JPH10508203A - ジスルフィド結合を有する異種ポリペプチドの細菌による産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細菌中で異種ポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸、該異種ポリペプチドをコードする核酸、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質および異種ポリペプチドの両者の分泌のためのシグナル配列、およびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸の両者の誘発可能なプロモーターを含む細菌細胞を、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸の発現を誘発した後に異種ポリペプチドをコードする核酸の発現を誘発する条件下および該異種ポリペプチドおよびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質の両者を細菌のペリプラズムに分泌させるかまたは該異種ポリペプチドを該細菌細胞を培養する培地に分泌させる条件下で培養する；および（ｂ）該異種ポリペプチドを該ペリプラズムまたは該培養培地から回収する工程を含む方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ジスルフィド結合を有する異種ポリペプチドの細菌による産生方法 発明の背景 発明の技術分野 本発明はＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質の過剰産生および分泌により細菌中で ポリペプチドを産生および分泌する方法に関する。関連開示の記載 イン・ビトロで、減弱および変性したリボヌクレアーゼを適切なジスルフィド 結合を形成して活性な酵素に再度折り畳むことができることを示した、強い影響 力を有するアンフィンセン（Anfinsen）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ Ａ 、４７：１３０９−１３１４（１９６１）の発行以来、タンパク質の折り畳み の技術分野において多数の研究が行われている。後に、真核生物における酸化的 折り畳みを担う触媒が見出され、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ ）と呼ばれた。 タンパク質の折り畳みを援助するタンパク質の２つのタイプを記す：おそらく 集合および適切な折り畳み以外の事象へと導かれる不適切な相互作用を妨げる非 触媒性分子シャペロン、およびタンパク質の折り畳み、シス−トランスプロピル 異性化およびジスルフィド結合の形成における２工程の触媒。イン・ビボにおけ るプロピルイソメラーゼ活性の必要性の明確な証拠はいまなお欠如しているが、 ジスルフィド結合の形成がひどく欠けている変異体の比較的最近の単離は、この 後者の折り畳み工程がイン・ビボで触媒されることを確認した。 ＰＤＩはイン・ビトロのデータにより、ジスルフィド結合および転位の触媒に 関連するとされる。クレイトン（Ｃreighton）ら、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１４２： ４３−６２（１９８０）；フリードマン（Ｆreedman）ら、Ｂiochem．Ｓoc.Ｓym p. 、５５：１６７−１９２（１９８９）。バードウェル（Ｂardwell）およびベ ックウィズ（Ｂeckwith）、Ｃell、７４：７６９−７７１（１９９３）。さ らに、カルボキシペプチダーゼＹにおいてジスルフィド結合を形成できないＰＤ Ｉにおける酵母変異体が同定され、イン・ビボにおけるジスルフィド結合の形成 におけるＰＤＩの重要性を示唆している。ラマンティア（ＬaＭantia）およびレ ンナルツ（Ｌennarz）、Ｃell、７４：８９９−９０８（１９９３）。原核生物 において、３つの別個の研究ブループによって大腸菌（Ｅ．coli）のペリプラズ ムにおいて同定された特定の遺伝子における変異は、分泌タンパク質におけるジ スルフィド結合の形成の割合において劇的および多面発現的な（pleiotropic） 減少を示す。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、バードウェルら、Ｃell 、６７：５８１−５８９（１９９１）およびミシアカス（Ｍissiakas）ら 、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０：７０８４−７０８８（１９９３ ）によってＤsbＡ（ジスルフィド結合）、およびカミタニ（Ｋamitani）ら、Ｅ ＭＢＯ Ｊ. 、１１：５７−６２（１９９２）によってＰpfＡ（ペリプラズムホス ファターゼ／タンパク質形成）とさまざまに呼ばれた。本明細書においては以下 、Ｄsb名称によって呼ぶ。ジスルフィド結合の形成におけるこの減少によって影 響を受ける分泌タンパク質は、アルカリホスファターゼおよびＯmpＡなどの大腸 菌に内在性のタンパク質から組換え哺乳動物タンパク質、ウロキナーゼおよび組 織プラスミノーゲンアクチベーターにおよぶ。現在、ジスルフィド結合の形成が 真核生物および原核生物の両者において触媒化された工程であることは明らかで ある。ＰＤＩおよびＤsbＡに関する概説のためには、バードウェルおよびベック ウィズ、Ｃell、上記（１９９３）を参照せよ。 該ＤsbＡタンパク質は、ジスルフィドイソメラーゼ同様に、高反応性を有する ジスルフィド結合を有する。ノイバ（Ｎoiva）およびレンナルツ、Ｊ．Ｂiol.Ｃ hem. 、２６７：３５５３−３５５６（１９９２）；ブレイド（Ｂulleid）、Ａdv ．Ｐrot. 、４４：１２５−１５０（１９９３）。その結晶構造が最近明らかにさ れ（マーティンら、Ｎature、３６５：４６４−４６８［１９９３］）、そのレ ドックス電位が決定された。ブンダーリッヒ（Ｗunderlich）およびグロックシ ューベル（Ｇlockshuber）、Ｐrot．Ｓci.、２：７１７−７２６（１９９３）。 それは細胞質チオレドキシンより有意に強力な酸化剤であり、真核生物のジスル フィドイソメラーゼにより一層類似している。折り畳まれていないＤsbＡは、お よそ１８.９kＪmol^-1によって反応性のジスルフィド結合を安定化させる。ザプ ン（Ｚapun）ら、Ｂiochemistry、３２:５０８３−５０９２（１９９３）。この 結果は、ジスルフィド結合がＤsbＡの折り畳まれた形態を安定化させ、それによ ってその高いエネルギー容量を付与することを示唆すると解釈される。 ジスルフィド結合の形成に関与する第２のタンパク質の遺伝子、dsbＢと呼ば れるものは、２つの別個のグループによってクローニングされた。バードウェル ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０：１０３８−１０４２（１９９ ３）およびミシアカスら、１９９３、上記。ＤsbＢは内膜にかかる膜内在性タン パク質である。それはＤsbＡの再酸化に関与するようであり、従って電子伝達工 程を、ペリプラズムにおけるジスルフィド結合の形成へと連結する鎖の一部を形 成するであろう。バードウェルら、上記（１９９３）。ジスルフィド結合の形成 のための第３の遺伝子、dsbＣが近年同定された。ミシアカスら、ＥＭＢＯ Ｊ. 、１３：２０１３−２０２０（１９９４）；シェブチック（Ｓhevchik）ら、Ｅ ＭＢＯ Ｊ. 、１３：２００７−２０１２（１９９４）。それは機能的にＤsbＡの 代わりができる２６−kＤaのペリプラズムタンパク質をコードする。 ＤsbＡがイン・ビボおよびイン・ビトロで大腸菌のペリプラズムタンパク質の ジスルフィド結合の急速な形成に必要であることが示されている。同様のことが 、大腸菌のペリプラズムにおける組換え真核生物タンパク質、例えば、種々のセ リンプロテアーゼ（バードウェルら、上記［１９９３］）、抗体断片（クナッピ ク（Ｋnappik）ら、Ｂio／Ｔechnology、１１：７７−８３［１９９３］）およ びＴ細胞受容体の断片の生成に関して見出された。正確に折り畳まれた組換え分 子の画分は天然のペリプラズムタンパク質の場合においてより小さくてよく、お よび非常に配列依存的である。ＤsbＡの過剰産生は正確に折り畳まれたペリプラ ズム抗体断片（クナッピクら、上記）の比率を増加させず、他の工程が、ペリプ ラズムにおけるその折り畳みを制限することを示唆している。さらに、ラギ（Ｒ agi）からのα−アミラーゼ／トリプシンインヒビターのペリプラズムにおける 折り畳みが、dsbＡ遺伝子が共発現し、ＤsbＡタンパク質が増殖培地中に存 在する還元されたグルタチオンなしに共分泌した場合には改善されないが、正確 に折り畳まれた分泌インヒビターにおける増加が培地に還元されたグルタチオン およびグロックシューベル、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.、２６８：２４５４７−２４５ ５０（１９９３）。さらに、ブンダーリッヒおよびグロックシューベルは分泌α −アミラーゼ／トリプシンインヒビタータンパク質の総蓄積において全く増加を 示さない。 Ｍicrobiology、１２：６８５−６９２（１９９４）は、ＤsbＡおよび低温での 大腸菌の熱ショックタンパク質の適度な過剰発現によって、大腸菌のペリプラズ ムにおいてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の機能的断片を産生した。後者はrpoＨ（熱 ショックシグマ因子、シグマ³²をコードする）の過剰発現によって達成された。 これはペリプラズムにおけるＴＣＲ断片の折り畳み率をおよそ２倍に増加させた 。その収率がrpoＨの過剰産生の不在下にあるものは知られていない。米国特許 第５,２７０,１８１号および第５,２９２,６４６号は、高い安定性および可溶性 のため、チオレドキシン様タンパク質（ＰＤＩのチオレドキシン様ドメインなど ）を有する融合タンパク質としての発現によって異種タンパク質の組換え産生を 開示する。１９９４年２月１５日に公開されたＪＰ ６０−３８７７１号は、ヒ ト血清アルブミンプレ−プロ配列に連結したヒトＰＤＩ遺伝子の発現およびこの 連結した遺伝子およびポリペプチドをコードする外来遺伝子の共発現を開示する 。１９９３年１２月３２日に公開されたＷＯ ９３／２５６７６号はＰＤＩ、好 ましくは酵母のＰＤＩを用いてジスルフィド結合した組換えタンパク質の産生を 開示する。１９８８年１２月７日に公開されたＥＰ ２９３,７９３号は、組換え タンパク質における天然のジスルフィド架橋配列を確実にするＰＤＩ活性を有す るポリペプチドを開示する。１９９４年４月１４日に公開されたＷＯ ９４／０ ８０１２号は熱ショックタンパク質またはＰＤＩなどのシャペロンタンパク質の 共発現による過剰発現した遺伝子産物の分泌の増加を開示する。１９９２年１０ 月２１日に公開されたＥＰ ５０９,８４１号は、ＰＤＩおよびタンパク質を含む 共 発現系を用いての酵母細胞からヒト血清アルブミンの分泌増加を開示する。 原核生物によって分泌されるタンパク質の総収率を増加する必要性が続いて存 在している。 従って、細菌内において外来ポリペプチドの蓄積を増強する細胞内環境を生理 学的に制御することに関する経済的に実行可能な方法を用いてポリペプチド収率 を増加する方法を提供するのが本発明の目的である。 本目的および他の目的は当業者には明らかであるだろう。 本発明の概要 従って、本発明の一態様においては、細菌中で異種ポリペプチドを産生する方 法であって、（ａ）ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸、該異種ポ リペプチドをコードする核酸、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質および異種ポリペ プチドの両者の分泌のためのシグナル配列、およびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク 質をコードする核酸および該異種ポリペプチドをコードする核酸の両者の誘発可 能なプロモーターを含む細菌細胞を、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードす る核酸の発現を誘発した後に異種ポリペプチドをコードする核酸の発現を誘発す る条件下および該異種ポリペプチドおよびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質の両者 を細菌のペリプラズムに分泌させるかまたは該異種ポリペプチドを該細菌細胞を 培養する培地に分泌させる条件下で培養する；および（ｂ）該異種ポリペプチド を該ペリプラズムまたは該培養培地から回収することを含む方法を提供する。 細菌タンパク質ＤsbＡまたはＤsbＣの過剰発現および分泌は、細菌のペリプラ ズムまたは培養培地において産生された異種ポリペプチドの量の有意に増加させ る。以下に示す具体例では、大腸菌のタンパク質ＤsbＡの過剰発現および分泌が 、大腸菌のペリプラズム領域における含有体に預けたヒトＩＧＦ−Ｉの総収率に おいて大きく増加した。さらに、この総収率の増加は、該培地中での全くのグル タチオン不在下での培養により、大腸菌熱ショック転写因子、ＲpoＨの共発現、 または過剰発現なしに達成される。 ＤsbＡが大腸菌のペリプラズムおよび外壁のタンパク質の折り畳みに関与する と示唆されているが、このタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現がそれ自体 で分泌されたヒトタンパク質にいずれかの影響を及ぼすかどうかは分からない。 また、dsbＡ遺伝子の過剰発現がＤsbＡ関連活性を一層高いレベルとさせるかど うかは分からない。いずれかの影響が見られるならば、ＤsbＡ活性の高いレベル がＩＧＦポリペプチドの適切な折り畳みを促進し、折り畳まれた、可溶性のＩＧ Ｆ−Ｉモノマーの高いレベルになるであろう。対照的に、ＩＧＦ−Ｉの総収率の 有意な増加が観察され（不溶性集合体へのＩＧＦ−Ｉポリペプチドの沈積による ）および可溶性の、適切に折り畳まれたタンパク質の収率は減少した。これらの 不溶性集合物を生理活性ポリペプチドに折り畳みこむため有効な方法が存在する という事実のため、不溶性ポリペプチドにおける増加は非常に有用な結果である 。 図面の簡単な説明 図１はpＪＪ４２、ＩＧＦ−Ｉを産生するために用いる、すなわちpＢＫＩＧＦ −２Ｂ、pＪＪ４１およびpＫＭtacIIの構築において使用されたプラスミドを示 す。 図２はＩＧＦ−Ｉを産生するために使用したプラスミドpＪＪ４０の構築を示 す。 図３はＩＧＦ−Ｉを産生するために使用したプラスミドpＢＫＩＧＦ２Ｂ−Ａ の構築を示す。 好ましい態様の詳細な説明 Ａ．定義 本明細書で使用する『dsbＡ』および『dsbＣ』は、それぞれＤsbＡまたはＤsb Ｃタンパク質として文献で公知の細菌ペリプラズムタンパク質をコードする遺伝 子をいう。それらは任意の細菌由来であってよく、例えば、大腸菌からのdsbＡ 遺伝子はバードウェルら、上記（１９９１）およびカミタニら、上記によって記 載され、大腸菌からのdsbＣ遺伝子はミシアカスら、１９９４、上記によって記 載されている。本明細書で使用する該dsbＡおよびdsbＣ遺伝子およびその産物に はＰＤＩまたはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとして機能する他のいずれ かの真核生物タンパク質（米国特許第５,２７０,１８１号および第５,２９２,６ ４６号；ＪＰ ６０−３８７７１号；ＷＯ ９３／２５６７６号；ＥＰ ２９３,７ ９３号；ＷＯ ９４／０８０１２号；およびＥＰ ５０９,８４１号、すべて上記 に開示されているものを含む）を含まない。ＤsbＡおよびＤsbＣはＰＤＩと多く の点で異なる。例えば、ＤsbＡおよびＤsbＣはレドックスバッファーの不在下で イソメラーゼ活性を保有するが、ＰＤＩはそのイソメラーゼ活性にレドックスバ ッファーを必要とする。さらに、ＤsbＡおよびＤsbＣはそれぞれ配列分析から２ １kＤおよび２５kＤの分子量を有し、それぞれ２および４のシステイン残基を含 むが、ＰＤＩは配列分析から５７kＤの分子量で６つのシステイン残基を含む。 本明細書で使用する、『シグナル配列』または『シグナルポリペプチド』とは 、異種ポリペプチドを培養した細菌のペリプラズムまたは培地に分泌させるかま たはＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をペリプラズムに分泌させるのに用いられる ことができるポリペプチドをいう。異種ポリペプチドのシグナルは細菌に同種で あるかまたは異種であってよく、該細菌中で産生されるポリペプチド原産のシグ ナルを含む。dsbＡおよびdsbＣに関して、該シグナル配列は細菌細胞に内在的で あるもので典型的であるが、その目的に関して有効である限りは必要ではない。 『過剰発現』遺伝子産物は、その遺伝子産物の通常の内在的な発現より多大な レベルで発現しているものである。それは、例えば宿主細胞において遺伝子産物 の発現を指令する組み換え構築物等を導入することによって、または例えば転写 を誘発することによって内在的遺伝子産物の発現の基礎レベルを変えることによ って達成することができる。 本発明のプロモーターは『誘発可能な』プロモーター、すなわち、転写因子の 結合に関する増加または減少した割合で転写を指令するプロモーターである。本 明細書で使用する『転写因子』とは、プロモーターの調節または制御領域に結合 することができ、それによって転写に影響を及ぼすことができるいずれかの因子 を含む。宿主細胞内の転写因子の合成またはプロモーター結合能力は該宿主を『 インデューサー』にさらすことによって、またはインデューサーを宿主細胞培地 から除去することによって制御することができる。従って、誘発可能なプロモー ターの発現を調節するため、インデューサーを宿主細胞の増殖培地に添加するか または除去する。 本明細書で使用する『発現を誘発する』との句は、このような遺伝子を含む細 胞をエフェクターまたはインデューサーにさらすことによって特異的な遺伝子か らの転写量を増加させることを意味する。 『インデューサー』とは、細胞集団に与えられると特異的な遺伝子からの転写 量を増加させるであろう化学薬剤または物理的作用剤をいう。これらは通常、そ の効果が特定の遺伝子のオペロンまたは基に特異的である小分子であり、リン酸 塩、アルコール、金属鉄、ホルモン、熱、冷気などを含む。例えば、イソプロピ ルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）およびラクトースはtacIIプロモーター のインデューサーであり、Ｌ−アラビノースはアラビノースプロモーターの適当 なインデューサーである。phoＡおよびpho５などのpho遺伝子プロモーターは培 地中の低濃度のリン酸塩によって誘発可能である。 本明細書で使用する『ポリペプチド』または『関心のあるポリペプチド』とは 、概して１０より多いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。該ポ リペプチドは『外在性』（それらが『異種』であること、すなわちＣＨＯ細胞に よって産生されるヒトタンパク質または哺乳動物細胞によって産生される酵母ポ リペプチドまたはポリペプチドの本来の源ではないヒト細胞株から産生されるヒ トポリペプチドなどの利用される宿主細胞に異種であることを意味する）である のが好ましい。 哺乳動物のポリペプチドの例には例えば、レニン、ヒト成長ホルモンを含む成 長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲 状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α１−抗トリプシン；インシュリンＡ−鎖 ；インシュリンＢ−鎖；プロインシュリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモ ン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶIIIＣ因子、第IX因子 、組織因子およびフォン・ウィルブラント因子などの凝固因子；プロテインＣな どの抗凝固因子；ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト 尿素または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）などのプラスミ ノーゲンアクチベーター；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因 子−アルファおよび−ベータ；エンケファリンアーゼ；ヒト血清アルブミンなど の 血清アルブミン；ミューラー管抑制物質；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖 ；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ベータ−ラクタマー ゼなどの微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増 殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテ インＡまたはＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロト ロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮ Ｔ−６）などの神経栄養因子またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；カルディオ トロフィン−１（cardiotrophin）（ＣＴ−１）などのカルディオトロフィン（ 心臓高栄養因子(cardiac hypertrophy factor)）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧ Ｆ）；aＦＧＦおよびbＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ ）；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｔ ＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む）などのトランスフォーミ ング増殖因子（ＴＧＦ）；インシュリン様増殖因子−Ｉおよび−II（ＩＧＦ−Ｉ およびＩＧＦ−II））；des（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシ ュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ− １９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン； 骨形態形成タンパク質（bone morphogenetic protein）（ＢＭＰ）；インターフ ェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマなどのインターフェロン；コロニー 刺激因子（ＣＳＦｓ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ） ；インタ−ロイキン（ＩＬｓ）（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０まで）；抗− ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジムスターゼ；Ｔ−細胞受容体；表面膜タン パク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗 原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン（addressin）；調節タ ンパク質；抗体；および上記に列挙したポリペプチドのいずれかの断片。 関心のある好ましい外在性ポリペプチドは哺乳動物のポリペプチドである。こ のような哺乳動物のポリペプチドの例にはt−ＰＡ、gp１２０、抗−ＨＥＲ−２ 、ＤＮアーゼ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、脳ＩＧＦ−Ｉ、成長ホルモン、リラキ シン鎖、成長ホルモン放出因子、インシュリン鎖またはプロ−インシュリン、ウ ロ キナーゼ、イムノトキシン、神経栄養因子および抗原が含まれる。特に好ましい 哺乳動物のポリペプチドには、例えば、t−ＰＡ、gp１２０（IIIb）、抗−ＨＥ Ｒ−２、ＤＮアーゼ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、成長ホルモン、ＮＧＦ、ＮＴ− ３、ＮＴ−４、ＮＴ−５およびＮＴ−６、より好ましくはＩＧＦ、最も好ましく はＩＧＦ−Ｉおよび最も好ましい哺乳動物のポリペプチドはヒトのポリペプチド である。 本明細書で使用する『ＩＧＦ−Ｉ』とは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび好 ましくはヒトを含むいずれかの種に本来存在する配列または変異形態および組換 えにより産生されたものにおけるインシュリン様増殖因子をいう。好ましい方法 において、該ＩＧＦ−Ｉはクローニングされ、ついでそのＤＮＡは発現させられ る（例えば、１９８４年１２月１９日に公開されたＥＰ第１２８,７３３号に記 載されている方法によって）。 『コントロール配列』との表現は、特定の宿主生物における実施可能に結合し コーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。細菌に適したコントロール 配列はアルカリホスファターゼプロモーター、任意にはオペレーター配列および リボソーム結合部位を含む。 他の核酸配列と機能的な関係におかれた場合、核酸は『実施可能に結合した』 という。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチド の分泌に関与するタンパク質として発現するなら、ポリペプチドのＤＮＡに実施 可能に結合する；プロモーターまたはエンハンサーは、コーディング配列の転写 に影響を及ぼすなら、該配列に実施可能に結合する；またはリボソーム結合部位 をコーディング配列の翻訳を促進するように配置するなら、該配列に実施可能に 結合する。一般に、『実施可能に結合した』とは、結合したＤＮＡ配列同士が隣 接しており、分泌リーダーの場合においては隣接し、リーディング相にある。結 合は都合の良い制限部位でライゲーションすることによって行う。このような部 位が存在しない場合には、該合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカー を従来の手腕に従って使用する。 本明細書で使用する表現『細胞』、『細胞株』および『細胞培養』は、相互変 換できるように使用し、このような語はすべてその子孫も含む。従って、『形質 転換体』および『形質転換細胞』は、第一代対象細胞およびトランスファー数に 関係なく、それら由来の培養物も含む。また、すべての子孫は、故意または偶然 の変異のためにＤＮＡ内容物において厳密に同一でないかもしれないと理解され る。もともと形質転換した細胞においてスクリーニングされたのと同様の機能ま たは生物学的活性を有する変異子孫を含む。特別な呼称が意図される場合は文脈 から明らかであるだろう。 本明細書で使用する『ポリメラーゼチェーンリアクション』または『ＰＣＲ』 の技術とは、一般に核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定部分の微少量を１ ９８７年７月２８日に発行された米国特許第４,６８３,１９５号に記載されたよ うに増幅する方法をいう。概して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するこ とができるよう関心のある領域の配列情報またはそれを越える配列情報が利用さ れるべき必要性がある；これらのプライマーは増殖されるべき鋳型の反対鎖配列 に同一または類似であろう。該２つのプライマーの５’−末端ヌクレオチドは増 殖された物質の両端に一致する。ＰＣＲは特異的なＲＮＡ配列、総ゲノムＤＮＡ からの特異的なＤＮＡ配列および総細胞ＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラ スミド配列などから転写されたcＤＮＡを増幅するのに使用することができる。 一般的に、ミュリス（Ｍullis）ら、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp．Ｑuant.Ｂi ol. 、５１：２６３（１９８７）；アーリッヒ（Ｅrlich）、編、ＰＣＲ Ｔechno logy 、（ストックトン・プレス（Ｓtockton Ｐress）、ニューヨーク、１９８９ ）参照。ＰＣＲの進歩に関する最近の概説には、アーリッヒら、Ｓcience、２５ ２ ：１６４３−１６５０（１９９１）参照。 本明細書で使用するＰＣＲは、プライマーとしての公知の核酸および核酸の特 定の部分を増幅または産生するための核酸ポリメラーゼの使用を含む核酸試験サ ンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の１つの、しかし唯一ではな い例であると考えられる。Ｂ．本発明の実施方法 本発明の工程において、dsbＡまたはdsbＣ遺伝子の発現を異種遺伝子発現のち ょ うど前（直前）に誘発する。該異種ポリペプチドおよびＤsbＡまたはＤsbＣタン パク質は両者ともがペリプラズムに分泌されるか、または異種ポリペプチドがこ れらのポリペプチドをコードする核酸が導入される細菌の培養培地中に分泌され る。該ポリペプチドが細菌ペリプラズムから回収されるのが好ましい。 dsbＡまたはdsbＣ核酸は、任意の細菌源からのcＤＮＡまたはゲノムＤＮＡで あってよく、一般に天然に存在する配列である。それは、核酸同士が同じベクタ ー上にある、すなわちそれらが結合していないなら、異種ポリペプチドをコード する核酸から適切に分離して置かれる。さらに、ＤsbＡまたはＤsbＣをコードす る核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸が別個の、多様な誘発可能なプ ロモーターの下にある結果、発現の誘発が必要とされる配列順に起こることがで きる。ＤsbＡまたはＤsbＣをコードする核酸および異種ポリペプチドをコードす る核酸は宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、または自動的に複製するプラスミド に含まれる。 もし、ＤsbＡまたはＤsbＣが宿主細胞の本来の産物である場合、およびこれら の天然に存在する遺伝子の発現を制御する因子が理解されるなら、このような因 子はdsbＡまたはdsbＣの過剰な発現を例えば、公知のインデューサー分子を用い て天然のプロモーターからの転写を誘発すること、遺伝子産物を誘発的に過剰発 現している変異株を産生するための遺伝子産物の発現を制御または抑制する核酸 の変異、該遺伝子産物の転写を通常抑制する因子の合成または機能を抑制する第 ２部位の変異などによって達成するよう操作されることができる。 別の態様において、該細菌は、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核 酸および異種ポリペプチドをコードする核酸をそれぞれ含む２つの別個のベクタ ーを含む。 別の態様において、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および異 種ポリペプチドをコードする核酸は同じベクターに含まれるが別個の誘発可能な プロモーターおよび別個のシグナル配列の制御下にある。 異種核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は細菌の適切なプロモータ ーの制御下での細菌中での発現のため複製可能なベクターに適切に挿入される。 多数のベクターはこの目的に利用することができ、適切なベクターの選択は該ベ クターに挿入しようとしている核酸の大きさおよび該ベクターで形質転換しよう とする特定の宿主細胞の大きさに主として依存するであろう。各ベクターはその 機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および調和している特定の宿主細胞に 依存している多様な要素を含む。細菌の形質転換に関するベクターの要素には一 般的に、以下の１つまたはそれ以上をこれらに限定するわけではないが含む；シ グナル配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子および誘発可能な プロモーター。 概して、宿主細胞に一致する種に由来するレプリコンおよびコントロール配列 を含むプラスミドベクターが細菌の宿主と関連して使用される。該ベクターは、 通常、複製部位ならびに形質転換した細胞における表現型選択を提供することが できるマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は大腸菌種由来のプラスミド（ 例えばボリバー（Ｂolivar）ら、Ｇene、２：９５［１９７７］参照）pＢＲ３２ ２を用いて典型的には形質転換される。pＢＲ３２２はアンピシリンおよびテト ラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、従って、形質転換した細胞を同定するのに 容易な手段を提供する。該pＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミド またはファージも一般には選択可能なマーカー遺伝子の発現のための微生物によ って用いられることができるプロモーターを含むか、または含むように修飾され る。 本明細書で関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡは直接、ならびに他の ポリペプチド、好ましくはシグナル配列または成熟ポリペプチドのＮ−末端で特 異的な開裂部位を有する他のポリペプチドとの融合にて発現されてよい。概して シグナル配列は該ベクターの要素であってよく、または該ベクターに挿入される ポリペプチドＤＮＡの一部分であってよい。選択された異種シグナル配列は宿主 細胞によって認識および所有される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって 開裂される）ものであるべきである。天然のシグナル配列を認識および所有しな い細菌宿主細胞については、該シグナル配列は、例えば、アルカリホスファター ゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐまたは耐熱性エンテロトキシンIIリーダーよりなる 群から選択される細菌のシグナル配列によって置換される。 発現およびクローニングベクターは、ベクターが１つまたはそれ以上の選択さ れた宿主細胞で複製することができるようにする核酸配列を含む。一般に、クロ ーニングベクターにおいて、該配列は宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製する ことができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。このような配列 は多様な細菌に関してよく知られている。プラスミドpＢＲ３２２からの複製起 点は最もグラム陰性細菌に適している。 発現およびクローニングベクターは一般に選択遺伝子（選択可能なマーカーと 名付けられてもいる）も含む。この遺伝子は選択培養培地中で増殖した形質転換 細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベク ターで形質転換していない宿主細胞は培養培地中で生存しないであろう。典型的 な選択遺伝子は（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマ イシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する抵抗性を与える、 （ｂ）栄養要求性欠乏症を補う、または（ｃ）複雑培地例えば桿菌のＤ−アラニ ンラセミ化酵素をコードする遺伝子から入手できない重要な栄養素を補給するタ ンパク質をコードする。選択案の一例は宿主細胞の増殖を阻害する薬剤を利用す るものである。異種遺伝子でうまく形質転換したそれらの細胞は薬剤耐性を与え るタンパク質を産生し、従って選択支配を生き残る。 異種ポリペプチドを産生するための発現ベクターもまた、宿主の細菌生物によ って認識され、関心のあるポリペプチドをコードする核酸に実施可能に結合して いる誘発可能なプロモーターを含む。それはまた、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク 質をコードする核酸に実施可能に連結した別個の誘発可能なプロモーターをも含 む。細菌宿主での使用に適している誘発可能なプロモーターは、β−ラクタマー ゼおよびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃhang）ら、Ｎature、２７５： ６１５［１９７８］；ゲッデル（Ｇoeddel）ら、Ｎature、２８１：５４４［１ ９７９］）、アラビノースプロモーター系（ガズマン（Ｇuzman）ら、Ｊ．Ｂact eriol. 、１７４：７７１６−７７２８［１９９２］）、アルカリホスファターゼ 、トリプトファン（trp）プロモーター系（ゲッデル、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８ ：４０５７［１９８０］およびＥＰ第３６,７７６号）およびtacプロモーター などのハ イブリッドプロモーター（デボーア（deＢoer）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci ．ＵＳＡ 、８０：２１−２５［１９８３］）を含む。しかしながら、他の公知の 細菌の誘発可能なプロモーターは適切である。それらのヌクレオチド配列は公開 され、それによって当業者はそれらを、任意の必要とされている制限部位を供給 するためのリンカーまたはアダプターを用いて、関心のあるポリペプチドをコー ドするＤＮＡまたはdsbＡまたはdsbＣ遺伝子（ジーベンリスト（Ｓiebenlist） ら、Ｃell、２０：２６９［１９８０］）にライゲーションすることができる。 細菌系において使用するためのプロモーターはまた、一般に関心のあるポリペ プチドをコードするＤＮＡに実施可能に連結したシャイン・ダルガノ（Ｓ.Ｄ.） 配列を含む。該プロモーターは制限酵素消化によって細菌由来のＤＮＡから除去 され、ついで目的のＤＮＡを含むベクターに挿入されることができる。 １つまたはそれ以上の上記に列挙した要素を含む適切なベクターの構築には標 準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は 必要とするプラスミドを得るために望ましい形態で開裂され、合わせられついで 再度ライゲーションされる。 構築されたプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析のため、ライ ゲーション混合物が、大腸菌Ｋ１２ ２９４株（ＡＴＣＣ受託番号第３１,４６６ 号）またはその他の株を形質転換するのに使用され、成功した形質転換体を適切 なアンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性によって選択する。形質転換体か らのプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、お よび／またはサンガー（Ｓanger）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、７ ４ ：５４６３−５４６７（１９７７）またはメッシング（Ｍessing）ら、Ｎucle ic Ａcids Ｒes. 、９：３０９（１９８１）またはマキサム（Ｍaxam）ら、Ｍeth ods in Ｅnzymology 、６５：４９９（１９８０）の方法によってシークエンシン グされる。 この目的に適切な細菌には、古細菌および真性細菌、特に真性細菌および最も 好ましくはエンテロバクテリアセエ（Ｅnterobacteriaseae）を含む。有用な細 菌の例にはエシェリキア（Ｅscherichia）、エンテロバクター（Ｅnterobacter ）、 アゾトバクター（Ａzotobacter）、エルウィニア（Ｅrwinia）、バシラス（Ｂac illus）、シュードモナス（Ｐseudomonas）、クレブシエラ（Ｋlebsiella）、プ ロテウス（Ｐroteus）、サルモネラ（Ｓalmonella）、セラチア（Ｓerratia）、 シゲラ（Ｓhigella）、リゾビア（Ｒhizobia）、ビトレオスシラ（Ｖitreoscill a）およびパラコッカス（Ｐaracoccus）を含む。適切な大腸菌宿主には、大腸菌 Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ受託番号第２７，３２５号）、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ受 託番号第３１,４４６号）、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ受託番 号第３１,５３７号）を含む。これらの例は制限するよりむしろ例示するもので ある。上記した細菌のいずれかの変異細胞もまた、使用されてよい。勿論、細菌 の細胞におけるレプリコンの複製性を考慮に入れて適切な細菌を選択することが 必要である。例えば、大腸菌、セラチアまたはサルモネラ種はｐＢＲ３２２、ｐ ＢＲ３２５、pＡＣＹＣ１７７またはpＫＮ４１０などのよく知られたプラスミド はレプリコンを提供するのに使用される。 大腸菌Ｗ３１１０株は宿主として、または親宿主として好ましい、というのは 組換え体ＤＮＡ産物の発酵のための一般的な宿主株であるからである。好ましく は、宿主細胞はタンパク質分解酵素の微少量を分泌すべきである。例えば、Ｗ３ １１０株は、大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２（完全なtonＡΔ表現型を有する）；大 腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４（完全なtonＡΔptr３表現型を有する）；大腸菌Ｗ３１ １０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ受託番号第５５，２４４号）（完全なtonＡΔptr３ph oＡΔＥ１５Δ（argＦ-lac）１６９ompＴΔdegＰ４１kan^r表現型を有する）；大 腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６（完全なtonＡΔptr３phoＡΔＥ１５Δ（argＦ-lac） １６９ompＴΔdegＰ４１kan^rrbs７ΔilvＧ表現型を有する）；大腸菌Ｗ３１１０ 株４０Ｂ４（非カナマイシン耐性degＰ欠失変異を有する３７Ｄ６株）；大腸菌 Ｗ３１１０株３３Ｄ３（完全なtonＡptr３lacＩqＬacＬ８ompＴdegＰkan^r表現型 を有する）；大腸菌Ｗ３１１０株３６Ｆ８（完全なtonＡphoＡΔ（argＦ-lac）p tr３degＰkan^RilvＧ＋表現型を有し、３７℃での温度耐性がある）；１９９０年 ８月７日に発行された米国特許第４,９４６,７８３号に開示された変異ペリプラ ズムプロテアーゼを有する大腸菌株などを含むような宿主の例とともに、タンパ ク質をコードする遺伝子において遺伝的変異に影響を及ぼすよう修飾されてよい 。 宿主細胞をトランスフェクションし、好ましくは上述した発現ベクターで形質 転換し、プロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、または目的の配列をコー ドする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された従来の栄養培地中で培養す る。 トランスフェクションとは、いずれかのコーディング配列が、実際に発現して いようといまいと、宿主細胞によって発現ベクターに取り込まれることをいう。 トランスフェクションの多数の方法は当業者に公知であり、例えば、ＣaＰＯ₄お よびエレクトロポレーションである。上手なトランスフェクションは、概して、 このベクターの操作の任意の指令が宿主細胞内で起こる場合に認められる。 形質転換とは、ＤＮＡを生物体に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、 または染色体組み込みによって複製可能にすることを意味する。使用する宿主細 胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用して行う。塩 化カルシウムを用いたカルシウム処理（サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキ ュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning ：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）［ニューヨーク：コールド・スプリングハーバー・ ラボラトリー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress）、１９８９］中、１. ８２章に記載されたように）は概して実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のため に使用される。形質転換のための他の方法はチャン（Chung）およびミラー（Ｍi ller）、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、１６：３５８０（１９８８）に記載されてい るように、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法は、エ レクトロポレーションと名付けられた技術を使用する。 本発明の目的のために関心のあるポリペプチドを産生するため使用される細菌 細胞は異種ポリペプチドをコードする核酸およびＤsbＡまたＤsbＣをコードする 核酸のプロモーターが一般的に、例えばサンブルックら、上記に記載されるよう に人工的に誘発されることができるような適切な培地中で培養する。適切な培地 の例としては、米国特許第５,３０４,４７２号および第５,３４２,７６３号に提 示されている。 炭素、窒素および無機リン酸源の他に必要ないずれかの補足物もまた、単独、 または複合窒素源などの他の補足物または培地との混合物として導入され、適切 な濃度で含まれてよい。培地のｐＨは、およそ５−９のいずれであってよく、主 として宿主生物に依存する。好ましくは、培地は還元されたグルタチオンを全く 含まず、細菌は熱ショック転写因子、ＲpoＨをコードする核酸を過剰発現すよう に培養されない。 誘発に関して、典型的に細胞を、dsbＡまたはdsbＣ遺伝子の発現を誘発するた め、例えば、およそＡ₅₅₀６０−８０（点誘発（例えば、インデューサーの添加 によって、または培地成分の枯渇によってなど）が始まるところで）においてあ る吸光度になるまで培養する。該吸光度がより一層高い量に達する（例えば、お よそＡ₅₅₀８０−１００）と、異種ポリペプチドの第２プロモーターの誘発が影 響を受ける。 遺伝子発現は、サンプル中で直接的に、例えばｍＲＮＡの転写を定量するため に従来のノーザンブロットによって測定されてよい。トーマス（Ｔhomas）、Ｐr oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、７７：５２０１−５２０５（１９８０）。種 々の標識が使用され、最も一般的なものは、放射性同位体、特に³²Ｐが使用され る。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾ヌクレオチ ドを用いるなど、他の技術も使用してよい。ついで、ビオチンはアビジンまたは 抗体と結合するための部位として機能し、広範囲の種々の標識（放射性核種、蛍 光、酵素など）で標識されてよい。 発現しているまたは過剰に発現している遺伝子産物が分泌されているかどうか を観察する手法は、容易に当業者には利用できる。一度培養培地が宿主細胞から 分離されると（例えば、遠心または濾過によって）、遺伝子産物はその遺伝子産 物に特徴的である公知の性質を利用することによって、無細胞系の培養培地にお いて検出されることができる。このような特性は、その遺伝子産物の顕著な免疫 学的、酵素的または物理学的特性を含むことができる。 例えば、もし過剰発現した遺伝子産物が独特の酵素活性を有するならば、その 活性のアッセイは宿主細胞によって使用される培養培地で行われることができる 。 さらに、与えられた遺伝子産物に対して応答する抗体が利用できる場合、このよ うな抗体は公知のいずれかの免疫学的アッセイ（例えば、ハーロウ（Ｈarlowe） ら、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａntibodies：Ａ Ｌab oratory Ｍanual ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク 、１９８８）にて遺伝子産物を検出するのに使用することができる。 分泌された遺伝子産物または、ポリペプチドを分子量などの特徴的な物理学的 な特性に基づいて区別する試験を用いて検出することもできる。その遺伝子産物 の物理学的特性を検出するため、宿主細胞によって新しく合成された全てのポリ ペプチドを標識する（例えば、放射性同位元素で）ことができる。宿主細胞内で 合成されたポリペプチドを標識するのに使用されることができる一般的な放射性 同位元素は、トリチウム（³Ｈ）、炭素−１４（¹⁴Ｃ）、硫黄−３５（³⁵Ｓ）な どを含む。例えば、宿主細胞は³⁵Ｓ−メチオニンまたは³⁵Ｓ−システイン培地中 で増殖されることができ、ついで³⁵Ｓ標識の有意な量は、過剰発現した異種ポリ ペプチドを含む新規に合成されたポリペプチドのいずれかに好ましく組み込まれ るであろう。ついで³⁵Ｓ含有培養培地を除去し、細胞を洗浄し、新鮮な放射性活 性を有さない培養培地中に静置する。³⁵Ｓ標識した発現した異種ポリペプチドの 分泌を可能にするのに十分な条件下でしばらく新鮮培地中で細胞を維持した後、 該培養培地を回収し、宿主細胞から分離する。培養培地中で分泌され、標識され たポリペプチドはついで公知の手法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 などによって決定されてよい。分泌された遺伝子産物を検出するためのこのよう な手法および／または他の手法はゲッデル（編）１９９０、Ｇene Ｅxpression Ｔechnology、Ｍethods in Ｅnzymology、 Ｖol．１８５（アカデミック・プレ ス（Ａcademic Ｐress））およびサンブルックら、上記に提供されている。 発現または過剰発現された遺伝子産物の分泌に関して、宿主細胞は該遺伝子産 物の分泌に十分な条件下で培養される。このような条件には、例えば、温度、栄 養および該細胞による分泌を可能にする細胞密度条件などが含まれる。さらに、 このような条件は当業者に公知のように、細胞が転写、翻訳および１つの細胞コ ンパートメントから他のコンパートメントへのタンパク質の輸送の基礎的な細胞 機能を行うことができるような条件である。 本発明の工程の実施において、総ポリペプチドの収率は一般的に増加するが、 可溶性ポリペプチドの収率は不変であるかまたは減少する、すなわち、不溶性（ 集合した）ポリペプチドの収率が増加する。 関心のあるポリペプチドは分泌ポリペプチドとしてペリプラズムまたは培養培 地から回収される。しばしば、組換え体細胞タンパク質またはポリペプチドから 、および関心のあるポリペプチドに実質的に類似である調製物を得るためのＤsb ＡまたはＤsbＣタンパク質から関心のあるポリペプチドを精製することは好まし い。第１工程として、培養培地またはリゼイトは粒子性細胞破片を除去するため 遠心される。該膜および可溶性タンパク質画分はついで必要ならば分離される。 ついで該ポリペプチドは可溶性タンパク質画分および培養リゼイトの膜分画から 、該ポリペプチドが膜結合か、可溶性か、または集合した形態で存在しているか により精製される。その後、ポリペプチドは可溶化され、再び折り畳まれ、必要 ならば、可溶性タンパク質およびポリペプチドの夾雑物から精製される。好まし い態様において、集合したポリペプチドは単離され、米国特許第５,２８８,９３ １号に開示されているようについで自発可溶化および再折り畳み工程が続く。 上に記載されたものなどのポリペプチドおよび発酵ブロス中に含有された非ポ リペプチドを含む複合生物学的混合物からの外在性ポリペプチドを単離する好ま しい方法は、細胞好ましくは細胞培養（本来の形態ではないポリペプチドを含む ）と試薬との接触に関与し、その結果水溶性抽出／単離が起こる。好ましくは、 該方法は該ポリペプチドが組換えで生成された後、発酵導管に試薬を直接添加し 、それによって、回収、ホモジナイゼーションおよびポリペプチドを得るための 遠心の余分な工程を回避する。残存する粒子はガウリンホモジナイゼーションお よび再懸濁、濾過またはその組み合わせによって除去されることができるが、こ の方法は残存粒子からの組換え体ポリペプチドを精製する多相抽出を利用する。 とりわけ、この方法は、細胞のペリプラズム中にリフラクティル体（refracti lebodies）を形成する、大腸菌を含む細菌細胞中に組換え体として産生される本 来は存在しない哺乳動物ポリペプチドにとって好ましい。この系において、尿素 、 塩酸グアニジンおよび／または塩基、およびジチオトレイトールまたはシステイ ンなどの１つまたはそれ以上の、変性剤（カオトロピック剤）をポリペプチド含 有培地に添加し、ついで該ブロスに相を形成する種を添加する。一度この第２群 の薬剤をブロスに添加すると多相が形成され、それによって１つの相がポリペプ チド中で豊富にされ、生物量固体および核酸中で枯渇される。好ましくは該系は ２ないし４の相を有し、より好ましくは２つの相、１つはポリペプチド中で豊富 にされ、他方は生物量固体および核酸中で豊富にされるものを有する。好ましく は、望ましいポリペプチドの配分は上相に存在し、その結果該上相は該ポリペプ チドが豊富であり生物量固体および核酸中に枯渇される。 特に、発酵が完了したのち、該細胞培を１つまたはそれ以上のカオトロピック 剤に接触させ、時に還元剤に、および相形成薬剤に接触させ、多相を形成し、そ のうちの１つの相は関心のあるポリペプチド中で豊富である。細胞からポリペプ チドを抽出するカオトロピック剤および還元剤を最初に添加するのが好ましく、 ついで相形成剤を添加する前にブロス中でその可溶度を維持するのが好ましい。 また、関心のあるポリペプチドが任意の相から（および任意の相に豊富である） 抽出されることができるが、好ましくは最上相から回収する。 最も好ましくは、カオトロピック剤および任意の還元剤を直接ポリペプチドの 単離前に発酵導管中の発酵ブロスに添加すると該薬剤は細胞に浸透でき、該ポリ ペプチドは可溶化され、周囲の培地に拡散することができる。該還元剤はもしポ リペプチドが少なくとも１つのスルフヒドリル基を含む場合には添加する。適切 な還元剤の例には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール （ＢＭＥ）、システイン、チオグリコレートおよび水素化ホウ素ナトリウムを含 む。バッファー中に存在する還元剤の量は主として還元剤およびカオトロピック 剤のタイプ、使用するバッファーのタイプとｐＨおよびバッファー中のポリペプ チドのタイプおよび濃度による。還元剤の有効量は、分子内ジスルフィド媒介集 合を排除するのに十分であるものである。例えば、０.５−６mg／mＬ ＩＧＦ− ＩのｐＨ７.５−１０.５での１−４Ｍ尿素を含むバッファー溶液中で、ＤＴＴ濃 度がおよそ１−２０mＭで、システイン濃度がおよそ１０−５０mＭである。好 ましい還元剤はおよそ２−１０mＭ ＤＴＴまたはおよそ３０−５０mＭ システイ ンである。 抽出の本方法を実施するのに適したカオトロピック剤は、例えば、グアニジン またはチオシアン酸塩、より好ましくは、尿素、塩酸グアニジンまたはチオシア ン酸ナトリウムを含む。バッファー中に存在するのに必要なカオトロピック剤の 量は、例えば、存在するカオトロピック剤のタイプおよびポリペプチドのタイプ に依存する。発酵ブロスに添加されるべきカオトロピック剤の量は細胞からポリ ペプチドを抽出しブロス中でその可溶度を維持するのに十分高いであろう。ポリ ペプチドが最上相から抽出されるべきなら、カオトロピック剤の量は相を形成す る種の添加後、密度は固体が底に沈む代わりに上昇点までは増加しないよう十分 低くなければならない。一般的に、カオトロピック剤の濃度はおよそ０.１〜９ Ｍ、好ましくはおよそ０.５〜９Ｍ、より好ましくはおよそ０.５〜６Ｍおよび最 も好ましくはおよそ０.５〜３Ｍである。また、好ましくはカオトロピック剤は 相を形成する薬剤を添加する前に培養培地に添加する。本明細書において好まし いカオトロピック剤はおよそ１.５〜２.５Ｍ、より好ましくはおよそ２Ｍの尿素 、またはおよそ０.５〜３Ｍの塩酸グアニジンである。最も好ましいカオトロピ ック剤は尿素である。 カオトロピック剤および還元剤が添加される水溶液中のポリペプチドの濃度は 、ポリペプチドが最大収量で回収できるような濃度でなければならない。使用す るのに正確な量は例えば、ポリペプチドのタイプおよび水溶液中の他の成分、例 えば還元剤、カオトロピック剤、相を形成する種およびｐＨといったものの濃度 およびタイプ次第である。一般に、ポリペプチドに関しては、ポリペプチドの好 ましい濃度はおよそ０.１〜１５mg／mＬである。ＩＧＦ−Ｉの好ましい濃度（変 性または本来のものでないＩＧＦ−Ｉの最大収量となる濃度）は、０.５〜６mg ／mＬ、より好ましくは１．５〜５mg／mＬの範囲にある。 本明細書で使用する相を形成する種のタイプは多数の因子（ポリペプチドのタ イプおよび処理されている発酵ブロス中での成分を含む）に依存している。該種 はポリペプチドは沈澱せず、１つの相は他の相より疎水性であり、そのためポリ ペプチドはより疎水性の相中に存在し、生物量固体および核酸は疎水性てはない 方の相に沈澱するように選択されなければならない。 相を形成する種は薬剤の組合せ（ポリマー組合せ（ポリマー−ポリマー）、ポ リマー−塩組合せ、溶媒−塩およびポリマー−溶媒組合せを含む）であってよい 。適切なポリマーは高親水性ポリマーおよび低親水性ポリマーの両者、すなわち 当該技術分野において公知の相を形成するポリマーの任意のものである。例には 、ポリエチレングリコール、またはその誘導体（ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６００ ０およびＰＥＧ８０００などの多様な分子量のＰＥＧ、記載されたＰＥＧの誘導 体、（例えば、グランフェルド（Grunfeld）ら、Ａppl．Ｂiochem．Ｂiotechnol . 、３３：１１７−１３８（１９９２）に記載されている）およそ３６,０００な いし３６０,０００の好ましい分子量を有する、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ ）、デキストラン（例えばデキストラン７０および５００）、デキストリンおよ びマルトデキストリン（好ましい分子量はおよそ６００ないし５,０００）、ス クロースおよびＦicoll−４００^TMポリマー（スクロースおよびエピクロロヒド リンのコポリマー）などのデンプンが含まれる。本明細書で好ましいポリマーは 、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン またはデキストランなどのポリサッカリドである。本明細書で最も好ましいポリ マーは種々の分子量のＰＥＧまたはＰＥＧ−ポリプロピレングリコールの組合せ またはコポリマーである。 適切な有機溶媒の例には、エチレングリコール、グリセロール、ジメチルスル ホキシド、ポリビニルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびメ タノール、エタノールおよび２−プロパノールなどのアルコールが含まれる。こ のような溶媒は、水溶液に添加されると、それらはその溶液の疎水度を高める。 塩は、無機または有機塩でよく、好ましくはポリペプチドを沈澱させるように 機能しないのがよい。遷移元素を含有する塩はポリペプチドを沈澱させがちであ るので好ましくない。アニオンは水性多相系を形成する可能性を有するものが選 択される。例には硫酸アンモニウム、リン酸二塩基ナトリウム、硫酸ナトリウム 、 リン酸アンモニウム、クエン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウ ム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫 酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マンガン、リン酸マンガンなどが含ま れる。２相水性系を形成するのに有用な塩のタイプは、ザスラブスキ（Ｚaslavs kii）ら、Ｊ．Ｃhrom.、４３９：２６７−２８１（１９８８）に一層完全に評価 されている。本明細書の好ましい塩は、硫酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩であ り、アルカリ金属またはアルカリ土類金属である。より好ましい塩は硫酸塩およ びクエン酸塩であり、最も好ましい塩はｐＨ制限が殆どないので硫酸塩が好まし い。本明細書における最も好ましい塩は硫酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウ ムである。 満足な多相系を得るための関心のあるポリペプチドに添加する相を形成する種 の量は、当業者に公知である。ポリペプチドに添加される相を形成する種の量は 例えば、カオトロピック剤および還元剤の量（もしあれば既に発酵ブロス中に存 在している）、細胞培養培地の性質、発酵に使用される細胞のタイプ、処理され るポリペプチドのタイプ、そのポリペプチドが下相または上相から回収されるか どうか、および添加される相を形成する種のタイプなどの因子による。使用され るポリマーの一般的な濃度は必要とされる相−容量の比率の大きさに依存し、ポ リマーの可溶度の制限までおよそ５％（w／w）および使用される塩の濃度は塩の 可溶度の制限までおよそ３％（w／w）である。相−容量の比率は生物量固体を収 容するのに十分でなければならない。有効である相を形成する種のタイプおよび 量は相ダイアグラムおよび最終結果すなわち、関心のあるポリペプチドの精製の 程度および収率を評価することによって決定することができる。もし相を形成す る種がポリマー−塩の組合せなら、添加される塩の濃度は好ましくはおよそ４− １５％（w／w）およびポリマーの濃度は５−１８％（w／w）であり、その結果目 的のポリペプチドは生物量固体および核酸が存在する相と逆の相にあるであろう 。 望ましい系がポリペプチドが最上の相に分布し、生物量固体および核酸が最下 相に分布するものである場合、相を形成する種の濃度の窓(window)がある。一層 多量なカオトロピック剤が可溶化を維持するために添加する場合、一層多量の 相を形成する種が必要である。しかしながら、これらすべての薬剤の高濃度は溶 液の密度を増加させる。高い密度は生物量固体を容易には沈澱させないようにす る。過剰に高い密度は生物量固体を表面に浮遊させるであろう。従って、カオト ロピック剤および相を形成する種の濃度はポリペプチドの完全な可溶化を維持す るのに十分高くなければならず、生物量固体を逆の（下の）相に沈澱させること ができるのに十分低くなければならない。 該ポリペプチドが上の相にて回収されるような場合、典型的には、例えば、塩 、ポリマーおよびポリペプチドのタイプに依存して、該塩濃度はおよそ４−７％ （w／w）であり、該ポリマー濃度はおよそ１２−１８％（w／w）であるであろう 。もし、有機溶媒が、エタノールなどの相を形成する種として添加されるならば 、好ましくは、ポリペプチドおよびアルコールのタイプに依存して、該溶液のお よそ１０〜３０％（容量／容量）の濃度にて添加され、もし他の相を形成する種 が存在するならば、好ましくはおよそ２０％（v／v）の濃度で添加される。 細胞培養物と種々の薬剤を接触させる厳密な条件は、例えば、バッファーのｐ Ｈ、相を形成する薬剤のタイプおよびポリペプチドおよびカオトロピック剤およ び還元剤のタイプおよび濃度に依存するであろう。反応温度は、一般におよそ２ ０〜４０℃であり、より好ましくは室温である。接触工程は一般に、少なくとも ３０分間、好ましくは副作用が起こるか否かによって３０分から１２時間、より 好ましくはおよそ３０分〜８時間、最も好ましくは３０分〜１.５時間で行う。 もしポリペプチドが折り畳まれていないなら、折り畳まれていない程度は本来 存在しないポリペプチドのクロマトグラフィー（疎水性相互作用クロマトグラフ ィー、またはイオン交換クロマトグラフィーを含む）によって適切に決定される 。本来存在しない物質のピーク領域の増加は、どれだけ本来存在しないポリペプ チドが存在しているのかを示す。 一度多相系が確立すると、１つの相はポリペプチドに富み、生物量固体および 核酸を含む崩壊した粒子および細胞中に枯渇する。２相系において、最上相がポ リペプチドに富み、一方で底の相は崩壊した粒子および細胞に富むのが好ましい 。該ポリペプチドは容易に該相の分離によって回収することができる。この回収 工 程は上相をデカントすること、下相を乾燥させることまたは遠心によって達成す ることができる。ついで、ポリペプチドはそれが含まれている相から該ポリペプ チドを沈澱させるように相のｐＨを変化させることによってか、または適切な溶 媒を添加することによって単離することができ、そうすることによって、沈澱し たポリペプチドは適切に遠心、または濾過によりまたはスラリーとして回収され る。別法として、該ポリペプチドは適切なポリマー、塩または溶媒の添加による 再抽出によってポリマー含有相から回収することができる。ＩＧＦ−Ｉの場合、 該ポリペプチドはＩＧＦ−Ｉが沈澱し、ＩＧＦ−Ｉの収量が少なくともまたはお よそ９７％より多くなるようにｐＨを低くすることによって、単離されたポリマ ーの相から回収される。ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質は本段階でポリペプチド から分離されるであろう。 一度多相系の液相から得ると、または後の精製段階から得ると、該ポリペプチ ドは適切に活性形態へと再度、折り畳まれる。利用することができる１つの適切 な再折り畳み方法は以下である。 該ポリペプチドが本明細書に記載の多相抽出系によって可溶化および抽出され た後、それは溶媒、カオトロピック剤、塩および微少量の銅またはマグネシウム 塩を含むバッファー中に静置または希釈される。このバッファーは任意のタイプ の宿主からのポリペプチドの再折り畳み量を予期せず増加させる。このバッファ ーは主としてポリペプチドおよび還元剤のタイプにより、ｐＨはおよそ７〜１２ 、好ましくは８〜１１、より好ましくは８.５〜１１および最も好ましくは８.５ 〜１０.５である。 該バッファーの１つの鍵となる成分は、例えば、ポリペプチドおよび溶媒のタ イプおよびカオトロピック剤の濃度などによって溶液のおよそ５−４０％（v／v ）、好ましくは１０−３０％（容量／容量）の濃度でアルコールまた極性非プロ トン性溶媒である。最も好ましい濃度はおよそ２０％（v／v）である。 該バッファーの第２の鍵となる成分は、主として使用するカオトロピック剤の 濃度、溶媒の濃度およびアルカリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩のタ イプによっておよそ０.２〜３Ｍ、好ましくは０.２〜２Ｍの濃度で存在するアル カリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩である。例えば、陽イオンがナト リウム、カリウムまたはアンモニウムの場合なら、濃度はおよそ０.５〜３Ｍで あるが、陽イオンがマグネシウムの場合には、濃度はおよそ０.２〜１Ｍである 。 該バッファーの第３の鍵となる成分は、カオトロピック剤の有効量である。こ のようなカオトロープ（chaotrope）の量は主としてアルカリ土類、アルカリ金 属またはアンモニウム塩の濃度、溶媒の濃度、使用するアルカリ土類、アルカリ 金属またはアンモニウム塩の具体的なタイプならびに該バッファーのｐＨに依存 するであろうが、一般にはおよそ０.１〜９Ｍ、好ましくはおよそ０.５〜６Ｍお よび最も好ましくはおよそ１.５〜４Ｍであろう。具体的なカオトロープに関し ては、好ましくは０.１〜２Ｍの塩酸グアニン、好ましくは１−３Ｍ、より好ま しくはおよそ１−２.５Ｍおよび最も好ましくはおよそ２Ｍの尿素を利用する。 該バッファーの第４の鍵となる成分は、酸化およびその結果の再度折り畳みが 起こるであろう銅およびマンガン塩から選択された遷移金属塩の有効量である。 銅またはマンガンの量は主として使用される遷移金属およびポリペプチドのタイ プおよび存在する酸素のレベルに依存している。酸素添加または酸素のレベルの 割合が低ければ低いほど、一層使用することができる銅またはマンガン塩の量は 高くなる。銅またはマンガンの濃度は典型的にはおよそ０.０１〜１５μＭ、好 ましくはおよそ０.０１〜１０μＭ、より好ましくは０.０１〜５μＭおよびさら に好ましくは０.０１〜０.５μＭである。上記の好ましい範囲は特にＩＧＦ−Ｉ に好まれる。もし濃度がおよそ１５μＭを越えて増加するなら、正しく折り畳ま れたポリペプチドの収量は、予期せずして劇的に減少する。最も好ましくは、銅 またはマンガン塩の濃度はおよそ０.５μＭである。遷移金属塩は、例えば発酵 の残渣またはバッファーに添加するかまたはその両者に添加するならば、既に外 在性遷移金属塩をバッファーに添加しないで存在するであろう。 該バッファーは最初のバッファー溶液に、上記に列挙したいずれかであってよ くＣＡＰＳＯ、グリシンおよびＣＡＰＳをｐＨ８.５−１１で、特におよそ２０ ｍＭの濃度で、最も好ましくはＣＡＰＳＯおよびグリシンであってよい。該ポリ ペプチドは再折り畳みバッファーで好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは 少なくともおよそ１０倍に希釈されてよい。別法として、該ポリペプチドは再折 り畳みバッファーに対して透析されてよい。該再折り畳みは典型的には０−４５ ℃、好ましくはおよそ２０−４０℃、より好ましくは２３−３７℃、さらに一層 好ましくはおよそ２５−３７℃、最も好ましくはおよそ２５℃で少なくともおよ そ１時間行われる。好ましい温度は塩、溶媒およびカオトロピック剤のレベルに よっては明らかには影響を及ぼされないが、スクロースおよびグリセロールの存 在によっては、およそ２０℃を超えて維持されるべき場合には影響を及ぼされる 。該溶液は任意に還元剤およびオスモライトも含む。 該還元剤は与えられた濃度範囲中で可溶化する工程のため、上記から適切に選 択される。その濃度は特にアルカリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩、 ポリペプチドおよび溶媒の濃度による。好ましくは還元剤の濃度はおよそ０.５ 〜８mＭ、より好ましくはおよそ１−５mＭ、さらに好ましくはおよそ０.５−２m Ｍである。好ましい還元剤はＤＴＴおよびシスティンである。 任意のオスモライトは、好ましくはスクロース（およそ０.２５−１Ｍの濃度 で）またはグリセロール（およそ１−４Ｍの濃度で）である。より好ましくは、 スクロース濃度はおよそ１Ｍおよびグリセロール濃度はおよそ４Ｍである。 折り畳みバッファー中のポリペプチドの最初の濃度は、ＨＰＬＣ、ＲＩＡまた はバイオアッセイによって決定されるように、正確に折り畳まれたものの回収さ れる誤って折り畳まれた形態に対する割合が最大となるであろう。その厳密な濃 度は例えば使用するポリペプチドのタイプによるであろう。好ましいポリペプチ ドの濃度（正しく折り畳まれた形態の最大収量となる）はおよそ０.１−１５mg ／mＬ、mg／mＬ、より好ましくはおよそ０.１−６mg／mＬおよび最も好ましくは およそ０.２−５mg／mＬの範囲である。 さらに、空気または酸素ガスなどの源は、銅またはマンガン塩とともに酸化に 影響を及ぼすようにバッファーに入れるかまたは導入される。該酸素はポリペプ チドまたは他のいずれかの薬剤をバッファーに添加する以前をんで、どんな時点 でもバッファー中に存在していてよい。 導入される酸素源の量は例えば、利用される容器のタイプ、ポリペプチドの濃 度、酸素源のタイプ、銅またはマンガン塩のタイプおよび存在する還元剤の量に よるであろうし、もしあれば、存在するカオトロピック剤のタイプおよび量なら びにバッファーのｐＨにもよるであろう。一般的に、該酸素源はアジテーターを 用い、受動的手法によって（例えば、上部の空気空間対液体の容量の比が２：１ である上部空間における空気として）導入されるであろう。別に、該酸素源はス パーガー（sparger）を用いて泡立てることによって導入されてよい。酸素の導 入の速度は、好ましくは１−１２時間、より好ましくはおよそ１−６時間、最も 好ましくはおよそ１−３時間で完了に達することができるよう十分でなければな らない。モル酸素の添加は還元剤の濃度およびポリペプチドの濃度に比例するが 、銅またはマグネシウム塩の濃度に反比例する。酸化の速度は、触媒のレベルに よって制限されるが、酸素の添加速度によっては制限されない。一層高いスパー ギング（sparging）の速度はより多容量の折り畳みに必要である。 この第２のインキュベーションは該ポリペプチドのＲＩＡ力価またはＨＰＬＣ 分析（例えば、ビダック（Ｖydac）またはベイカー（Ｂaker）Ｃ−１８カラムな どを用いてＲＩＡ力価またはバッファー中に存在する正しく、生物学的に活性の あるポリペプチド形態の増加する量に直接相関する、正しく折り畳まれたポリペ プチドピークの大きさを増加させて）適切に決定する。該インキュベーションは 、ＲＩＡまたはＨＰＬＣによって決定されるように、正しく折り畳まれたポリペ プチド形態の収率および正しく折り畳まれたポリペプチド形態の誤って折り畳ま れたポリペプチド形態に対する割合を最大にするべく、およびマルチマー（mult imer）の収率、マスバランス（mass balance）によって決定されるような関連ポ リペプチドの収率を最少にするべく行われる。 以下の手法は適切な精製方法の例である：イムノアフィニティーまたはイオン 交換カラム上での画分；エタノール沈澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥ などの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；等電点クロマトグラフィー； ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈澱；および例えばセファデックス（Ｓph adex）Ｇ−７５を用いたゲル濾過。 以下の例は例示のために提供されるものであって制限するためのものではない 。 全ての特許およびその明細書に引用されている科学的参照文献は参照のため本明 細書に明確に包含される。 実施例Ｉ dsbＡヌクレオチド配列がｐ１６−１（バードウェルら、上記、１９９１）か らＰＣＲ技術を用いて増幅され、ＸbaＩ部位をＤsbＡ−コーディング配列の５’ 末端に、およびＣlaＩ部位を３’末端に添加した。このＤＮＡ断片は適当な制限 酵素で消化し、ｐＫＭＴacIIの１.０kb ＰstＩ−ＸbaＩ断片でライゲーション（ デボーアら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８０：２１−２５［１９８ ３］）およびｐＢＫＩＧＦ−２Ｂの３.６kb ＣlaＩ−ＰstＩ断片（米国特許第５ ,３４２,７６３号）でライゲーションした。その結果のプラスミドであるpＪＪ ４１（図１参照）はtacIIプロモーターの制御下でdsbＡを含み、アンピシリンお よびテトラサイクリン耐性を与える。このプラスミドをＣlaＩで消化し、および その末端はクレノウ断片およびデオキシリボヌクレオチドによって充填した。 クレノウ断片の不活性化および消化したＤＮＡの抽出の後、そのＤＮＡを配列 的にＳacＩで消化し、ついでβ−ラクタマーゼ遺伝子の５’−末端を含む１.５k bの断片およびＴacII−dsbＡ要素を精製した。これはＥcoＲＩ消化の４.６kb断 片でライゲーションし、pＢＫＩＧＦ−２Ｂ（これもＳacＩで消化されている） で充填した。このpＢＫＩＧＦ−２Ｂ断片はβ−ラクタマーゼの３'末端を含み、 アンピシリン耐性による選択を可能とするとともに、テトラサイクリン耐性のＤ ＮＡ配列およびＩＧＦ−Ｉの産生のＤＮＡ配列を含んでいた。このプラスミドは pＪＪ４２（図１参照）と示される。 該プラスミドは大腸菌３３Ｄ３株（Ｗ３１１０tonＡptr３lacＩqＬacＬ８omp ＴdegＰkan^r表現型を有する）に形質転換した。この株はＰ１（ミラー（Ｊ．Ｍi ller）、Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics、コールド・スプリング・ハー バー、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９７ ２）由来ファージＰ1kc、およびトランスポゾン遺伝学（クレックナー（Ｋleckn er）ら、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１１６：１２５−１５９［１９７７］）でトランス ダクションに関与する技術を使用していくつかの工程にて構築された。 使用される出発宿主は大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０（Ｆ−ラムダであるＫ−１２株 （バックマン（Ｂachmann）、Ｂact．Ｒev.、３６：５２５−５５７［１９７２ ］；ネイダート（Ｆ．Ｃ．Ｎeidhardt）ら、編、Ｅscherichia ｃoli and Ｓalm onella typhimurium：Ｃellular and Ｍolecular Ｂiology 、第２巻、アメリカ ン・ソサイエティー・フォー・マイクロバイオロジー（Ａmerican Ｓociety for Ｍicrobiology）、ワシントンＤ.Ｃ.、１９８７）中、バックマン、『デリベー ションズ・アンド・ジェノタイプス・オブ・サム・ミュータント・デリバティブ ズ・オブ・エシェリキア・コリ Ｋ−１２（”Ｄerivations and Ｇenotypes of Ｓome Ｍurtant Ｄerivatives of Ｅscherichia coli Ｋ−１２”）、１１９０ −１２１９ページ）であった。 ゲノムへのtonＡ（fhuＡ）変異およびptr３変異の導入は１９９４年４月１９ 日に発行された米国特許第５,３０４,４７２号に詳細に記載されている。結果の 株は９Ｅ４と名付けられた。lacＩ^q（ミュラーヒル（Ｍuller- Ｈill）ら、Ｐroc ．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、５９：１２５９［１９６８］）およびlacＬ８ （スケイフ（Ｓcaife）およびベックウィズ、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp．Ｑ uant．Ｂiol. 、３１：４０３［１９６７］）変異はproＣでのコトランスダクシ ョンによって９Ｅ４株に導入された。最初に、連結したＴn５挿入がProＣおよび phoＡΔＥ１５（サーシー（Ｓarthy，Ａ.）ら、Ｊ．Ｂacteriol.、１４５：２８ ８−２９２［１９８１］）変異が導入された。プロリン原栄養体へのＰ１トラン スダクションはproＣ遺伝子およびphoＡ遺伝子を蓄え、また、lacＩ^qlacＬ８変 異を導入した。lacＩ^q変異は野生株に比較してlacリプレッサーの過剰産生とな る。lacＩ^q変異の存在は色素産生基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−gal）を含むＬＢプレート上で観察す ることができる。これらのプレート上でlacＩ⁺株は明るい青色、lacＩ^q株は無色 である。該ＬacＬ８変異はlacオペロン酵素レベルを低くすることになるプロモ ーター変異である。ＬacＬ８変異の存在は、マッコンキー（ＭacConkey）１％ラ クトース培地上で、中心が暗赤色および周囲の端がベージュ色であるコロニーと して検出することができる。ompＴ欠失およびdegＰ変異のその株への導入は、米 国特許 第５,３０４,４７２号に詳細に記載されている。 最後の３３Ｄ３株はＴ１およびφ８０ファージに耐性であり、３つのプロテア ーゼを欠如し、lacリプレッサーを過剰産生させ、誘発したときの野生型lacオペ ロン酵素レベルより低く産生する。 pＪＪ４２を含む３３Ｄ３細胞は、ついで米国特許第５,３０４,４７２号、実 施例II、１×feed条件に記載されているＩＧＦ−Ｉ産生に同一の条件下で１０リ ッターファーメンター（１０−liter fermentor）で増殖させた。その培養物の 吸光度（Ａ₅₅₀）が６０に達した時、tacIIプロモーターを誘発するためにＩＰＴ Ｇまたはラクトースを下記の所定量添加した。増殖培地を吸光度（Ａ₅₅₀）が８ ０から１００となるようにリン酸塩欠失およびphoＡプロモーターのために設計 した。総ＩＧＦ−Ｉ産生を米国特許第５，３０４,４７２号によって記載された 高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイにより測定した。 その結果を下記表１に示す： その結果は細菌のペリプラズムにおけるdsbＡ遺伝子の過剰発現がいずれかの インデューサーによって誘発されたすべての工程のためのＩＧＦ−Ｉの収率を改 良することを示している。ＩＧＦ−Ｉ蓄積における増加はおよそ６０％であった 。正確に折り畳まれたＩＧＦ−Ｉは、上記または米国特許第５,２８８,９３１号 に記載された方法によってのように酸素的再折り畳みが続く液体−液体抽出（li quid-liquid extraction）によって高収率で回収することができる。 実施例II dsbＡヌクレオチド配列を大腸菌のゲノムからのＰＣＲ技術（ミシアカスら、 上記［１９９４］）を用いて増幅し、ついでＸbaＩ部位をＤsbＣコーディング配 列の５’末端およびＣlaＩ部位を該配列の３’末端に添加した。このＤＮＡ断片 を適当な制限酵素で消化し、ついで１.０kbのpＫＭＴacIIのＰstＩ−ＸbaＩ断片 （デボーアら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８０：２１−２５［１９ ８３］および３.６kbのpＢＫＩＧＦ−２ＢのＣlaＩ−ＰstＩ断片（米国特許第５ ,３４６２,７６３号）でライゲーションした。その結果のプラスミド、pＪＪ３ ７（図２参照）はＴacIIプロモーターの制御下でdsbＣを含み、アンピシリンお よびテトラサイクリン耐性を与える。このプラスミドをＣlaＩで消化し、ついで その末端をクレノウ断片およびデオキシリボヌクレオチドにより充填する。 クレノウ断片および消化ＤＮＡの不活性化後、そのＤＮＡを引き続いてＳcaＩ で消化し、ついでβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の５’末端を含む１.５kbの断片 およびＴacII-dsbＣ要素を精製した。これをＥcoＲＩ消化してpＢＫＩＧＦ−２ Ｂに充填した４.６kb断片（これもまた、ＳcaＩで消化した）でライゲーション した。このpＢＫＩＧＦ−２Ｂの断片はβ−ラクタマーゼの３’末端を含み、ア ンピシリン耐性ならびにテトラサイクリン耐性のＤＮＡ配列の選択およびＩＧＦ −Ｉの産生を可能にした。このプラスミドはｐＪＪ４０と示された（図２参照） 。 このプラスミドを上記のように大腸菌３３Ｄ３株に形質転換した。ついで、p ＪＪ４０を含む３３Ｄ３細胞を米国特許第５,３０４,４７２号、実施例II、１× feed条件に記載されているＩＧＦ−Ｉ産生に同一の条件下で１０−リッターファ ーメンターで増殖させた。その培養物の吸光度（Ａ₅₅₀）が６０に達したとき、t acIIプロモーターを誘発するために１％ラクトースを添加し、それによってdsb Ｃ発現を増加させた。その増殖培地を吸光度（Ａ₅₅₀）が８０から１００となる ようにリン酸塩欠失およびphoＡプロモーターのために設計した。総ＩＧＦ−Ｉ 産生を米国特許第５，３０４,４７２号によって記載されたＨＰＬＣアッセイに より測定した。 その結果は１％ラクトースは３g／Ｌ ＩＧＦ−Ｉを産生するコントロールであ るpＢＫＩＧＦ−２Ｂ（インデューサーなし）に対して、４g／Ｌ ＩＧＦ−Ｉを 産生するというものである。 実施例III dsbＡ遺伝子を培地中のアラビノースの存在に応じてその遺伝子を過剰発現す るクローニングされた誘発可能なアラビニースプロモーター（ガズマン（Ｇuzma n）ら、上記）を含むベクターpＢＡＤ１８（図３）にクローニングした。そのds bＡ遺伝子（クローニングにおいて容易にするために制限部位を付着させた）を ＰＣＲにより増幅した。ＥcoＲＩ部位を５'端に、およびＫpnＩ部位を３'端に置 いた。dsbＡをクローニングしたベクターを同じ酵素で消化し、そのdsbＡＰＣＲ 産物をpＢＡＤＪ２（図３）を形成するために、消化したベクターでライゲーシ ョンした。このプラスミドpＢＡＤＪ２をＣlaＩおよびＨindIIIで消化し、つい でクレノウポリメラーゼ断片Ｉの使用によって消化した平滑末端でライゲーショ ンした。アラビノースプロモーターとdsbＡをコードする１.９kb断片を増幅した 。ついで、このdsbＡ遺伝子を有するアラビノースプロモーターを上記のように ＩＧＦ−Ｉ産生プラスミドpＢＫＩＧＦ−２ＢのＥcoＲＶ部位にクローニングし た。dsbＡの転写の方向はＩＧＦ−Ｉと同様であった。このプラスミドをpＢＫＩ ＧＦ２Ｂ−Ａと称する。 ついでプラスミドpＢＫＩＧＦ２Ｂ−Ａを大腸菌３６Ｆ８株（表現型Ｗ３１１ ０tonＡphoＡΔ（argＦ-lac）prt３degＰkan^RilvＧ＋、３７℃で耐熱性である） に形質転換した。この株を上記同様の基本的な技術を用いて幾つかの工程にて構 築した。２７Ａ７の構築のための出発宿主は米国特許第５,３０４,４７２号に詳 細に記載されている。 次に、degＰ４１kan^r変異を２７Ａ７に導入した。この変異は米国特許第５,３ ０４,４７２号に記載されている。その株を２７Ｂ４と称する。２７Ｂ４株は３ ７℃および４２℃にてＬＢ培地上での増殖が乏しい。耐熱性の単離体はよく増殖 した自発的なコロニーを採取することによって３７℃で得た。この株は３５Ｅ７ と称する。 ついでリボース欠失がilv遺伝子に連結したＴn１０挿入物でのＰ１コトランス フェクションによって、３５Ｅ７株に導入した。イソロイシン／バリン自発栄養 体はilvＧ２０９６^R変異を有する株上で増殖したＰ１ファージを用いてプロトロ フィー（protrophy）にトランスダクションし（ローサー（Ｌawrher）ら、Ｐroc ． Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、７８：９２２−９２５［１９８１］）、野生型大 腸菌Ｋ−１２株をバリンに感受性にさせるフレームシフトを修正する。ilv２０ ９６^R遺伝子座を４０μg／mＬのバリンに対する３６Ｆ８宿主の耐性によって確 認した。rbs欠失はまた、この工程の間に修正されて、株をリボースを炭素源と して利用することができるようにする。 最後の３８Ｆ８株はＴ１およびφ８０ファージに耐性であり、２つのプロテア ーゼを欠如し、培地中でリン酸塩の欠失に関して、アルカリホスファターゼを過 剰産生せず、３７℃でよく増殖し、バリンの毒性に感受性がない。 ついで、プラスミドｐＢＫＩＧＦ２Ｂ−Ａを含む３６Ｆ８細胞を上記の米国特 許第５,３０４,４７２号に記載の１×feed条件、実施例IIIに記載されているＩ ＧＦ−Ｉ産生に同一の条件下で１０−リッターファーメンター内で増殖させた。 その培養物の吸光度（Ａ₅₅₀）が８０に達した時に１％（w／v）Ｌ−アラビノー スを加えた。これはdsbＡ発現を誘発およびペリプラズムにＤsbＡタンパク質の 分泌という結果となる。増殖培地を吸光度（Ａ₅₅₀）が１００となるようなリン 酸欠失およびphoＡプロモーター誘発のために設計した。総ＩＧＦ−Ｉ産生を実 施例Ｉで使用したＨＰＬＣアッセイにて測定した。 その結果を下の表２に示す： その結果は細菌のペリプラズム中でのdsbＡ遺伝子の過剰発現がアラビノース プロモーターおよびＤsbＡに関与する全ての工程の総（可溶性および不溶性）Ｉ ＧＦ−Ｉの収量を改善することを示している。このＩＧＦ−Ｉ蓄積における増加 は１％Ｌ−アラビノースを用いて約２倍となった。正確に折り畳まれた形態のＩ ＧＦ−Ｉは上記のように液体−液体抽出および再度折り畳まれることによって、 または米国特許第５,２８８，９３１号に記載されている方法によって回復され てよい。 収量の増加は、非常に類似したプラスミドからのdsbＢを過剰発現している細 胞は増加を示さないように、ＤsbＢには見られなかった。さらに、もしdsbＡ Ｄ ＮＡおよびＩＧＦ−Ｉ ＤＮＡが同じプロモーターを用いて共発現した場合、総 ＩＧＦ−Ｉ収量はdsbＡ遺伝子（ｐＲＫＩＧＦ−２Ｂ）なしでコントロールに比 較して減少した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細菌中で異種ポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）ＤsbＡまたはＤ sbＣタンパク質をコードする核酸、該異種ポリペプチドをコードする核酸、Ｄsb ＡまたはＤsbＣタンパク質および異種ポリペプチドの両者の分泌のためのシグナ ル配列、およびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異種ポ リペプチドをコードする核酸の両者の誘発可能なプロモーターを含む細菌細胞を 、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸の発現を誘発した後に異種ポ リペプチドをコードする核酸の発現を誘発する条件下および該異種ポリペプチド およびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質の両者を細菌のペリプラズムに分泌させる かまたは該異種ポリペプチドを該細菌細胞を培養する培地に分泌させる条件下で 培養する；および（ｂ）該異種ポリペプチドを該ペリプラズムまたは該培養培地 から回収することを含む方法。 ２．該異種ポリペプチドが哺乳動物のポリペプチドである請求項１に記載の方法 。 ３．該哺乳動物のポリペプチドがヒトのポリペプチドである請求項２に記載の方 法。 ４．該異種ポリペプチドがインシュリン様増殖因子である請求項２に記載の方法 。 ５．該細菌細胞が真正細菌細胞である請求項１に記載の方法。 ６．該真正細菌細胞がエンテロバクテリアセエ細胞である請求項５に記載の方法 。 ７．該真正細菌細胞が大腸菌細胞である請求項６に記載の方法。 ８．ＤsbＡをコードする核酸を発現する請求項１に記載の方法。 ９．該ポリペプチドを該細菌細胞のペリプラズムから回収する請求項１に記載の 方法。 １０．該ポリペプチドの回収後、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質を該ポリペプチ ドから分離する請求項１に記載の方法。 １１．該細菌細胞をＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異 種ポリペプチドをコードする核酸を含む１つまたは２つの発現ベクターで形質転 換する請求項１に記載の方法。 １２．該細菌細胞をＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異 種ポリペプチドをコードする核酸を各々含む２つのベクターで形質転換する請求 項１１に記載の方法。 １３．ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異種ポリペプチ ドをコードする核酸を、該細菌細胞を形質転換する１つのベクターに含む請求項 １１に記載の方法。 １４．ＤsbＡまたはＤsbＣをコードする核酸の発現の誘発を培養培地にインデュ ーサーを添加することによって行う請求項１に記載の方法。 １５．該インデューサーがＩＰＴＧ、ラクトースまたはＬ−アラビノースである 請求項１４に記載の方法。 １６．該培養がグルタチオンの不在下で行われる請求項１に記載の方法。 １７．総ポリペプチドの収率が該方法の結果として増加し、可溶性ポリペプチド の収率が変化しないかまたは減少する請求項１に記載の方法。 １８．該培養を熱ショック転写因子をコードする核酸の発現レベルが該核酸の発 現の内在レベルを越えて増強しないで行う請求項１に記載の方法。