JP2661894B2 - 細菌株及びプラスミド - Google Patents
細菌株及びプラスミドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、当該たんぱく質の
前駆体をコードするＤＮＡ配列体を当該細菌に導入し
て、特定の型の突然変異を担う（Ｃａｒｒｙ）グラム陰
性菌を培養することによって、たんぱく質を得ることを
可能にする微生物学的方法に用いる細菌株及びプラスミ
ドに関する。 【０００２】本発明は、多くの技術分野で適用でき、特
に有効成分がたんぱく質である医薬の製造に適用でき
る。 【０００３】 【従来の技術】多数のたんぱく質は、翻訳後の成熟を受
けた後にのみ、生物学的活性を獲得することが知られて
いる。細胞質中で前駆体の形で生合成され、それから細
胞質から運び出されるたんぱく質の場合には、この成熟
の第１段階は、シグナルペプチドと称されるＮ未端をこ
の前駆体から酵素的に除去することであることが多い。
前駆体の形で生合成されたこの型のたんぱく質は、原核
生物と真核生物の両方について知られている。このよう
なたんぱく質として特に言及できるものには、例えば、
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の種など
により産生されるβ−ラクタマーゼ ＴＥＭ−１とアル
カリ性 ホスファターゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の種により産生さ
れるプロティンＡ、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の種な
どにより産生されるα−アミラーゼ（これらは原核生物
由来のたんぱく質である）、また、ヒト成長ホルモン、
ヒトインシュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、
上皮成長因子（これらは真核細胞により産生されるたん
ぱく質である）などがある。 【０００４】更に、当該たんぱく質を製造するために、
天然のたんぱく質前駆体をコードするＤＮＡ配列体を担
うプラスミドを用いて形質転換したグラム陰性菌を、使
用できることが知られている（Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２（１９８
４）１６１−１６５；Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ ３９（１９８５）２４７−２５４）。
この場合には、細胞機構によって次の過程が確実に行わ
れる。細胞質区画で、ＤＮＡ配列体が転写され、それか
ら対応するメッセンジャーＲＮＡが翻訳される。このよ
うにして生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って移
動する間または移動の後、酵素開裂または分解、シグナ
ルペプチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない前
駆体に対応するたんぱく質は、細菌のペリプラズムに蓄
積される。ここからこのたんぱく質を得ることができ
る。 【０００５】上記のＤＮＡ配列体が、シグナルペプチド
に関して、天然の前駆体（つまり、通常の産生を行う細
胞で合成される形）と異なる前駆体をコードする場合に
も、類似する結果が得られている。例えば、真核生物由
来のたんぱく質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペ
プチドが結合した前駆体が合成された（Ｋ．Ｔａｌｍａ
ｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７（１９８０）３９８８−３９
９２；Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３
９（１９８５）２４７−２５４）。 【０００６】また、細菌に、オペロンの発現を制限する
または、抑制さえも行う突然変異を起こせることが知ら
れている。このオペロンの転写は、アデノシン３′，
５′−環状リン酸（ｃＡＭＰ）がＣＲＰ（環状ＡＭＰレ
セプタたんぱく質）（これはＣＡＰ（カタボライト活性
化たんぱく質）とも称される）と会合して生じるｃＡＭ
Ｐ−ＣＲＰ複合体が、このオペロンの調節要素へ固定さ
れた後にのみ開始されるような転写である。これらのオ
ペロンの機能に関しては、「オペロン」（ＴｈｅＯｐｅ
ｒｏｎ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｓ．Ｒｅ
ｚｎｉｋｏｆｆ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０）中の「Ｌａｃプ
ロモータ」（Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ
Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ）の章に説明されている。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】そのような生合成能が
減少した細菌（阻害されたオペロンは、多くの酵素の合
成を支配するので）が、始めから、たんぱく質工業生産
用の好ましい宿主を形成できないことは明らかであっ
た。 【０００８】グレイらによる１９８４年と１９８５年の
報告（上記）には、当該たんぱく質の前駆体をコードす
るＤＮＡ配列体を導入した細菌を培養することによっ
て、たんぱく質を製造するこれまでの研究が、調節要素
（特にプロモータ）を特に選択することによりプラスミ
ド構造の効率を高めることに向けられていたことが示さ
れている。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者は細菌宿主に関
心を払い、別の方向の研究を行った。驚くべきことに、
転写がｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定に依存するオペロ
ンの発現を制限するまたは抑制さえも行う少なくとも１
つの突然変異を担うクロモソームを有するグラム陰性菌
が、前駆体の形で生合成されるたんぱく質の工業生産の
ための好ましい宿主を構成することが見出された。 【００１０】第１の特徴によれば、本発明は、当該たん
ぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体を導入したグ
ラム陰性菌を培養することによって、たんぱく質を生産
する微生物学的方法に関する。この方法は、転写がｃＡ
ＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定に依存するオペロンの発現を
制限するまたは抑制さえも行う少なくとも１つの突然変
異を担うクロモソームを有する細菌種の使用を包含す
る。 【００１１】この突然変異は、ｃＡＭＰの細胞内濃度を
減少する傾向があるもの；機能形のＣＲＰ合成を制限ま
たは抑制するもの；突然変異形のＣＲＰの合成を導き、
ＤＮＡへの固定が妨げられるまたは比較的に効率が落ち
るようなｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の形成を起こすもの；
および、当該複合体の固定が妨げられるまたは比較的に
効率が落ちるような仕方に、ＤＮＡに対するｃＡＭＰ−
ＣＲＰ複合体の固定の部位を修飾するものである。これ
らは、発現が温度などのパラメータに依存する条件突然
変異であってよい。 【００１２】これらの突然変異の中で、クロモソーム遺
伝子ｃｙａ自身またはその発現を調節するＤＮＡ配列体
に、この遺伝子がコードするアデニル酸シクラーゼが合
成されないか、またはその特異的な活性、すなわちアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）のｃＡＭＰへの変換を行うこ
とができない形で合成するように影響を及ぼす突然変異
が、特に特徴づけられる。クロモソーム遺伝子ｃｒｐ自
身またはその発現を調節するＤＮＡ配列体に、この遺伝
子がコードするＣＲＰが合成されないか、またはＤＮＡ
への効率的な固定を可能にする十分に安定なｃＡＭＰ−
ＣＲＰ複合体が形成されないような突然変異形で合成す
るように影響を及ぼす突然変異も、同様である。便宜
上、これらの突然変異をここではｃｙａ突然変異および
ｃｒｐ突然変異と称する。 【００１３】ｃｙａおよびｃｒｐ突然変異は任意の種類
のものでよいが、特に可能なものは、置換による突然変
異、挿入による突然変異、変換による突然変異、または
例えば欠失による突然変異である。突然変異は、一対の
ヌクレオチドのみに影響を与えるものであってよいが、
この型の点突然変異は可逆的なので、幾対かのヌクレオ
チドに同時に影響を与える不可逆的突然変異が好まし
い。多重点突然変異が更に可能性がある。ｃｙａ突然変
異の場合には、ｃＡＭＰは合成されず、ｃＡＭＰ−ＣＲ
Ｐ複合体の形成は起き得ない。外来性ｃＡＭＰの添加に
よって、この合成の欠如を克服し、乱された細胞機能を
回復することが可能となる。ｃｒｐ突然変異の場合に
は、ＣＲＰはもはや機能形では合成されず、同様に、ｃ
ＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の形成は起き得ない。ここでは、
外来性ｃＡＭＰの添加は、乱された細胞機能の回復には
無力である。 【００１４】本発明は、ｃｙａ遺伝子およびその発明を
調節するＤＮＡ配列体により形成される系、またはｃｒ
ｐ遺伝子およびその発現を調節するＤＮＡ配列体により
形成される系、またはその両方の系に影響を及ぼす少な
くとも１つの突然変異を担うクロモソームを有する細菌
株を使用する上に定めた微生物学的方法に、有利に関連
している。 【００１５】本発明では、ｃＡＭＰが、種々のオペロン
の発現の制御を行うＣＲＰとカップリングしている任意
のグラム陰性菌の種に属する細菌株を使用できる。この
型の細菌株は、多くのバクテリオファージの作用に対し
て驚く程に耐性なので、工業生産での使用は一層有利と
なる（Ｓｕｓｈｉｌ Ｋｕｍａｒ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１２
５（１９７６）５４５−５５５）。好ましい細菌の種は
大腸菌である。 【００１６】他の特徴によれば、本発明は、使用する突
然変異細菌株が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学
的方法に関する。 【００１７】本発明者は特に、１９８６年２月１７日に
国立微生物寄託機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．），Ｐａｒ
ｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に寄託した大腸菌の２つの突然
変異菌株を選択した。菌株の１つは点ｃｒｐ突然変異を
担い（寄託番号Ｉ−５２８）、他の菌株は欠失による非
点ｃｙａ突然変異を担う（寄託番号Ｉ−５２９）。 【００１８】本発明は、好ましくは、突然変異菌株が、
寄託番号Ｉ−５２８およびＩ−５２９としてＣ．Ｎ．
Ｃ．Ｍ．に寄託された菌株の一方または他方の特性を有
する上記の微生物学的方法に関する。 【００１９】本発明の方法によって、多くのたんぱく質
を得ることが可能となる。製造を望むたんぱく質が、前
駆体の形で天然に生合成されるか否かはほとんど重要で
ないことを理解する必要がある。また、この方法は非天
然のたんぱく質の製造にも適している。例えば、１次構
造を２つまたはそれ以上の既知のたんぱく質から選択し
たハイブリッドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、
この方法は、Ｎ未端にシグナルペプチドとして挙動する
ペプチドが結合した上記のたんぱく質をコードするＤＮ
Ａ配列体の製造を満足する。 【００２０】本発明による方法は、ヒト成長ホルモン
（以後、ｈＧＨと称する）の製造に対して特に有利であ
る。 【００２１】図１は、ｈＧＨが合成される下垂体細胞か
ら単離された天然ｈＧＨ前駆体の１つをコードするＤＮ
Ａ配列体、および、この前駆体のアミノ酸配列体を示し
ている。最初の２６のアミノ酸（図中の−２６位のアミ
ノ酸から数える）がシグナルペプチドを構成し、他の１
９１のアミノ酸（ここでは１から１９１までの番号を付
ける）は実際のｈＧＨ（以後、「成熟ｈＧＨ」と称す
る）のアミノ酸である。 【００２２】次の表１に図１中で使用したアミノ酸の略
語を説明する。 【００２３】表１ アミノ酸 略語 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リジン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ 図１に示したＤＮＡ配列体のコドンでは、通常の意味で
Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇを使用している。これらはそれぞれ、ア
デニン、シトシン、チミン、グアニンの塩基を示す。 【００２４】本発明を実施するためには、突然変異細菌
が、所望のたんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列
体を含むことが必要である。「前駆体」の語は、それが
存在する場合は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグ
ナルペプチドを修飾して得られた上記の天然前駆体の任
意の誘導体を、更に、シグナルペプチドとして挙動でき
るペプチドが上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体
を意味するものとして理解される。前駆体は特に、既知
の原核および真核生物のシグナルペプチドまたはその誘
導体を包含する群から選択できる。 【００２５】上記たんぱく質の前駆体をコードするＤＮ
Ａ配列体を、プラスミドなどの複製可能な発現ベクター
により細菌に導入できる。上記配列体の発現に必要な調
節要素（特に、プロモータ）が、その機能を行うために
その配列体の付近に位置することが必要であることは明
白である。 【００２６】例えば、使用する細菌株内で複製できるこ
とを条件として、従来技術（Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３９（１９８５）２４７−２５４）
に説明されているプラスミドを使用できる。これらのプ
ラスミドの選択に関しては、使用する構造体内で、所望
のたんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体が誘導
可能である必要はないことが示された。上記の配列体が
幾つかの複写として存在することも重要である。 【００２７】本発明者は、実際に、細菌細胞内での複製
の後、細胞当り５０ないし３００の比率で複写が存在
し、それぞれの複写が所望のたんぱく質の前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列体の複写を担うことができる幾つかの
プラスミドを構築し、選択した。これらのプラスミドの
１つによって形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１株を、
１９８６年２月１７日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託した。
この菌株は寄託番号Ｉ−５３０である。便宜上、以後の
説明では、寄託番号Ｉ−５３０としてＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．
に寄託されたこのプラスミドを参照する。このプラスミ
ド（以後、内部参照によりｐ１６３，１とも称する）
は、ｈＧＨの天然の前駆体の１つをコードするＤＮＡ配
列体を担う。図１に示すこの配列体は、ヒト下垂体細胞
で合成された前駆体の１つから決定された配列体と同一
である。これを、１）５′未端から始まり、ＲＮＡポリ
メラーゼ認識部位（−３５位に位置するそのヌクレオチ
ドの中央の部位、文献（Ｍ．Ｔａｋａｎａｍｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６０（１９７６）２９７−３
０２）に定められている）を含むトリプトファン プロ
モーターの断片、および、２）ＲＮＡポリメラーゼ認識
部位（−３５位に位置するそのヌクレオチドの中央の部
位）と、固定部位（−１０位に位置するそのヌクレオチ
ドの中央の部位、文献（Ｄ．Ｐｒｉｂｎｏｗ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２（１９７
５）７８４−７８９）に定められている）とを分離して
いる領域と５′未端との間の部分を除いたプロモーター
オペレータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ）ラ
クトース ＵＶ５が結合したハイブリッド プロモータ
ーオペレータの制御下に置いた。 【００２８】図２に、上記のプラスミドについて、主要
なＤＮＡ配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。 【００２９】 【表１】【００３０】この地図は、また、一定の制限酵素、つま
り、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII 、ＰｓｔＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、およびＰｖｕＩの酵素の作用部
位を示している。 【００３１】プラスミドｐ１６３，１中に突然変異ＵＶ
５（「オペロン」中の「Ｌａｃプロモータ」の章（前記
参照）に説明されている）が存在するために、ｈＧＨ前
駆体をコードするＤＮＡ配列体の発現が、ｃＡＭＰおよ
ひＣＲＰの併合作用に不感受性となる。このプラスミド
は、その一般的特性を仮定して、天然のｈＧＨ前駆体の
１つをコードするＤＮＡ配列体を、他の前駆体特に他の
たんぱく質の前駆体をコードする配列体に置換すること
によって、他のプラスミドを構築するために使用でき
る。 【００３２】他の特徴によれば、本発明は、所望のたん
ぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体が、その発現
を可能にする調節要素と共に、プラスミドに担われる上
記の微生物学的方法に関する。特に、上記のＤＮＡ配列
体が、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された寄託番号Ｉ−５３
０のプラスミドの一般的特性を有するプラスミドによっ
て担われる上記の微生物学的方法に関する。 【００３３】他の特徴によれば、本発明は、上記細菌株
が、ｈＧＨ前駆体をコードするＤＮＡ配列体を含有する
上記の微生物学的方法に関する。 【００３４】他の特徴によれば、本発明は、寄託番号Ｉ
−５２８およびＩ−５２９としてＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄
託された細菌株に関する。 【００３５】更に他の特徴によれば、本発明は、寄託番
号Ｉ−５３０としてＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託されたプラ
スミドに関する。 【００３６】次に、具体例を用いて本発明を説明する。
当然、本発明は、これらの例で説明されている本発明の
方法の適用には制限されない。本発明には、特許請求の
範囲によって定められる範囲の変法の全てが含まれる。 【００３７】 【実施例】例 Ｉ．使用する細菌およびプラスミド ４つの細菌株および４つのプラスミドを使用した。 【００３８】これらの例では、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託
した寄託番号Ｉ−５２８およびＩ−５２９の菌株とは別
に、他に次の２つの大腸菌の菌株に言及する。 【００３９】・欠失による非点ｃｙａ突然変異および欠
失による非点ｃｒｐ突然変異の両方を担う菌株。以後、
内部参照によりＡと称する。Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉ−５２
９株はこの菌株から誘導される。 【００４０】・ｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定後にのみ
転写が開始されるオペロンの発現を、制限または抑制で
きる突然変異を担わない菌株。ＭＣ１０６１（大腸菌、
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ−Ｈ
ａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）として知
られている。以後、内部参照によりＴと称する。Ｃ．
Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉ−５２８株はこの菌株から誘導される。 【００４１】これらの例では、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託
した寄託番号Ｉ−５３０のプラスミドとは別に、他に３
つのプラスミドに言及する。これらは内部参照により、
ｐ１６４，１、ｐ２００，３、ｐ２１２，６と称する。 【００４２】プラスミドｐ１６４，１はプラスミドｐ１
６３，１と非常に類似しており、本質的な相違は突然変
異ＵＶ５が存在しないことである。 【００４３】プラスミドｐ２１２，６はプラスミドｐ１
６３，１と類似している。図３に、これについて、主要
なＤＮＡ配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。 【００４４】 【表２】 【００４５】図２に示したプラスミドｐ１６３，１と同
様に、一定の制限酵素の作用部位を図３に示す。 【００４６】プラスミドｐ２００，３はプラスミドｐ２
１２，６と等価であり、ｈＧＨ前駆体をコードするＤＮ
Ａ配列体の発現に関する非抑制特性のために選択した。 【００４７】天然のｈＧＨ前駆体の１つをコードし、プ
ラスミドｐ２１２，６およびｐ２００，３により担われ
るＤＮＡ配列体は、図１に示す配列体と、２つの置換に
おいて異なっている。つまり、コドンＡＣＣは、−２４
位に位置するアミノ酸をコードするコドンＡＣＡに置換
され、同様に、コドンＴＣＴは、−２２位に位置するア
ミノ酸をコードするコドンＴＣＣに置換された。 【００４８】II．一般的方法論 行なった実験は、問題の宿主ベクター対を予め調製し(
§２．１参照）、宿主がｈＧＨ前駆体をコードするＤＮ
Ａ配列体を発現できるような条件下に培養し（§２．２
参照）、必要ならば発現を誘導（§２．３参照）するこ
とと、細胞周辺腔に含まれるたんぱく質を採取すること
と（§２．４参照）、ペリプラズムｈＧＨを同定するこ
と（§２．５参照）とからなる。 【００４９】２．１．宿主ベクター対の調製 当業者に知られており、特に以下の著書に記載されてい
る細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。 【００５０】・「分子クローニング（実験室マニア
ル）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２） ・「分子遺伝学の実験」（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉ
ｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊ．Ｈ．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７２） ２．２．培養 ａ）接種 固体培地（ＬＢ培地＋寒天）で得られた分離コロニー
を、以下の特性を有し、かつ１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを添加した５ｍｌの培地（ＬＢ培地）中に懸濁さ
せる。即ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、カゼイ
ンのパンクレアチンによる 加水分解物（ＤＩＦＣＯからのバクトトリプトン） １０ｇ 酵母抽出物 ５ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ 蒸溜水添加 １ｌ であり、 ・加圧滅菌前にｐＨを７．３に調節した。 【００５１】ｂ）一次インキュベーション ３７℃、１８時間で培養菌が定常的な成長相に達する。 【００５２】ｃ）希釈 ６００ｎｍにおける読み（分光光度計 Ｂａｕｓｃｈ−
Ｌｏｍｂ ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ２０）での光学密
度、即ちＯＤ６００ｎｍが約０．０５になるように、細
菌懸濁液をＬＢ培地中で希釈する。 【００５３】ｄ）二次インキュベーション ２．２．ｃに従って得られた細菌懸濁液５０ｍｌを、Ｏ
Ｄ６００ｎｍが約０．２になるまで３７℃でインキュベ
ーションした。 【００５４】２．３．誘導 ２．２．ｄに従って得られた細菌懸濁液中に、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトース（ＩＰＴＧ）をその最
終濃度が１ｍＭになる量だけ添加する。ここで、ＩＰＴ
Ｇはリプレッサー（通常はラクトース オペレータに結
合する）の作用を中和することによって、ｈＧＨ前駆体
の合成を開始し、かつ維持するために用いる。 【００５５】２．４．浸透圧ショック （文献（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４１（１９６６）３
０５５−３０６２）において、Ｎ．Ｇ．Ｎｏｓｓａｌお
よびＬ．Ａ．Ｈｅｐｐｅｌが発表したプロトコールを参
照してもよい。） ａ）細菌懸濁液の調製 ２．２．ｄ（誘導が必要とされない場合）のようにして
得られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られた懸
濁液の試料を採取し、ＯＤ６００ｎｍが約１０になるよ
うにこれを処理（６０００ｇで５分間遠心分離、上澄み
を除去、細菌をＬＢ培地中に再度懸濁）する。 【００５６】ｂ）洗浄 ２．４．ａで得られた懸濁液を６０００ｇで５分間遠心
分離する。 【００５７】一定容量の残渣を、次の組成を有する溶液
Ａ中に採取する。即ち、溶液Ａは蒸溜水に下記のものを
添加することによって調製されたｐＨ＝７の緩衝液であ
る。 【００５８】・トリ（ヒドロキシメチル）アミノエタン
−ＨＣｌ、即ち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 最終濃度が３０ｍＭのように添加する。 【００５９】・エチレンジアミン四酢酸、即ち、ＥＤＴ
Ａ 最終濃度が１ｍＭになるように添加する。 【００６０】ｃ）スクロースの作用 ２．４．ｂで得られた懸濁液を６０００ｇで５分間遠心
分離する。 【００６１】溶液Ａに対応する組成を有し、かつ、１５
ｇ／１００ｍｌのスクロースを添加した溶液Ｂ中に、残
渣の一定量を注意深く採取し、直ちに用いる。 【００６２】その懸濁液を２０℃で１０分間放置する。 【００６３】それから、６０００ｇで５分間遠心分離す
る。 【００６４】遠心管を氷水中に静置する。 【００６５】上澄みを注意深く除去し、氷水温度に保た
れた脱イオン水中に再度静置する（一定容量で）。 【００６６】この方法で調製された懸濁液（ＯＤ６００
ｎｍは約１０）を０℃で５分間放置する。 【００６７】ｄ）細胞周辺腔に存在するたんぱく質の採
集 ２．４．ｃで得られた懸濁液を、１８，０００ｇで１０
分間遠心分離する。 【００６８】上澄みを集める。これには細胞周辺腔に存
在するたんぱく質が含まれる。 【００６９】２．５．ペリプラズムｈＧＨの同定 ａ）方法論 ２．４．ｄで得られた上澄みを、ヒト成長ホルモンのラ
ジオイムノアッセイにかける（ＣＯＡＴＲＩＡR 125 Ｉ
−ｈＧＨ ｋｉｔ−Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃ
ｅ）。 【００７０】この同定は、次の操作を連続して行なうこ
とからなる。 【００７１】・ヨウ素１２５で標識されたｈＧＨを予め
定められた量だけ導入し、予め定められた量の第一の抗
−ｈＧＨ抗体を目当てとして、同定されるべき分析試料
中に含まれるｈＧＨとの間で競合させる反応。 【００７２】・第一の抗体を前記第一の抗体に対する第
二の抗体に結合させ、固体物質に固定する反応。 【００７３】インキュベーション後には、ヨウ素１２５
で標識したｈＧＨの比率は、分析試料中のｈＧＨの量に
逆比例する。 【００７４】２．６．ペリプラズムｈＧＨの特性チェッ
ク １）方法論 ２．４．ｄで得られた上澄みから採集したｈＧＨの性質
をチェックした。 【００７５】これは、次の操作を連続して行なうことに
より実施した。 【００７６】・上澄み中に含まれる異なったたんぱく質
の、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による分離
（文献（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ ２２
７（１９７０）６８０−６８５）中にＬａｅｍｍｌｉに
より記載されたプロトコールによる）。 【００７７】この方法では、成熟形のｈＧＨおよびｈＧ
Ｈ前駆体が、それぞれの見かけの分子量に応じて２つの
異なった点に移動する。 【００７８】・ゲル中に含まれる前記たんぱく質の、ニ
トロセルロースフィルター上への移動（文献（Ｈ．Ｔｏ
ｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６（１９７９）４３５０−４３
５４）の技術に従う）。 【００７９】・バーネットの技術（Ｗ．Ｗ．Ｂｕｒｎｅ
ｔｔｅ，ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２（１９８
１）１９５−２０３）に従って行なわれる免疫検出。こ
れには次のような連続的工程が含まれる。 【００８０】・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ａ
（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ，ＮａＣｌ １７０ｍ
Ｍ，ＫＩ １ｍＭ）で１０分間濯ぐ。 【００８１】・ニトロセルロースフィルターを、３７℃
で３０分間、緩衝液Ｂ（３ｇ／１００ｍｌの割合で牛血
清アルブミンを添加した緩衝液Ａ）に接触させる。 【００８２】・ニトロセルロースフィルターを、２０℃
で１８時間、免疫血清（成熟ｈＧＨおよびその前駆体を
認識する多クローン性抗体）に接触させる。 【００８３】・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ｂ
で濯ぐ。 【００８４】・ニトロセルロースフィルターを、２０℃
で６時間、１ｍｌ当り０．１マイクロキュリーのヨウ素
１２５で標識されたプロテインＡの溶液と接触させる。 【００８５】・フィルターを緩衝液Ａで濯ぐ。 【００８６】・フィルターを２枚の吸収性シートの間で
乾燥する。 【００８７】・Ｘ線フィルターに接触させる。 【００８８】・フィルムを現像する。 【００８９】２）結果 処理条件を選択することによって、使用する細菌株およ
びプラスミドと関係なく、ペリプラズムｈＧＨは分子の
約９８％が成熟形で存在することに注目すべきである。 【００９０】III ．結果 ３．１．例Ａ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ２１２，６と、大
腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株／ｐ２１２，６によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比較。 【００９１】これらの結果は、突然変異株（ＣＮＣＭ
Ｉ−５２８株）の方が、非突然変異株（Ｔ株）よりも２
倍以上高い効率で、ペリプラズムｈＧＨを生産できるこ
とを示している。 【００９２】３．２．例Ｂ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ１６３，１と、大
腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株／ｐ１６３，１と、大腸菌
Ｔ株／ｐ１６４，１と、大腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株
／ｐ１６４，１によってそれぞれ生産されたペリプラズ
ムｈＧＨのレベルの比較。 【００９３】誘導時間を３時間とし、浸透圧ショックお
よび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した
上澄み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。 【００９４】 ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りｎｇ数） ｐ１６３，１ ｐ１６４，１ Ｔ株 ５．８ ６．４ ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株 ７．８ １０．８ 誘導時間を３時間３０分とし、浸透圧ショックおよび濁
度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した上澄み
１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定したとこ
ろ、次の結果が得られた。 【００９５】 ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りμｇ数） Ｔ株／ｐ２１２，６ ０．８６ ＣＮＣＭ ２．００ Ｉ−５２８株／ｐ２１２，６ ｈＧＨ前駆体をコードするＤＮＡ配列体が、その発現に
関して、シグナルの制御下においてｃＡＭＰおよびＣＲ
Ｐの併合作用に感受性であると考えられるか否かにかか
わらず、突然変異株（ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株）は著し
く増大した量のペリプラズムｈＧＨを生産できると考え
られる（一例では約３０％の増加、他の例では７０％の
増加）。 【００９６】３．３．例Ｃ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ２２０，３と、大
腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株／ｐ２００，３によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比較。 【００９７】実験は誘導なしで行なった。浸透圧ショッ
クおよび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取
した上澄み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定
したところ、次の結果が得られた。 【００９８】 ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りｎｇ数） Ｔ株／ｐ２００，３ ２００ ＣＮＣＭ ５１２ Ｉ−５２８株／ｐ２００，３ 突然変異株（ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株）は、非突然変異
株（Ｔ株）よりも２倍以上高い効率で、ペリプラズムｈ
ＧＨを生産できると考えられる。 【００９９】この実験は、前駆体の合成が誘導可能であ
るか否かにかかわらず、得られる効果が同じオーダーで
あることを示している。 【０１００】３．４．例Ｄ 宿主ベクター対である大腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２９株／
ｐ２１２，６によって、ｃＡＭＰの存在下または非存在
下でそれぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの
比較。 【０１０１】誘導時間を３０分〜１２０分の間で変化さ
せたところ、次の結果が得られた。これらの結果は、い
ずれも浸透圧ショックおよび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１
に調節した後に、採取した上澄み１ｍｌ当りの成熟ペリ
プラズムｈＧＨの量（μｇ）を測定したものである。 【０１０２】 成熟ｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りμｇ数） ｃＡＭＰ非存在 ｃＡＭＰ存在 表現型［ｃｙａ- ］ 表現型［ｃｙａ+ ］＊ ３０分後 ０．１５３ ０．１００ ６０分後 ０．６７０ ０．２４３ １２０分後 １．６５０ ０．９７５ ＊ＣＡＭＰの存在下ではｃｙａ変異の効果は発現せず、菌株は野生型［ｃｙａ+ ］を有している。 【０１０３】：それは、ｃｙａ特性に関する変異を受け
ていない菌株の特徴を有している。 【０１０４】突然変異株（ＣＮＣＭ Ｉ−５２９株）
は、処理条件の選択下でｃｙａ変異の発現においてのみ
異なる親株よりも高い効率で、ペリプラズムｈＧＨを生
産できると考えられる。 【０１０５】３．５．例Ｅ 与えられた宿主ベクター対によって生産されるペリプラ
ズムｈＧＨレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。 【０１０６】この実験は誘導時間３時間で行ない、次の
結果が得られた。 【０１０７】 【表３】【０１０８】ペリプラズムｈＧＨの値は、浸透圧ショッ
クおよび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取
した上澄み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨのμｇ数で
表した。 【０１０９】全ペリプラズムたんぱく質はブラッドフォ
ードの方法（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７２（１９７
６）２４８−２６４）で測定し、浸透圧ショックおよび
濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した上澄
み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨのｍｇ数で表した。 【０１１０】この実験は、細胞周辺腔内に存在するたん
ぱく質レベルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプ
ラズム酵素の生産が、野生型菌株の存在により得られた
値およびクロモソームがｃｙａ変異（外因性ｃＡＭＰ添
加のないＣＮＣＭ Ｉ−５２９株）またはｃｒｐ変異
（外因性ｃＡＭＰ添加のあるＡ株）を有する菌株の存在
下での実質的な量に比較して、減少することを示してい
る。同時に、突然変異の一方または他方が発現すると
き、ペリプラズムｇＨＧの生産は大幅に増大する。 【０１１１】３．６．例Ｆ ｃＡＭＰの非存在下に、宿主ベクター対であるＡ株／ｐ
２１２，６とＩ−５２９株／ｐ２１２，６によってそれ
ぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比較。 【０１１２】誘導時間を２時間とし、浸透圧ショックお
よび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した
上澄み１ｍｌ当りの成熟したペリプラズムｈＧＨの量
（μｇ）を測定したところ、次の結果が得られた。 【０１１３】 成熟ｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りμｇ数） Ｔ株／ｐ２１２，６ ２．０８ ＣＮＣＭ ２．０７ Ｉ−５２９株／ｐ２１２，６ クロモソームがｃｙａ欠失変異およびｃｒｐ欠失変異を
有するＡ株と、クロモソームが同様のｃｙａ欠失変異を
有するＩ−５２９株は、同一の挙動をすると考えられ
る。 【０１１４】これらの例は、ｃＡＭＰ−ＣＭＰ複合体の
固定後にのみ転写が開始され得るオペロンの発現を制限
しまたは抑制する変異をもった菌株を使用することによ
って、明白な利点がもたらされることを示している。：
事実、これらの菌株は所望のペリプラズムたんぱく質の
生産を実質的に増大（これらの例では、成熟形でのたん
ぱく質について９８％）させることが可能である。例Ｅ
では、このような細菌の使用によって与えられる絶対的
な一次的利点（ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ｆｉｒｓｔ−ｒ
ａｔｅ ａｄｖａｎｔａｇｅ）が強調される。：変異株
は細胞周辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生産
を制限するから、観察される増大は絶対的なだけでな
く、相対的である。；これは、目標とするたんぱく質の
細胞周辺腔の内容物からの精製を容易にする。
前駆体をコードするＤＮＡ配列体を当該細菌に導入し
て、特定の型の突然変異を担う（Ｃａｒｒｙ）グラム陰
性菌を培養することによって、たんぱく質を得ることを
可能にする微生物学的方法に用いる細菌株及びプラスミ
ドに関する。 【０００２】本発明は、多くの技術分野で適用でき、特
に有効成分がたんぱく質である医薬の製造に適用でき
る。 【０００３】 【従来の技術】多数のたんぱく質は、翻訳後の成熟を受
けた後にのみ、生物学的活性を獲得することが知られて
いる。細胞質中で前駆体の形で生合成され、それから細
胞質から運び出されるたんぱく質の場合には、この成熟
の第１段階は、シグナルペプチドと称されるＮ未端をこ
の前駆体から酵素的に除去することであることが多い。
前駆体の形で生合成されたこの型のたんぱく質は、原核
生物と真核生物の両方について知られている。このよう
なたんぱく質として特に言及できるものには、例えば、
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の種など
により産生されるβ−ラクタマーゼ ＴＥＭ−１とアル
カリ性 ホスファターゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の種により産生さ
れるプロティンＡ、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の種な
どにより産生されるα−アミラーゼ（これらは原核生物
由来のたんぱく質である）、また、ヒト成長ホルモン、
ヒトインシュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、
上皮成長因子（これらは真核細胞により産生されるたん
ぱく質である）などがある。 【０００４】更に、当該たんぱく質を製造するために、
天然のたんぱく質前駆体をコードするＤＮＡ配列体を担
うプラスミドを用いて形質転換したグラム陰性菌を、使
用できることが知られている（Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２（１９８
４）１６１−１６５；Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ ３９（１９８５）２４７−２５４）。
この場合には、細胞機構によって次の過程が確実に行わ
れる。細胞質区画で、ＤＮＡ配列体が転写され、それか
ら対応するメッセンジャーＲＮＡが翻訳される。このよ
うにして生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って移
動する間または移動の後、酵素開裂または分解、シグナ
ルペプチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない前
駆体に対応するたんぱく質は、細菌のペリプラズムに蓄
積される。ここからこのたんぱく質を得ることができ
る。 【０００５】上記のＤＮＡ配列体が、シグナルペプチド
に関して、天然の前駆体（つまり、通常の産生を行う細
胞で合成される形）と異なる前駆体をコードする場合に
も、類似する結果が得られている。例えば、真核生物由
来のたんぱく質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペ
プチドが結合した前駆体が合成された（Ｋ．Ｔａｌｍａ
ｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７（１９８０）３９８８−３９
９２；Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３
９（１９８５）２４７−２５４）。 【０００６】また、細菌に、オペロンの発現を制限する
または、抑制さえも行う突然変異を起こせることが知ら
れている。このオペロンの転写は、アデノシン３′，
５′−環状リン酸（ｃＡＭＰ）がＣＲＰ（環状ＡＭＰレ
セプタたんぱく質）（これはＣＡＰ（カタボライト活性
化たんぱく質）とも称される）と会合して生じるｃＡＭ
Ｐ−ＣＲＰ複合体が、このオペロンの調節要素へ固定さ
れた後にのみ開始されるような転写である。これらのオ
ペロンの機能に関しては、「オペロン」（ＴｈｅＯｐｅ
ｒｏｎ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｓ．Ｒｅ
ｚｎｉｋｏｆｆ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０）中の「Ｌａｃプ
ロモータ」（Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ
Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ）の章に説明されている。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】そのような生合成能が
減少した細菌（阻害されたオペロンは、多くの酵素の合
成を支配するので）が、始めから、たんぱく質工業生産
用の好ましい宿主を形成できないことは明らかであっ
た。 【０００８】グレイらによる１９８４年と１９８５年の
報告（上記）には、当該たんぱく質の前駆体をコードす
るＤＮＡ配列体を導入した細菌を培養することによっ
て、たんぱく質を製造するこれまでの研究が、調節要素
（特にプロモータ）を特に選択することによりプラスミ
ド構造の効率を高めることに向けられていたことが示さ
れている。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者は細菌宿主に関
心を払い、別の方向の研究を行った。驚くべきことに、
転写がｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定に依存するオペロ
ンの発現を制限するまたは抑制さえも行う少なくとも１
つの突然変異を担うクロモソームを有するグラム陰性菌
が、前駆体の形で生合成されるたんぱく質の工業生産の
ための好ましい宿主を構成することが見出された。 【００１０】第１の特徴によれば、本発明は、当該たん
ぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体を導入したグ
ラム陰性菌を培養することによって、たんぱく質を生産
する微生物学的方法に関する。この方法は、転写がｃＡ
ＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定に依存するオペロンの発現を
制限するまたは抑制さえも行う少なくとも１つの突然変
異を担うクロモソームを有する細菌種の使用を包含す
る。 【００１１】この突然変異は、ｃＡＭＰの細胞内濃度を
減少する傾向があるもの；機能形のＣＲＰ合成を制限ま
たは抑制するもの；突然変異形のＣＲＰの合成を導き、
ＤＮＡへの固定が妨げられるまたは比較的に効率が落ち
るようなｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の形成を起こすもの；
および、当該複合体の固定が妨げられるまたは比較的に
効率が落ちるような仕方に、ＤＮＡに対するｃＡＭＰ−
ＣＲＰ複合体の固定の部位を修飾するものである。これ
らは、発現が温度などのパラメータに依存する条件突然
変異であってよい。 【００１２】これらの突然変異の中で、クロモソーム遺
伝子ｃｙａ自身またはその発現を調節するＤＮＡ配列体
に、この遺伝子がコードするアデニル酸シクラーゼが合
成されないか、またはその特異的な活性、すなわちアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）のｃＡＭＰへの変換を行うこ
とができない形で合成するように影響を及ぼす突然変異
が、特に特徴づけられる。クロモソーム遺伝子ｃｒｐ自
身またはその発現を調節するＤＮＡ配列体に、この遺伝
子がコードするＣＲＰが合成されないか、またはＤＮＡ
への効率的な固定を可能にする十分に安定なｃＡＭＰ−
ＣＲＰ複合体が形成されないような突然変異形で合成す
るように影響を及ぼす突然変異も、同様である。便宜
上、これらの突然変異をここではｃｙａ突然変異および
ｃｒｐ突然変異と称する。 【００１３】ｃｙａおよびｃｒｐ突然変異は任意の種類
のものでよいが、特に可能なものは、置換による突然変
異、挿入による突然変異、変換による突然変異、または
例えば欠失による突然変異である。突然変異は、一対の
ヌクレオチドのみに影響を与えるものであってよいが、
この型の点突然変異は可逆的なので、幾対かのヌクレオ
チドに同時に影響を与える不可逆的突然変異が好まし
い。多重点突然変異が更に可能性がある。ｃｙａ突然変
異の場合には、ｃＡＭＰは合成されず、ｃＡＭＰ−ＣＲ
Ｐ複合体の形成は起き得ない。外来性ｃＡＭＰの添加に
よって、この合成の欠如を克服し、乱された細胞機能を
回復することが可能となる。ｃｒｐ突然変異の場合に
は、ＣＲＰはもはや機能形では合成されず、同様に、ｃ
ＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の形成は起き得ない。ここでは、
外来性ｃＡＭＰの添加は、乱された細胞機能の回復には
無力である。 【００１４】本発明は、ｃｙａ遺伝子およびその発明を
調節するＤＮＡ配列体により形成される系、またはｃｒ
ｐ遺伝子およびその発現を調節するＤＮＡ配列体により
形成される系、またはその両方の系に影響を及ぼす少な
くとも１つの突然変異を担うクロモソームを有する細菌
株を使用する上に定めた微生物学的方法に、有利に関連
している。 【００１５】本発明では、ｃＡＭＰが、種々のオペロン
の発現の制御を行うＣＲＰとカップリングしている任意
のグラム陰性菌の種に属する細菌株を使用できる。この
型の細菌株は、多くのバクテリオファージの作用に対し
て驚く程に耐性なので、工業生産での使用は一層有利と
なる（Ｓｕｓｈｉｌ Ｋｕｍａｒ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１２
５（１９７６）５４５−５５５）。好ましい細菌の種は
大腸菌である。 【００１６】他の特徴によれば、本発明は、使用する突
然変異細菌株が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学
的方法に関する。 【００１７】本発明者は特に、１９８６年２月１７日に
国立微生物寄託機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．），Ｐａｒ
ｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に寄託した大腸菌の２つの突然
変異菌株を選択した。菌株の１つは点ｃｒｐ突然変異を
担い（寄託番号Ｉ−５２８）、他の菌株は欠失による非
点ｃｙａ突然変異を担う（寄託番号Ｉ−５２９）。 【００１８】本発明は、好ましくは、突然変異菌株が、
寄託番号Ｉ−５２８およびＩ−５２９としてＣ．Ｎ．
Ｃ．Ｍ．に寄託された菌株の一方または他方の特性を有
する上記の微生物学的方法に関する。 【００１９】本発明の方法によって、多くのたんぱく質
を得ることが可能となる。製造を望むたんぱく質が、前
駆体の形で天然に生合成されるか否かはほとんど重要で
ないことを理解する必要がある。また、この方法は非天
然のたんぱく質の製造にも適している。例えば、１次構
造を２つまたはそれ以上の既知のたんぱく質から選択し
たハイブリッドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、
この方法は、Ｎ未端にシグナルペプチドとして挙動する
ペプチドが結合した上記のたんぱく質をコードするＤＮ
Ａ配列体の製造を満足する。 【００２０】本発明による方法は、ヒト成長ホルモン
（以後、ｈＧＨと称する）の製造に対して特に有利であ
る。 【００２１】図１は、ｈＧＨが合成される下垂体細胞か
ら単離された天然ｈＧＨ前駆体の１つをコードするＤＮ
Ａ配列体、および、この前駆体のアミノ酸配列体を示し
ている。最初の２６のアミノ酸（図中の−２６位のアミ
ノ酸から数える）がシグナルペプチドを構成し、他の１
９１のアミノ酸（ここでは１から１９１までの番号を付
ける）は実際のｈＧＨ（以後、「成熟ｈＧＨ」と称す
る）のアミノ酸である。 【００２２】次の表１に図１中で使用したアミノ酸の略
語を説明する。 【００２３】表１ アミノ酸 略語 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リジン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ 図１に示したＤＮＡ配列体のコドンでは、通常の意味で
Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇを使用している。これらはそれぞれ、ア
デニン、シトシン、チミン、グアニンの塩基を示す。 【００２４】本発明を実施するためには、突然変異細菌
が、所望のたんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列
体を含むことが必要である。「前駆体」の語は、それが
存在する場合は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグ
ナルペプチドを修飾して得られた上記の天然前駆体の任
意の誘導体を、更に、シグナルペプチドとして挙動でき
るペプチドが上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体
を意味するものとして理解される。前駆体は特に、既知
の原核および真核生物のシグナルペプチドまたはその誘
導体を包含する群から選択できる。 【００２５】上記たんぱく質の前駆体をコードするＤＮ
Ａ配列体を、プラスミドなどの複製可能な発現ベクター
により細菌に導入できる。上記配列体の発現に必要な調
節要素（特に、プロモータ）が、その機能を行うために
その配列体の付近に位置することが必要であることは明
白である。 【００２６】例えば、使用する細菌株内で複製できるこ
とを条件として、従来技術（Ｇ．Ｌ．Ｇｒａｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３９（１９８５）２４７−２５４）
に説明されているプラスミドを使用できる。これらのプ
ラスミドの選択に関しては、使用する構造体内で、所望
のたんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体が誘導
可能である必要はないことが示された。上記の配列体が
幾つかの複写として存在することも重要である。 【００２７】本発明者は、実際に、細菌細胞内での複製
の後、細胞当り５０ないし３００の比率で複写が存在
し、それぞれの複写が所望のたんぱく質の前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列体の複写を担うことができる幾つかの
プラスミドを構築し、選択した。これらのプラスミドの
１つによって形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１株を、
１９８６年２月１７日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託した。
この菌株は寄託番号Ｉ−５３０である。便宜上、以後の
説明では、寄託番号Ｉ−５３０としてＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．
に寄託されたこのプラスミドを参照する。このプラスミ
ド（以後、内部参照によりｐ１６３，１とも称する）
は、ｈＧＨの天然の前駆体の１つをコードするＤＮＡ配
列体を担う。図１に示すこの配列体は、ヒト下垂体細胞
で合成された前駆体の１つから決定された配列体と同一
である。これを、１）５′未端から始まり、ＲＮＡポリ
メラーゼ認識部位（−３５位に位置するそのヌクレオチ
ドの中央の部位、文献（Ｍ．Ｔａｋａｎａｍｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６０（１９７６）２９７−３
０２）に定められている）を含むトリプトファン プロ
モーターの断片、および、２）ＲＮＡポリメラーゼ認識
部位（−３５位に位置するそのヌクレオチドの中央の部
位）と、固定部位（−１０位に位置するそのヌクレオチ
ドの中央の部位、文献（Ｄ．Ｐｒｉｂｎｏｗ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２（１９７
５）７８４−７８９）に定められている）とを分離して
いる領域と５′未端との間の部分を除いたプロモーター
オペレータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ）ラ
クトース ＵＶ５が結合したハイブリッド プロモータ
ーオペレータの制御下に置いた。 【００２８】図２に、上記のプラスミドについて、主要
なＤＮＡ配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。 【００２９】 【表１】【００３０】この地図は、また、一定の制限酵素、つま
り、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII 、ＰｓｔＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、およびＰｖｕＩの酵素の作用部
位を示している。 【００３１】プラスミドｐ１６３，１中に突然変異ＵＶ
５（「オペロン」中の「Ｌａｃプロモータ」の章（前記
参照）に説明されている）が存在するために、ｈＧＨ前
駆体をコードするＤＮＡ配列体の発現が、ｃＡＭＰおよ
ひＣＲＰの併合作用に不感受性となる。このプラスミド
は、その一般的特性を仮定して、天然のｈＧＨ前駆体の
１つをコードするＤＮＡ配列体を、他の前駆体特に他の
たんぱく質の前駆体をコードする配列体に置換すること
によって、他のプラスミドを構築するために使用でき
る。 【００３２】他の特徴によれば、本発明は、所望のたん
ぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体が、その発現
を可能にする調節要素と共に、プラスミドに担われる上
記の微生物学的方法に関する。特に、上記のＤＮＡ配列
体が、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された寄託番号Ｉ−５３
０のプラスミドの一般的特性を有するプラスミドによっ
て担われる上記の微生物学的方法に関する。 【００３３】他の特徴によれば、本発明は、上記細菌株
が、ｈＧＨ前駆体をコードするＤＮＡ配列体を含有する
上記の微生物学的方法に関する。 【００３４】他の特徴によれば、本発明は、寄託番号Ｉ
−５２８およびＩ−５２９としてＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄
託された細菌株に関する。 【００３５】更に他の特徴によれば、本発明は、寄託番
号Ｉ−５３０としてＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託されたプラ
スミドに関する。 【００３６】次に、具体例を用いて本発明を説明する。
当然、本発明は、これらの例で説明されている本発明の
方法の適用には制限されない。本発明には、特許請求の
範囲によって定められる範囲の変法の全てが含まれる。 【００３７】 【実施例】例 Ｉ．使用する細菌およびプラスミド ４つの細菌株および４つのプラスミドを使用した。 【００３８】これらの例では、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託
した寄託番号Ｉ−５２８およびＩ−５２９の菌株とは別
に、他に次の２つの大腸菌の菌株に言及する。 【００３９】・欠失による非点ｃｙａ突然変異および欠
失による非点ｃｒｐ突然変異の両方を担う菌株。以後、
内部参照によりＡと称する。Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉ−５２
９株はこの菌株から誘導される。 【００４０】・ｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定後にのみ
転写が開始されるオペロンの発現を、制限または抑制で
きる突然変異を担わない菌株。ＭＣ１０６１（大腸菌、
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ−Ｈ
ａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）として知
られている。以後、内部参照によりＴと称する。Ｃ．
Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉ−５２８株はこの菌株から誘導される。 【００４１】これらの例では、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託
した寄託番号Ｉ−５３０のプラスミドとは別に、他に３
つのプラスミドに言及する。これらは内部参照により、
ｐ１６４，１、ｐ２００，３、ｐ２１２，６と称する。 【００４２】プラスミドｐ１６４，１はプラスミドｐ１
６３，１と非常に類似しており、本質的な相違は突然変
異ＵＶ５が存在しないことである。 【００４３】プラスミドｐ２１２，６はプラスミドｐ１
６３，１と類似している。図３に、これについて、主要
なＤＮＡ配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。 【００４４】 【表２】 【００４５】図２に示したプラスミドｐ１６３，１と同
様に、一定の制限酵素の作用部位を図３に示す。 【００４６】プラスミドｐ２００，３はプラスミドｐ２
１２，６と等価であり、ｈＧＨ前駆体をコードするＤＮ
Ａ配列体の発現に関する非抑制特性のために選択した。 【００４７】天然のｈＧＨ前駆体の１つをコードし、プ
ラスミドｐ２１２，６およびｐ２００，３により担われ
るＤＮＡ配列体は、図１に示す配列体と、２つの置換に
おいて異なっている。つまり、コドンＡＣＣは、−２４
位に位置するアミノ酸をコードするコドンＡＣＡに置換
され、同様に、コドンＴＣＴは、−２２位に位置するア
ミノ酸をコードするコドンＴＣＣに置換された。 【００４８】II．一般的方法論 行なった実験は、問題の宿主ベクター対を予め調製し(
§２．１参照）、宿主がｈＧＨ前駆体をコードするＤＮ
Ａ配列体を発現できるような条件下に培養し（§２．２
参照）、必要ならば発現を誘導（§２．３参照）するこ
とと、細胞周辺腔に含まれるたんぱく質を採取すること
と（§２．４参照）、ペリプラズムｈＧＨを同定するこ
と（§２．５参照）とからなる。 【００４９】２．１．宿主ベクター対の調製 当業者に知られており、特に以下の著書に記載されてい
る細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。 【００５０】・「分子クローニング（実験室マニア
ル）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２） ・「分子遺伝学の実験」（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉ
ｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊ．Ｈ．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７２） ２．２．培養 ａ）接種 固体培地（ＬＢ培地＋寒天）で得られた分離コロニー
を、以下の特性を有し、かつ１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを添加した５ｍｌの培地（ＬＢ培地）中に懸濁さ
せる。即ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、カゼイ
ンのパンクレアチンによる 加水分解物（ＤＩＦＣＯからのバクトトリプトン） １０ｇ 酵母抽出物 ５ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ 蒸溜水添加 １ｌ であり、 ・加圧滅菌前にｐＨを７．３に調節した。 【００５１】ｂ）一次インキュベーション ３７℃、１８時間で培養菌が定常的な成長相に達する。 【００５２】ｃ）希釈 ６００ｎｍにおける読み（分光光度計 Ｂａｕｓｃｈ−
Ｌｏｍｂ ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ２０）での光学密
度、即ちＯＤ６００ｎｍが約０．０５になるように、細
菌懸濁液をＬＢ培地中で希釈する。 【００５３】ｄ）二次インキュベーション ２．２．ｃに従って得られた細菌懸濁液５０ｍｌを、Ｏ
Ｄ６００ｎｍが約０．２になるまで３７℃でインキュベ
ーションした。 【００５４】２．３．誘導 ２．２．ｄに従って得られた細菌懸濁液中に、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトース（ＩＰＴＧ）をその最
終濃度が１ｍＭになる量だけ添加する。ここで、ＩＰＴ
Ｇはリプレッサー（通常はラクトース オペレータに結
合する）の作用を中和することによって、ｈＧＨ前駆体
の合成を開始し、かつ維持するために用いる。 【００５５】２．４．浸透圧ショック （文献（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４１（１９６６）３
０５５−３０６２）において、Ｎ．Ｇ．Ｎｏｓｓａｌお
よびＬ．Ａ．Ｈｅｐｐｅｌが発表したプロトコールを参
照してもよい。） ａ）細菌懸濁液の調製 ２．２．ｄ（誘導が必要とされない場合）のようにして
得られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られた懸
濁液の試料を採取し、ＯＤ６００ｎｍが約１０になるよ
うにこれを処理（６０００ｇで５分間遠心分離、上澄み
を除去、細菌をＬＢ培地中に再度懸濁）する。 【００５６】ｂ）洗浄 ２．４．ａで得られた懸濁液を６０００ｇで５分間遠心
分離する。 【００５７】一定容量の残渣を、次の組成を有する溶液
Ａ中に採取する。即ち、溶液Ａは蒸溜水に下記のものを
添加することによって調製されたｐＨ＝７の緩衝液であ
る。 【００５８】・トリ（ヒドロキシメチル）アミノエタン
−ＨＣｌ、即ち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 最終濃度が３０ｍＭのように添加する。 【００５９】・エチレンジアミン四酢酸、即ち、ＥＤＴ
Ａ 最終濃度が１ｍＭになるように添加する。 【００６０】ｃ）スクロースの作用 ２．４．ｂで得られた懸濁液を６０００ｇで５分間遠心
分離する。 【００６１】溶液Ａに対応する組成を有し、かつ、１５
ｇ／１００ｍｌのスクロースを添加した溶液Ｂ中に、残
渣の一定量を注意深く採取し、直ちに用いる。 【００６２】その懸濁液を２０℃で１０分間放置する。 【００６３】それから、６０００ｇで５分間遠心分離す
る。 【００６４】遠心管を氷水中に静置する。 【００６５】上澄みを注意深く除去し、氷水温度に保た
れた脱イオン水中に再度静置する（一定容量で）。 【００６６】この方法で調製された懸濁液（ＯＤ６００
ｎｍは約１０）を０℃で５分間放置する。 【００６７】ｄ）細胞周辺腔に存在するたんぱく質の採
集 ２．４．ｃで得られた懸濁液を、１８，０００ｇで１０
分間遠心分離する。 【００６８】上澄みを集める。これには細胞周辺腔に存
在するたんぱく質が含まれる。 【００６９】２．５．ペリプラズムｈＧＨの同定 ａ）方法論 ２．４．ｄで得られた上澄みを、ヒト成長ホルモンのラ
ジオイムノアッセイにかける（ＣＯＡＴＲＩＡR 125 Ｉ
−ｈＧＨ ｋｉｔ−Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃ
ｅ）。 【００７０】この同定は、次の操作を連続して行なうこ
とからなる。 【００７１】・ヨウ素１２５で標識されたｈＧＨを予め
定められた量だけ導入し、予め定められた量の第一の抗
−ｈＧＨ抗体を目当てとして、同定されるべき分析試料
中に含まれるｈＧＨとの間で競合させる反応。 【００７２】・第一の抗体を前記第一の抗体に対する第
二の抗体に結合させ、固体物質に固定する反応。 【００７３】インキュベーション後には、ヨウ素１２５
で標識したｈＧＨの比率は、分析試料中のｈＧＨの量に
逆比例する。 【００７４】２．６．ペリプラズムｈＧＨの特性チェッ
ク １）方法論 ２．４．ｄで得られた上澄みから採集したｈＧＨの性質
をチェックした。 【００７５】これは、次の操作を連続して行なうことに
より実施した。 【００７６】・上澄み中に含まれる異なったたんぱく質
の、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による分離
（文献（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ ２２
７（１９７０）６８０−６８５）中にＬａｅｍｍｌｉに
より記載されたプロトコールによる）。 【００７７】この方法では、成熟形のｈＧＨおよびｈＧ
Ｈ前駆体が、それぞれの見かけの分子量に応じて２つの
異なった点に移動する。 【００７８】・ゲル中に含まれる前記たんぱく質の、ニ
トロセルロースフィルター上への移動（文献（Ｈ．Ｔｏ
ｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６（１９７９）４３５０−４３
５４）の技術に従う）。 【００７９】・バーネットの技術（Ｗ．Ｗ．Ｂｕｒｎｅ
ｔｔｅ，ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２（１９８
１）１９５−２０３）に従って行なわれる免疫検出。こ
れには次のような連続的工程が含まれる。 【００８０】・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ａ
（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ，ＮａＣｌ １７０ｍ
Ｍ，ＫＩ １ｍＭ）で１０分間濯ぐ。 【００８１】・ニトロセルロースフィルターを、３７℃
で３０分間、緩衝液Ｂ（３ｇ／１００ｍｌの割合で牛血
清アルブミンを添加した緩衝液Ａ）に接触させる。 【００８２】・ニトロセルロースフィルターを、２０℃
で１８時間、免疫血清（成熟ｈＧＨおよびその前駆体を
認識する多クローン性抗体）に接触させる。 【００８３】・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ｂ
で濯ぐ。 【００８４】・ニトロセルロースフィルターを、２０℃
で６時間、１ｍｌ当り０．１マイクロキュリーのヨウ素
１２５で標識されたプロテインＡの溶液と接触させる。 【００８５】・フィルターを緩衝液Ａで濯ぐ。 【００８６】・フィルターを２枚の吸収性シートの間で
乾燥する。 【００８７】・Ｘ線フィルターに接触させる。 【００８８】・フィルムを現像する。 【００８９】２）結果 処理条件を選択することによって、使用する細菌株およ
びプラスミドと関係なく、ペリプラズムｈＧＨは分子の
約９８％が成熟形で存在することに注目すべきである。 【００９０】III ．結果 ３．１．例Ａ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ２１２，６と、大
腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株／ｐ２１２，６によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比較。 【００９１】これらの結果は、突然変異株（ＣＮＣＭ
Ｉ−５２８株）の方が、非突然変異株（Ｔ株）よりも２
倍以上高い効率で、ペリプラズムｈＧＨを生産できるこ
とを示している。 【００９２】３．２．例Ｂ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ１６３，１と、大
腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株／ｐ１６３，１と、大腸菌
Ｔ株／ｐ１６４，１と、大腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株
／ｐ１６４，１によってそれぞれ生産されたペリプラズ
ムｈＧＨのレベルの比較。 【００９３】誘導時間を３時間とし、浸透圧ショックお
よび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した
上澄み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。 【００９４】 ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りｎｇ数） ｐ１６３，１ ｐ１６４，１ Ｔ株 ５．８ ６．４ ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株 ７．８ １０．８ 誘導時間を３時間３０分とし、浸透圧ショックおよび濁
度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した上澄み
１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定したとこ
ろ、次の結果が得られた。 【００９５】 ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りμｇ数） Ｔ株／ｐ２１２，６ ０．８６ ＣＮＣＭ ２．００ Ｉ−５２８株／ｐ２１２，６ ｈＧＨ前駆体をコードするＤＮＡ配列体が、その発現に
関して、シグナルの制御下においてｃＡＭＰおよびＣＲ
Ｐの併合作用に感受性であると考えられるか否かにかか
わらず、突然変異株（ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株）は著し
く増大した量のペリプラズムｈＧＨを生産できると考え
られる（一例では約３０％の増加、他の例では７０％の
増加）。 【００９６】３．３．例Ｃ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ２２０，３と、大
腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株／ｐ２００，３によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比較。 【００９７】実験は誘導なしで行なった。浸透圧ショッ
クおよび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取
した上澄み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定
したところ、次の結果が得られた。 【００９８】 ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りｎｇ数） Ｔ株／ｐ２００，３ ２００ ＣＮＣＭ ５１２ Ｉ−５２８株／ｐ２００，３ 突然変異株（ＣＮＣＭ Ｉ−５２８株）は、非突然変異
株（Ｔ株）よりも２倍以上高い効率で、ペリプラズムｈ
ＧＨを生産できると考えられる。 【００９９】この実験は、前駆体の合成が誘導可能であ
るか否かにかかわらず、得られる効果が同じオーダーで
あることを示している。 【０１００】３．４．例Ｄ 宿主ベクター対である大腸菌ＣＮＣＭ Ｉ−５２９株／
ｐ２１２，６によって、ｃＡＭＰの存在下または非存在
下でそれぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの
比較。 【０１０１】誘導時間を３０分〜１２０分の間で変化さ
せたところ、次の結果が得られた。これらの結果は、い
ずれも浸透圧ショックおよび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１
に調節した後に、採取した上澄み１ｍｌ当りの成熟ペリ
プラズムｈＧＨの量（μｇ）を測定したものである。 【０１０２】 成熟ｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りμｇ数） ｃＡＭＰ非存在 ｃＡＭＰ存在 表現型［ｃｙａ- ］ 表現型［ｃｙａ+ ］＊ ３０分後 ０．１５３ ０．１００ ６０分後 ０．６７０ ０．２４３ １２０分後 １．６５０ ０．９７５ ＊ＣＡＭＰの存在下ではｃｙａ変異の効果は発現せず、菌株は野生型［ｃｙａ+ ］を有している。 【０１０３】：それは、ｃｙａ特性に関する変異を受け
ていない菌株の特徴を有している。 【０１０４】突然変異株（ＣＮＣＭ Ｉ−５２９株）
は、処理条件の選択下でｃｙａ変異の発現においてのみ
異なる親株よりも高い効率で、ペリプラズムｈＧＨを生
産できると考えられる。 【０１０５】３．５．例Ｅ 与えられた宿主ベクター対によって生産されるペリプラ
ズムｈＧＨレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。 【０１０６】この実験は誘導時間３時間で行ない、次の
結果が得られた。 【０１０７】 【表３】【０１０８】ペリプラズムｈＧＨの値は、浸透圧ショッ
クおよび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取
した上澄み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨのμｇ数で
表した。 【０１０９】全ペリプラズムたんぱく質はブラッドフォ
ードの方法（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７２（１９７
６）２４８−２６４）で測定し、浸透圧ショックおよび
濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した上澄
み１ｍｌ当りのペリプラズムｈＧＨのｍｇ数で表した。 【０１１０】この実験は、細胞周辺腔内に存在するたん
ぱく質レベルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプ
ラズム酵素の生産が、野生型菌株の存在により得られた
値およびクロモソームがｃｙａ変異（外因性ｃＡＭＰ添
加のないＣＮＣＭ Ｉ−５２９株）またはｃｒｐ変異
（外因性ｃＡＭＰ添加のあるＡ株）を有する菌株の存在
下での実質的な量に比較して、減少することを示してい
る。同時に、突然変異の一方または他方が発現すると
き、ペリプラズムｇＨＧの生産は大幅に増大する。 【０１１１】３．６．例Ｆ ｃＡＭＰの非存在下に、宿主ベクター対であるＡ株／ｐ
２１２，６とＩ−５２９株／ｐ２１２，６によってそれ
ぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比較。 【０１１２】誘導時間を２時間とし、浸透圧ショックお
よび濁度をＯＤ６００ｎｍ＝１に調節した後に採取した
上澄み１ｍｌ当りの成熟したペリプラズムｈＧＨの量
（μｇ）を測定したところ、次の結果が得られた。 【０１１３】 成熟ｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ＝１となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み１ｍｌ当りμｇ数） Ｔ株／ｐ２１２，６ ２．０８ ＣＮＣＭ ２．０７ Ｉ−５２９株／ｐ２１２，６ クロモソームがｃｙａ欠失変異およびｃｒｐ欠失変異を
有するＡ株と、クロモソームが同様のｃｙａ欠失変異を
有するＩ−５２９株は、同一の挙動をすると考えられ
る。 【０１１４】これらの例は、ｃＡＭＰ−ＣＭＰ複合体の
固定後にのみ転写が開始され得るオペロンの発現を制限
しまたは抑制する変異をもった菌株を使用することによ
って、明白な利点がもたらされることを示している。：
事実、これらの菌株は所望のペリプラズムたんぱく質の
生産を実質的に増大（これらの例では、成熟形でのたん
ぱく質について９８％）させることが可能である。例Ｅ
では、このような細菌の使用によって与えられる絶対的
な一次的利点（ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ｆｉｒｓｔ−ｒ
ａｔｅ ａｄｖａｎｔａｇｅ）が強調される。：変異株
は細胞周辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生産
を制限するから、観察される増大は絶対的なだけでな
く、相対的である。；これは、目標とするたんぱく質の
細胞周辺腔の内容物からの精製を容易にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】天然ｈＧＨ前駆体の１つをコードするＤＮＡ配
列体およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。 【図２】ペリプラズムについて、主要なＤＮＡ配列体の
位置と配向を示す機能地図である。 【図３】ペリプラズムについて、主要なＤＮＡ配列体の
位置と配向を示す機能地図である。
列体およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。 【図２】ペリプラズムについて、主要なＤＮＡ配列体の
位置と配向を示す機能地図である。 【図３】ペリプラズムについて、主要なＤＮＡ配列体の
位置と配向を示す機能地図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 パスカル・レプラトワ
フランス国、81470 キューク・トゥー
ルサ、キャンボン・レ・ラボア、アン・
サン・ピエール （番地無し)
(72)発明者 ウイレム・ロスカム
フランス国、31450 モンジスカール、
マジョウレ （番地無し)
(72)発明者 イブリン・リオウズン・ジョセフ
フランス国、31650 サン・オレン・ド
ゥ・ギャンビル、リュ・デュ・パレ ８
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ−５２８として寄託
した大腸菌株であって、該菌株の染色体がｃｒｐ遺伝子
およびその発現を調節するＤＮＡ配列によって形成され
る系に影響を与えるなくとも一つの突然変異を有してい
るる菌株。
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|---|---|---|---|
| FR8605133 | 1986-04-10 | ||
| FR8605133A FR2597114B1 (fr) | 1986-04-10 | 1986-04-10 | Procede microbiologique pour l'obtention d'une proteine par culture d'une souche bacterienne mutante |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62088603A Division JP2528872B2 (ja) | 1986-04-10 | 1987-04-10 | 突然変異細菌株の培養によるたんぱく質の微生物学的製造方法 |
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|---|---|---|---|
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