 210 μΐ de mistura reaccional padrão numa câmara de diálise (Slide-A-Lyzer, limite de exclusão de peso molecular 10 000, Pierce, IL) que foi colocado em 6,0 mL de tampão de reservatório (idêntico à mistura reaccional excepto pela ausência de extracto S30, ADN- e ARN-polimerase de T7).

Todas as reacções de síntese foram efectuadas a 37°C durante determinados períodos de tempo.

Determinação do rendimento da síntese de proteína. A quantidade de proteína sintetizada foi estimada pela medição da radioactividade insolúvel em TCA utilizando um contador de cintilações de líquidos (LS3801, Beckman), tal como descrito por Kim, et ai. (1996) Eur. J. Biochem. 239: 881-886.

Actividade enzimática do domínio de protease de uroquinase sintetizada na ausência de células. Retiraram-se amostras de 20 pL durante períodos de incubação para medir a actividade enzimática da proteína sintetizada. Após centrifugar as amostras, retirou-se 10 mL de sobrenadante e adicionou-se a uma microplaca contendo 80 pL de tampão de ensaio (NaCl 38 mM, Tris-Cl 50 mM, pH 8,8) e 10 pL de solução de substrato (Chromozyme U 2 mM, Roche Molecular Biochemicals, CA) . Mediu-se a alteração na absorvância a 405 nm num leitor de microplacas (SpectraMax 190, Molecular Devices, CA). 23 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ

Análise da concentração de glutationa reduzida. A concentração de glutationa reduzida foi medida utilizando ácido ditionitrobenzóico (DTNB). Preparou-se uma solução de DTNB a 4,0 mg/mL em solução de Tris-Cl 1 M (pH 7,8). Misturaram-se amostras de 10 pL com o mesmo volume de TCA a 10% para parar a redução enzimática e centrifugou-se. Para determinar a concentração de glutationa reduzida, adicionou-se 10 pL de sobrenadante e 10 pL de solução de DTNB a 80 pL de solução de Tris-Cl 1 M numa microplaca. Após 3 minutos, mediram-se as absorvâncias a 412 nm e determinou-se a concentração de glutationa a partir de uma curva padrão.

Construção de estirpes mutantes. As mutações de inserção em trxB ou gor na estirpe FA113 (Bessette et ai. (1999) P.N.A.S. 96(24):13703-8) foram transferidas para a estirpe AI9 por transdução Pl seguindo os procedimentos padrão (Miller (1992) A Short Course in Bacterial Genetics. p. 263-364. Cold Spring Harbor Press, NY.)

Resultados

Preparou-se 210 pL de mistura reaccional e incubou-se no reactor semi-contínuo apresentado na figura 1. Retiraram-se amostras de 10 pL durante a incubação para determinar a quantidade de proteína sintetizada (apresentada na figura 2, círculos abertos). Ao mesmo tempo, retiraram-se amostras de 20 pL para a medição de actividade de serina protease (quadrados abertos, reacção sem plasmídeo; quadrados a cheio, reacção com o plasmídeo pK7UK).

Para monitorizar a alteração no potencial redox, retiraram-se amostras de 10 pL da mistura reaccional e da solução de reservatório. Mediram-se as concentrações de glutationa reduzida, tal como descrito em materiais e métodos. As concentrações de glutationa oxidada foram estimadas com base nas concentrações iniciais e nas quantidades de glutationa reduzida medidas. Os resultados apresentam-se na figura 3. As concentrações iniciais de glutationa reduzida e oxidada foram 1 mM e 4 mM, respectivamente.

Para monitorizar a variação temporal da glutationa reduzida numa reacção em descontínuo, durante a incubação de 24 ΕΡ 1 315 826/ΡΤ uma reacção em descontínuo de 150 pL, retiraram-se amostras de 10 pL em determinados pontos de tempo, trataram-se com solução de TCA e determinaram-se as concentrações. As concentrações de glutationa reduzida foram medidas tal como descrito em materiais e métodos. As concentrações de glutationa oxidada foram estimadas com base nas concentrações iniciais e nas quantidades de glutationa reduzida medidas. Os resultados apresentam-se na figura 4. As concentrações iniciais de glutationa reduzida e oxidada foram 1 mM e 4 mM, respectivamente.

Para determinar os efeitos de diferentes estirpes na redução de glutationa, prepararam-se extractos celulares a partir das estirpes mutantes indicadas na figura 5 e incubaram-se com a mistura reaccional. Retiraram-se amostras de 10 pL em determinados pontos temporais, trataram-se com solução de TCA e determinaram-se as concentrações de GSH tal como descrito anteriormente. Prepararam-se extractos celulares por aplicação breve de ultra-sons à pasta celular ressuspensa em tampão S30. As concentrações totais de proteínas celulares nas misturas reaccionais foram 6,8 (A19); 5,2 (A19 trxB); 5,5 (Al9 gor); e 5,4 (FA113) mg/mL, respectivamente. Em experiências em que se utilizou extracto celular A19 para síntese de proteína, a concentração de proteína celular foi de 10,8 mg/mL. A expressão de uroquinase foi determinada no extracto tratado com IAA, tal como apresentado na figura 6. Tratou-se o plasmídeo pK7UK nas misturas reaccionais padrão contendo extracto celular normal ou tratado com IAA. Após 1 hora de incubação, mediu-se a quantidade de radioactividade insolúvel em TCA tal como descrito nos métodos experimentais.

Na figura 7 apresenta-se a variação temporal da redução de glutationa e da actividade enzimática da proteína expressa numa reacção descontínua. O plasmídeo pK7UK foi expresso em 450 pL de mistura reaccional contendo extracto S30 não tratado ou tratado com IAA e tampão de glutationa 5 mM (forma reduzida 1 mM e forma oxidada 4 mM) . A determinados intervalos de tempo, retiraram-se amostras de 40 pL e ensaiaram-se para concentração de GSH (painel A) e actividade enzimática (painel B), tal como descrito em materiais e métodos. Círculos 25

ΕΡ 1 315 826/PT aberto, reacção com extracto celular normal; círculos a cheio, reacção com extracto celular tratado com IAA.

Na figura 8 apresenta-se o efeito de PDI ou dsbC na velocidade de síntese de proteína activa. Adicionou-se dsbC a 133 pg/mL ou PDI a 27 pg/mL a uma reacção com extracto celular tratado com IAA. Retiraram-se amostras de 20 pL durante a incubação e mediram-se as actividades enzimáticas tal como descrito. Círculos abertos (reacção de controlo sem foldase); círculos a cheio (adição de PDI); quadrados a cheio (adição de DsbC) .

Lisboa, 2010-02-11

Claims (12)

1. ΕΡ 1 315 826/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método síntese in vitro melhorada de polipéptidos com dobramento correcto compreendendo uma ou mais ligações dissulfureto, em que o melhoramento compreende: sintetizar o referido polipéptido numa mistura reaccional compreendendo um extracto biológico que foi pré-tratado com um agente de inactivação de sulfidrilo que alquila ou acetila grupos sulfidrilo livres; e um tampão redox compreendendo um ou mais de glutationa, ditiotreitol, ditioeritritol, β-mercaptoetanol, tioglicolato e cisteína.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido agente de inactivação de sulfidrilo é seleccionado do grupo que consiste em iodoacetamida, N-etilmaleimida, iodoacetato e N-iodoacetil-N'-(5-sulfónico-l-naftil)etileno-diamina.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido agente de inactivação de sulfidrilo é iodoacetamida.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido tampão redox compreende uma mistura de glutationa oxidada e reduzida.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a referida mistura está numa razão de 4:1 de oxidada para reduzida.
6. 6. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido extracto biológico é derivado de uma célula bacteriana que foi modificada geneticamente para inactivar uma ou mais enzimas redutoras.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que as referidas uma ou mais enzimas incluem tiorredoxina-redutase e glutationa-redutase.
8. 8. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a referida mistura reaccional inclui adicionalmente uma ou mais enzimas que melhoram o dobramento dos polipéptidos ou a geração de ligações dissulfureto. ΕΡ 1 315 826/ΡΤ 2/2
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que as referidas uma ou mais enzimas que melhoram o dobramento dos polipéptidos ou a geração de ligações dissulfureto são enzimas foldase.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida enzima foldase é seleccionada do grupo que consiste em DsbA, B, C, D, pdi, GroEL/ES, DnaK, DnaJ, GrpE, BIP e ciclofilinas, tais como PPI.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a referida foldase é DsbC.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a referida foldase é PDI. Lisboa, 2010-02-11