JP2528872B2 - 突然変異細菌株の培養によるたんぱく質の微生物学的製造方法 - Google Patents

突然変異細菌株の培養によるたんぱく質の微生物学的製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、当該たんぱく質の前駆体をコードするDNA
配列体を当該細菌に導入して、特定の型の突然変異を担
う（carry）グラム陰性菌を培養することによって、た
んぱく質を得ることを可能にする微生物学的方法に関す
る。
本発明は、多くの技術分野で適用でき、特に有効成分
がたんぱく質である医薬の製造に適用できる。
多数のたんぱく質は、翻訳後の成熟を受けた後にの
み、生物学的活性を獲得することが知られている。細胞
質中で前駆体の形で生合成され、それから細胞質から運
び出されるたんぱく質の場合には、この成熟の第１段階
は、シグナルペプチドと称されるＮ末端をこの前駆体か
ら酵素的に除去することであることが多い。前駆体の形
で生合成されたこの型のたんぱく質は、原核生物と真核
生物の両方について知られている。このようなたんぱく
質として特に言及できるものには、例えば、大腸菌（Es
cherichia coli）の種などにより産生されるβ−ラクタ
マーゼ TEM-1とアルカリ性 ホスファターゼ、黄色ブ
ドウ球菌（Staphylococcus aureus）の種により産生さ
れるプロテインＡ、デンプン液化バチルス（Bacillus a
myloliquefaciens）の種などにより産生されるα−アミ
ラーゼ（これらは原核生物由来のたんぱく質である）、
また、ヒト成長ホルモン、ヒトインシュリン、組織プラ
スミノーゲン活性化因子、上皮成長因子（これらは真核
細胞により産生されるたんぱく質である）などがある。
更に、当該たんぱく質を製造するために、天然のたん
ぱく質前駆体をコードするDNA配列体を担うプラスミド
を用いて形質転換したグラム陰性菌を、使用できること
が知られている（G.L.Gray et al.,Biotechnology 2（1
984）161-165;G.L.Gray et al.,Gene 39（1985）247-25
4）。この場合には、細胞機構によって次の過程が確実
に行われる。細胞質区画で、DNA配列体が転写され、そ
れから対応するメッセンジャーRNAが翻訳される。この
ようにして生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って
移動する間または移動の後、酵素開裂または分解、シグ
ナルペプチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない
前駆体に対応するこのたんぱく質は、細菌のペリプラズ
ムに蓄積される。ここからこのたんぱく質を得ることが
できる。
上記のDNA配列体が、シグナルペプチドに関して、天
然の前駆体（つまり、通常の産生を行う細胞で合成され
る形）と異なる前駆体をコードする場合にも、類似する
結果が得られている。例えば、真核生物由来のたんぱく
質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペプチドが結合
した前駆体が合成された（K.Talmadge et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,77（1980）3988-3992;G.L.Gray et a
l.,Gene 39（1985）247-254）。
また、細菌に、オペロンの発現を制限するまたは抑制
さえも行う突然変異を起こせることが知られている。こ
のオペロンの転写は、アデノシン３′,5′−環状リン酸
（cAMP）がCRP（環状AMPレセプタたんぱく質）（これは
CAP（カタボライト活性化たんぱく質）とも称される）
と会合して生じるcAMP-CRP複合体が、このオペロンの調
節要素へ固定された後にのみ開始されるような転写であ
る。これらのオペロンの機能に関しては、「オペロン」
（The Operon,J.H.Miller and W.S.Reznikoff,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,1980）中の「Lacプロモータ」
（W.S.Reznikoff and J.N.Abelson）の章に説明されて
いる。
そのような生合成能が減少した細菌（阻害されたオペ
ロンは、多くの酵素の合成を支配するので）が、始めか
ら、たんぱく質工業生産用の好ましい宿主を形成できな
いことは明らかであった。
グレイらによる1984年と1985年の報告（上記）には、
当該たんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体を導入
した細菌を培養することによって、たんぱく質を製造す
るこれまでの研究が、調節要素（特にプロモータ）を特
に選択することによりプラスミド構造の効率を高めるこ
とに向けられていたことが示されている。
本発明者は細菌宿主に関心を払い、別の方向の研究を
行った。驚くべきことに、転写がcAMP-CRP複合体の固定
に依存するオペロンの発現を制限するまたは抑制さえも
行う少なくとも１つの突然変異を担うクロモソームを有
するグラム陰性菌が、前駆体の形で生合成されるたんぱ
く質の工業生産のための好ましい宿主を構成することが
見出された。
第１の特徴によれば、本発明は、当該たんぱく質の前
駆体をコードするDNA配列体を導入したグラム陰性菌を
培養することによって、たんぱく質を生産する微生物学
的方法に関する。この方法は、転写がcAMP-CRP複合体の
固定に依存するオペロンの発現を制限するまたは抑制さ
えも行う少なくとも１つの突然変異を担うクロモソーム
を有する細菌種の使用を包含する。
この突然変異は、cAMPの細胞内濃度を減少する傾向が
あるもの；機能形のCRP合成を制限または抑制するも
の；突然変異形のCRPの合成を導き、DNAへの固定が妨げ
られるまたは比較的に効率が落ちるようなcAMP-CRP複合
体の形成を起こすもの；および、当該複合体の固定が妨
げられるまたは比較的に効率が落ちるような仕方に、DN
Aに対するcAMP-CRP複合体の固定の部位を修飾するもの
である。これらは、発現が温度などのパラメータに依存
する条件突然変異であってよい。
これらの突然変異の中で、クロモソーム遺伝子cya自
身またはその発現を調節するDNA配列体に、この遺伝子
がコードするアデニル酸シクラーゼが合成されないか、
またはその特異的な活性、すなわちアデノシン 三リン
酸（ATP）のcAMPへの変換を行うことができない形で合
成するように影響を及ぼす突然特異が、特に特徴づけら
れる。クロモソーム遺伝子crp自身またはその発現を調
節するDNA配列体に、この遺伝子がコードするCRPが合成
されないか、またはDNAへの効率的な固定を可能にする
十分に安定なcAMP-CRP複合体が形成されないような突然
変異形で合成するように影響を及ぼす突然変異も、同様
である。便宜上、これらの突然変異をここではcya突然
変異およびcrp突然変異と称する。
cyaおよびcrp突然変異は任意の種類のものでよいが、
特に可能なものは、置換による突然変異、挿入による突
然変異、変換による突然変異、または例えば欠失による
突然変異である。突然変異は、一対のヌクレオチドのみ
に影響を与えるものであってよいが、この型の点突然変
異は可逆的なので、幾対かのヌクレチドに同時に影響を
与える不可逆的突然変異が好ましい。多重点突然変異が
更に可能性がある。cya突然変異の場合には、cAMPは合
成されず、cAMP-CRP複合体の形成は起き得ない。外来性
cAMPの添加によって、この合成の欠如を克服し、乱され
た細胞機能を回復することが可能となる。crp突然変異
の場合には、CRPはもはや機能形では合成されず、同様
に、cAMP-CRP複合体の形成は起き得ない。ここでは、外
来性cAMPの添加は、乱された細胞機能の回復には無力で
ある。
本発明は、cya遺伝子およびその発現を調節するDNA配
列体により形成される系、またはcrp遺伝子およびその
発現を調節するDNA配列体により形成される系、または
その両方の系に影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異
を担うクロモソームを有する細菌株を使用する上に定め
た微生物学的方法に、有利に関連している。
本発明では、cAMPが、種々のオペロンの発現の制御を
行うCRPとカップリングしている任意のグラム陰性菌の
種に属する細菌株を使用できる。この型の細菌株は、多
くのバクテリオファージの作用に対して驚く程に耐性な
ので、工業生産での使用は一層有利となる（Sushil Kum
ar,J.Bact.125（1976）545-555）。好ましい細菌の種は
大腸菌である。
他の特徴によれば、本発明は、使用する突然変異細菌
株が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学的方法に関
する。
本発明者は特に、1986年２月17日に国立微生物寄託機
関（Collection Nationale de Cultures de Microorgan
ismes（C.N.C.M.）,Paris,France）に寄託した大腸菌の
２つの突然変異菌株を選択した。菌株の１つは点crp突
然変異を担い（寄託番号I-528）、他の菌株は欠失によ
る非点cya突然変異を担う（寄託番号I-529）。
本発明は、好ましくは、突然変異菌株が、寄託番号I-
528およびI-529としてC.N.C.M.に寄託された菌株の一方
または他方の特性を有する上記の微生物学的方法に関す
る。
本発明の方法によって、多くのたんぱく質を得ること
が可能となる。製造を望むたんぱく質が、前駆体の形で
天然に生合成されるか否かはほとんど重要でないことを
理解する必要がある。また、この方法は非天然のたんぱ
く質の製造にも適している。例えば、１次構造を２つま
たはそれ以上の既知のたんぱく質から選択したハイブリ
ッドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、この方法
は、Ｎ末端にシグナルペプチドとして挙動するペプチド
が結合した上記のたんぱく質をコードするDNA配列体の
製造を満足する。
本発明による方法は、ヒト成長ホルモン（以後、hGH
と称する）の製造に対して特に有利である。
第１図は、hGHが合成される下垂体細胞から単離され
た天然hGH前駆体の１つをコードするDNA配列体、およ
び、この前駆体のアミノ酸配列体を示している。最初の
26のアミノ酸（図中の−26位のアミノ酸から数える）が
シグナルペプチドを構成し、他の191のアミノ酸（ここ
では１から191までの番号を付ける）は実際のhGH（以
後、「成熟hGH」と称する）のアミノ酸である。
次の第１表に第１図中で使用したアミノ酸の略語を説
明する。
第１表 アミノ酸 略語 アラニン Ａ アルギニン Ｒ アルパラギン Ｎ アルパラギン酸 Ｄ システイン Ｃ グルタミン Ｑ グルタミン酸 Ｅ グリシン Ｇ ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ ロイシン Ｌ リジン Ｋ メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ プロリン Ｐ セリン Ｓ トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ チロシン Ｙ バリン Ｖ 第１図に示したDNA配列体のコドンでは、通常の意味
でＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇを使用している。これらはそれぞれ、
アデニン、シトシン、チミン、グアニンの塩基を示す。
本発明を実施するためには、突然変異細菌が、所望の
たんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体を含むこと
が必要である。「前駆体」の語は、それが存在する場合
は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグナルペプチド
を修飾して得られた上記の天然前駆体の任意の誘導体
を、更に、シグナルペプチドとして挙動できるペプチド
が上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体を意味する
ものとして理解される。前駆体は特に、既知の原核およ
び真核生物のシグナルペプチドまたはその誘導体を包含
する群から選択できる。
上記たんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体を、
プラスミドなどの複製可能な発現ベクターにより細菌に
導入できる。上記配列体の発現に必要な調節要素（特
に、プロモータ）が、その機能を行うためにその配列体
の付近に位置することが必要であることは明白である。
例えば、使用する細菌株内で複製できることを条件と
して、従来技術（G.L.Gray et al.,Gene 39（1985）247
-254）に説明されているプラスミドを使用できる。これ
らのプラスミドの選択に関しては、使用する構造体内
で、所望のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体
が誘導可能である必要はないことが示された。上記の配
列体が幾つかの複写として存在することも重要である。
本発明者は、実際に、細菌細胞内での複製の後、細胞
当り50ないし300の比率で複写が存在し、それぞれの複
写が所望のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体
の複写を担うことができる幾つかのプラスミドを構築
し、選択した。これらのプラスミドの１つによって形質
転換された大腸菌MC1061株を、1986年２月17日にC.N.C.
M.に寄託した。この菌株は寄託番号I-530である。便宜
上、以後の説明では、寄託番号I-530としてC.N.C.M.に
寄託されたこのプラスミドを参照する。このプラスミド
（以後、内部参照によりp163,1とも称する）は、hGHの
天然の前駆体の１つをコードするDNA配列体を担う。第
１図に示すこの配列体は、ヒト下垂体細胞で合成された
前駆体の１つから決定された配列体と同一である。これ
を、 １）５′末端から始まり、RNAポリメラーゼ認識部位
（−35位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、文
献（M.Takanami et al.,Nature 260（1976）297-302）
に定められている）を含むトリプトファン プロモータ
ーの断片、および、 ２）RNAポリメラーゼ認識部位（−35位に位置するその
ヌクレオチドの中央の部位）と、固定部位（−10位に位
置するそのヌクレオチドの中央の部位、文献（D.Pribno
w,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72（1975）784-789）に定め
られている）とを分離している領域と５′末端との間の
部分を除いたプロモーターオペレータ（promoter-opera
tor）ラクトース UV5が結合したハイブリッド プロモ
ーターオペレータの制御下に置いた。
第２図に、上記のプラスミドについて、主要なDNA配
列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図中に使用し
た記号の意味は次の通りである。
この地図は、また、一定の制限酵素、つまり、SalI、
BamHI、HindIII、PstI、EcoRI、XhoI、およびPvuIの酵
素の作用部位を示している。
プラスミドp163,1中に突然変異UV5（「オペロン」中
の「Lacプロモータ」の章（前記参照）に説明されてい
る）が存在するために、hGH前駆体をコードするDNA配列
体の発現が、cAMPおよびCRPの併合作用に不感受性とな
る。このプラスミドは、その一般的特性を仮定して、天
然のhGH前駆体の１つをコードするDNA配列体を、他の前
駆体特に他のたんぱく質の前駆体をコードする配列体に
置換することによって、他のプラスミドを構築するため
に使用できる。
他の特徴によれば、本発明は、所望のたんぱく質の前
駆体をコードするDNA配列体が、その発現を可能にする
調節要素と共に、プラスミドに担われる上記の微生物学
的方法に関する。特に、上記のDNA配列体が、C.N.C.M.
に寄託された寄託番号I-530のプラスミドの一般的特性
を有するプラスミドによって担われる上記の微生物学的
方法に関する。
他の特徴によれば、本発明は、上記細菌株が、hGH前
駆体をコードするDNA配列体を含有する上記の微生物学
的方法に関する。
他の特徴によれば、本発明は、寄託番号I-528およびI
-529としてC.N.C.M.に寄託された細菌株に関する。
更に他の特徴によれば、本発明は、寄託番号I-530と
してC.N.C.M.に寄託されたプラスミドに関する。
次に、具体例を用いて本発明を説明する。当然、本発
明は、これらの例で説明されている本発明の方法の適用
には制限されない。本発明には、特許請求の範囲によっ
て定められる範囲の変法の全てが含まれる。
例 I.使用する細菌およびプラスミド ４つの細菌株および４つのプラスミドを使用した。
これらの例では、C.N.C.M.に寄託した寄託番号I-528
およびI-529の菌株とは別に、他に次の２つの大腸菌の
菌株に言及する。
・欠失による非点cya突然変異および欠失による非点crp
突然変異の両方を担う菌株。以後、内部参照によりＡと
称する。C.N.C.M.I-529株はこの菌株から誘導される。
・cAMP-CRP複合体の固定後にのみ転写が開始されるオペ
ロンの発現を、制限または抑制できる突然変異を担わな
い菌株。MC1061（大腸菌、Genetic S ock Center,New-H
aven,Connecticut,USA）として知られている。以後、内
部参照によりＴと称する。C.N.C.M.I-528株はこの菌株
から誘導される。
これらの例では、C.N.C.M.に寄託した寄託番号I-530
のプラスミドとは別に、他に３つのプラスミドに言及す
る。これらは内部参照により、p164,1、p200,3、p212,6
と称する。
プラスミドp164,1はプラスミドp163,1と非常に類似し
ており、本質的な相違は突然変異UV5が存在しないこと
である。
プラスミドp212,6はプラスミドp163,1と類似してい
る。第３図に、これについて、主要なDNA配列体の位置
と配向を示す機能地図を示す。図中に使用した記号の意
味は次の通りである。
第２図に示したプラスミドp163,1と同様に、一定の制
限酵素の作用部位を第３図に示す。
プラスミドp200,3はプラスミドp212,6と等価であり、
hGH前駆体をコードするDNA配列体の発現に関する非抑制
特性のために選択した。
天然のhGH前駆体の１つをコードし、プラスミドp212,
6およびp200,3により担われるDNA配列体は、第１図に示
す配列体と、２つの置換において異なっている。つま
り、コドンACCは、−24位に位置するアミノ酸をコード
するコドンACAに置換され、同様に、コドンTCTは、−22
位に位置するアミノ酸をコードするコドンTCCに置換さ
れた。
II.一般的方法論 行なった実験は、問題の宿主ベクター対を予め調製し
（§2.1参照）、宿主がhGH前駆体をコードするDNA配列
体を発現できるような条件下に培養し（§2.2参照）、
必要ならば発現を誘導（§2.3参照）することと、細胞
周辺腔に含まれるたんぱく質を採取することと（§2.4
参照）、ペリプラズムhGHを同定すること（§2.5参照）
とからなる。
2.1.宿主ベクター対の調製 当業者に知られており、特に以下の著書に記載されて
いる細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。
・「分子クローニング（実験室マニアル）」 （Molecular cloning-A Laboratory Manual,T.Maniati
s,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Cold Spring Harbor La
boratory,1982） ・「分子遺伝学の実験」（Experiments in molecular g
enetics,J.H.Miller,Cold Spring Harbor Laboratory,1
972） 2.2.培養 ａ）接種 固体培地（LB培地＋寒天）で得られた分離コロニー
を、以下の特性を有し、かつ100μg/mlのアンピシリン
を添加した5mlの培地（LB培地）中に懸濁させる。即
ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、 カゼインのパンクレアチンによる 加水分解物（DIFCOからのバクトトリプトン） 10g 酵母抽出物 5g 塩化ナトリウム 5g 蒸溜水添加 1 であり、 ・加圧滅菌前にpHを7.3に調節した。
ｂ）一次インキュべーション 37℃、18時間で培養菌が定常的な成長相に達する。
ｃ）希釈 600nmにおける読み（分光光度計 Bausch-Lomb spect
ronic20）での光学密度、即ちOD 600nmが約0.05になる
ように、細菌懸濁液をLB培地中で希釈する。
ｄ）二次インキュべーション 2.2.cに従って得られた細菌懸濁液50mlを、OD 600nm
が約0.2になるまで37℃でインキュベーションした。
2.3.誘導 2.2.dに従って得られた細菌懸濁液中に、イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトース（IPTG）をその最終濃度
が1mMになる量だけ添加する。ここで、IPTGはリプレッ
サー（通常はラクトース オペレータに結合する）の作
用を中和することによって、hGH前駆体の合成を開始
し、かつ維持するために用いる。
2.4.浸透圧ショック （文献（The Journal of Biological Chemistry 241
（1966）3055-3062）において、N.G.NossalおよびL.A.H
eppelが発表したプロトコールを参照してもよい） ａ）細菌懸濁液の調製 2.2.d（誘導が必要とされない場合）のようにして得
られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られた懸濁
液の試料を採取し、OD 600nmが約10になるようにこれを
処理（6000gで５分間遠心分離、上澄みを除去、細菌をL
B培地中に再度懸濁）する。
ｂ）洗浄 2.4.aで得られた懸濁液を6000gで５分間遠心分離す
る。
一定容量の残渣を、次の組成を有する溶液Ａ中に採取
する。即ち、溶液Ａは蒸溜水に下記のものを添加するこ
とによって調製されたpH＝７の緩衝液である。
・トリ（ヒドロキシメチル）アミノエタン−HCl、即
ち、Tris-HCl 最終濃度が30mMのように添加する。
・エチレンジアミン四酢酸、即ち、EDTA 最終濃度が1mMになるように添加する。
ｃ）スクロースの作用 2.4.bで得られた懸濁液を6000gで５分間遠心分離す
る。
溶液Ａに対応する組成を有し、かつ15g/100mlのスク
ロースを添加した溶液Ｂ中に、残渣の一定量を注意深く
採取し、直ちに用いる。
その懸濁液を20℃で10分間放置する。
それから、6000gで５分間遠心分離する。
遠心管を氷水中に静置する。
上澄みを注意深く除去し、氷水温度に保たれた脱イオ
ン水中に再度静置する（一定容量で）。
この方法で調製された懸濁液（OD 600nmは約10）を０
℃で５分間放置する。
ｄ）細胞周辺腔に存在するたんぱく質の採集 2.4.cで得られた懸濁液を、18,000gで10分間遠心分離
する。
上澄みを集める。これには細胞周辺腔に存在するたん
ぱく質が含まれる。
2.5.ペリプラズムhGHの同定 ａ）方法論 2.4.dで得られた上澄みを、ヒト成長ホルモンのラジ
オイムアッセイにかける（COATRIAR 125I‐hGH kit-Bi
omerieux,France）。
この同定は、次の操作を連続して行なうことからな
る。
・ヨウ素125で標識されたhGHを予め定められた量だけ導
入し、予め定められた量の第一の抗−hGH抗体を目当て
として、同定されるべき分析試料中に含まれるhGHとの
間で競合させる反応。
・第一の抗体を前記第一の抗体に対する第二の抗体に結
合させ、固体物質に固定する反応。
インキュベーション後には、ヨウ素125で標識したhGH
の比率は、分析試料中のhGHの量に逆比例する。
2.6.ペリプラズムhGHの特性チェック １）方法論 2.4.dで得られた上澄みから採集したhGHの性質をチェ
ックした。
これは、次の操作を連続して行なうことにより実施し
た。
・上澄み中に含まれる異なったたんぱく質の、ポリアク
リルアミドゲル上での電気泳動による分離（文献（U.K.
Laemmli,Nature 227（1970）680-685）中にLaemmliによ
り記載されたプロトコールによる）。
この方法では、成熟形のhGHおよびhGH前駆体が、それ
ぞれの見かけの分子量に応じて２つの異なった点に移動
する。
・ゲル中に含まれる前記たんぱく質の、ニトロセルロー
スフィルター上への移動（文献（H.Towbin et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 76（1979）4350-4354）の技術に
従う）。
・バーネットの技術（W.W.Burnette,Anal.Biochem.112
（1981）195-203）に従って行なわれる免疫検出。これ
には次のような連続的工程が含まれる。
・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ａ（Tris-HCl 1
0mM,NaCl 170mM,KI 1mM）で10分間濯ぐ。
・ニトロセルロースフィルターを、37℃で30分間、緩衝
液Ｂ（3g/100mlの割合で牛血清アルブミンを添加した緩
衝液Ａ）に接触させる。
・ニトロセルロースフィルターを、20℃で18時間、免疫
血清（成熟hGHおよびその前駆体を認識する多クローン
性抗体）に接触させる。
・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ｂで濯ぐ。
・ニトロセルロースフィルターを、20℃で６時間、1ml
当り0.1マイクロキュリーのヨウ素125で標識されたプロ
テインＡの溶液と接触させる。
・フィルターを緩衝液Ａで濯ぐ。
・フィルターを２枚の吸収性シートの間で乾燥する。
・Ｘ線フィルムに接触させる。
・フィルムを現像する。
２）結果 処理条件を選択することによって、使用する細菌株お
よびプラスミドと関係なく、ペリプラズムhGHは分子の
約98％が成熟形で存在することに注目すべきである。
III.結果 3.1.例Ａ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株/p212,6と、大腸菌C
NCM I-528株/p212,6によってそれぞれ生産されたペリプ
ラズムhGHのレベルの比較。
誘導時間を３時間30分とし、浸透圧ショックおよび濁
度をOD 600nm＝１に調節した後に採取した上澄み1ml当
りのペリプラズムhGHの量を測定したところ、次の結果
が得られた。
これらの結果は、突然変異株（CNCM I-528株）の方
が、非突然変異株（Ｔ株）よりも２倍以上高い効率で、
ペリプラズムhGHを生産できることを示している。
3.2.例Ｂ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株/p163,1と、大腸菌C
NCM I-528株/p163,1と、大腸菌Ｔ株/p164,1と、大腸菌C
NCM I-528株/p164,1によってそれぞれ生産されたペリプ
ラズムhGHのレベルの比較。
誘導時間を３時間とし、浸透圧ショックおよび濁度を
OD 600nm＝１に調節した後に採取した上澄み1ml当りの
ペリプラズムhGHの量を測定たところ、次の結果が得ら
れた。
hGH前駆体をコードするDNA配列体が、その発現に関し
て、シグナルの制御下においてcAMPおよびCRPの併合作
用に感受性であると考えられるか否かにかかわらず、突
然変異株（CNCM I-528株）は著しく増大した量のペリプ
ラズムhGHを生産できると考えられる（一例では約30％
の増加、他の例では70％の増加）。
3.3.例Ｃ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株/p200,3と、大腸菌C
NCM I-528株/p200,3によってそれぞれ生産されたペリプ
ラズムhGHのレベルの比較。
実験は誘導なしで行なった。浸透圧ショックおよび濁
度をOD 600nm＝１に調節した後に採取した上澄み1ml当
りのペリプラズムhGHの量を測定したところ、次の結果
が得られた。
突然変異株（CNCM I-528株）は、非突然変異株（Ｔ
株）よりも２倍以上高い効率で、ペリプラズムhGHを生
産できると考えられる。
この実験は、前駆体の合成が誘導可能であるか否かに
かかわらず、得られる効果が同じオーダーであることを
示している。
3.4.例Ｄ 宿主ベクター対である大腸菌CNCM I-529株/p212,6に
よって、cAMPの存在下または非存在下でそれぞれ生産さ
れたペリプラズムhGHのレベルの比較。
誘導時間を30分〜120分の間で変化させたところ、次
の結果が得られた。これらの結果は、いずれも浸透圧シ
ョックおよび濁度をOD 600nm＝１に調節した後に、採取
した上澄み1ml当りの成熟ペリプラズムhGHの量（μｇ）
を測定したものである。
突然変異株（CNCM I-529株）は、処理条件の選択下で
cya変異の発現においてのみ異なる親株よりも高い効率
で、ペリプラズムhGHを生産できると考えられる。
3.5.例Ｅ 与えられた宿主ベクター対によって生産されるペリプ
ラズムhGHレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。
この実験は誘導時間３時間で行ない、次の結果が得ら
れた。
ペリプラズムhGHの値は、浸透圧ショックおよび濁度
をOD 600nm＝１に調節した後に採取した上澄み1ml当り
のペリプラズムhGHのμｇ数で表した。
全ペリプラズムたんぱく質はブラッドフォードの方法
（M.M.Bradford,Analytical Biochemistry 72（1976）2
48-264）で測定し、浸透圧ショックおよび濁度をOD 600
nm＝１に調節した後に採取した上澄み1ml当りのペリプ
ラズムhGHのmg数で表した。
この実験は、細胞周辺腔内に存在するたんぱく質レベ
ルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプラズム酵素
の生産が、野生型菌株の存在により得られた値およびク
ロモソームがcya変異（外因性cAMP添加のないCNCM I-52
9株）またはcrp変異（外因性cAMP添加のあるＡ株）を有
する菌株の存在下での実質的な量を比較して、減少する
ことを示している。同時に、突然変異の一方または他方
が発現するとき、ペリプラズムgHGの生産は大幅に増大
する。
3.6.例Ｆ cAMPの非存在下に、宿主ベクター対であるＡ株/p212,
6とI-529株/p212,6によってそれぞれ生産されたペリプ
ラズムhGHのレベルの比較。
誘導時間を２時間とし、浸透圧ショックおよび濁度を
OD 600nm＝１に調節した後に採取した上澄み1ml当りの
成熟したペリプラズムhGHの量（μｇ）を測定したとこ
ろ、次の結果が得られた。
クロモソームがcya欠失変異およびcrp欠失変異を有す
るＡ株と、クロモソームが同様のcya欠失変異を有するI
-529株は、同一の挙動をすると考えられる。
これらの例は、cAMP-CRP複合体の固定後にのみ転写が
開始され得るオペロンの発現を制限しまたは抑制する変
異をもった菌株を使用することによって、明白な利点が
もたらされることを示している。：事実、これらの菌株
は所望のペリプラズムたんぱく質の生産を実質的に増大
（これらの例では、成熟形でのたんぱく質について98
％）させることが可能である。例Ｅでは、このような細
菌の使用によって与えられる絶対的な一次的利点（abso
lutely first-rate advantage）が強調される。：変異
株は細胞周辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生
産を制限するから、観察される増大は絶対的なだけでな
く、相対的である。；これは、目標とするたんぱく質の
細胞周辺腔の内容物からの精製を容易にする。
【図面の簡単な説明】
第１図は、天然hGH前駆体の１つをコードするDNA配列体
およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。第２図
および第３図は、プラスミドについて、主要なDNA配列
体の位置と配向を示す機能地図である。
フロントページの続き (72)発明者 パスカル・レプラトワ フランス国、81470 キューク・トウー ルサ、キャンボン・レ・ラボア、アン・ サン・ピエール（番地無し) (72)発明者 ウイレム・ロスカム フランス国、31450 モンジスカール、 マジョウレ（番地無し) (72)発明者 イブリン・リオウズン・ジョセフ フランス国、31650 サン・オレン・ド ウ・ギャンビル、リュ・デユ・パレ ８

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】当該たんぱく質の前駆体をコードするDNA
    配列体を導入されたグラム陰性菌を培養することによっ
    てたんぱく質を製造する微生物学的方法であって、転写
    がcAMP-CRP複合体の固定に依存するオペロンの発現を制
    限するまたは抑制さえも行う少なくとも１つの突然変異
    を担うクロモソームを有する細菌株を使用することを包
    含する、たんぱく質を製造する微生物学的方法。
  2. 【請求項２】当該細菌のクロモソームが、cya遺伝子と
    その発現を調節するDNA配列体とにより形成される系に
    影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異を担う特許請求
    の範囲第１項記載の微生物学的方法。
  3. 【請求項３】当該細菌のクロモソームが、cya遺伝子と
    その発現を調節するDNA配列体とにより形成される系に
    影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異を担う特許請求
    の範囲第１項記載の微生物学的方法。
  4. 【請求項４】当該補菌のクロモソームが、cya遺伝子と
    その発現を調節するDNA配列体とにより形成される系に
    影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異、および、crp
    遺伝子とその発現を調節するDNA配列体とにより形成さ
    れる系に影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異を担う
    特許請求の範囲第１項記載の微生物学的方法。
  5. 【請求項５】使用する突然変異細菌株が大腸菌の種の菌
    株である特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
    か１項に記載する微生物学的方法。
  6. 【請求項６】突然変異細菌株がC.N.C.M.に寄託番号I-52
    9として寄託した菌株の特性を有する特許請求の範囲第
    ２項から第５項までのいずれか１項に記載する微生物学
    的方法。
  7. 【請求項７】突然変異細菌株がC.N.C.M.に寄託番号I-52
    8として寄託した菌株の特性を有する特許請求の範囲第
    ３項から第５項までのいずれか１項に記載する微生物学
    的方法。
  8. 【請求項８】クロモソームが２つの欠失を有し、その一
    方が、cya遺伝子とその発現を調節するDNA配列体とによ
    り形成される系に影響を及ぼし、他方が、crp遺伝子と
    その発現を調節するDNA配列体とにより形成される系に
    影響を及ぼす大腸菌の菌株を、突然変異細菌株として使
    用する特許請求の範囲第４項または第５項に記載する微
    生物学的方法。
  9. 【請求項９】所望のたんぱく質の前駆体をコードするDN
    A配列体が、その発現を可能にする調節要素と共に、プ
    ラスミドに担われている特許請求の範囲第１項から第８
    項までのいずれか１項に記載する微生物学的方法。
  10. 【請求項１０】当該細菌株がヒト成長ホルモンの前駆体
    をコードするDNA配列体を含有する特許請求の範囲第１
    項から第９項までのいずれか第１項に記載する微生物学
    的方法。
  11. 【請求項１１】C.N.C.M.に寄託番号I-530として寄託し
    たプラスミドの一般的特性を有するプラスミドに、当該
    DNA配列体が担われる特許請求の範囲第10項記載の微生
    物学的方法。
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