KR102533566B1 - 코돈 리프로그래밍화된 답토마이신 생합성 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

코돈 리프로그래밍화된 답토마이신 생합성 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이종 발현이 가능한 코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군 및 이의 제조 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 스트렙토마이시스 로제오스포로스의 유전체에 포함된 답토마이신 생합성 유전자 군을 클로닝한 후, 생산 수율이 높은 이종 균주에서 발현시킬 수 있도록 리팩토링한 재조합된 답토마이신 생합성 유전자 군의 서열 및 이를 제조하는 방법 및 이의 응용과 관련된 것이다.

Description

코돈 리프로그래밍화된 답토마이신 생합성 유전자 및 이의 용도{Codon-reprogrammed daptomycin non-ribosomal peptide synthetase gene and uses thereof}
본 발명은 생산 수율 향상을 위한 프로모터 엔지니어링 및 이종 발현이 가능하도록 생합성 유전자의 코돈을 리프로그래밍화 하고, 이에 의해 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군 및 이의 용도에 대한 것이다.
답토마이신은 미국식품의약처(FDA)에 승인된 리포펩타이드계 항생제로서 항생제 내성 슈퍼박테리아에 우수한 항미생물활성을 나타내며 내성 율이 낮아 다제내성 박테리아 감염증 치료제로 사용된다.
답토마이신의 생산은 스트렙토마이시스 로제오스포로스(Streptomyces roseosporus)의 발효배양 중 유전체 내 답토마이신 생합성 유전자군의 발현에 의해 이루어진다. 답토마이신 생합성유전자군은 생합성에 관련한 전사조절인자, 생합성유전자, 수송유전자 등을 포함하고 있다. 하지만 생산균주 내 답토마이신 생합성유전자군의 발현은 복잡한 발현 시스템에 조절되어 발현 수준이 매우 낮아 소량의 답토마이신이 생산되며, 고생산성 균주 개발의 어려움으로 작용한다.
생합성유전자군의 전사 및 발현율 증가에 따른 생산수율 증가방법으로는 다중화프로모터 엔지니어링과 같은 유전적 조작방법이 개발되었지만, 답토마이신 생합성유전자군의 경우 상대적으로 큰 핵산분자의 염기서열과 비-리보솜성 펩타이드 생합성유전자 (dptBC, non-ribosomal peptide synthetase) 내 다수의 반복되는 염기서열로 인해 클로닝을 통한 이종발현 및 프로모터 엔지니어링 조작이 제한된다.
따라서, 답토마이신 대량생산능을 갖는 산업 균주 개발을 위해서는 답토마이신 생합성 유전자군의 리팩토링 및 이종발현 방법에 의한 답토마이신 대량생산 방법에 대한 개발 및 연구가 절실히 필요하다.
이에 본 발명자들은 답토마이신의 생산 수율 증가 및 이종 발현을 위한 목적으로 답토마이신 생합성 유전자 군에 대한 연구 끝에, 상기 유전자의 일부 서열을 치환 또는 코돈 리프로그래밍화를 통해 리팩토링하고, 이를 대량 생산이 가능한 산업 균주에서 발현하여, 답토마이신을 생산할 수 있는 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 답토마이신 생합성 유전자 군 내의 비-리보솜성 펩타이드 생합성 효소 유전자 내의 반복 서열을 코돈 리프로그래밍화를 통한 리팩토링에 의해 제거한 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 DNA 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 DNA 분자가 포함된 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 벡터를 통해 형질 전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명은 스트렙토마이시스 로제오포러스(Streptomyces roseosporus)의 유전체 라이브러리로부터 개별 dptA, dptBC 및 dptD 유전자를 포함하는 포스미드(fosmid)를 선별하는 단계; 상기 답토마이신 생합성 유전자 군 내의, dptBC 유전자의 반복 염기서열을 제거하기 위한 코돈 리프로그래밍화를 수행하는 단계; 코돈 리프로그래밍화된 dptBC와 dptA 및 dptD 유전자들을 포함하는 유전자 군의 리팩토링 및 클로닝 단계; 및 상기 클로닝된 각각의 유전자를 서브-클로닝하여 재조립하는 단계를 포함하는 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군의 클로닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 답토마이신 생합성 유전자 군 내의 비-리보솜성 펩타이드인 답토마이신의 생합성 유전자(답토마이신 NRPS) 서열 내에 포함된 반복 서열 중 한 개 이상의 서열을 코돈 리프로그래밍화를 통해 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.
답토마이신 생합성 유전자 군은 유기체, 바람직하게는 박테리아 세포에서 답토마이신의 생합성을 위해 필요한 생합성 효소, 수송 단백질 그리고 전사 조절 단백질 등을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 답토마이신 생합성 유전자 군은 비-리보솜성 펩타이드 생합성 효소(DptA, DptBC, DptD), 보조 생합성 효소(DptE, DptF, DptG DptH, DptI, DptJ), 수송 단백질(DptM, DptN, DptP), 그리고 전사 조절 단백질 (DptR1, DptR2)을 코딩하는 유전자들과 그 외 기능이 알려지지 않은 답토마이신 합성에 필요한 다른 생합성 효소 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 포함한다. 본 발명의 일 실시 예에서, 상기 답토마이신 생합성 유전자 군은 상기 제1항에 있어서, 상기 dptA, dptBC ,dptD, dptE, dptF, dptG, dptH, dptI, dptJ, dptM, dptN, dptP, dptR1 및 dptR2 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 답토마이신 생합성 유전자 를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 특히 "dptA", "dptBC", 및 "dptD" 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 "dptA", "dptBC", 및 "dptD" 는 답토마이신의 뼈대 화학 구조의 생합성에 관여하는 일련의 서브유닛으로 구성되는 비-리보솜성 펩타이드 생합성 효소 들을 코딩하는 유전자에 해당한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함한 포스미드 클론은 스트렙토마이스세스 로제오포러스 (Streptomyces roseosporus)의 유전체 라이브러리로부터 서열번호 1 내지 서열번호 6 의 염기 서열의 프라이머를 이용하여, PCR 스크리닝 방법에 의해 선별된 것이며, 상기 비-리보솜성 펩타이드 생합성 유전자(NRPS)의 염기서열 내에 다수의 반복적인 염기서열을 포함하는 특징이 있다.
본 발명자들은 상기 반복 서열에 의해 답토마이신 생합성 유전자 군의 프로모터 엔지니어링에 한계가 있음을 확인하고, 이를 해결하고자 상기 반복 서열과 코딩하는 아미노산 서열은 동일하나 상이한 코돈을 포함하는 염기서열로 이를 치환하는 코돈 리프로그래밍화를 수행하였다.
본 발명의 일 실시 예에서, 상기 답토마이신 비-리보솜성 펩타이드 생합성 효소 유전자(dptBC NRPS)는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍에 의해 선별된 "pNRRL11379-248-6" 단위체 DNA 염기서열 내에 포함되며, 상기 유전자(dptBC, NRPS, 22,017bp)의 반복 서열은 상기 단위체 서열의 5,596 내지 7,323번째 서열을 포함하는 A 영역, 12,217 내지 15,225 번째 서열을 포함하는 B 영역 및 16,606 내지 21,951 번째 서열을 포함하는 C 영역이며, 코돈 리프로그래밍화 결과, 상기 A, B 및 C 영역은 각각 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 합성 A영역, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 합성 B영역, 및 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 합성 C영역으로 치환되었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 DNA 분자는, 각각의 답토마이신 생합성 유전자 군이 박테리아 인공 염색체(BAC)에 서브클로닝 됨으로써, 상기 BAC으로부터 유래된 DNA 서열을 포함하는 것인, DNA 분자이다. 본 발명의 답토마이신 생합성 유전자 군에 포함되는 dptA, dptBC 및 dptD 유전자는 각각 효모 내 상동재조합을 통하여 BAC 벡터 시스템으로 서브클로닝 되었다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 DNA 분자를 포함하는 벡터 및 이를 통해 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 벡터는 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드 (plasmid), 코스미드 (cosmid), 포스미드 (fosmid), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 효모 인공 염색체(YAC)일 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. 본 발명의 벡터는 상기 벡터 내에 작동 가능하게 연결된 답토마이신 생합성 유전자 군을 발현되도록 할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 BAC을 이용하였다.
본 발명에서 제공하는 DNA 분자의 주요한 특징은 효모 내 상동재조합을 이용한 리팩토링 혹은 이종 발현이 가능한 점에 있다. 따라서, 본 발명의 상기 숙주 세포는 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 스트렙토마이스시스 로제오포러스(Streptomyces roseosporus) 및, 이 밖에 이종 숙주를 이용할 수 있다. 상기 유전적 엔지니어링을 위한 숙주는 효모 혹은 대장균, 이종 발현 숙주로는 스트렙토마이시스 리비단스(Streptomyces. lividans) 혹은 스트렙토마이시스 시엘리칼라(Streptomyces coelicolor) 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트렙토마이시스 로제오포러스(Streptomyces roseosporus)의 유전체 라이브러리로부터 dptA, dptBC 또는 dptD 생합성 유전자를 포함하는 포스미드 클론을 선별하는 단계; 상기 답토마이신 생합성 유전자 군 중, dptBC의 반복 서열을 제거하기 위한 코돈 리프로그래밍화를 수행하는 단계; 코돈 리프로그래밍화된 dptBC, dptA 및 dptD 유전자 들을 포함하는 유전자 군을 클로닝하는 단계; 및 상기 클로닝된 유전자군을 서브-클로닝하여 재조립하는 단계를 포함하는 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군의 클로닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 "리팩토링"이란, 세포에서 발현되는 유전자 발현 패턴을 조절하여, 목적하는 세포로 전환시키기 위한 방법을 말한다. 일반적으로 클로닝은 외래 유전자 또는 DNA 등을 포함하는 벡터를 도입하는 과정을 통해 수행될 수 있으며, 본 발명에서는 재조합된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포에 도입함으로써 수행될 수 있다.
상기 답토마이신 생합성 유전자 클러스터는 dptA, dptBC 및 dptD 유전자 서열을 포함하며, 본 발명에서는 상기 유전자 중에서 dptBC의 반복 DNA 염기서열을 제거하기 위하여 코돈 리프로그래밍화를 수행하였다. "코돈 리프로그래밍(Codon reprograming)" 이란, 단백질을 코딩하는 부위의 아미노산 코돈 중에서 반복 염기서열에서 나타나는 코돈을 동일 아미노산을 코딩하는 대체 코돈으로 변형시켜 상동재조합을 일으킬 수 있는 반복 염기서열을 제거하는 과정을 말한다. 본 발명에서는 상기 코돈 리프로그래밍화된 서열을 포함하는 답토마이신 생합성 유전자 클러스터가 스트렙토마이시스 속(sp.)에 속하는 미생물 뿐만 아니라, 답토마이신의 대량 생산이 가능한 산업 미생물에서 DNA를 안정적으로 유지하고, 증폭할 수 있도록 하는 효과를 가진다. 또한 이러한 이종 발현을 통해, 결과적으로는 답토마이신의 생산 수율을 현저히 개선할 수 있게 되었다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 설명한 코돈 리프로그래밍화에 의해 리펙토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 DNA 분자를 이용하여 답토마이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 예에서, 상기 DNA 분자를 통해 형질 전환된 대장균에서, 상기 도입된 DNA의 안정적 발현 및 복제를 유지함을 확인하였다. 즉, 기존의 반복 서열을 가지고 있는 답토마이신 생합성 유전자 군(WT: Wild Type)과 비교하여, WT의 경우에는 다수의 DNA 절편이 관찰되는 등, 세포 내 유지 및 복제가 불완전 하였던 반면, 본 발명의 코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링된 DNA 분자는 이종 숙주인 대장균에서도 안정적으로 유지 및 증폭됨을 확인하였다.
본 발명은 이종 발현이 가능하도록 코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군 및 이의 용도에 대한 것으로, 코돈 리프로그래밍화된 서열을 포함하는 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군이 답토마이신의 대량 생산이 가능한 산업 미생물에서 DNA를 안정적으로 유지하고, 증폭할 수 있도록 하는 효과를 가진다.
도 1은 본 발명에 따른 코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군 및 이를 이용한 이종 발현 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 스트렙토마이시스 로제오스포로스(S. roseoporus) 유전체 내의 답토아미신 생합성 유전자 군 및 이의 포스미드 클론을 선별하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 답토마이신 생합성 유전자 군에 포함된 비 리보솜성 펩타이드 생합성 유전자 (dptBC NRPS)의 반복 서열 및 이의 코돈 리프로그래밍화 결과의 좌표를 나타낸 것이다.
도 4는 코돈 리프로그래밍화된 dptBC 유전자를 포함하는 답토마이신 생합성 유전자 군의 재조립을 위한 서브클로닝 및 이의 유전자 맵을 나타낸 것이다.
도 5는 효모 내 상동 재조합에 의한 신규 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군의 클로닝 과정 및 클론을 선별하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 스트렙토마이시스 리비단스(S. lividans)를 생산 균주로 하여, 이종 발현에 의한 답토마이신 유도체인 리포펩타이드 생산을 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 BAC 클론이 숙주 세포 내에서 안정적으로 복제 및 증폭되는 결과를 확인한 것이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시 예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시 예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시 예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시 예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 스트렙토마이시스 로제오스포로스 유전체 DNA 라이브러리 제작
답토마이신 생산 균주의 유전체 DNA를 추출하기 위해, 스트렙토마이시스 로제오스포로스 균주를 TSB배지에 접종하여 30
Figure 112020071376651-pat00001
의 배양기에서 3-4일간 배양하였다. 배양액으로부터 원심분리기를 이용해 균체를 분리한 후 염석(salting out)방법으로 유전체 DNA를 분리하였으며 이는 DNA 전기영동법으로 확인하였다.
상기 분리한 유전체 DNA 단편은 루시젠(Lucigen) 회사의 포스미드(Fosmid) 라이브러리 제작 키트의 방법에 따라 pCC1FOS (Genebank: EU140751)에 클로닝하고, 이를 EPI300T1 대장균 균주에 형질 전환하여 유전체 라이브러리를 제작하였다.
실시예 2. 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 클론 선별
상기 실시예 1에서 제작한 유전체 라이브러리를 대상으로 PCR 기반 스크리닝 방법을 이용하여 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 포스미드 클론인, pNRRL11379-7-24, pNRRL11379-248-6 및 pNRRL11379-178-42을 선별하였다. PCR 스크리닝에 사용된 프라이머 쌍의 DNA 염기서열은 하기 표 1과 같다.
단위체 이름 길이 서열 서열번호
pNRRL11379-7-24 dpt_Front_GT_FW1 20 CGATTGGTGAACGTGATGGT 1
dpt_Front_GT_RV1 20 CGAGGAGATGACCGATCCAG 2
pNRRL11379-248-6 dpt_Middle_GT_FW1 20 CGTGGTGGGTGACATCGAGA 3
dpt_ Middle _GT_RV1 20 CTGGACGACACAGAGATCCG 4
pNRRL11379-178-42 dpt_Back_GT_FW1 20 TACGAGAACCACGGCAGTCT 5
dpt_Back_GT_RV1 20 GCACCAGTCTTGCGCTCTTG 6
도 2에 도시한 바와 같이, 상기 선별한 세 개의 포스미드 클론에 대하여 생어 분석 방법을 통해 해당 클론의 말단 DNA 염기서열을 확인하였으며, 그 결과, pNRRL11379-248-6 클론의 말단이 pNRRL11379-7-24 및 pNRRL11379-178-42의 말단과 서로 부분적으로 중복됨을 확인하였다.
실시예 3. 비 리보솜성 펩타이드 생합성 유전자(dptBC)의 코돈 리프로그래밍화에 의한 리팩토링
상기 실시 예 2에서 선별한 pNRRL11379-248-6 클론은 dptBC 비-리보솜성 펩타이드 생합성 효소의 유전자를 포함하고 있으며, 이는 22,017 kb 길이의 DNA 염기서열로서, 7,339개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화한다. 하지만 dptBC 유전자 내 생합성 모듈간에 고도의 유사성을 가지는 서열을 포함하며, 다수의 반복되는 염기서열이 존재하고 있어, 정확한 반복 염기서열의 위치와 크기 및 중복 회수를 분석하기 위해 온라인 생물정보 소프트웨어인 Ugene 소프트웨어를 사용하여 dptBC 생합성 유전자의 DNA 염기서열을 분석하고, 이 정보를 바탕으로 코돈 리프로그래밍 방법을 디자인 하였다.
본 발명에서는 반복되는 DNA 염기서열을 제거하고자 dptBC 비리보솜성 펩타이드 생합성 효소의 아미노산 암호화 코돈 중에서 반복되는 DNA 염기서열에 포함되는 코돈 들을, 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈 들로 대체하였다. 또, 암호화 서열 중 희귀 코돈(rare codon)은 방선균 숙주에서 편중되어 사용되는 코돈(preferred codon)으로 대체하는 코돈 최적화 (Codon-optimization) 방법을 사용하였다.
그 결과, dptBC 비-리보솜성 펩타이드 생합성효소의 유전자 코돈은 도 3과 같이 리프로그래밍에 의해 재구성되었으며, 정확하게는 5,596-7,323 번째 염기서열 (SynthA region : 1,728), 12,217-15,225 번째 염기서열 (SynthB reion : 3,009), 16606-21951 번째 염기서열 (SynthC region: 5,346)이 각각 리프로그래밍에 의해 재구성되었다.
코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링 된 비-리보솜성 펩타이 생합성효소의 유전자(dptBC)를 클로닝하기 위해 젠스크립트(Genescript) 회사에 유전자 합성 서비스를 의뢰하여 공통염기서열(Overlapped sequences)을 포함한 각 6,500 bp, 4,804 bp, 2730 bp 크기의 DNA 염기서열을 갖는 3개의 DNA 분자를 화학적 방법으로 합성하였다.
실시예 4. 효모 내 상동재조합에 의한 답토마이신 생합성유전자 군 클로닝
먼저, 상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>에서 제작한 3개의 답토마이신 생합성 유전자를 포함하는 단편 클론들의 염기서열 들을 생어 분석법으로 확인하였고, 도 4의 내용과 같이 효모 내 상동재조합(Homologous recombination)을 이용해 BAC 벡터 시스템으로 각각 서브 클로닝(Sub-cloning)하였다.
구체적으로, <실시예 2> 및 <실시예 3>에서 제작한 답토마이신 생합성유전자를 포함하는 단편 클론들이 서브 클로닝 되어있는 (Sub-cloning) BAC 클론들을 SwaI 제한효소를 처리하여 선형화(linearization) 하고, HpaI 제한 효소로 처리된 캡쳐 BAC 벡터와 함께 염화 리튬 형질전환 방법으로 효모에 동시에 형질전환하였다. 이때, 효모의 상동재조합(Homologous recombination)에 의해서 재조립된 형질 전환체는 His이 결핍된 한천배지에서 선별되었고, 3-4일 동일한 구성성분을 갖는 배지에서 액체 배양 후 재조합 DNA를 분리하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 답토마이신 생합성유전자 군이 클로닝 된 BAC 클론은 PCR을 이용한 방법 및 DNA 전기영동 방법을 이용하여 확인되었다. PCR 스크리닝을 위한 프라이머 염기서열은 하기 표와 같다.
단위체 프라이머 이름 프라이머 쌍
번호		 서열
Reprogrammed daptomycin biosynthetic gene cluster dpt_Front_GT_FW1 1 GGTTACAGAAGTCGTGAA
dpt_Front_GT_RV1 TTCAAGCCCCTCTACGACGA
dpt_Front_GT_FW2 2 GTGAAGTCCCGGAGGCTCTC
dpt_Front_GT_RV2 CGTTTCGCGCTGACTTTCCA
dpt_Middle_GT_FW1 3 CGTGGTGGGTGACATCGAGA
dpt_Middle_GT_RV1 CTGGACGACACAGAGATCCG
dpt_Middle_GT_FW2 4 TACACGCGAGTGTTGAGGAT
dpt_Middle_GT_RV2 GAAGCCATGTGGTACTCGAC
dpt_Middle_GT_FW3 5 TTCCACTCCGTCAGGACACG
dpt_Middle_GT_RV3 CCGAAGATCTCATCGGCTTC
dpt_Middle_GT_FW4 6 CACGATCAGATCCAGCCCAC
dpt_Middle_GT_RV4 AACACGATTGACCGTGAGGT
dpt_Middle_GT_FW5 7 GCGGAGTTTGATCTGATCGT
dpt_Middle_GT_RV5 AACTGCACCTTATTGACGAC
dpt_Back_GT_FW1 8 ACAGGATCTCTTCACGGGCT
dpt_Back_GT_RV1 CCATCGGCGAACTGTATGTG
dpt_Back_GT_FW2 9 TACGAGAACCACGGCAGTCT
dpt_Back_GT_RV2 GCACCAGTCTTGCGCTCTTG
본 발명에서 제작된 리팩토링된 답토마이신 생합성유전자 군이 클로닝된 BAC 클론의 전체 DNA 염기서열은 일루미나 (Illumina) 차세대염기서열분석(NGS)법을 이용하여 동정하였다.
실시예 5. 리팩토링된 답토마이신 생합성유전자 군의 이종발현
상기에서 수행한 실험 결과를 바탕으로, 리팩토링된 답토마이신 생합성유전자군의 이종 발현 방법을 구축하였다.
구체적으로, 상기 코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링된 답토마이신 생합성유전자군 BAC 클론은 대장균의 접합성 형질전환 (Conjugative transfer method) 방법을 이용하여 이종 숙주인 스트렙토마이시스 리비단스 (Streptomyces lividans) 균주로 형질전환 하였으며, 형질전환체는 10 mM 염화마그네슘이 첨가된 ISP4 (BD bioscience, USA) 배지에서 항생제 내성 특이성을 이용해 선별하였다.
선별된 형질전환체는 아프라마이신(Apramycin) 날리딕산(Nalidixic acid)이 첨가된 ISP4 고체배지에서 7-8일간 배양 후 포자를 회수하여 100 ml 삼각플라스크의 R5A 액체배지에 접종하여 배양하였다.
도 6의 내용과 같이, 이종 숙주의 배양액 내 대사 산물의 정성 분석은 역상 액체크로마토그래피(Reverse-phased HPLC)법을 이용하여 분석하였다. 그 결과 답토마이신 유도체(A21978C)가 생산되었으며 HPLC/MS을 이용한 분자량 분석 시, 각각 1634(A21978C1), 1648(A21978C2), 1662(A21978C3)의 분자량을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자군 BAC 클론의 복제 및 증폭
본 발명에 의한 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 BAC 클론은 코돈 리프로그래밍화에 의해 반복적 염기서열을 제거하였으며, 유전적 엔지니어링(Genetic engineering)에 용이한 모델 생명체 (Model organism)인 효모, 대장균 혹은 방선균으로의 형질전환 및 유전적 복제가 가능한 BAC 클론 시스템을 구축하였다.
상기 <실시예 4>에서 선별된 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군이 포함된 BAC 클론은 기존의 반복적 염기서열을 보유한 답토마이신 생합성 유전자 군 BAC 클론에 비해 세포 내에서 안정적 유지 및 복제가 가능하다는 장점이 있다.
이를 확인하기 위한 방법으로, 기존의 답토마이신 생합성 유전자 군 그리고 본 발명의 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자군이 포함된 각각의 BAC 클론을 전기충격 형질전환 (Electro-transformation) 방법을 이용하여 대장균 내 형질전환 후, 클로람페니콜 (Chloramphenicol 12.5 μg/ml) 혹은 아프라마이신 (Aprmycin 50μg/ml) 을 함유한 LB (Difco broth miller, BD) 한천배지에서 항생제 내성 특이성을 이용하여 형질전환체를 선별하였다. 이후, 각 대장균 클론들은 클로람페니콜 (Chloramphenicol 12.5 μg/ml) 및 유도인자용액(Copy control induction solution) 이 첨가된 LB 액체배지에서 배양 (37℃ 24시간 배양) 후 세포 내 플라스미드(Plasmid)를 추출하였다. 추출한 각 답토마이신 생합성유전자군을 포함하는 BAC 클론은 도7에서 나타낸 바와 같이 0.5% 아가로즈겔 (Agarose gel)에서 135 V로 60분간 전기영동 (electrophoresis)하였다.
그 결과, 도 7에서 보듯이, 기존의 답토마이신 생합성 유전자 군이 포함되어 있는 BAC 클론은 세포 내 불안정한 유지 및 복제로 인한 다수의 DNA 절편 조각이 관찰 되었지만, 반면 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 BAC 클론은 기존의 답토마이신 생합성 유전자 군 클론에 비해 안정적 세포 내 유지 및 플라스미드 증폭이 가능하였다. 모델 생명체 내 안정적 유지 및 복제는 유전적 엔지니어링에 유용하게 이용될 수 있으며, 다른 이종 숙주로의 형질전환을 가능하게 한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 진술한 설명이 아니라 청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry academy coorperation of Konkuk university <120> Codon-reprogrammed daptomycin non-ribosomal peptide synthetase gene and uses thereof <130> 1067439 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces roseosporus <400> 1 cgattggtga acgtgatggt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces roseosporus <400> 2 cgaggagatg accgatccag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces roseosporus <400> 3 cgtggtgggt gacatcgaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces roseosporus <400> 4 ctggacgaca cagagatccg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces roseosporus <400> 5 tacgagaacc acggcagtct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces roseosporus <400> 6 gcaccagtct tgcgctcttg 20 <210> 7 <211> 1728 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reprogrammed region A <400> 7 gtcgtcccgg tgggtgtcgt cggtgagctg tacgtggccg gtgtcggtct cgcacggggg 60 tacctcggtc gtgccggtct cacggccgag cggttcgtgg cgtgcccgtt cggtgcgccg 120 ggtgagcgta tgtaccgtac 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Asn Gly Lys Val Asp Arg Ala 6725 6730 6735 Gly Leu Pro Val Pro Val Val Ser Val Ala Gly Phe Cys Ala Pro Ser 6740 6745 6750 Ser Pro Arg Glu Glu Val Leu Cys Gly Leu Phe Ala Glu Val Leu Gly 6755 6760 6765 Val Glu Arg Val Gly Val Asp Asp Gly Phe Phe Asp Leu Gly Gly Asp 6770 6775 6780 Ser Ile Leu Ser Ile Gln Leu Val Ala Arg Ala Arg Arg Ala Gly Leu 6785 6790 6795 6800 Glu Leu Ser Val Arg Asp Val Phe Glu Gly Arg Thr Val Arg Ala Leu 6805 6810 6815 Ala Ala Val Val Arg Gly Ser Asp Ala Gly Ala Val Gly Val Val Gly 6820 6825 6830 Gly Ala Glu Ile Val Leu Pro Gly Val Gly Glu Val Glu Arg Trp Pro 6835 6840 6845 Val Val Glu Trp Leu Ala Glu Arg Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Val 6850 6855 6860 Val Arg Gly Phe Asn Gln Ser Val Val Leu Ala Val Pro Ala Gly Leu 6865 6870 6875 6880 Val Trp Glu Glu Leu Arg Val Leu Leu Gly Ala Val Arg Asp Arg His 6885 6890 6895 Glu Ala Trp Arg Leu Arg Val Leu Asp Ser Gly Ala Leu Cys Val Asp 6900 6905 6910 Gly Val Val Pro Asp Asp Gly Ser Trp Ile Val Arg Cys Asp Leu Ser 6915 6920 6925 Gly Met Gly Val Asp Gly Gln Val Asp Ala Val Arg Ala Ala Ala Val 6930 6935 6940 Glu Ala Arg Ala Trp Leu Asp Pro Ser Val Gly Arg Val Val Arg Ala 6945 6950 6955 6960 Val Trp Leu Glu Arg Gly Gly Asp Arg Ser Gly Val Leu Val Leu Val 6965 6970 6975 Ala His His Leu Val Val Asp Gly Val Ser Trp Arg Val Val Leu Gly 6980 6985 6990 Asp Leu Ala Glu Gly Trp Ala Gln Val Arg Ser Gly Gly Arg Val Glu 6995 7000 7005 Leu Gly Val Val Gly Thr Ser Leu Arg Gly Trp Ala Ala Ala Leu Ala 7010 7015 7020 Glu Gln Gly Arg Arg Gly Glu Arg Ala Gly Glu Val Glu Leu Trp Ser 7025 7030 7035 7040 Arg Met Val Arg Gly Ala Asp Val Leu Val Gly Ser Arg Ala Val Asp 7045 7050 7055 Gly Ala Val Asp Val Phe Gly Gly Val Val Ser Val Asp Ser Arg Ala 7060 7065 7070 Ser Val Ser Val Ser Arg Ala Leu Leu Thr Glu Val Pro Ser Val Leu 7075 7080 7085 Gly Val Gly Val Gln Glu Val Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Ala Val 7090 7095 7100 Ala Arg Trp Arg Gly Arg Gly Gly Pro Val Val Val Asp Val Glu Gly 7105 7110 7115 7120 His Gly Arg Asn Glu Asp Ala Val Arg Gly Ala Asp Leu Ser Arg Thr 7125 7130 7135 Val Gly Trp Phe Thr Ser Val Tyr Pro Val Arg Val Pro Val Glu Ser 7140 7145 7150 Ala Ser Trp Asp Glu Val Arg Ala Gly Gly Pro Val Val Gly Arg Val 7155 7160 7165 Val Arg Glu Val Lys Glu Thr Leu Arg Ser Leu Pro Asp Gln Gly Leu 7170 7175 7180 Gly Tyr Gly Ile Leu Arg Tyr Leu Asp Pro Glu His Gly Pro Ala Leu 7185 7190 7195 7200 Ala Arg His Ala Thr Pro Gln Phe Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Arg Phe 7205 7210 7215 Thr Thr Gly Thr Asp Glu Thr Thr Thr Ala Asp Ala Leu Asp Arg Ala 7220 7225 7230 Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Ser Ala Ala Gly Gln Asp Pro Glu 7235 7240 7245 Leu Pro Val Ala His Ala Val Glu Phe Asn Ala Ile Thr Leu Asp Thr 7250 7255 7260 Pro Glu Gly Pro Arg Leu Gly Val Thr Trp Ser Trp Pro Thr Thr Leu 7265 7270 7275 7280 Leu Pro Glu Ser Arg Ile Arg Glu Leu Ala Arg Tyr Trp Asp Glu Ala 7285 7290 7295 Leu Glu Gly Leu Val Glu His Ala Arg His Pro Glu Ala Gly Gly Leu 7300 7305 7310 Thr Pro Ser Asp Val Gly Leu Ala Glu Leu Ser Phe Ala Glu Ile Glu 7315 7320 7325 Leu Leu Glu Asp Asp Trp Arg Thr Gln Gly 7330 7335

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  6. 서열번호 10으로 표시되는 코돈 리프로그래밍화된 dptBC 유전자를 포함하는 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 DNA 분자.
  7. 제6 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 박테리아 인공 염색체(BAC)로부터 유래된 DNA 서열을 포함하는 것인, DNA 분자.
  8. 제6 항 또는 제7 항의 DNA 분자를 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 코스미드, BAC 및 효모 인공 염색체(YAC)를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  10. 제8항의 벡터를 통해 형질 전환된 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 DNA를 가지고 있는 숙주 세포.
  11. 제10 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 스트렙토마이시스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이시스 로제오스포로스 (Streptomyces roseosporus), 및 스트렙토마이시스 시엘리칼라 (Streptomyces coelicolor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래된 것인 세포.
  12. ⅰ) 스트렙토마이스세스 로제오포러스(Streptomyces roseosporus)의 유전체 라이브러리로부터 dptBC를 포함하는 답토마이신 생합성 유전자 군을 포함하는 포스미드 클론을 선별하는 단계;
    ⅱ) 상기 답토마이신 생합성 유전자 군 중, 비-리보솜성 펩타이드 생합성 유전자 (dptBC, NRPS)의 반복 서열을 제거하기 위한 코돈 리프로그래밍화를 수행하는 단계;
    ⅲ) 상기 코돈 리프로그래밍화에 의해 리팩토링되어 서열번호 10으로 표시되는 dptBC 유전자를 클로닝하는 단계; 및
    ⅳ) 상기 클로닝된 각각의 유전자들을 포함하는 DNA 절편의 서브-클로닝을 통해 재조립하는 단계를 포함하는 리팩토링된 답토마이신 생합성 유전자 군을 클로닝 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 ⅱ) 단계의 코돈 리프로그래밍화는 dptBC 유전자의 5,596 내지 7,323번째 염기를 포함하는 A 영역, 12,217 내지 15,225 번째 염기를 포함하는 B 영역 및 16,606 내지 21,951번째 염기를 포함하는 C 영역 중 하나 이상의 영역을 각각 치환하여 재구성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 A 영역, B 영역 및 C 영역은 각각 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 합성 A영역, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 합성 B영역, 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 합성 C영역으로 치환되는 것인 방법.
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