KR20230095120A - 재조합 미생물, 이의 제조 방법 및 타가토스 생산에서의 응용 - Google Patents

재조합 미생물, 이의 제조 방법 및 타가토스 생산에서의 응용 Download PDF

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Abstract

유전공학에 의해 변형된 재조합 미생물 및 타가토스 생산에서 이의 응용, 상기 재조합 미생물의 제조 방법, 및 타가토스 생산 균주와 타가토스의 생산 방법을 제공한다. 상기 재조합 미생물은 포도당을 기질로 하거나 글리세롤과 포도당을 기질로 하여 타가토스를 생산하며, 형질전환을 통한 타가토스의 생산 효율이 높고 다중 효소 정제 공정 단계가 필요하지 않다.

Description

재조합 미생물, 이의 제조 방법 및 타가토스 생산에서의 응용
본 발명은 생명공학 및 유전공학 기술분야에 속하는 것으로, 구체적으로는 재조합 미생물, 재조합 미생물의 제조 방법 및 타가토스 생산에서의 응용, 및 타가토스 생산 균주와 타가토스의 생산 방법에 관한 것이다.
타가토스(Tagatose)는 천연적으로 존재하는 희귀한 케토헥소스(ketohexose)로서, 알도스 갈락토스(aldose galactose)의 이성질체이자 과당의 에피머(epimer)이기도 하다. 타가토스의 단맛 특성은 자당과 비슷하나 칼로리는 자당의 3분의 1에 불과하여 저칼로리 감미료로 불린다. 천연 타가토스는 주로 요구르트, 분유 등 유제품에 존재한다. 타가토스는 매우 신선하고 순수한 당도를 제공하며, 그 맛의 특성은 과당과 비슷하다. 연구에 따르면, 타가토스는 저칼로리, 저혈당지수, 충치 방지, 산화 방지, 프리바이오틱스(Prebiotics), 장 기능 개선, 면역 조절, 프로드러그(Prodrug) 등 중요한 생리적 기능을 가지고 있어 식품, 음료, 의약, 건강 관리 등 분야에 널리 응용될 수 있으며 거대한 경제적 가치를 가지고 있다[1].
현재 타가토스의 생산 방법에는 주로 화학적 합성법과 생물학적 형질전환법 두 가지가 있다. 화학적 합성법은 주로 갈락토스(galactose)를 원료로 하고 알칼리성 금속염을 촉매로 하여 갈락토스를 이성질화하여 타가토스-금속 수산화물 착물 침전을 생성한 다음 산을 이용하여 중화시켜 타가토스를 얻는다. 화학적 합성법은 에너지 소모가 많고 부반응이 많으며 생성물이 복잡하여 타가토스의 분리 및 정제 과정이 어렵고, 산, 알칼리, 금속 이온을 배출하므로 화학적 오염을 일으키기 쉽다.
생물학적 형질전환법은 화학적 합성법에 비해 형질전환 효율이 높고 특이성이 강하며 부산물이 적고 정제 단계가 간단하여 타가토스 생산의 주요 방향이 되고 있다. 생물학적 형질전환법은 주로 갈락티톨(Galactitol)이나 갈락토스를 원료로 하여 효소 또는 미생물의 촉매 작용 하에 상응한 기질을 타가토스로 형질전환시킨다. 그러나 갈락티톨은 가격이 상대적으로 높고 공급원이 한정되어 있어 산업화 생산의 원료로 사용하기에 적합하지 않다. 갈락토스를 원료로 하여 이성질화, 탈염, 탈색, 분리, 농축, 결정화 등의 단계를 거쳐 순수한 타가토스를 생산하는 것이 타가토스의 주류 생산 방법이다. 그러나 갈락토스는 타가토스로 완전히 형질전환될 수 없고, 최종 생성물은 갈락토스와 타가토스의 혼합물이므로, 순수한 타가토스를 분리하기 위해서는 복잡한 분리 공정이 필요하여 공정의 난이도와 원가가 증가하고; 동시에 갈락토스의 상대적으로 높은 가격으로 인해 타가토스의 생산 원가가 상승하게 된다[2-4]. 따라서 타가토스로의 형질전환 효율을 보장함과 동시에 타가토스 생산의 공정 원가와 난이도를 줄이는 것은 현재 시급히 해결해야 할 중요한 문제이다.
특허문헌 1에서는 프럭토키나아제(fructokinase), 6-포스페이트 타가토스 에피머라아제(6-phosphate tagatose epimerase) 및 6-포스페이트 타가토스 포스파타아제(6-phosphate tagatose phosphatase)를 촉매 효소로 포함하여 과당을 타가토스로 형질전환시킬 수 있는 다중 효소 촉매 형질전환에 의한 타가토스 생산 방법을 개시하였다. 그러나 프락토키나아제로 과당을 촉매하여 프락토스-6-포스페이트(fructose 6-phosphate)로 형질전환시키는 과정에서 아데노신 3인산(ATP, adenosine triphosphate)을 더 첨가하여 과당을 기질로 인산화시켜야 하는데, 고가의 ATP를 첨가하게 되면 타가토스의 생산 원가가 높아져 산업화 생산 가치가 떨어지게 된다.
특허문헌 2에서는 헥수로네이트 C4-에피머라아제(Hexuronate C4-epimerase) 변이체를 이용하여 과당을 타가토스로 형질전환시킬 수 있는 헥수로네이트 C4-에피머라아제 형질전환 활성이 개선된 헥수로네이트 C4-에피머라아제 변이체를 개시하였다. 그러나 변형된 헥수로네이트 C4-에피머라아제 변이체는 여전히 활성이 낮고 타가토스로의 형질전환 효율이 낮아 산업 생산 요구를 충족할 수 없는 문제가 존재한다.
특허문헌 3에서는 전분, 말토덱스트린(maltodextrin), 자당 등을 기질로 하여 형질전환을 통한 타가토스의 생산 공정에 응용될 수 있는 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제(tagatose-6-phosphate phosphatase)를 개시하였다. 그러나 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 여전히 효소 활성이 낮고 실제 산업 생산에서 이용 가치가 낮은 문제가 존재한다.
특허문헌 4에서는 전분 또는 전분 유도체를 기질로 하고, a-글루칸 포스파타아제(a-glucan phosphatase), 글루코스 포스포뮤타제(glucose phosphomutase), 글루코스 포스페이트 이소머라아제(glucose phosphate isomerase), 6-포스페이트 타가토스 에피머라아제(6-phosphate tagatose epimerase), 6-포스페이트 타가토스 포스파타아제(6-phosphate tagatose phosphatase) 및 무기 인산 이온을 첨가하여 다중 효소 분자 기계를 구축하고 다중 효소 촉매 반응을 수행하여 타가토스를 얻는 타가토스의 제조 방법을 개시하였다. 인용문헌 4의 제조 방법은 원료의 형질전환율과 타가토스의 수율을 향상시켰으나, 타가토스가 합성된 후 다양한 효소의 혼합액으로부터 타가토스를 정제해야 하므로 정제 공정의 단계와 난이도가 높아지게 된다.
인용문헌:
[1] Oh D-K: Tagatose: properties, applications, and biotechnological processes. App. Microbiol. Biotechnol. 2007, 76:1-8.
[2] Rhimi M, Aghajari N, Juy M, Chouayekh H, Maguin E, Haser R, Bejar S: Rational design of Bacillus stearothermophilus US100l-arabinose isomerase: Potential applications for d-tagatose production. Biochim. 2009, 91:650-653.
[3] Oh H-J, Kim H-J, Oh D-K: Increase in d-tagatose production rate by site-directed mutagenesis of l-arabinose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans. Biotechnol. Lett. 2006, 28:145-149.
[4] Bosshart A, Hee CS, Bechtold M, Schirmer T, Panke S: Directed divergent evolution of a thermostable D-tagatose epimerase towards improved activity for two hexose substrates. ChemBioChem 2015,16:592-601.
특허문헌1: WO2015016544A1
특허문헌2: CN109415715A
특허문헌3: WO2018004310A1
특허문헌4: CN106399427A
선행기술에 존재하는 기술적 과제를 감안하면, 예를 들어, 기존의 타가토스의 생산 방법은 원료 원가가 높고 형질전환율이 낮으며 다중 효소 정제 단계가 필요하여 타가토스의 생산 공정이 복잡해지는 단점이 있다. 이에 본 발명은 글리세롤(glycerol)과 포도당을 기질로 하여 형질전환을 통해 타가토스를 생산할 수 있고, 형질전환의 효율이 높고 환경 친화도가 높으며 다중 효소 정제가 필요하지 않고 생산 원가가 낮은 장점을 가지고 있어 타가토스의 산업화 생산에 적합한 재조합 미생물을 제공한다.
(1) 재조합 미생물로서, 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물과 비교하여,
(a) 포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphotransferase system)의 포도당 특이적 전달 단백질의 단백질 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
(b) 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제(tagatose-6-phosphate epimerase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성; 및
(c) 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제(tagatose-6-phosphate phosphatase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성 중 적어도 하나를 갖는다.
(2) (1)에 따른 재조합 미생물에 있어서, 상기 포도당 특이적 전달 단백질은,
(a1) 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 포도당 특이적 전달 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드(polypeptide);
(a2) 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 포도당 특이적 전달 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
(a3) 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되고,
선택적으로, 상기 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는,
(b1) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
(b2) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
(b3) 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되며,
선택적으로, 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는,
(c1) 서열번호 7 또는 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
(c2) 서열번호 7 또는 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
(c3) 서열번호 8 또는 서열번호 55로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택된다.
(3) (1) 또는 (2)에 따른 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물과 비교하여,
(d) 글루코키나아제(glucokinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성;
(e) 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제(glucose-6-phosphate isomerase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성;
(f) 프럭토스-6-포스페이트 키나아제(fructose-6-phosphate kinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
(g) 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
(h) 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
(i) 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성; 및
(j) HPr 키나아제(kinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성 중 적어도 하나를 더 갖는다.
(4) (3)에 따른 재조합 미생물에 있어서, 상기 글루코키나아제는,
(d1) 서열번호 9 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 글루코키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
(d2) 서열번호 9 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 글루코키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
(d3) 서열번호 10 또는 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되고,
선택적으로, 상기 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제는,
(e1) 서열번호 13 또는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
(e2) 서열번호 13 또는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고, 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
(e3) 서열번호 14 또는 서열번호 16로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택된다.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 고초균(Bacillus subtilis), 유산균 또는 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)으로부터 유래된다.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물의 제조 방법으로서, 상기 제조 방법은,
야생형 미생물 내 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자에 대해 유전자 녹아웃 또는 녹다운을 수행하는 단계; 및
타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 재조합 발현 벡터를 상기 재조합 미생물에 도입하는 단계, 또는, 상기 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 각각 발현하는 재조합 발현 벡터를 상기 재조합 미생물에 도입하는 단계를 포함한다.
(7) (6)에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 제조 방법은,
상기 재조합 미생물 내 글루코키나아제의 코딩 유전자의 발현 수준을 향상시키는 단계;
상기 재조합 미생물 내 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제의 코딩 유전자의 발현 수준을 향상시키는 단계;
상기 재조합 미생물 내 프럭토스-6-포스페이트 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계;
상기 재조합 미생물 내 피루베이트 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계;
상기 재조합 미생물 내 포스포글루코뮤타제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계;
상기 재조합 미생물 내 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계; 및
상기 재조합 미생물 내 HPr 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계 중 적어도 하나를 더 포함한다.
(8) (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물, 또는 (6) 또는 (7)에 따른 방법으로 제조된 재조합 미생물은 타가토스 생산에 응용된다.
(9) 타가토스 생산 균주로서, 상기 타가토스 생산 균주는 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물, 또는 (6) 또는 (7)에 따른 방법으로 제조된 재조합 미생물이다.
(10) (9)에 따른 타가토스 생산 균주에 있어서, 상기 타가토스 생산 균주는 포도당 또는 포도당과 글리세롤(glycerol)을 기질로 하고;
바람직하게는, 상기 타가토스 생산 균주는 대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰, 고초균, 유산균 또는 맥주효모균으로부터 유래된다.
(11) 타가토스의 생산 방법으로서, 상기 타가토스의 생산 방법은 포도당 또는 포도당과 글리세롤을 기질로 하고, (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물, (6) 또는 (7)에 따른 방법으로 제조된 재조합 미생물, 또는 (9) 내지 (10) 중 어느 한 항에 따른 타가토스 생산 균주를 이용하여 발효 반응을 진행하는 단계를 포함한다.
(12) (11)에 따른 타가토스의 생산 방법에 있어서, 상기 타가토스의 생산 방법은 상기 발효 반응이 종료된 후 상기 발효 반응액으로부터 타가토스를 분리하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 특이적 전달 단백질 활성이 감소 또는 소실되어 재조합 미생물에 의한 글리세롤 기질의 이용에 대한 포도당의 억제 효과를 감소 또는 제거함으로써 재조합 미생물이 글리세롤과 포도당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있도록 하는 재조합 미생물을 제공한다. 이는 원료 가격이 저렴하고 공급원이 광범위하며 형질전환을 통한 타가토스의 생산 효율이 높고 다중 효소 정제 공정 단계가 필요하지 않아 생산 원가 및 환경 오염을 줄여 중요한 산업 응용 가치를 가지고 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 재조합 미생물의 제조 방법은 제조 과정이 간단하고 구현에 용이하며, 포도당과 글리세롤을 기질로 하여 타가토스를 생산하는 재조합 미생물을 얻을 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 타가토스 생산 균주는 글리세롤과 포도당을 기질로 하고, 여기서, 글리세롤은 탄소원으로서 균주 내에서 대사를 진행하여 균주의 성장에 공급함으로써 균주의 성장에 적합한 조건에서 포도당을 이용한 타가토스 합성 경로를 진행하여 수율이 향상된 타가토스를 얻도록 한다.
일 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 타가토스의 생산 방법은 재조합 미생물 또는 타가토스 생산 균주로 발효 및 생산을 진행하여 원료의 형질전환 효율이 높고 타가토스 수율이 높으며, 공정이 간단하고 원가를 절감하는 장점을 가지고 있어 타가토스의 산업 규모화 생산에 적합하다.
도 1은 재조합 미생물이 포도당과 글리세롤을 기질로 하여 타가토스를 생산하는 대사 과정 모식도를 나타낸 것이다.
도 2A 내지 도 2D는 벡터 pTKSCS, pTKRed, pACYCDuet, pETDuet의 맵을 각각 나타낸 것이다. 여기서, 도 2A는 pTKSCS의 벡터 맵이고, 도 2B는 pTKRed의 벡터 맵이며, 도 2C는 pACYCDuet의 벡터 맵이고, 도 2D는 pETDuet의 벡터 맵이다.
도 3A 내지 도 3B는 벡터 pSS 및 pWB980의 맵을 나타낸 것이고, 여기서, 도 3A은 pSS의 벡터 맵이고, 도 3B는 pWB980의 벡터 맵이다.
도 4는 타가토스 생산 대장균 공학 균주 YH6-2로 글리세롤과 포도당을 발효시켜 생산된 타가토스의 고성능 액체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 타가토스 생산 고초균 공학 균주 YJ14-1로 글리세롤과 포도당을 발효시켜 생산된 타가토스의 고성능 액체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다.
정의
특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 “포함”과 함께 사용되는 경우, 단어 “일(a)” 또는 “하나(an)”는 “하나”를 의미할 수도 있고 “하나 이상”, “적어도 하나” 및 “하나 또는 그 초과”를 의미할 수도 있다.
특허청구범위 및 명세서에서 사용된 바와 같이, 단어 “포함”, “구비”, “포괄” 또는 “함유”는 내부에 포함되거나 개방적인 것을 말하며, 추가적인 인용되지 않은 소자 또는 방법의 단계를 배제하지 않는다.
명세서 전체에서, 용어 “약”은 하나의 값이 해당 값의 측정에 사용되는 장치 또는 방법의 오차의 표준편차를 포함함을 의미한다.
본 발명에 개시된 내용은 용어 “또는”의 정의로서 단지 대체물 및 “및/또는”을 지지하지만, 단지 대체물일 뿐이거나 또는 대체물 간 상호 배타적이라고 명시되지 않는 한, 특허청구범위에서의 용어 “또는”은 “및/또는”을 의미한다.
특허청구범위 또는 명세서에서 사용되는 경우 선택적/선택 가능한/바람직한 “수치 범위”는 수치의 양쪽 끝점을 포함할 뿐만 아니라, 전술한 수치의 끝점에 대해 상기 수치의 끝점 사이에 포함되는 모든 자연수를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “형질전환(converting)”은 다른 유기 또는 무기 촉매를 사용할 수도 있지만, 주로 하나 이상의 폴리펩타이드(효소)에 의해 하나의 분자로부터 다른 분자로의 화학적 전환을 촉매하는 것을 의미하며; 또한 기대하는 생성물의 몰량과 제한된 기질의 몰량의 비율(%를 단위로 함)을 의미할 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “폴리펩타이드”, “효소”, “폴리펩타이드 또는 효소”, “폴리펩타이드/효소”는 동일한 의미를 가지며, 본 발명에서 호환 가능하다. 전술한 용어는 복수의 아미노산이 펩타이드 결합을 통해 구성된 중합체를 의미하며, 포스페이트기 및 포르밀기의 변형 등을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 특이적 전달 단백질”은 포스포트랜스퍼라제 시스템(Phosphotransferase system, PTS)에 관여하는 포도당 특이적 전달 단백질을 의미한다. PTS 시스템은 박테리아, 진균 및 일부 고세균에 널리 존재하나 동식물에 존재하지 않는다. PTS 시스템은 유기체의 탄소 대사 조절을 매개하며, 유도물 억제(Inducer exclusion) 현상이 존재한다. 유도물 억제는 바람직한 탄소원(예를 들어, PTS 탄소원-포도당)이 수송 및 대사될 때 다른 바람직하지 않은 탄소원의 흡수 및 이용을 억제하는 것을 의미한다. 대장균을 예로 들면, 배지에 포도당과 다른 탄소원(예를 들어, 유당, 맥아당, 글리세롤 등)이 동시에 존재할 때, 포도당이 우선적으로 이용되어 인산기가 PTS 시스템의 포도당 특이적 전달 단백질 사이에서 캐스케이드 전달되고 포도당 특이적 전달 단백질의 탈인산화가 증가된다. 인산화되지 않은 포도당 특이적 전달 단백질은 각각의 수송체 또는 키나아제(예를 들어, LacY, MalK, GlpK)에 결합되어 유당, 맥아당 및 글리세롤과 같은 탄소원의 수송 및 인산화를 억제한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “타가토스-6-포스페이트 에피머라아제”(Tagatose-6-phosphate 4-epimerase, T6PE), 일명 6-포스페이트 타가토스 에피머라아제는 프럭토스-6-포스페이트와 타가토스-6-포스페이트의 상호 형질전환을 촉매할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는 아그로박테륨 Agrobacterium tumefaciens로부터 유래된다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는 균주 Agrobacterium tumefaciens str. C58로부터 유래된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “타가토스-6-포스페이트 포스파타아제”(Tagatose-6-phosphate phosphatase, T6PP), 일명 6-포스페이트 타가토스 포스파타아제는 타가토스-6-포스페이트로부터 타가토스로의 형질전환을 촉매할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 아키오글루부스속 Archaeoglobus fulgidus, Archaeoglobus profundus로부터 유래된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “글루코키나아제”(Glucokinase, glk)는 헥소키나아제 동종효소의 일종으로서, 포도당의 인산화 과정 및 글루코스-6-포스페이트(Glucose 6-phosphate, G6P)의 생산 과정에 관여하며, 이 과정에서 하나의 ATP를 소모하여 ADP(아데노신 2인산)로 형질전환시키며, Mg2+가 관여되어야 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 글루코키나아제는 대장균으로부터 유래되고; 다른 일부 실시형태에서, 글루코키나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰, 고초균, 유산균 또는 맥주효모균과 같이 포도당을 기질로 하여 당 대사가 일어나는 균주로부터 유래될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “글루코스-6-포스페이트 이소머라아제”(Glucose-6-phosphate isomerase, G6PI, pgi), 일명 6-포스페이트 글루코스 이소머라아제는 세포질 및 세포외액에 존재하고, 그 주요 기능은 D-글루코스-6-포스페이트(D-glucose-6-phosphate)와 D-프럭토스-6-포스페이트(D-fructose-6-phosphate) 사이의 상호 교환을 촉매하는 것으로 해당 및 포도당신생합성의 중요한 효소이며, 효소 활성뿐만 아니라 세포 및 성장 인자의 활성도 갖고 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제는 대장균으로부터 유래되고; 일부 실시형태에서, 본 발명의 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제는 고초균으로부터 유래되며; 다른 일부 실시형태에서, 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제는 코리네박테리움 글루타미쿰, 유산균 또는 맥주효모균과 같이 포도당을 기질로 하여 당 대사가 일어나는 균주로부터 유래될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “포스포글루코뮤타제”(Phosphoglucomutase, pgm), 일명 글루코스 포스포뮤타제는 글루코스-1-포스페이트와 글루코스-6-포스페이트의 상호 형질전환을 촉매할 수 있고, 당 대사에서 중요한 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 포스포글루코뮤타제는 대장균으로부터 유래되고; 일부 실시형태에서, 본 발명의 포스포글루코뮤타제는 고초균으로부터 유래되며; 다른 일부 실시형태에서, 포스포글루코뮤타제는 코리네박테리움 글루타미쿰, 유산균 또는 맥주효모균과 같이 포도당을 기질로 하여 당 대사가 일어나는 균주로부터 유래될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제”(Glucose 6-phosphatedehydrogenase)는 NAD+ 또는 NADP+를 수용체로 하고 공여체 CH-OH기에 작용하는 산화 환원 효소이다. 이러한 효소는 D-글루코스-6-포스페이트+NADP+=D-글루코노-1,5-락톤-6-포스페이트+NADPH+H+와 같은 효소 반응을 촉매할 수 있다. 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제는 주로 오탄당 인산 경로에 관여하며 β-D-글루코스와 같은 다른 당류에도 서서히 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제는 대장균으로부터 유래되고; 일부 실시형태에서, 본 발명의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제는 고초균으로부터 유래되며; 다른 일부 실시형태에서, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제는 코리네박테리움 글루타미쿰, 유산균 또는 맥주효모균과 같이 포도당을 기질로 하여 당 대사가 일어나는 균주로부터 유래될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “프럭토스-6-포스페이트 키나아제”, 일명 6-포스포프럭토키나아제(Phosphofructokinase, pfk)는 키나아제의 일종으로, 프럭토스-6-포스페이트에 작용할 수 있으며, 포스포프럭토키아나제 1(Phosphofructokinase-1, pfk-1)의 작용을 통해 프럭토스-1,6-디포스페이트(Fructose-1,6-diphosphate)를 얻을 수 있다. 포스포프럭토키아나제 2(Phosphofructokinase-2, pfk-2)의 작용을 통해 프럭토스-2,6-디포스페이트를 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 프럭토스-6-포스페이트 키나아제는 대장균으로부터 유래되고 pfkA 및 pfkB를 포함하며; 일부 실시형태에서, 본 발명의 프럭토스-6-포스페이트 키나아제는 고초균으로부터 유래되고 pfkA를 포함하며; 다른 일부 실시형태에서, 글루코키나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰, 유산균 또는 맥주효모균 등 당 대사가 일어나는 균주로부터 유래될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “피루베이트 키나아제”(Pyruvate kinase, PK), 일명 피루베이트 포스포트랜스퍼라제, 포스포피루베이트 키나아제는 인산기가 포스포에놀피루베이트(PEP)에서 ADP로 전달되는 반응을 촉매하여 하나의 피루브산 분자와 하나의 ATP 분자를 생성한다. 피루베이트 키나아제는 포스포에놀피루베이트와 ADP를 ATP와 피루베이트로 형질전환시키며, 해당 과정에서 주요한 속도 제한 효소 중의 하나이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 피루베이트 키나아제는 대장균으로부터 유래되고 pykA 및 pykF를 포함한다. 다른 일부 실시형태에서, 피루베이트 키나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰, 고초균, 유산균 또는 맥주효모균 등 균주로부터 유래될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “HPr 키나아제”(HPrK)는 포스포트랜스퍼라제 시스템(Phosphotransferase system, PTS)에 관여하는 특이적 전달 단백질 요소를 말한다. 포도당과 같은 PTS에 의해 운반되는 당류가 존재하는 조건에서, 프럭토스-1,6-디포스페이트는 HPr 키나아제(HPrK)가 HPr의 46번째 세린을 인산화하도록 촉진하여 인산화 생성물 P-Ser-HPr을 생성한다. 인산화 생성물 P-Ser-HPr은 나아가 이화생성물 조절 단백질(CcpA)과 결합하고, 결합 생성물은 HPr 키나아제 코딩 유전자 앞의 이화생성물 반응 요소(cre) 영역과 상호 작용하여 대사산물 억제 효과를 발휘함으로써 세포가 글리세롤을 세포 내로 운반하여 대사를 진행할 수 없도록 한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “효소 활성”, “단백질 활성”은 또한 “비활성” 또는 “비활성도”로 표현되며, 이들은 본 발명에서 동일한 의미를 가지므로 호환하여 사용 가능하다. 이는 폴리펩타이드(효소, 단백질) 1 mg 당 효소 활성(U/mg), 단백질 활성(U/mg)을 의미한다.
본 발명에서 용어 “발현”은 RNA 생산 및 단백질 생산에 관련된 임의의 단계를 포함하며, 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어 “코딩 유전자”는 일정한 규칙을 통해 단백질의 합성을 유도할 수 있는 DNA 분자를 말하며, 단백질 코딩 유전자가 단백질의 합성을 유도하는 과정은 일반적으로 이중가닥 DNA를 주형으로 하는 전사 과정과 mRNA를 주형으로 하는 번역 과정을 포함한다. 코딩 유전자는 CDS 서열(Coding Sequence)을 포함하고 있어 단백질을 코딩하는 mRNA의 생산을 유도할 수 있다. 본 발명에서 언급된 코딩 유전자는 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 특이적 전달 단백질, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제, 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제, 글루코키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제, 프럭토스-6-포스페이트 키나아제, 피루베이트 키나아제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, HPr 키나아제와 같은 단백질 및 효소의 코딩 유전자를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “야생형”은 자연계에서 발견될 수 있는 객체를 말한다. 예를 들어, 자연계의 소스로부터 분리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 미생물은 자연적으로 존재하는 것이다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, “자연적으로 존재하는”과 “야생형”은 동의어이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “미생물”은 육안으로 관찰하기 어려운 미세한 생물의 총칭이며, 박테리아, 진균 등을 포함한다. 미생물은 표면적과 부피의 비율이 매우 크므로 외부 환경과 신속하게 물질을 교환하여 대사산물을 생산할 수 있다. 본 발명에서 미생물은 특히 발효 및 배양되어 당류, 지질, 아미노산 및 뉴클레오티드와 같은 대사산물을 생산할 수 있는 발효 미생물을 말한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “재조합 미생물”은 유전공학적 방법으로 재조합하여 얻은 변형된 미생물을 말한다. 실시형태에는 재조합 유전자 도입, 미생물의 내인성 유전자에 대한 녹아웃, 녹다운 처리와 같은 작업이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 용어 “재조합 유전자”는 자연적으로 존재하지 않는 유전자이며, 재조합 유전자는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 단백질 코딩 서열을 포함한다. 실시형태에는 미생물에 도입된 외인성 유전자, 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 내인성 단백질 코딩 서열, 및 변형된 단백질 코딩 서열을 갖는 유전자가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 재조합 유전자는 미생물의 게놈, 미생물의 플라스미드 또는 미생물의 파지에 저장된다.
일부 실시형태에서, 단백질 활성이 감소 또는 소실된 특성, 단백질 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성, 효소 활성이 감소 또는 소실된 특성, 효소 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성을 갖는 재조합 미생물은, 미생물의 세포에 약한 프로모터 및 약한 리보솜 결합 부위를 도입하거나, 단백질 및 효소의 코딩 유전자에 대해 유전자 녹아웃 또는 녹다운을 진행하거나, 단백질 및 효소의 코딩 유전자에 무작위 단편을 삽입하여 단백질 및 효소가 활성을 상실하도록 하는 유전공학적 방법으로 변형된 재조합 미생물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 활성이 강화된 특성, 단백질 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성, 효소 활성이 강화된 특성, 효소 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성을 갖는 재조합 미생물은, 미생물의 세포에 강력한 프로모터 및 강력한 리보솜 결합 부위를 도입하거나, 비통합 단백질 및 효소의 재조합 발현 벡터를 도입하거나, 염색체 통합 단백질 및 효소의 재조합 발현 벡터를 도입하는 유전공학적 방법으로 변형된 재조합 미생물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 대장균을 야생형 미생물로 하여 유전공학적 방법으로 변형된 재조합 균주이고; 일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 고초균을 야생형 미생물로 하여 유전공학적 방법으로 변형된 재조합 균주이며; 다른 일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰, 유산균 또는 맥주효모균 등 발효 균주를 야생형 미생물로 하여 유전공학적 방법으로 변형된 재조합 균주일 수도 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “작동 가능하게 연결”은 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 배치되는 구조를 말한다. 예시적으로, 상기 조절 서열은 프로모터 및/또는 인핸서에 의해 코딩된 서열로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “내인성”은 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발현되거나 생산되는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 기타 화합물을 말한다. 다시 말해서, 내인성 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 기타 화합물은 외인성이 아니다. 예를 들어, 세포가 처음 자연계에서 분리될 때, 세포에는 “내인성” 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드가 존재한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “외인성”은 발현이 필요한 특정 세포 또는 유기체에서 자연적으로 발견되거나 발현되는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드를 말한다. 외인성 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 기타 화합물은 내인성이 아니다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “아미노산 돌연변이” 또는 “뉴클레오티드 돌연변이”는 “하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 치환, 반복, 결실 또는 추가”된 것을 포함한다. 본 발명에서, 용어 “돌연변이”는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 변화되는 것을 말한다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 용어“돌연변이”는 “치환”을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 “돌연변이”는 “보존적 돌연변이”로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서, 용어 “보존적 돌연변이”는 단백질의 기능을 정상적으로 유지할 수 있는 돌연변이를 말한다. 보존적 돌연변이의 대표적인 예는 보존적 치환이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “보존적 치환”은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 것과 관련된다. 당업계에는 알칼리성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 무전하 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신 및 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판), β-분지쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린 및 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 것을 포함하여 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 이미 정의되어 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, “보존적 치환”은 일반적으로 단백질의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산을 교환한다. 이러한 치환은 보존적일 수 있다. 보존적 치환으로 간주되는 치환으로서, 이 밖에도 보존적 돌연변이에는 유전자로부터 유래되는 개체 차이, 계통 및 종의 차이로 인해 자연적으로 발생하는 돌연변이도 포함된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “폴리뉴클레오티드”는 뉴클레오티드로 구성된 중합체를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 개별 단편의 형태일 수도 있고, 더 큰 뉴클레오티드 서열 구조의 구성 부분일 수도 있으며, 이는 수 또는 농도 상으로 적어도 한 번 분리된 뉴클레오티드 서열로부터 유래되고, 표준 분자 생물학적 방법으로(예를 들어, 클로닝 벡터를 사용하여) 식별, 조작 및 복구된 서열 및 그의 구성 요소인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 하나의 뉴클레오티드 서열이 하나의 DNA 서열(즉 A, T, G, C)을 통해 표시될 때, 이는 또한 하나의 RNA 서열(즉 A, U, G, C)을 포함하고, 여기서 “T”는 “U”에 의해 치환된다. 다시 말해서, “폴리뉴클레오티드”는 다른 뉴클레오티드(개별 단편 또는 전체 단편)로부터 제거된 뉴클레오티드 중합체를 말하거나, 또는 발현 벡터 또는 폴리시스트론 서열과 같은 더 큰 뉴클레오티드 구조의 구성 부분 또는 성분일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 cDNA 서열을 포함한다. “재조합 폴리뉴클레오티드”는 “폴리뉴클레오티드”의 일종이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “벡터”는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함함으로써 적합한 숙주에서 목적 유전자를 발현하는 DNA 구성물을 말한다. “재조합 발현 벡터”는 예를 들어 필요한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 데 사용되는 DNA 구조를 말한다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는, i) 프로모터 및 인핸서와 같이 유전자 발현에 조절 효과가 있는 유전적 요소의 집합; ii) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열; 및 iii) 개시 및 종결 서열을 적절히 전사 및 번역하는 전사 서브 유닛을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 방식으로 구축된다. 벡터의 성질은 중요하지 않으며, 플라스미드, 바이러스, 파지 및 트랜스포존을 포함한 모든 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열을 포함하되 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 효모 플라스미드 및 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 백시니아, 아데노 바이러스, 계두, 배큘로바이러스, SV40 및 슈도광견병과 같은 바이러스로부터 온 DNA 등이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “형질도입”은 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가지며, 즉 외인성 DNA를 숙주에 도입하는 과정을 말한다. 상기 형질전환 방법에는 핵산을 세포 내에 도입하는 모든 방법이 포함되고, 이러한 방법에는 전기천공법, 인산칼슘(CaPO4) 침전법, 염화칼슘(CaCl2) 침전법, 마이크로인젝션(microinjection)법, 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 및 리튬 아세테이트-DMSO법이 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “타가토스 수율”은 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가지며, 즉 전체 기질에서 타가토스의 생성에 소모된 기질의 백분율을 말한다. 본 발명에서, “타가토스 수율”과 “기질 형질전환율”은 서로 대체되어 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물의 배양은 당업계의 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있는 바, 웰 플레이트 배양, 쉐이크 플라스크 배양, 배치 배양, 연속 배양 및 유가 배양 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 온도, 시간, 배지의 pH 값 등 다양한 배양 조건은 실제 상황에 따라 적절히 조절될 수 있다.
달리 정의되거나 문맥에서 명시되지 않는 한, 본 발명의 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
타가토스 생산 균주
하나의 기술적 해결수단에서, 본 발명은 야생형 미생물에 대해 유전자 변형을 진행하는 방식을 통해 재조합 미생물을 얻고 나아가 타가토스를 생산한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 재조합 미생물은 대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰, 고초균, 유산균 또는 맥주효모균으로부터 유래된다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 대장균 및 고초균을 야생형 미생물로 하여 대장균 및 고초균을 각각 유전공학적으로 변형시킨다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자를 녹아웃시키거나, 또는 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자에 무작위 단편을 삽입하는 것과 같이 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 효소 활성을 제거하여 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 효소 활성이 상실되도록 한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질을 제거하는 목적은 글리세롤 기질의 이용에 대한 포도당의 억제 효과를 제거하기 위한 것이고, 대장균 또는 고초균의 재조합 균주는 글리세롤과 포도당을 동시에 기질로 사용하며, 여기서 글리세롤은 탄소원으로서 세포대사에 진입하여 균주의 성장을 공급하고, 균주는 성장할 수 있는 조건에서 포도당을 탄소원으로 사용하여 세포 내 타가토스 합성 경로에 진입함으로써 타가토스를 합성할 수 있다(도 1).
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 글루코키나아제 및 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제의 효소 활성을 강화하는 것을 통해, 예를 들어 강력한 프로모터를 도입하거나 플라스미드 에피솜 발현 형태를 사용하는 것을 통해 글루코키나아제 및 글루코스 6-포스페이트 이소머라아제의 코딩 유전자의 발현 강도를 강화하거나, 또는 염색체 통합 방식으로 다른 종으로부터 유래된 효소 활성이 보다 높은 글루코키나아제와 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제의 코딩 유전자를 통합한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 프럭토스-6-포스페이트 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃시키거나, 또는 프럭토스-6-포스페이트 키나아제의 코딩 유전자에 무작위 단편을 삽입하는 것과 같이 프럭토스-6-포스페이트 키나아제의 효소 활성을 제거하여 프럭토스-6-포스페이트 키나아제의 효소 활성이 상실되도록 한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 강력한 프로모터, 강력한 리포솜 결합 부위, 염색체 통합 또는 플라스미드 에피솜 발현 형태를 사용하는 것과 같이 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 효소 활성을 강화하여 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 코딩 유전자의 발현 강도를 강화한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 피루베이트 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃시키거나, 또는 피루베이트 키나아제의 코딩 유전자에 무작위 단편을 삽입하는 것과 같이 피루베이트 키나아제의 효소 활성을 제거하여 피루베이트 키나아제의 효소 활성이 상실되도록 한다.
포스포엔올피루브산(Phosphoenolpyruvate)은 글리세롤 대사 경로, 즉 글리세롤이 세포에 진입하여 글리세레이트-3-포스페이트(G3P)를 생성하는 단계에서, PEP가 고에너지 인산기를 제공하여 글리세롤의 G3P 생성을 촉진함으로써 글리세롤 대사 능력을 촉진하며, 이 단계는 균주가 글리세롤에 의존하여 성장하는 데 도움이 된다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 포스포글루코뮤타제의 코딩 유전자를 녹아웃시키거나, 또는 포스포글루코뮤타제의 코딩 유전자에 무작위 단편을 삽입하는 것과 같이 포스포글루코뮤타제의 효소 활성을 제거하여 포스포글루코뮤타제의 효소 활성이 상실되도록 한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제의 코딩 유전자를 녹아웃시키거나, 또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제의 코딩 유전자에 무작위 단편을 삽입하는 것과 같이 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제의 효소 활성을 감소하여 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제의 효소 활성이 상실되도록 하고; 약한 프로모터 또는 약한 리보솜 결합 부위를 통해 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제의 코딩 유전자의 전사 발현 수준을 감소시킴으로써 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제의 효소 활성을 감소시킨다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 HPr 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃시키거나, 또는 HPr 키나아제의 코딩 유전자에 무작위 단편을 삽입하는 것과 같이 HPr 키나아제의 효소 활성을 제거하여 HPr 키나아제의 효소 활성이 상실되도록 한다. HPr 키나아제를 제거하는 목적은 글리세롤 기질의 이용에 대한 포도당의 억제 효과를 제거하기 위한 것이다.
타가토스 생산 대장균 공학 균주의 구축 방법
하나의 기술적 해결수단에서, 본 발명은 타가토스 생산 대장균 공학 균주의 구축 방법을 제공한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 대장균 Escherichia coli의 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자 ptsG의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암(arm)을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 벡터 pTKSCS(도 2A) 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하고, 상동 재조합 단편을 대장균 MG1655(DE3)에 형질전환시키며, λ-Red 상동 재조합 기술로 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자 ptsG 유전자를 놋아웃시켜 재조합 균주 YH1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 대장균 Escherichia coli으로부터 유래된 글루코키나아제 코딩 유전자 glcK와 대장균 Escherichia coli으로부터 유래된 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 코딩 유전자 pgi를 증폭하고 발현 벡터 pACYCDuet에 구축하여, 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glcK-pgi를 얻고, 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glcK-pgi를 대장균 YH1에 형질전환시켜 재조합 균주 YH2를 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 대장균 Escherichia coli의 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 pfkA의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 벡터 pTKSCS(도 2A) 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하고, 상동 재조합 단편을 재조합 균주 YH2에 형질전환시키며, λ-Red 상동 재조합 기술로 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 pfkA 유전자를 녹아웃시켜 재조합 균주 YH3를 얻고, 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glcK-pgi를 대장균 YH3에 형질전환시켜 재조합 균주 YH3-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 대장균 Escherichia coli의 피루베이트 키나아제 코딩 유전자 pykF의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 벡터 pTKSCS(도 2A) 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하고, 상동 재조합 단편을 재조합 균주 YH3에 형질전환시키며, λ-Red 상동 재조합 기술로 피루베이트 키나아제 코딩 유전자 pykF유전자를 녹아웃시켜 재조합 균주 YH4를 얻고, 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glcK-pgi를 대장균 YH4에 형질전환시켜 재조합 균주 YH4-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 대장균 Escherichia coli의 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 벡터 pTKSCS(도 2A) 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하고, 상동 재조합 단편을 재조합 균주 YH4에 형질전환시키며, λ-Red 상동 재조합 기술로 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm유전자를 녹아웃시켜 재조합 균주 YH5를 얻고, 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glcK-pgi를 대장균 YH5에 형질전환시켜 재조합 균주 YH5-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 대장균 Escherichia coli의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 벡터 pTKSCS(도 2A) 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하고, 상동 재조합 단편을 재조합 균주 YH5에 형질전환시키며, λ-Red 상동 재조합 기술로 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf 유전자를 녹아웃시켜 재조합 균주 YH6을 얻고, 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glcK-pgi를 대장균 YH6에 형질전환시켜 재조합 균주 YH6-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 Agrobacterium tumefaciens str. C58로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 아키오글루부스속 Archaeoglobus fulgidus 및/또는 Archaeoglobus profundus로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 증폭하고, 발현 벡터 pETDuet에 구축하여 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 얻고, 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 대장균 MG1655(DE3)에 형질전환시켜 재조합 균주 MG1655-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YH1에 구축하여 재조합 균주 YH1-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YH2에 구축하여 재조합 균주 YH2-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YH3-1에 구축하여 재조합 균주 YH3-2를 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YH4-1에 구축하여 재조합 균주 YH4-2를 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YH5-1에 구축하여 재조합 균주 YH5-2를 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pETDuet-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YH6-1에 구축하여 재조합 균주 YH6-2를 얻는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시형태에서, 재조합 균주 BMG1655-1, YH1-1, YH2-1, YH3-2, YH4-2, YH5-2 및 YH6-2은 타가토스를 생산하는 대장균 공학 균주로 사용될 수 있으며, 포도당 또는 포도당과 글리세롤의 혼합 배지를 발효시켜 타가토스를 생산한다.
타가토스 생산 고초균 공학 균주의 구축 방법
하나의 기술적 해결수단에서, 본 발명은 타가토스 생산 고초균 공학 균주의 구축 방법을 제공한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 고초균 Bacillus subtilis 168 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제(uracil phosphoribosyltransferase) 코딩 유전자 upp의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 코딩 유전자upp의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 증폭하고 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR를 얻고, 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR를 고초균 SCK6에 형질전환시킨 다음, 분자 내 상동 재조합 기술을 통해 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 코딩 유전자upp 유전자가 녹아웃된 재조합 공학 균주YJ8을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 고초균 Bacillus subtilis 168의 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 코딩 유전자ptsG의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 코딩 유전자 ptsG의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 증폭하고 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR를 얻고, 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR를 고초균YJ8에 형질전환시킨 다음, 분자 내 상동 재조합 기술을 통해 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 코딩 유전자 ptsG가 녹아웃된 재조합 공학 균주YJ9을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 고초균 Bacillus subtilis 168의 HPr 키나아제 코딩 유전자 hprK의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 HPr 키나아제 코딩 유전자 hprK의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 증폭하고 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-hprK-FR를 얻고, 재조합 통합 벡터 pSS-hprK-FR를 고초균 YJ9에 형질전환시킨 다음, 분자 내 상동 재조합 기술을 통해 HPr 키나아제 코딩 유전자 hprK 유전자가 녹아웃된 재조합 공학 균주 YJ10을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 고초균 Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 글루코키나아제 코딩 유전자 glcK와 고초균 Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 코딩 유전자 pgi를 증폭하고 통합 벡터 pSS-ptsG-FR에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR-glcK-pgi를 얻고, 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR-glcK-pgi를 고초균 YJ10에 형질전환시킨 다음, 분자 내 상동 재조합 기술을 통해 글루코키나아제 코딩 유전자 glcK와 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 코딩 유전자 pgi가 게놈 상에 통합된 재조합 공학 균주 YJ11을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 고초균 Bacillus subtilis 168 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 pfkA의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 프럭토스 6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 pfkA의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 증폭하고 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-pfkA-FR를 얻고, 재조합 통합 벡터 pSS-pfkA-FR를 고초균 YJ11에 형질전환시킨 다음, 분자 내 상동 재조합 기술을 통해 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 pfkA 유전자가 녹아웃된 재조합 공학 균주 YJ12를 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 고초균 Bacillus subtilis 168 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 증폭하고 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-pgm-FR를 얻고, 재조합 통합 벡터 pSS-pgm-FR를 고초균 YJ12에 형질전환시킨 다음, 분자 내 상동 재조합 기술을 통해 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm유전자가 녹아웃된 재조합 공학 균주 YJ13을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 고초균 Bacillus subtilis 168 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 함유하는 프라이머를 설계하고, PCR 기술을 통해 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf의 업스트림 및 다운스트림 상동성 암을 증폭하고 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-zwf-FR를 얻고, 재조합 통합 벡터 pSS-zwf-FR를 고초균 YJ13에 형질전환시킨 다음, 분자 내 상동 재조합 기술을 통해 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf유전자가 녹아웃된 재조합 공학 균주 YJ14를 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 Agrobacterium tumefaciens str. C58로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 아키오글루부스속 Archaeoglobus fulgidus 및/또는 Archaeoglobus profundus로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 증폭하고 발현 벡터 pWB980에 구축하여 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 얻고, 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 고초균 SCK6에 형질전환시켜 재조합 균주 SCK6-1를 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YJ8에 구축하여 재조합 균주 YJ8-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YJ9에 구축하여 재조합 균주 YJ9-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YJ10에 구축하여 재조합 균주 YJ10-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YJ11에 구축하여 재조합 균주 YJ11-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YJ12에 구축하여 재조합 균주 YJ12-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YJ13에 구축하여 재조합 균주 YJ13-1을 얻는다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE와 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자를 보유하는 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 재조합 균주 YJ14에 구축하여 재조합 균주 YJ14-1을 얻는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시형태에서, 재조합 균주 SCK6-1, YJ8-1, YJ9-1, YJ10-1, YJ11-1, YJ12-1, YJ13-1 및 YJ14-1은 타가토스 생산 고초균 공학 균주로 사용될 수 있으며, 포도당 또는 포도당과 글리세롤의 혼합 배지를 발효시켜 타가토스를 생산한다.
타가토스의 생산 방법
하나의 기술적 해결수단에서, 본 발명은 타가토스의 생산 방법을 제공한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 타가토스의 생산 방법은,
(1) 타가토스 생산 균주를 발효 및 배양하는 단계; 및
(2) 발효 반응이 완료된 후 발효 반응액을 수집하고, 그 중에서 타가토스를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생산 과정에서 타가토스 생산 균주는 포도당과 글리세롤을 기질로 하여 효율적인 형질전환을 통해 타가토스를 생산함으로써 높은 수율의 타가토스를 얻을 수 있다. 본 발명의 타가토스 생산 방법은 포도당과 글리세롤을 기질로 하여 원료의 공급원이 광범위하고 가격이 저렴하며, 다중 효소 분리 공정이 필요하지 않아 환경 친화도가 높고 생산 원가가 낮으므로, 중요한 공정 응용 가치를 가지고 있다.
일부 실시형태에서, 타가토스를 생산하는 대장균 공학 균주를 발효 및 배양하는 배지는 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모추출물 및 10 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL, 암피실린 100 ng/mL)이고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가한다.
일부 실시형태에서, 타가토스를 생산하는 대장균 공학 균주를 발효 및 배양하는 배지는 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)이다.
일부 실시형태에서, 타가토스를 생산하는 고초균 공학 균주를 발효 및 배양하는 배지는 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)이고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가한다.
일부 실시형태에서, 타가토스를 생산하는 대장균 공학 균주를 발효 및 배양하는 배지는 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)이고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가한다.
일부 실시형태에서, 타가토스 생산 균주의 발효 및 배양 조건은 37℃, 200rpm조건에서 타가토스 생산 균주를 12 ~ 24 h 동안 배양하는 것이다.
일부 실시형태에서, 타가토스를 분리하는 방법은 당업계의 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 여과, 탈색, 탈염, 농축, 결정화 및 HPLC 검출을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
당업계에서 미생물을 조작하는 방법은 이미 공지되어 있으며, 예를 들어 “분자 생물학 현대적 방법”(Online ISBN： 9780471142720, John Wiley and Sons, Inc.), “미생물 대사 공학: 방법 및 프로토콜”(Qiong Cheng Ed., Springer) 및 “시스템 대사 공학: 방법과 프로토콜”(Hal S. Alper Ed., Springer)과 같은 간행물에 설명되어 있다.
본 발명에서, 서열번호 1 ~ 서열번호 17, 서열번호 54~서열번호 55로 표시되는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 번호의 의미는 다음과 같다.
서열번호 1로 표시되는 서열은 대장균 포도당 특이적 전달 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 2로 표시되는 서열은 대장균 포도당 특이적 전달 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 3으로 표시되는 서열은 고초균 포도당 특이적 전달 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 4로 표시되는 서열은 고초균 포도당 특이적 전달 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 5로 표시되는 서열은 아그로박테륨 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 6으로 표시되는 서열은 아그로박테륨 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 7로 표시되는 서열은 아키오글루부스속 Archaeoglobus fulgidus 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 8로 표시되는 서열은 아키오글루부스속 Archaeoglobus fulgidus 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 9로 표시되는 서열은 대장균 글루코키나아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 10으로 표시되는 서열은 대장균 글루코키나아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 11로 표시되는 서열은 고초균 글루코키나아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 12로 표시되는 서열은 고초균 글루코키나아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 13으로 표시되는 서열은 대장균 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 14로 표시되는 서열은 대장균 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 15로 표시되는 서열은 고초균 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 16으로 표시되는 서열은 고초균 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 17로 표시되는 서열은SceI-tet-SceI 단편의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 54로 표시되는 서열은 아키오글루부스속 Archaeoglobus profundus 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 55로 표시되는 서열은 아키오글루부스속 Archaeoglobus profundus 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
실시예
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 아래의 상세한 설명을 통해 더욱 분명해질 것이다. 그러나 이해해야 할 점은, 상세한 설명 및 구체적인 실시예(본 발명의 구체적인 실시형태를 나타내나)는 단지 설명의 목적으로만 제공되며, 이는 당업자가 이러한 상세한 설명을 읽은 후 본 발명의 사상 및 범위 내에서 이루어진 다양한 변경 및 변형을 명백히 알 수 있기 때문이다.
본 실시예에서 사용된 실험 기술과 실험 방법은 특별한 설명이 없는 한 통상적인 기술적 방법이며, 예를 들어, 아래의 실시예에서 구체적인 조건이 명시되지 않은 실험 방법은 통상적인 조건, 예를 들어 Sambrook 등, “분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)”에서 설명한 조건 또는 제조업체가 권장하는 조건에 따른다. 실시예에서 사용된 재료, 시약 등은 특별한 설명이 없는 한 모두 정상적인 상업 경로를 통해 얻을 수 있다.
실시예 1 대장균 재조합 균주 YH1의 구축
(1) KEGG 데이터베이스에서 대장균 MG1655로부터 유래된 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 코딩 유전자ptsG에 따라 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 코딩 유전자 ptsG의 업스트림 65 bp 상동성 단편 및 다운스트림 65 bp 상동성 단편을 포함하는 프라이머1 및 프라이머2를 설계하고, PCR를 통해 pTKSCS 벡터 상의 SceI-tet-SceI 단편(SceI-tet-SceI 단편의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17로 표시된 바와 같음)을 증폭하여 ptsG 유전자의 업스트림 및 다운스트림 상동성 단편을 함유하는 저항성 단편 1을 얻었다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 1, 서열은 서열번호 18: CAGGAGCACTCTCAATTATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTGTACGGCCCCAAGGTCCAAACGGTGA로 표시된 바와 같다.
프라이머2, 서열은 서열번호 19: GCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGATTAGTGGTTACGGATGTACTCATCCATCAGCGATTTACCGACCTTTTGCAGGTTAGCTTGGCTTCAGGGATGAGGCGCCATC로 표시된 바와 같다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH1의 구축
대장균 MG1655(DE3) 컴피턴트 세포(100 uL)를 제조하고, Red 재조합에 필요한 플라스미드 pTKRed(온도 민감성 플라스미드)(도 2B)에 옮긴 후, 스펙티노마이신(spectinomycin)이 포함된 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 플레이트에서 단일 콜로니(colony)를 골라 스펙티노마이신과 IPTG가 포함된 액체 LB에 옮기고 30℃에서 배양하여 pTKRed가 포함된 MG1655(DE3) 일렉트로컴피턴트(Electrocompetent)(100 uL)를 제조하였다.
단계 1에서 얻은 단편 1과 일렉트로컴피턴트를 골고루 혼합하고 전기 충격 후 스펙티노마이신과 클로람페니콜(chloramphenicol)이 포함된 이중 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 30 시간 동안 배양하였다. 단일 클론을 골라 콜로니 PCR 검증(검증 프라이머는 프라이머 3 및 프라이머 4임)을 수행한 결과, PCR 생성물의 크기가 약 1775bp(게놈 상의 ptsG 유전자 업스트림 단편, SceI-tet-SceI 단편 및 게놈 상의 ptsG 유전자 다운스트림 단편 함유)인 균주는 정확한 이중 교차 균주였다.
양성 클론을 골라 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스(arabinose)를 함유하는 LB 액체 배지에 옮겨 8 ~ 12 h 동안 배양한 후, 균액을 희석하여 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 플레이스에 도포하고 밤새 배양하였다. 이 단계의 목적은 아라비노스를 통해 SceI의 발현을 유도하고, SceI 인식 부위를 포함하는 DNA를 절단하여 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진함으로써 tet 저항성 단편을 제거하는 것이다. 플레이트 상에서 여러 단일 클론을 골라 다시 콜로니 PCR(검증 프라이머는 프라이머 3 및 프라이머 4임)을 수행한 결과, PCR 생성물이 약 382 bp인 DNA의 형질전환체는 양성 클론이었다. 양성 클론을 저항성이 없는 액체 LB로 옮기고 37℃에서 8 ~ 12시간 동안 배양하면 pTKRed 플라스미드를 제거할 수 있다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자가 녹아웃된 대장균 재조합 공학 균주, 즉 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 효소 활성이 없는 대장균 재조합 공학 균주를 저장하고 YH1로 명명하였다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 3, 서열은 서열번호 20: CGTCAAACAAATTGGCACTG로 표시된 바와 같다.
프라이머 4, 서열은 서열번호 21: GAACGTCAATAACCTGTTCG로 표시된 바와 같다.
실시예 2 대장균 재조합 균주 YH2의 구축
(1) 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glk-pgi의 구축
KEGG 데이터베이스에서 대장균으로부터 유래된 글루코키나아제 코딩 유전자 glk 및 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 코딩 유전자 pgi에 따라 프라이머 5 및 프라이머 6은 glk가 증폭되고, 프라이머 7 및 프라이머 8은 pgi가 증폭되도록 설계하였다. 프라이머 9 및 프라이머 10은 플라스미드 백본 pACYCDuet이 증폭되도록 설계하고(도 2C), 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법[5]을 사용하여 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glcK를 구축한 후; 프라이머 11 및 프라이머 12은 플라스미드 백본 pACYCDuet-glk이 증폭되도록 설계하고, 단순 클로닝 (simple cloning) 방법으로 재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glk-pgi를 얻었다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 5, 서열은 서열번호 22: GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGACAAAGTATGCATTAGTCGGTG로 표시된 바와 같다.
프라이머 6, 서열은 서열번호 23: CGATTACTTTCTGTTCGACTTAAGCATTACAGAATGTGACCTAAGGTCTG로 표시된 바와 같다.
프라이머 7, 서열은 서열번호 24: GTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGAAAAACATCAATCCAACGCAG로 표시된 바와 같다.
프라이머 8, 서열은 서열번호 25: TCAGCGGTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTAACCGCGCCACGCTTTATAGCG로 표시된 바와 같다.
프라이머 9, 서열은 서열번호 26: CAGACCTTAGGTCACATTCTGTAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCG으로 표시된 바와 같다.
프라이머 10, 서열은 서열번호 27: CACCGACTAATGCATACTTTGTCATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAAC로 표시된 바와 같다.
프라이머 11, 서열은 서열번호 28: GCTATAAAGCGTGGCGCGGTTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAG로 표시된 바와 같다.
프라이머 12, 서열은 서열번호 29: CTGCGTTGGATTGATGTTTTTCATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAAC로 표시된 바와 같다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH2의 구축
재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glk-pgi를 재조합 균주 YH1에 형질전환시켜 재조합 균주YH2를 얻었다.
실시예 3 대장균 재조합 균주 YH3-1의 구축
(1) pfkA 유전자가 녹아웃된 재조합 단편의 구축
KEGG 데이터베이스에서 대장균 Mg1655으로부터 유래된 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 pfkA에 따라 pfkA 업스트림 65 bp 상동성 단편 및 다운스트림 65 bp 상동성 단편의 프라이머 13 및 프라이머 14를 설계하고, PCR를 통해 pTKSCS 벡터 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하여 pfkA 유전자의 업스트림 및 다운스트림 상동성 단편을 함유하는 저항성 단편 2를 얻었다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 13, 서열은 서열번호 30: CATTCCAAAGTTCAGAGGTAGTCATGATTAAGAAAATCGGTGTGTTGACAAGCGGCGGTGATGCGtacggccccaaggtccaaacggtga로 표시된 바와 같다.
프라이머14, 서열은 서열번호 31: GCCTTTTTCCGAAATCATTAATACAGTTTTTTCGCGCAGTCCAGCCAGTCACCTTTGAACGGACGCGCATCACCGCCGCTTGTCAACACACCGATttggcttcagggatgaggcgccatc로 표시된 바와 같다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH3의 구축
대장균 YH2 컴피턴트 세포(100 uL)를 제조하고, Red 재조합에 필요한 플라스미드 pTKRed(온도 민감성 플라스미드)에 옮긴 후, 스펙티노마이신이 포함된 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 플레이트에서 단일 콜로니를 골라 스펙티노마이신과 IPTG가 포함된 액체 LB에 옮기고 30℃에서 배양하여 pTKRed가 포함된 YH2 일렉트로컴피턴트(100 uL)를 제조하였다.
단계 1에서 얻은 단편 2와 일렉트로컴피턴트를 골고루 혼합하고 전기 충격 후 스펙티노마이신과 클로람페니콜이 포함된 이중 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 30 시간 동안 배양하였다. 단일 클론을 골라 콜로니 PCR 검증(검증 프라이머는 프라이머 15 및 프라이머 16임)을 수행한 결과, PCR 생성물의 크기가 약 1757bp(게놈 상의 pfkA유전자 업스트림 단편, SceI-tet-SceI 단편 및 게놈 상의 pfkA 유전자 다운스트림 단편 함유)인 균주는 정확한 이중 교차 균주였다.
양성 클론을 골라 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 LB 액체 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후, 균액을 희석하여 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 플레이스에 도포하고 밤새 배양하였다. 이 단계의 목적은 아라비노스를 통해 SceI의 발현을 유도하고, SceI 인식 부위를 포함하는 DNA를 절단하여 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진함으로써 tet 저항성 단편을 제거하는 것이다. 플레이트 상에서 여러 단일 클론을 골라 다시 콜로니 PCR(검증 프라이머는 프라이머 15 및 프라이머 16임)을 수행한 결과, PCR 생성물이 약 364 bp인 DNA의 형질전환체는 양성 클론이었다. 양성 클론을 저항성이 없는 액체 LB에 옮기고 37℃에서 8 ~ 12시간 동안 배양하면 pTKRed 플라스미드를 제거할 수 있다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 프럭토스 6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자pfkA가 녹아웃된 대장균 재조합 공학 균주, 즉 프럭토스 6-포스페이드 키나아제 코딩 유전자 pfkA가 없는 대장균 재조합 공학 균주를 저장하고 YH3로 명명하였다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 15, 서열은 서열번호 32: CATTTGGCCTGACCTGAATC로 표시된 바와 같다.
프라이머 16, 서열은 서열번호 33: CGAACGCCTTATCCGGCCTAC로 표시된 바와 같다.
(3) 대장균 재조합 균주 YH3-1의 구축
재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glk-pgi를 재조합 균주 YH3에 형질전환시켜 재조합 균주YH3-1을 얻었다.
실시예 4 대장균 재조합 균주 YH4-1의 구축
(1)pykF 유전자가 녹아웃된 재조합 단편의 구축
KEGG 데이터베이스에서 대장균으로부터 유래된 피루베이트 키나아제 코딩 유전자 pykF에 따라pykF 업스트림 65 bp 상동성 단편 및 다운스트림 65 bp 상동성 단편의 프라이머 17 및 프라이머 18을 설계하고, PCR를 통해 pTKSCS 벡터 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하여 pykF 유전자의 업스트림 및 다운스트림 상동성 단편을 함유하는 저항성 단편 3을 얻었다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 17, 서열은 서열번호 34: AGACTGTCATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGAATCTGAAGAGATGtacggccccaaggtccaaacggtga로 표시된 바와 같다.
프라이머18, 서열은 서열번호 35: CAAAAGCAATATTACAGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGTGCACCCATCTCTTCAGATTCGGTTTTCGGTCCGATttggcttcagggatgaggcgccatc로 표시된 바와 같다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH4의 구축
대장균 YH3 컴피턴트 세포(100 uL)를 제조하고, Red 재조합에 필요한 플라스미드 pTKRed(온도 민감성 플라스미드)에 옮긴 후, 스펙티노마이신이 포함된 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 플레이트에서 단일 콜로니를 골라 스펙티노마이신과 IPTG가 포함된 액체 LB에 옮기고 30℃에서 배양하여 pTKRed가 포함된 YH3 일렉트로컴피턴트(100 uL)를 제조하였다.
단계 1에서 얻은 단편 3와 일렉트로컴피턴트를 골고루 혼합하고 전기 충격 후 스펙티노마이신과 클로람페니콜이 포함된 이중 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 30 시간 동안 배양하였다. 단일 클론을 골라 콜로니 PCR 검증(검증 프라이머는 프라이머 19 및 프라이머 20임)을 수행한 결과, PCR 생성물의 크기가 약 2310bp(게놈 상의 pykF 유전자 업스트림 단편, SceI-tet-SceI 단편 및 게놈 상의 pykF 유전자 다운스트림 단편 함유)인 균주는 정확한 이중 교차 균주였다.
양성 클론을 골라 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 LB 액체 배지에 옮겨 8 ~ 12 h 동안 배양한 후, 균액을 희석하여 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 플레이스에 도포하고 밤새 배양하였다. 이 단계의 목적은 아라비노스를 통해 SceI의 발현을 유도하고, SceI 인식 부위를 포함하는 DNA를 절단하여 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진함으로써 tet 저항성 단편을 제거하는 것이다. 플레이트 상에서 여러 단일 클론을 골라 다시 콜로니 PCR(검증 프라이머는 프라이머 15 및 프라이머 16임)을 수행한 결과, PCR 생성물이 약 364 bp인 DNA의 형질전환체는 양성 클론이었다. 양성 클론을 저항성이 없는 액체 LB로 옮기고 37℃에서 8 ~ 12시간 동안 배양하면 pTKRed 플라스미드를 제거할 수 있다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 피루베이트 키나아제 코딩 유전자 pykF가 녹아웃된 대장균 재조합 공학 균주, 즉 피루베이트 키나아제 코딩 유전자 pykF가 없는 대장균 재조합 공학 균주를 저장하고 YH4로 명명하였다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 19, 서열은 서열번호 36: AACTTCGGCACCAGACGTTG로 표시된 바와 같다.
프라이머 20, 서열은 서열번호 37: TCTGAACGTCAGAAGACAGC로 표시된 바와 같다.
(3) 대장균 재조합 균주 YH4-1의 구축
재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glk-pgi를 재조합 균주 YH4에 형질전환시켜 재조합 균주YH4-1을 얻었다.
실시예 5 대장균 재조합 균주 YH5-1의 구축
(1) pgm 유전자가 녹아웃된 재조합 단편의 구축
KEGG 데이터베이스에서 대장균으로부터 유래된 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm에 따라 pgm 업스트림 65 bp 상동성 단편 및 다운스트림 65 bp 상동성 단편의 프라이머 21 및 프라이머 22를 설계하고, PCR를 통해 pTKSCS 벡터 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하여 pgm 유전자 상에 다운스트림 상동성 단편을 함유하는 저항성 단편 4를 얻었다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 21, 서열은 서열번호 38: AAACGTTGCAGACAAAGGACAAAGCAATGGCAATCCACAATCGTGCAGGCCAACCTGCACAACAGtacggccccaaggtccaaacggtga로 표시된 바와 같다.
프라이머22, 서열은 서열번호 39: GTGTTTACGCGTTTTTCAGAACTTCGCTAACAATCTCAACCGCTTCTTTCTCAATCTGCTTGCGCTGTTGTGCAGGTTGGCCTGCACGATTGTGttggcttcagggatgaggcgccatc로 표시된 바와 같다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH5의 구축
대장균 YH4 컴피턴트 세포(100 μL)를 제조하고, Red 재조합에 필요한 플라스미드 pTKRed(온도 민감성 플라스미드)에 옮긴 후, 스펙티노마이신이 포함된 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 플레이트에서 단일 콜로니를 골라 스펙티노마이신과 IPTG가 포함된 액체 LB에 옮기고 30℃에서 배양하여 pTKRed가 포함된 YH4 일렉트로컴피턴트(100 μL)를 제조하였다.
단계 1에서 얻은 단편 4와 일렉트로컴피턴트를 골고루 혼합하고 전기 충격 후 스펙티노마이신과 클로람페니콜이 포함된 이중 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 30 시간 동안 배양하였다. 단일 클론을 골라 콜로니 PCR 검증(검증 프라이머는 프라이머 23 및 프라이머 24임)을 수행한 결과, PCR 생성물의 크기가 약 2200bp(게놈 상의 pgm 유전자 업스트림 단편, SceI-tet-SceI 단편 및 게놈 상의 pgm 유전자 다운스트림 단편 함유)인 균주는 정확한 이중 교차 균주였다.
양성 클론을 골라 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 LB 액체 배지에 옮겨 8 ~ 12 h 동안 배양한 후, 균액을 희석하여 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 플레이스에 도포하고 밤새 배양하였다. 이 단계의 목적은 아라비노스를 통해 SceI의 발현을 유도하고, SceI 인식 부위를 포함하는 DNA를 절단하여 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진함으로써 tet 저항성 단편을 제거하는 것이다. 플레이트 상에서 여러 단일 클론을 골라 다시 콜로니 PCR(검증 프라이머는 프라이머 15 및 프라이머 16임)을 수행한 결과, PCR 생성물이 약 807 bp인 DNA의 형질전환체는 양성 클론이었다. 양성 클론을 저항성이 없는 액체 LB로 옮기고 37℃에서 8 ~ 12시간 동안 배양하면 pTKRed 플라스미드를 제거할 수 있다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm가 녹아웃된 대장균 재조합 공학 균주, 즉 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm가 없는 대장균 재조합 공학 균주를 저장하고 YH5로 명명하였다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 23, 서열은 서열번호 40: CGGTCAAAACGATTAAAGACAAG로 표시된 바와 같다.
프라이머 24, 서열은 서열번호 41: CCAGTCGCCAGCTAATGATG로 표시된 바와 같다.
(3) 대장균 재조합 균주 YH5-1의 구축
재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glk-pgi를 재조합 균주 YH5에 형질전환시켜 재조합 균주YH5-1을 얻었다.
실시예 6 대장균 재조합 균주 YH6-1의 구축
(1) zwf 유전자가 녹아웃된 재조합 단편의 구축
KEGG 데이터베이스에서 대장균으로부터 유래된 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf에 따라 zwf 업스트림 65 bp 상동성 단편 및 다운스트림 65 bp 상동성 단편의 프라이머 21 및 프라이머 22를 설계하고, PCR를 통해 pTKSCS 벡터 상의 SceI-tet-SceI 단편을 증폭하여 zwf 유전자 상에 다운스트림 상동성 단편을 함유하는 저항성 단편 5를 얻었다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 25, 서열은 서열번호 42: GTTAACTTAAGGAGAATGACATGGCGGTAACGCAAACAGCCCAGGCCTGTGACCTGGTCATTTTCtacggccccaaggtccaaacggtga로 표시된 바와 같다.
프라이머26, 서열은 서열번호 43: AAGCGCAGATATTACTCAAACTCATTCCAGGAACGACCATCACGGGTAATCATCGCCACCGAGGCGAAAATGACCAGGTCACAGGCCTGGGCTGTttggcttcagggatgaggcgccatc로 표시된 바와 같다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH6의 구축
대장균 YH5 컴피턴트 세포(100 uL)를 제조하고, Red 재조합에 필요한 플라스미드 pTKRed(온도 민감성 플라스미드)에 옮긴 후, 스펙티노마이신이 포함된 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 플레이트에서 단일 콜로니를 골라 스펙티노마이신과 IPTG가 포함된 액체 LB에 옮기고 30℃에서 배양하여 pTKRed가 포함된 YH5 일렉트로컴피턴트(100 uL)를 제조하였다.
단계 1에서 얻은 단편 5와 일렉트로컴피턴트를 골고루 혼합하고 전기 충격 후 스펙티노마이신과 클로람페니콜이 포함된 이중 저항성 플레이트에 도포하여 30℃에서 30 시간 동안 배양하였다. 단일 클론을 골라 콜로니 PCR 검증(검증 프라이머는 프라이머 27 및 프라이머 28임)을 수행한 결과, PCR 생성물의 크기가 약 2306bp(게놈 상의 zwf 유전자 업스트림 단편, SceI-tet-SceI 단편 및 게놈 상의 zwf 유전자 다운스트림 단편 함유)인 균주는 정확한 이중 교차 균주였다.
양성 클론을 골라 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 LB 액체 배지에 옮겨 8 ~ 12 h 동안 배양한 후, 균액을 희석하여 스펙티노마이신, IPTG 및 아라비노스를 함유하는 플레이스에 도포하고 밤새 배양하였다. 이 단계의 목적은 아라비노스를 통해 SceI의 발현을 유도하고, SceI 인식 부위를 포함하는 DNA를 절단하여 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진함으로써 tet 저항성 단편을 제거하는 것이다. 플레이트 상에서 여러 단일 클론을 골라 다시 콜로니 PCR(검증 프라이머는 프라이머 27 및 프라이머 28임)을 수행한 결과, PCR 생성물이 약 913 bp인 DNA의 형질전환체는 양성 클론이었다. 양성 클론을 저항성이 없는 액체 LB로 옮기고 37℃에서 8 ~ 12시간 동안 배양하면 pTKRed 플라스미드를 제거할 수 있다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf가 녹아웃된 대장균 재조합 공학 균주, 즉 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf가 없는 대장균 재조합 공학 균주를 저장하고 YH6으로 명명하였다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 27, 서열은 서열번호 44으로 표시된 바와 같다. GATTTGCTCAAATGTTCCAGC
프라이머 28, 서열은 서열번호 45로 표시된 바와 같다. GCAACATGCTTTTCAAAGAG
(3) 대장균 재조합 균주 YH6-1의 구축
재조합 발현 벡터 pACYCDuet-glk-pgi를 재조합 균주 YH6에 형질전환시켜 재조합 균주YH6-1을 얻었다.
실시예 7 대장균 재조합 균주 MG1655-1의 구축
(1) 재조합 발현 벡터 pETDuet-t6pe-t6pp의 구축
KEGG 데이터베이스에서 Agrobacterium tumefaciens str. C58로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE 및 아키오글루부스속 Archaeoglobus fulgidus 또는 Archaeoglobus profundus로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자에 따라 프라이머 29 및 프라이머 30은 t6pe가 증폭되고, 프라이머 31 및 프라이머 32는 t6pp가 증폭되도록 설계하였다. 프라이머 33 및 프라이머 34은 플라스미드 백본 pETDuet이 증폭되도록 설계하고(도 2D), 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법[5]을 사용하여 재조합 발현 벡터 pETDuet-t6pe를 구축한 후; 프라이머 35 및 프라이머 36은 플라스미드 백본 pETDuet-t6pe가 증폭되도록 설계하고, 단순 클로닝(simple cloning) 방법으로 재조합 발현 벡터 pETDuet-t6pe-t6pp를 얻었다. 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.
프라이머 29, 서열은 서열번호 46: GTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGAACACCGAACATCCGCTGAAAAATG로 표시된 바와 같다.
프라이머 30, 서열은 서열번호 47: CGGTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTACTCGAGAATCAGTTTGAATTCACCG로 표시된 바와 같다.
프라이머 31, 서열은 서열번호 48: GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGTTCAAGCCGAAAGCGATCGCG로 표시된 바와 같다.
프라이머 32, 서열은 서열번호 49: GATTACTTTCTGTTCGACTTAAGCATTAACGCAGCAGGCCCAGAAACTGCAG로 표시된 바와 같다.
프라이머 33, 서열은 서열번호 50: CATTTTTCAGCGGATGTTCGGTGTTCATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAAC로 표시된 바와 같다.
프라이머 34, 서열은 서열번호 51: CGGTGAATTCAAACTGATTCTCGAGTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCG로 표시된 바와 같다.
프라이머 35, 서열은 서열번호 52:. CTGCAGTTTCTGGGCCTGCTGCGTTAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATC로 표시된 바와 같다
프라이머 36, 서열은 서열번호 53: CGCGATCGCTTTCGGCTTGAACATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC로 표시된 바와 같다.
(2) 대장균 재조합 균주 MG1655-1의 구축
재조합 발현 벡터 pETDuet-t6pe-t6pp를 대장균 MG1655(DE3)에 형질전환시켜 재조합 균주 MG1655-1을 얻었다.
동일한 방법으로 재조합 발현 벡터 pETDuet-t6pe-t6pp를 대장균 재조합 균주 YH1, YH2, YH3-1, YH4-1, YH5-1, YH6-1에 도입하여 타가토스6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스6-포스페이트 포스파타아제 효소 활성이 강화된 대장균 재조합 균주 YH1-1, YH2-1, YH3-2, YH4-2, YH5-2, YH6-2를 얻었다.
실시예 8 타가토스 생산에서 대장균 재조합 균주 Mg1655-1의 응용
(1) 대장균 재조합 균주 MG1655-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모추출물 및 10 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 MG1655-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 1.0%였다.
(2) 대장균 재조합 균주 MG1655-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)를 선택하고 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 MG1655-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 1.0%였다.
실시예 9 타가토스 생산에서 대장균 재조합 균주 YH1-1의 응용
(1) 대장균 재조합 균주 YH1-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH1-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 2.0%였다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH1-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)를 선택하고 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH1-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 6.0%였다.
실시예 10 타가토스 생산에서 대장균 재조합 균주 YH2-1의 응용
(1) 대장균 재조합 균주 YH2-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모추출물 및 10 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH2-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 2.0%였다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH2-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)를 선택하고 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH2-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 8.0%였다.
실시예 11 타가토스 생산에서 대장균 재조합 균주 YH3-2의 응용
(1) 대장균 재조합 균주 YH3-2의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모추출물 및 5 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL, 암피실린 100ng/mL)를 선택하고 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH3-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 20%였다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH3-2의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)를 선택하고 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH3-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 30%였다.
실시예 12 타가토스 생산에서 대장균 재조합 균주 YH4-2의 응용
(1) 대장균 재조합 균주 YH4-2의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모추출물 및 5 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL, 암피실린 100ng/mL)를 선택하고 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH4-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 16%였다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH4-2의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)를 선택하고 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH4-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 32%였다.
실시예 13 타가토스 생산에서 대장균 재조합 균주 YH5-2의 응용
(1) 대장균 재조합 균주 YH5-2의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물 및 5 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL, 암피실린 100ng/mL)를 선택하고 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH5-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 24%였다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH5-2의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)를 선택하고 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH5-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 60%였다.
실시예 14 타가토스 생산에서 대장균 재조합 균주 YH6-2의 응용
(1) 대장균 재조합 균주 YH6-2의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 LB 배지(10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모추출물 및 5 g/L 염화나트륨, 카나마이신 25 ng/mL, 암피실린 100ng/mL)를 선택하고 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH6-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 41%였다.
(2) 대장균 재조합 균주 YH6-2의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 M9Y 배지(10 g/L 글리세롤, 20 g/L 포도당, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 1 g/L NH4Cl, 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 및 2 g/L 효모추출물)를 선택하고 37℃, 200 rpm 조건에서 대장균 재조합 균주 YH6-2를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 79%였다.
도 4는 대장균 공학 균주 YH6-2로 포도당과 글리세롤을 발효시켜 생산된 타가토스의 고성능 액체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것으로, 대장균 재조합 균주는 포도당과 글리세롤을 동시에 발효시켜 효율적으로 타가토스를 생산할 수 있으며, 발효 반응액의 성분이 단순하여 타가토스의 분리 및 정제가 용이하다.
실시예 15 고초균 재조합 균주 YJ8의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 고초균Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 코딩 유전자 upp의 유전자 서열에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 코딩 유전자 업스트림 500 bp 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻으며, 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법으로 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 YJ8의 구축
고초균 균주 SCK6 슈퍼컴피턴트 세포[6](200 μL)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR(1 μg)와 고초균 균주 SCK6 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 클로람페니콜(5 μg/mL)을 함유한 고체 배지 LB(효모추출물 5 g/L, 펩톤10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 골라 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp DNA 단편 및 2000 bp DNA 단편의 두 밴드(여기서1000 bp DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-upp-FR에서 벡터의 upp 코딩 유전자 업스트림 및 다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp DNA 단편의 크기는 게놈 상에 upp 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, upp 코딩 유전자 및 upp 코딩 유전자 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기임)는 양성 클론이었다.
양성 클론을 골라 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후 200 uL의 균액을 취하여 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음, 멸균수로 재현탁하고 5-FU MSM(Minimal Salt Medium) 배지 고체 플레이트(40% glucose 20.0 ml/L, 4% glutamine 50.0 mL/L, 0.5% histidine 10.0 mL/L, 1% vitamin B1 1.0 mL/L, 20 mM 5-FU 500 μL/L, 10×spizizen 100.0 mL/L, 1000×미량원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지에서 배양함으로써 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진하고, 5-FU MSM 배지에서 스크리닝 및 배양하여 upp가 녹아웃된 목적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU MSM 배지 고체 플레이트 상에서 여러 콜로니를 골라 다시 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만 가진 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 코딩 유전자가 녹아웃된 고초균 재조합 공학 균주, 즉 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 효소 활성이 없는 고초균 재조합 공학 균주를 저장하고 YJ8로 명명하였다.
실시예 16 고초균 재조합 균주YJ9의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 고초균Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 코딩 유전자 ptsG의 유전자 서열에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 코딩 유전자 업스트림 500 bp 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻으며, 심플 클로닝(simple cloning) 연결 방법으로 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 YJ9의 구축
고초균 균주 YJ8 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR(1 μg)와 고초균 균주 YJ8 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 클로람페니콜(5 μg/mL)을 함유한 고체 배지 LB(효모추출물 5 g/L, 펩톤10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 골라 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp DNA 단편 및 2000 bp DNA 단편의 두 밴드(여기서1000 bp DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-ptsG-FR에서 벡터의 ptsG 코딩 유전자 업스트림 및 다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp DNA 단편의 크기는 게놈 상에 ptsG 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, ptsG 코딩 유전자 및 ptsG 코딩 유전자 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기임)는 양성 클론이었다.
양성 클론을 골라 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후 200 uL의 균액을 취하여 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음, 멸균수로 재현탁하고 5-FU MSM 배지 고체 플레이트(40% glucose 20.0 ml/L, 4% glutamine 50.0 mL/L, 0.5% histidine 10.0 mL/L, 1% vitamin B1 1.0 mL/L, 20 mM 5-FU 500 μL/L, 10×spizizen 100.0 mL/L, 1000×미량원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지에서 배양함으로써 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진하고, 5-FU MSM 배지에서 스크리닝 및 배양하여 ptsG가 녹아웃된 표적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU MSM 배지 고체 플레이트 상에서 여러 콜로니를 골라 다시 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만 가진 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자가 녹아웃된 고초균 재조합 공학 균주, 즉 PTS 시스템 포도당 특이적 전달 단백질 효소 활성이 없는 고초균 재조합 공학 균주를 저장하고 YJ9로 명명하였다.
실시예 17 고초균 재조합 균주YJ10의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-hprK-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 고초균Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 HPr 키나아제 코딩 유전자 hprK의 유전자 서열에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 HPr 키나아제 코딩 유전자 업스트림 500 bp 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻으며, 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법으로 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-hprK-FR를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 YJ10의 구축
고초균 균주 YJ9 슈퍼컴피턴트 세포(200 uL)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-hprK-FR (1 ug)와 고초균 균주 YJ9 슈퍼컴피턴트 세포(200 uL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 클로람페니콜(5 ug/mL)을 함유한 고체 배지 Lb(효모추출물 5 g/L, 펩톤10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 골라 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp DNA 단편 및 2000 bp DNA 단편의 두 밴드(여기서1000 bp DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-hprK-FR에서 벡터의 hprK 코딩 유전자 업스트림 및 다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp DNA 단편의 크기는 게놈 상에 hprK 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, hprK 코딩 유전자 및 hprK 코딩 유전자 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기임)는 양성 클론이었다.
양성 클론을 골라 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후 200 uL의 균액을 취하여 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음, 멸균수로 재현탁하고 5-FU MSM 배지 고체 플레이트(40% glucose 20.0 ml/L, 4% glutamine 50.0 mL/L, 0.5% histidine 10.0 mL/L, 1% vitamin B1 1.0 mL/L, 20 mM 5-FU 500 μL/L, 10×spizizen 100.0 mL/L, 1000×미량원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지에서 배양함으로써 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진하고, 5-FU MSM 배지에서 스크리닝 및 배양하여 ptsG가 녹아웃된 표적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU MSM 배지 고체 플레이트 상에서 여러 콜로니를 골라 다시 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만 가진 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 HPr 키나아제 코딩 유전자가 녹아웃된 고초균 재조합 공학 균주, 즉 HPr 키나아제 효소 활성이 없는 고초균 재조합 공학 균주를 저장하고 YJ10로 명명하였다.
실시예 18 고초균 재조합 균주YJ11의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR-glcK-pgi의 구축
KEGG 데이터베이스에서 고초균Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 글루코키나아제 코딩 유전자 glcK의 유전자 서열 및 고초균 Bacillus subtilis 168로부터 유래된 글루코스 6-포스페이트 이소머라아제 코딩 유전자 pgi의 유전자 서열에 따라 glcK 유전자 및 pgi 유전자가 증폭된 프라이머를 설계하고, 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법으로 통합 벡터 pSS-ptsG-FR에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR-glcK-pgi를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 YJ11의 구축
고초균 균주 YJ10 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-ptsG-FR-glcK-pgi(1 ug)와 고초균 균주 YJ10 슈퍼컴피턴트 세포(200 uL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 클로람페니콜(5 ug/mL)을 함유한 고체 배지 Lb(효모추출물 5 g/L, 펩톤10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 골라 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 2000 bp DNA 단편 및 4000 bp DNA 단편의 두 밴드(여기서2000 bp DNA 단편의 크기는 게놈에 ptsG 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, ptsG 코딩 유전자 및 ptsG 코딩 유전자 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기이고, 4000 bp DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-ptsG-FR-glcK-pgi에 ptsG 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, glcK 유전자, pgi 유전자 및 ptsG 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기임)는 양성 클론이었다.
양성 클론을 골라 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후 200 uL의 균액을 취하여 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음, 멸균수로 재현탁하고 5-FU MSM 배지 고체 플레이트(40% glucose 20.0 ml/L, 4% glutamine 50.0 mL/L, 0.5% histidine 10.0 mL/L, 1% vitamin B1 1.0 mL/L, 20 mM 5-FU 500 μL/L, 10×spizizen 100.0 mL/L, 1000×미량원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지에서 배양함으로써 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진하고, 5-FU MSM 배지에서 스크리닝 및 배양하여 glcK 유전자 및 pgi 유전자가 ptsG 유전자 위치에 통합된 목적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU MSM 배지 고체 플레이트 상에서 여러 콜로니를 골라 다시 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 4000 bp의 DNA 단편만 가진 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 글루코키나아제코딩 유전자 glcK의 유전자 서열 및 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 코딩 유전자 pgi가 ptsG 위치에 통합된 고초균 재조합 공학 균주, 즉 글루코키나아제 및 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 효소 활성이 강화된 고초균 재조합 공학 균주를 저장하고 YJ11로 명명하였다.
실시예 19 고초균 재조합 균주 YJ12의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-pfkA-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 고초균Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 pfkA의 유전자 서열에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자 업스트림 500 bp상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻으며, 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법으로 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-pfkA-FR를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 YJ12의 구축
고초균 균주 YJ11 슈퍼컴피턴트 세포(200 uL)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-pfkA-FR (1 ug)와 고초균 균주 YJ11 슈퍼컴피턴트 세포(200 uL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 클로람페니콜(5 ug/mL)을 함유한 고체 배지 Lb(효모추출물 5 g/L, 펩톤10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 골라 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp DNA 단편 및 2000 bp DNA 단편의 두 밴드(여기서1000 bp DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-pfkA-FR에서 벡터의 pfkA 코딩 유전자 업스트림 및 다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp DNA 단편의 크기는 게놈 상에 pfkA 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, pfkA 코딩 유전자 및 pfkA 코딩 유전자 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기임)는 양성 클론이었다.
양성 클론을 골라 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후 200 uL의 균액을 취하여 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음, 멸균수로 재현탁하고 5-FU MSM 배지 고체 플레이트(40% glucose 20.0 ml/L, 4% glutamine 50.0 mL/L, 0.5% histidine 10.0 mL/L, 1% vitamin B1 1.0 mL/L, 20 mM 5-FU 500 μL/L, 10×spizizen 100.0 mL/L, 1000×미량원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지에서 배양함으로써 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진하고, 5-FU MSM 배지에서 스크리닝 및 배양하여 pfkA가 녹아웃된 목적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU MSM 배지 고체 플레이트 상에서 여러 콜로니를 골라 다시 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만 가진 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 코딩 유전자가 녹아웃된 고초균 재조합 공학 균주, 즉 프럭토스-6-포스페이트 키나아제 효소 활성이 없는 고초균 재조합 공학 균주를 저장하고 YJ12로 명명하였다.
실시예 20 고초균 재조합 균주 YJ13의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-pgm-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 고초균Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm의 유전자 서열에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 업스트림 500 bp 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻으며, 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법으로 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-pgm-FR를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 YJ13의 구축
고초균 균주 YJ12 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-pgm-FR(1 μg)와 고초균 균주 YJ12 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 클로람페니콜(5 μg/mL)을 함유한 고체 배지 LB(효모추출물 5 g/L, 펩톤10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 골라 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp DNA 단편 및 2000 bp DNA 단편의 두 밴드(여기서1000 bp DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-pgm-FR에서 벡터의 pgm 코딩 유전자 업스트림 및 다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp DNA 단편의 크기는 게놈 상에 pgm 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, pgm 코딩 유전자 및 pgm 코딩 유전자 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기임)는 양성 클론이었다.
양성 클론을 골라 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후 200 uL의 균액을 취하여 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음, 멸균수로 재현탁하고 5-FU MSM 배지 고체 플레이트(40% glucose 20.0 ml/L, 4% glutamine 50.0 mL/L, 0.5% histidine 10.0 mL/L, 1% vitamin B1 1.0 mL/L, 20 mM 5-FU 500 μL/L, 10×spizizen 100.0 mL/L, 1000×미량원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지에서 배양함으로써 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진하고, 5-FU MSM 배지에서 스크리닝 및 배양하여 pgm이 녹아웃된 목적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU MSM 배지 고체 플레이트 상에서 여러 콜로니를 골라 다시 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만 가진 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자가 녹아웃된 고초균 재조합 공학 균주, 즉 포스포글루코뮤타제 효소 활성이 없는 고초균 재조합 공학 균주를 저장하고 YJ13로 명명하였다.
실시예 21 고초균 재조합 균주 YJ14의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-zwf-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 고초균Bacillus subtilis 168으로부터 유래된 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 zwf의 유전자 서열에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자 업스트림 500 bp 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻으며, 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법으로 통합 벡터 pSS에 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-zwf-FR를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 YJ14의 구축
고초균 균주 YJ13 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-zwf-FR(1 μg)와 고초균 균주 YJ13 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 클로람페니콜(5 μg/mL)을 함유한 고체 배지 LB(효모추출물 5 g/L, 펩톤10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 골라 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp DNA 단편 및 2000 bp DNA 단편의 두 밴드(여기서1000 bp DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-pgm-FR에서 벡터의 zwf 코딩 유전자 업스트림 및 다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp DNA 단편의 크기는 게놈 상에 zwf 코딩 유전자 업스트림 상동성 암, zwf 코딩 유전자 및 zwf 코딩 유전자 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편의 크기임)는 양성 클론이었다.
양성 클론을 골라 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지로 옮기고 8 ~ 12 h 동안 배양한 후 200 uL의 균액을 취하여 원심분리를 통해 상층액을 제거한 다음, 멸균수로 재현탁하고 5-FU MSM 배지 고체 플레이트(40% glucose 20.0 ml/L, 4% glutamine 50.0 mL/L, 0.5% histidine 10.0 mL/L, 1% vitamin B1 1.0 mL/L, 20 mM 5-FU 500 μL/L, 10×spizizen 100.0 mL/L, 1000×미량원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제를 첨가하지 않은 LB 배지에서 배양함으로써 양성 형질전환체의 분자 내 상동 재조합을 촉진하고, 5-FU MSM 배지에서 스크리닝 및 배양하여 zwf가 녹아웃된 목적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU MSM 배지 고체 플레이트 상에서 여러 콜로니를 골라 다시 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만 가진 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 코딩 유전자가 녹아웃된 고초균 재조합 공학 균주, 즉 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 효소 활성이 없는 고초균 재조합 공학 균주를 저장하고 YJ14로 명명하였다.
실시예 22 고초균 재조합 균주 SKC6-1의 구축
(1) 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP의 구축
KEGG 데이터베이스에서 Agrobacterium tumefaciens str. C58로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 T6PE 및 아키오글루부스속 Archaeoglobus fulgidus 또는 Archaeoglobus profundus로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 T6PP 유전자에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 단편을 얻으며, 단순 클로닝(simple cloning) 연결 방법을 사용하여 발현 벡터 pWB980에 구축하여 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP를 얻었다.
(2) 고초균 재조합 균주 SCK6-1의 구축
고초균 균주 SCK6 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 제조하고, 재조합 발현 벡터 pWB980-T6PE-T6PP(1 μg)와 고초균 균주 SCK6 슈퍼컴피턴트 세포(200 μL)를 골고루 혼합한 후 37℃의 진탕기에 넣고 90 min 동안 소생시키고, 균액을 카나마이신(25 ug/mL)을 함유한 고체 배지 Lb(효모추출물 5 g/L, 펩톤 10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃ 인큐베이터에서 14 ~ 16 h 동안 배양하였다. 카나마이신 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 선택하여 콜로니 PCR 검증을 수행하고, PCR 증폭을 통해 얻은 2000 bp의 DNA 단편의 형질전환체는 양성 클론이었다. 형질전환체 PCR를 시퀀싱하여 검증하고 정확한 균주, 즉 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스6-포스페이트 포스파타아제 효소 활성이 강화된 고초균 재조합 공학 균주를 저장하여 SCK6-1로 명명하였다.
동일한 방법으로 플라스미드 pWB980-T6PE-T6PP를 고초균 재조합 균주 YJ8, YJ9, YJ10, YJ11, YJ12, YJ13, YJ14에 도입하여 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 효소 활성이 강화된 고초균 재조합 공학 균주 YJ8-1, YJ9-1, YJ10-1, YJ11-1, YJ12-1, YJ13-1, YJ14-1를 얻었다.
실시예 23 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 SCK6-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 SCK6-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 SCK6-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0 .22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 1.0%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 SCK6-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 SCK6-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 1.0%였다.
실시예 24 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ8-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 YJ8-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ8-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 2.0%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 YJ8-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물和 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ8-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 2.0%였다.
실시예 25 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ9-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 YJ9-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ9-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 2.3%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 YJ9-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ9-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 2.5%였다.
실시예 26 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ10-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 YJ10-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ10-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 2.7%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 YJ10-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ10-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 4.0%였다.
실시예 27 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ11-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 YJ11-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ11-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 3.0%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 YJ11-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ11-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 5.0%였다.
실시예 28 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ12-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 YJ12-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ12-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 8.0%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 YJ12-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ12-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 16.0%였다.
실시예 29 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ13-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 YJ13-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ13-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm 에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 16%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 YJ13-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ13-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 35%였다.
실시예 30 타가토스 생산에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ14-1의 응용
(1) 고초균 재조합 공학 균주 YJ14-1의 포도당 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ14-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 33%였다.
(2) 고초균 재조합 공학 균주 YJ14-1의 포도당과 글리세롤의 발효에 의한 타가토스의 합성
100 mL의 SR 배지(15 g/L 펩톤, 25 g/L 효모추출물 및 3 g/L K2HPO4, 카나마이신 25 ng/mL)를 선택하고, 최종 농도가 20 g/L인 포도당 및 20 g/L인 글리세롤을 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 고초균 재조합 공학 균주 YJ14-1를 12 ~ 24 h 동안 배양하고, 발효가 완료된 후 시료를 14000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 0.22 μm의 미세다공성 여과막으로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 하기 조건에서 수행된다. 기기는 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 1200, 분석 컬럼: HPX-87H, 이동상: 5 mM H2SO4, 유속: 0.6 mL/min, 컬럼 온도: 60℃, 검출기: 시차 굴절률 검출기, 로딩량은 20 μl이다. 12 h 동안 발효 후 타가토스 수율은 70%였다.
도 5는 고초균 재조합 공학 균주 YJ14-1로 포도당과 글리세롤을 발효시켜 생산된 타가토스의 고성능 액체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것으로, 고초균 재조합 공학 균주는 포도당과 글리세롤을 동시에 발효시켜 효율적으로 타가토스를 생산할 수 있으며, 발효 반응액의 성분이 단순하여 타가토스의 분리 및 정제가 용이하다.
[5] You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11.
[6] Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microb. Biotechnol., 4(1), 98-105. doi:10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x.
본 명세서에서 개시된 모든 기술적 특징은 모두 임의의 조합 방식으로 조합될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 각 특징은 기타 동일하거나 동등하거나 유사한 작용을 가진 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 언급되지 않는 한 개시된 각 특징은 일련의 동등하거나 유사한 특징의 구현예일 뿐이다.
이 밖에, 상기 설명으로부터 당업자는 본 발명으로부터 본 발명의 핵심적 특징을 쉽게 이해할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 사용 목적 및 조건에 적합하도록 본 발명에 대해 다양한 수정을 진행할 수 있으므로, 이러한 수정 또한 첨부된 특허청구범위 내에 속하도록 의도된다.
<110> TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES <120> RECOMBINANT MICROORGANISM, PREPARATION METHOD THEREFOR, AND APPLICATION OF RECOMBINANT MICROORGANISM IN PRODUCTION OF TAGATOSE <130> 6A17-2083360IB <150> CN202011224203.0 <151> 2020-11-05 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 477 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Phe Lys Asn Ala Phe Ala Asn Leu Gln Lys Val Gly Lys Ser Leu 1 5 10 15 Met Leu Pro Val Ser Val Leu Pro Ile Ala Gly Ile Leu Leu Gly Val 20 25 30 Gly Ser Ala Asn Phe Ser Trp Leu Pro Ala Val Val Ser His Val Met 35 40 45 Ala Glu Ala Gly Gly Ser Val Phe Ala Asn Met Pro Leu Ile Phe Ala 50 55 60 Ile Gly Val Ala Leu Gly Phe Thr Asn Asn Asp Gly Val Ser Ala Leu 65 70 75 80 Ala Ala Val Val Ala Tyr Gly Ile Met Val Lys Thr Met Ala Val Val 85 90 95 Ala Pro Leu Val Leu His Leu Pro Ala Glu Glu Ile Ala Ser Lys His 100 105 110 Leu Ala Asp Thr Gly Val Leu Gly Gly Ile Ile Ser Gly Ala Ile Ala 115 120 125 Ala Tyr Met Phe Asn Arg Phe Tyr Arg 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Val Leu Ser Gly Asn Ser Ser 340 345 350 Lys Leu Trp Leu Phe Pro Ile Val Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Val Tyr 355 360 365 Tyr Thr Ile Phe Arg Val Leu Ile Lys Ala Leu Asp Leu Lys Thr Pro 370 375 380 Gly Arg Glu Asp Ala Thr Glu Asp Ala Lys Ala Thr Gly Thr Ser Glu 385 390 395 400 Met Ala Pro Ala Leu Val Ala Ala Phe Gly Gly Lys Glu Asn Ile Thr 405 410 415 Asn Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg Leu Arg Val Ser Val Ala Asp Val 420 425 430 Ser Lys Val Asp Gln Ala Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala Ala Gly Val 435 440 445 Val Val Ala Gly Ser Gly Val Gln Ala Ile Phe Gly Thr Lys Ser Asp 450 455 460 Asn Leu Lys Thr Glu Met Asp Glu Tyr Ile Arg Asn His 465 470 475 <210> 2 <211> 1431 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60 tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt cagctggctg 120 cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc aaacatgcca 180 ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt atccgcgctg 240 gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc gccactggta 300 ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg cgtactcgga 360 gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg tattaagctg 420 cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc tggcctggct 480 gccatcttta ctggcgttgt gctgtccttc atttggccgc cgattggttc tgcaatccag 540 accttctctc agtgggctgc ttaccagaac ccggtagttg cgtttggcat ttacggtttc 600 atcgaacgtt gcctggtacc gtttggtctg caccacatct ggaacgtacc tttccagatg 660 cagattggtg aatacaccaa cgcagcaggt caggttttcc acggcgacat tccgcgttat 720 atggcgggtg acccgactgc gggtaaactg tctggtggct tcctgttcaa aatgtacggt 780 ctgccagctg ccgcaattgc tatctggcac tctgctaaac cagaaaaccg cgcgaaagtg 840 ggcggtatta tgatctccgc ggcgctgacc tcgttcctga ccggtatcac cgagccgatc 900 gagttctcct tcatgttcgt tgcgccgatc ctgtacatca tccacgcgat tctggcaggc 960 ctggcattcc caatctgtat tcttctgggg atgcgtgacg gtacgtcgtt ctcgcacggt 1020 ctgatcgact tcatcgttct gtctggtaac agcagcaaac tgtggctgtt cccgatcgtc 1080 ggtatcggtt atgcgattgt ttactacacc atcttccgcg tgctgattaa agcactggat 1140 ctgaaaacgc cgggtcgtga agacgcgact gaagatgcaa aagcgacagg taccagcgaa 1200 atggcaccgg ctctggttgc tgcatttggt ggtaaagaaa acattactaa cctcgacgca 1260 tgtattaccc gtctgcgcgt cagcgttgct gatgtgtcta aagtggatca ggccggcctg 1320 aagaaactgg gcgcagcggg cgtagtggtt gctggttctg gtgttcaggc gattttcggt 1380 actaaatccg ataacctgaa aaccgagatg gatgagtaca tccgtaacca c 1431 <210> 3 <211> 699 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 3 Met Phe Lys Ala Leu Phe Gly Val Leu Gln Lys Ile Gly Arg Ala Leu 1 5 10 15 Met Leu Pro Val Ala Ile Leu Pro Ala Ala Gly Ile Leu Leu Ala Ile 20 25 30 Gly Asn Ala Met Gln Asn Lys Asp Met Ile Gln Val Leu His Phe Leu 35 40 45 Ser Asn Asp Asn Val Gln Leu Val Ala Gly Val Met Glu Ser Ala Gly 50 55 60 Gln Ile Val Phe Asp Asn Leu Pro Leu Leu Phe Ala Val Gly Val Ala 65 70 75 80 Ile Gly Leu Ala Asn Gly Asp Gly Val Ala Gly Ile Ala Ala Ile Ile 85 90 95 Gly Tyr Leu Val Met Asn Val Ser Met Ser Ala Val Leu Leu Ala Asn 100 105 110 Gly Thr Ile Pro Ser Asp Ser Val Glu Arg Ala Lys Phe Phe Thr Glu 115 120 125 Asn His Pro Ala Tyr Val Asn Met Leu Gly Ile Pro Thr Leu Ala Thr 130 135 140 Gly Val Phe Gly Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Ala Ala Leu Leu Phe 145 150 155 160 Asn Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Leu Pro Gln Tyr Leu Gly Phe Phe Ala 165 170 175 Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Val Thr Ser Ile Ser Ala Leu Ile Leu 180 185 190 Gly Leu Ile Met Leu Val Ile Trp Pro Pro Ile Gln His Gly Leu Asn 195 200 205 Ala Phe Ser Thr Gly Leu Val Glu Ala Asn Pro Thr Leu Ala Ala Phe 210 215 220 Ile Phe Gly Val Ile Glu Arg Ser Leu Ile Pro Phe Gly Leu His His 225 230 235 240 Ile Phe Tyr Ser Pro Phe Trp Tyr Glu Phe Phe Ser Tyr Lys Ser Ala 245 250 255 Ala Gly Glu Ile Ile Arg Gly Asp Gln Arg Ile Phe Met Ala Gln Ile 260 265 270 Lys Asp Gly Val Gln Leu Thr Ala Gly Thr Phe Met Thr Gly Lys Tyr 275 280 285 Pro Phe Met Met Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Ile Tyr His 290 295 300 Glu Ala Lys Pro Gln Asn Lys Lys Leu Val Ala Gly Ile Met Gly Ser 305 310 315 320 Ala Ala Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Leu Glu Phe 325 330 335 Ser Phe Leu Phe Val Ala Pro Val Leu Phe Ala Ile His Cys Leu Phe 340 345 350 Ala Gly Leu Ser Phe Met Val Met Gln Leu Leu Asn Val Lys Ile Gly 355 360 365 Met Thr Phe Ser Gly Gly Leu Ile Asp Tyr Phe Leu Phe Gly Ile Leu 370 375 380 Pro Asn Arg Thr Ala Trp Trp Leu Val Ile Pro Val Gly Leu Gly Leu 385 390 395 400 Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Gly Phe Arg Phe Ala Ile Arg Lys Phe Asn 405 410 415 Leu Lys Thr Pro Gly Arg Glu Asp Ala Ala Glu Glu Thr Ala Ala Pro 420 425 430 Gly Lys Thr Gly Glu Ala Gly Asp Leu Pro Tyr Glu Ile Leu Gln Ala 435 440 445 Met Gly Asp Gln Glu Asn Ile Lys His Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg 450 455 460 Leu Arg Val Thr Val Asn Asp Gln Lys Lys Val Asp Lys Asp Arg Leu 465 470 475 480 Lys Gln Leu Gly Ala Ser Gly Val Leu Glu Val Gly Asn Asn Ile Gln 485 490 495 Ala Ile Phe Gly Pro Arg Ser Asp Gly Leu Lys Thr Gln Met Gln Asp 500 505 510 Ile Ile Ala Gly Arg Lys Pro Arg Pro Glu Pro Lys Thr Ser Ala Gln 515 520 525 Glu Glu Val Gly Gln Gln Val Glu Glu Val Ile Ala Glu Pro Leu Gln 530 535 540 Asn Glu Ile Gly Glu Glu Val Phe Val Ser Pro Ile Thr Gly Glu Ile 545 550 555 560 His Pro Ile Thr Asp Val Pro Asp Gln Val Phe Ser Gly Lys Met Met 565 570 575 Gly Asp Gly Phe Ala Ile Leu Pro Ser Glu Gly Ile Val Val Ser Pro 580 585 590 Val Arg Gly Lys Ile Leu Asn Val Phe Pro Thr Lys His Ala Ile Gly 595 600 605 Leu Gln Ser Asp Gly Gly Arg Glu Ile Leu Ile His Phe Gly Ile Asp 610 615 620 Thr Val Ser Leu Lys Gly Glu Gly Phe Thr Ser Phe Val Ser Glu Gly 625 630 635 640 Asp Arg Val Glu Pro Gly Gln Lys Leu Leu Glu Val Asp Leu Asp Ala 645 650 655 Val Lys Pro Asn Val Pro Ser Leu Met Thr Pro Ile Val Phe Thr Asn 660 665 670 Leu Ala Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Lys Ala Ser Gly Ser Val Asn 675 680 685 Arg Glu Gln Glu Asp Ile Val Lys Ile Glu Lys 690 695 <210> 4 <211> 2097 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 4 atgtttaaag cattattcgg cgttcttcaa aaaattgggc gtgcgcttat gcttccagtt 60 gcgatccttc cggctgcggg tattttgctt gcgatcggga atgcgatgca aaataaggac 120 atgattcagg tcctgcattt cttgagcaat gacaatgttc agcttgtagc aggtgtgatg 180 gaaagtgctg ggcagattgt tttcgataac cttccgcttc ttttcgcagt aggtgtagcc 240 atcgggcttg ccaatggtga tggagttgca gggattgcag caattatcgg ttatcttgta 300 atgaatgtat ccatgagtgc ggttcttctt gcaaacggaa ccattccttc ggattcagtt 360 gaaagagcca agttctttac ggaaaaccat cctgcatatg taaacatgct tggtatacct 420 accttggcga caggggtgtt cggcggtatt atcgtcggtg tgttagctgc attattgttt 480 aacagatttt acacaattga actgccgcaa taccttggtt tctttgcggg taaacgtttc 540 gttccaattg ttacgtcaat ttctgcactg attctgggtc ttattatgtt agtgatctgg 600 cctccaatcc agcatggatt gaatgccttt tcaacaggat tagtggaagc gaatccaacc 660 cttgctgcat ttatcttcgg ggtgattgaa cgttcgctta tcccattcgg attgcaccat 720 attttctatt caccgttctg gtatgaattc ttcagctata agagtgcagc aggagaaatc 780 atccgcgggg atcagcgtat ctttatggcg cagattaaag acggcgtaca gttaacggca 840 ggtacgttca tgacaggtaa atatccattt atgatgttcg gtctgcctgc tgcggcgctt 900 gccatttatc atgaagcaaa accgcaaaac aaaaaactcg ttgcaggtat tatgggttca 960 gcggccttga catctttctt aacggggatc acagagccat tggaattttc tttcttattc 1020 gttgctccag tcctgtttgc gattcactgt ttgtttgcgg gactttcatt catggtcatg 1080 cagctgttga atgttaagat tggtatgaca ttctccggcg gtttaattga ctacttccta 1140 ttcggtattt taccaaaccg gacggcatgg tggcttgtca tccctgtcgg cttagggtta 1200 gcggtcattt actactttgg attccgattt gccatccgca aatttaatct gaaaacacct 1260 ggacgcgagg atgctgcgga agaaacagca gcacctggga aaacaggtga agcaggagat 1320 cttccttatg agattctgca ggcaatgggt gaccaggaaa acatcaaaca ccttgatgct 1380 tgtatcactc gtctgcgtgt gactgtaaac gatcagaaaa aggttgataa agaccgtctg 1440 aaacagcttg gcgcttccgg agtgctggaa gtcggcaaca acattcaggc tattttcgga 1500 ccgcgttctg acgggttaaa aacacaaatg caagacatta ttgcgggacg caagcctaga 1560 cctgagccga aaacatctgc tcaagaggaa gtaggccagc aggttgagga agtgattgca 1620 gaaccgctgc aaaatgaaat cggcgaggaa gttttcgttt ctccgattac cggggaaatt 1680 cacccaatta cggatgttcc tgaccaagtc ttctcaggga aaatgatggg tgacggtttt 1740 gcgattctcc cttctgaagg aattgtcgta tcaccggttc gcggaaaaat tctcaatgtg 1800 ttcccgacaa aacatgcgat cggcctgcaa tccgacggcg gaagagaaat tttaatccac 1860 tttggtattg ataccgtcag cctgaagggc gaaggattta cgtctttcgt atcagaagga 1920 gaccgcgttg agcctggaca aaaacttctt gaagttgatc tggatgcagt caaaccgaat 1980 gtaccatctc tcatgacacc gattgtattt acaaaccttg ctgaaggaga aacagtcagc 2040 attaaagcaa gcggttcagt caacagagaa caagaagata ttgtgaagat tgaaaaa 2097 <210> 5 <211> 425 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 5 Met Thr Ala Ile Leu Glu Asn Leu Ala Ala Ala Arg Arg Ala Gly Lys 1 5 10 15 Pro Ala Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Val Val Leu Arg 20 25 30 Ala Ala Ile Arg Arg Ala Ala Ala Ser Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu 35 40 45 Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn His Leu Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr 50 55 60 Pro Arg Asp Phe Val Ala Phe Val Asn Ser Ile Ala Ala Glu Glu Gly 65 70 75 80 Leu Pro Ala Glu Leu Leu Ile Phe Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Asn 85 90 95 Pro Trp Arg Arg Glu Lys Ala Glu Asp Ala Leu Thr Lys Ala Ala Ala 100 105 110 Met Val Asp Ala Tyr Val Thr Ala Gly Phe Arg Lys Ile His Leu Asp 115 120 125 Ala Ser Met Gly Cys Ala Gly Glu Pro Ala Ala Leu Asp Asp Val Thr 130 135 140 Ile Ala His Arg Ala Ala Lys Leu Thr Ala Val Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160 Thr Glu Ala Gly Leu Pro Lys Pro Leu Tyr Ile Leu Gly Thr Glu Val 165 170 175 Pro Val Pro Gly Gly Ala Asp His Val Leu Glu Thr Val Ala Pro Thr 180 185 190 Glu Pro Gln Ala Ala Arg Asn Thr Ile Asp Leu His Arg Glu Ile Phe 195 200 205 Ala Gln His Gly Leu Ser Asp Ala Phe Glu Arg Val Ile Ala Phe Val 210 215 220 Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Ser Asp Asn Val Val Ala Tyr Asp 225 230 235 240 Pro Gln Ala Ala Gln Ser Leu Ser Ala Val Leu Asp Gly Glu Pro Arg 245 250 255 Leu Val Phe Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Glu Pro Ala Leu 260 265 270 Ala Ala Leu Val Arg Asp Gly Tyr Pro Ile Leu Lys Val Gly Pro Gly 275 280 285 Leu Thr Phe Ala Tyr Arg Glu Ala Leu Tyr Ala Leu Asp Met Ile Ala 290 295 300 Ser Glu Met Val Gly Thr Tyr Gly Asp Arg Pro Leu Ala Arg Thr Met 305 310 315 320 Glu Lys Leu Met Leu Ser Ala Pro Gly Asp Trp Gln Gly His Tyr His 325 330 335 Gly Asp Asp Ile Thr Leu Arg Leu Gln Arg His Tyr Ser Tyr Ser Asp 340 345 350 Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Ala Leu Ala Ala Val Ser 355 360 365 Thr Leu His Lys Ala Leu Asp Gly Lys Thr Ile Pro Glu Thr Leu Leu 370 375 380 Arg Gln Tyr Leu Gly Glu Leu Pro Leu Ala Ala Val Ala Gly Lys Glu 385 390 395 400 Pro Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Val Asp Gln Val Leu Ala Thr Tyr 405 410 415 His Ala Ala Thr Gly Glu Gly Arg His 420 425 <210> 6 <211> 1275 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 6 atgaccgcca ttttggaaaa tctcgccgcc gcgcgccgcg ccggcaaacc tgcgggcatc 60 acttcggtct gctcggccca ccccgttgtc ctgcgcgccg caatccgccg cgccgccgcc 120 agtcaaacgg ccgtactgat cgaggccacc tgcaatcagg tcaatcatct cggtggttat 180 accggcatga caccgcgtga cttcgttgcc ttcgtcaaca gcatcgccgc ggaagaagga 240 ctgcccgccg aactgctgat ctttggcggc gatcatctcg gccccaatcc ctggcgcagg 300 gagaaggccg aggacgcgct gacaaaagcc gccgccatgg tcgacgccta tgtcacagct 360 ggttttcgca agatccacct tgatgcatcg atgggctgcg ccggtgagcc ggcagccctg 420 gatgacgtca ccatcgccca ccgcgccgcg aaactcacag ccgttgccga aaaggcagcc 480 actgaggctg gcctgccaaa accgctttat attctgggca ccgaagtgcc ggtgcccggc 540 ggtgccgacc atgtgcttga gaccgtcgca ccgaccgaac cgcaggcggc gcgcaacacc 600 atcgatcttc atcgcgaaat ctttgcgcag cacggtcttt ccgatgcgtt cgaacgggtc 660 atcgcctttg tcgtgcagcc gggtgtggaa ttcggcagcg acaatgtcgt cgcttatgat 720 ccgcaggcag cgcagagcct gagcgccgtg ctggatggcg aaccgcgact ggtcttcgaa 780 gcccattcga ccgattacca gaccgagcct gcccttgcgg cactggtacg cgacggatat 840 ccgatcctca aagttggacc gggcctcacc ttcgcttacc gggaagcgct ttatgcactc 900 gacatgatcg cctccgaaat ggtcggcacc tatggcgacc gaccgctggc gcggactatg 960 gaaaaattga tgttaagcgc gccgggcgac tggcagggcc attaccatgg cgacgacatc 1020 acgctccgat tgcaacgcca ttacagctac agcgaccgca tccgttacta ctggacgcga 1080 ccggaagcgc tcgcggccgt ttccaccttg cataaggcac tggatgggaa gacaattccc 1140 gaaaccctgc tgcgccaata tctcggcgaa ttgccgctcg cggcggttgc gggaaaggaa 1200 ccggaggagg ttctggtcgc ggcggtggat caggtgctgg cgacctatca cgcggcgacg 1260 ggcgaaggcc gccac 1275 <210> 7 <211> 223 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidus <400> 7 Met Phe Lys Pro Lys Ala Ile Ala Val Asp Ile Asp Gly Thr Leu Thr 1 5 10 15 Asp Arg Lys Arg Ala Leu Asn Cys Arg Ala Val Glu Ala Leu Arg Lys 20 25 30 Val Lys Ile Pro Val Ile Leu Ala Thr Gly Asn Ile Ser Cys Phe Ala 35 40 45 Arg Ala Ala Ala Lys Leu Ile Gly Val Ser Asp Val Val Ile Cys Glu 50 55 60 Asn Gly Gly Val Val Arg Phe Glu Tyr Asp Gly Glu Asp Ile Val Leu 65 70 75 80 Gly Asp Lys Glu Lys Cys Val Glu Ala Val Arg Val Leu Glu Lys His 85 90 95 Tyr Glu Val Glu Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Arg Lys Ser Glu Val Cys 100 105 110 Met Arg Arg Ser Phe Asp Ile Asn Glu Ala Arg Lys Leu Ile Glu Gly 115 120 125 Met Gly Val Lys Leu Val Asp Ser Gly Phe Ala Tyr His Ile Met Asp 130 135 140 Ala Asp Val Ser Lys Gly Lys Ala Leu Lys Phe Val Ala Glu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Ile Ser Ser Ala Glu Phe Ala Val Ile Gly Asp Ser Glu Asn Asp 165 170 175 Ile Asp Met Phe Arg Val Ala Gly Phe Gly Ile Ala Val Ala Asn Ala 180 185 190 Asp Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ala Asp Leu Val Thr 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<400> 9 Met Thr Lys Tyr Ala Leu Val Gly Asp Val Gly Gly Thr Asn Ala Arg 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Asp Ile Ala Ser Gly Glu Ile Ser Gln Ala Lys Thr 20 25 30 Tyr Ser Gly Leu Asp Tyr Pro Ser Leu Glu Ala Val Ile Arg Val Tyr 35 40 45 Leu Glu Glu His Lys Val Glu Val Lys Asp Gly Cys Ile Ala Ile Ala 50 55 60 Cys Pro Ile Thr Gly Asp Trp Val Ala Met Thr Asn His Thr Trp Ala 65 70 75 80 Phe Ser Ile Ala Glu Met Lys Lys Asn Leu Gly Phe Ser His Leu Glu 85 90 95 Ile Ile Asn Asp Phe Thr Ala Val Ser Met Ala Ile Pro Met Leu Lys 100 105 110 Lys Glu His Leu Ile Gln Phe Gly Gly Ala Glu Pro Val Glu Gly Lys 115 120 125 Pro Ile Ala Val Tyr Gly Ala Gly Thr Gly Leu Gly Val Ala His Leu 130 135 140 Val His Val Asp Lys Arg Trp Val Ser Leu Pro Gly Glu Gly Gly His 145 150 155 160 Val Asp Phe Ala Pro Asn Ser Glu Glu Glu Ala Ile Ile Leu Glu Ile 165 170 175 Leu Arg Ala Glu Ile Gly His Val Ser Ala Glu Arg Val Leu Ser Gly 180 185 190 Pro Gly Leu Val Asn Leu Tyr Arg Ala Ile Val Lys Ala Asp Asn Arg 195 200 205 Leu Pro Glu 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660 agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaaa aacacgttgc aaaacacttt 720 gcggcgcttt ccaccaatgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780 ttcgagttct gggactgggt tggcggccgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840 attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttccggcgc acacgcgatg 900 gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960 ggcatctggt acaacaattt ctttggtgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020 tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggagtccaa cggtaagtat 1080 gttgaccgta acggtaacgt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacca 1140 ggcactaacg gtcagcacgc gttctaccag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200 tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260 ctgtctaact tcttcgccca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320 gagcaggaat atcgtgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380 aaagtattcg aaggtaaccg cccgaccaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440 agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500 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480 cttcttgaag agaaatacgg taaagaagaa gcgaaagcgc ggatttatgc aacaactgat 540 aaagagcgcg gcgcattaaa aacgctttct aacgaagaag gctttgaatc attcgtaatt 600 cctgacgatg tcggcggccg ttattcagtt ttaacagctg taggtctctt gccgattgct 660 gtcagcggcg tcaacattga cgacatgatg aaaggcgccc tggatgcgag caaagatttt 720 gcaacatctg aactggaaga taacccagca taccaatatg cggttgttcg caatgtcctt 780 tataataagg gcaaaacaat tgaaatgctc atcaactacg aaccggcgct tcaatacttt 840 gcggaatggt ggaagcagct gttcggagaa agcgaaggga aagatgagaa gggcatttat 900 ccttcttcag cgaactattc aacagacctt cattctttag gccagtatgt acaagaaggc 960 cgcagagatt tattcgaaac ggtcctgaac gtagagaagc ctaaacatga actgacaatt 1020 gaggaagcgg ataacgatct tgacggcttg aactatttag ccggtaaaac tgttgatttc 1080 gttaacaaaa aagcattcca aggtacaatg cttgcccata cagacggaaa tgttccgaac 1140 ttaatcgtta acattcctga gctgaatgca tatacttttg gataccttgt atatttcttc 1200 gaaaaagcct gcgcgatgag cggttacctc cttggcgtca atccgtttga ccagcctggt 1260 gtagaagcgt ataaagtcaa tatgtttgcg ttactcggca aacctggctt tgaagagaaa 1320 aaagcagagc ttgaaaaacg tctggaagat 1350 <210> 17 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of SceI-tet-SceI fragment <400> 17 tagggataac agggtaatat ttacgttgac accacctttc gcgtatggca tgatagcgcc 60 cggaagagag tcaattcagg gtggtgaata tgaatagttc gacaaagatc gcattggtaa 120 ttacgttact cgatgccatg gggattggcc ttatcatgcc agtcttgcca acgttattac 180 gtgaatttat tgcttcggaa gatatcgcta accactttgg cgtattgctt gcactttatg 240 cgttaatgca ggttatcttt gctccttggc ttggaaaaat gtctgaccga tttggtcggc 300 gcccagtgct gttgttgtca ttaataggcg catcgctgga ttacttattg ctggcttttt 360 caagtgcgct ttggatgctg tatttaggcc gtttgctttc agggatcaca ggagctactg 420 gggctgtcgc ggcatcggtc attgccgata ccacctcagc ttctcaacgc gtgaagtggt 480 tcggttggtt aggggcaagt tttgggcttg gtttaatagc ggggcctatt attggtggtt 540 ttgcaggaga gatttcaccg catagtccct tttttatcgc tgcgttgcta aatattgtca 600 ctttccttgt ggttatgttt tggttccgtg aaaccaaaaa tacacgtgat aatacagata 660 ccgaagtagg ggttgagacg caatcaaatt cggtgtacat cactttattt aaaacgatgc 720 ccattttgtt gattatttat ttttcagcgc aattgatagg ccaaattccc gcaacggtgt 780 gggtgctatt taccgaaaat cgttttggat ggaatagcat gatggttggc ttttcattag 840 cgggtcttgg tcttttacac tcagtattcc aagcctttgt ggcaggaaga atagccacta 900 aatggggcga aaaaacggca gtactgctcg aatttattgc agatagtagt gcatttgcct 960 ttttagcgtt tatatctgaa ggttggttag atttccctgt tttaatttta ttggctggtg 1020 gtgggatcgc tttacctgca ttacagggag tgatgtctat ccaaacaaag agtcatgagc 1080 aaggtgcttt acagggatta ttggtgagcc ttaccaatgc aaccggtgtt attggcccat 1140 tactgtttac tgttatttat aatcattcac taccaatttg ggatggctgg atttggatta 1200 ttggtttagc gttttactgt attattatcc tgctatcaat gaccttcatg ttgacccctc 1260 aagctcaggg gagtaaacag gagacaagtg cttagtaggg ataacagggt aat 1313 <210> 18 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 18 caggagcact ctcaattatg tttaagaatg catttgctaa cctgcaaaag gtcggtaaat 60 cgctgtacgg ccccaaggtc caaacggtga 90 <210> 19 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 19 gccatctggc tgccttagtc tccccaacgt cttacggatt agtggttacg gatgtactca 60 tccatcagcg atttaccgac cttttgcagg ttagcttggc ttcagggatg aggcgccatc 120 120 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 20 cgtcaaacaa attggcactg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 21 gaacgtcaat aacctgttcg 20 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 22 gtttaacttt aataaggaga tataccatga caaagtatgc attagtcggt g 51 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 23 cgattacttt ctgttcgact taagcattac agaatgtgac ctaaggtctg 50 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 24 gttaagtata agaaggagat atacatatga aaaacatcaa tccaacgcag 50 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 25 tcagcggtgg cagcagccta ggttaattaa ccgcgccacg ctttatagcg 50 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 26 cagaccttag gtcacattct gtaatgctta agtcgaacag aaagtaatcg 50 <210> 27 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 27 caccgactaa tgcatacttt gtcatggtat atctccttat taaagttaaa c 51 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 28 gctataaagc gtggcgcggt taattaacct aggctgctgc caccgctgag 50 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 29 ctgcgttgga ttgatgtttt tcatatgtat atctccttct tatacttaac 50 <210> 30 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 30 cattccaaag ttcagaggta gtcatgatta agaaaatcgg tgtgttgaca agcggcggtg 60 atgcgtacgg ccccaaggtc caaacggtga 90 <210> 31 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 31 gcctttttcc gaaatcatta atacagtttt ttcgcgcagt ccagccagtc acctttgaac 60 ggacgcgcat caccgccgct tgtcaacaca ccgatttggc ttcagggatg aggcgccatc 120 120 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 32 catttggcct gacctgaatc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 33 cgaacgcctt atccggccta c 21 <210> 34 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 34 agactgtcat gaaaaagacc aaaattgttt gcaccatcgg accgaaaacc gaatctgaag 60 agatgtacgg ccccaaggtc caaacggtga 90 <210> 35 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 35 caaaagcaat attacaggac gtgaacagat gcggtgttag tagtgccgct cggtaccagt 60 gcacccatct cttcagattc ggttttcggt ccgatttggc ttcagggatg aggcgccatc 120 120 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 36 aacttcggca ccagacgttg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 37 tctgaacgtc agaagacagc 20 <210> 38 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 38 aaacgttgca gacaaaggac aaagcaatgg caatccacaa tcgtgcaggc caacctgcac 60 aacagtacgg ccccaaggtc caaacggtga 90 <210> 39 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 39 gtgtttacgc gtttttcaga acttcgctaa caatctcaac cgcttctttc tcaatctgct 60 tgcgctgttg tgcaggttgg cctgcacgat tgtgttggct tcagggatga ggcgccatc 119 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 40 cggtcaaaac gattaaagac aag 23 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 41 ccagtcgcca gctaatgatg 20 <210> 42 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 42 gttaacttaa ggagaatgac atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca 60 ttttctacgg ccccaaggtc caaacggtga 90 <210> 43 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 43 aagcgcagat attactcaaa ctcattccag gaacgaccat cacgggtaat catcgccacc 60 gaggcgaaaa tgaccaggtc acaggcctgg gctgtttggc ttcagggatg aggcgccatc 120 120 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 44 gatttgctca aatgttccag c 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 45 gcaacatgct tttcaaagag 20 <210> 46 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 46 gttaagtata agaaggagat atacatatga acaccgaaca tccgctgaaa aatg 54 <210> 47 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 47 cggtggcagc agcctaggtt aattactcga gaatcagttt gaattcaccg 50 <210> 48 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 48 gtttaacttt aagaaggaga tataccatgt tcaagccgaa agcgatcgcg 50 <210> 49 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 49 gattactttc tgttcgactt aagcattaac gcagcaggcc cagaaactgc ag 52 <210> 50 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 50 catttttcag cggatgttcg gtgttcatat gtatatctcc ttcttatact taac 54 <210> 51 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 51 cggtgaattc aaactgattc tcgagtaatt aacctaggct gctgccaccg 50 <210> 52 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 52 ctgcagtttc tgggcctgct gcgttaatgc ttaagtcgaa cagaaagtaa tc 52 <210> 53 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 53 cgcgatcgct ttcggcttga acatggtata tctccttctt aaagttaaac 50 <210> 54 <211> 657 <212> PRT <213> Archaeoglobus profundus <400> 54 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 290 295 300 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 305 310 315 320 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 325 330 335 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 355 360 365 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 385 390 395 400 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 405 410 415 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 420 425 430 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 450 455 460 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 465 470 475 480 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 500 505 510 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 530 535 540 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 545 550 555 560 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 565 570 575 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 580 585 590 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 595 600 605 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 610 615 620 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 625 630 635 640 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 645 650 655 Ala <210> 55 <211> 657 <212> DNA <213> Archaeoglobus profundus <400> 55 gtgttcaagg ctttggtagt tgatatagac ggaactttga cggataagaa gagggcaata 60 aactgcagag cggtcgaagc acttagaaaa ctaaagattc ctgttgtctt ggcaaccgga 120 aacatttcat gctttgcaag ggctgtagct aagattatag gtgtttccga tattgtaata 180 gctgagaacg gaggtgttgt cagattcagc tacgacggag aggacatagt tctgggggat 240 agaagtaaat gcttaagagc tttggagaca cttagaaaac gcttcaaagt agagcttctc 300 gacaacgaat ataggaagtc tgaggtctgc atgaggagga acttccctat agaggaagct 360 agaaagatac tgccaaaaga tgttagaata gtcgatacag gcttcgcata ccacataatc 420 gatgcaaatg tcagcaaggg gaaggctttg atgttcatag ccgataagct tggcttggac 480 gttaaggatt tcattgcgat aggtgattcc gaaaacgaca ttgaaatgtt ggaagttgca 540 ggttttggcg ttgcagttgc gaatgcggat gaaaagctta aggaggtagc ggatttggtc 600 acatcgaagc ctaatggaga cggagttgtc gaagctcttg agttcttggg actcatt 657

Claims (12)

  1. 재조합 미생물로서,
    상기 재조합 미생물은 야생형 미생물과 비교하여,
    (a) 포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphotransferase system)의 포도당 특이적 전달 단백질의 단백질 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
    (b) 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제(tagatose-6-phosphate epimerase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성; 및
    (c) 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제(tagatose-6-phosphate phosphatase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성 중 적어도 하나를 갖는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포도당 특이적 전달 단백질은,
    (a1) 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 포도당 특이적 전달 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드(polypeptide);
    (a2) 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 포도당 특이적 전달 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
    (a3) 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되고,
    선택적으로, 상기 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는,
    (b1) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
    (b2) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
    (b3) 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되며,
    선택적으로, 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는,
    (c1) 서열번호 7 또는 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
    (c2) 서열번호 7 또는 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
    (c3) 서열번호 8 또는 서열번호 55로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되는 재조합 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 야생형 미생물과 비교하여,
    (d) 글루코키나아제(glucokinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성;
    (e) 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제(glucose-6-phosphate isomerase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 강화된 특성;
    (f) 프럭토스-6-포스페이트 키나아제(fructose-6-phosphate kinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
    (g) 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
    (h) 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성;
    (i) 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성; 및
    (j) HPr 키나아제(kinase)의 효소 활성 및/또는 이의 코딩 유전자의 발현 수준이 감소 또는 소실된 특성 중 적어도 하나를 더 갖는 재조합 미생물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 글루코키나아제는,
    (d1) 서열번호 9 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 글루코키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
    (d2) 서열번호 9 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고 글루코키나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
    (d3) 서열번호 10 또는 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되고,
    선택적으로, 상기 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제는,
    (e1) 서열번호 13 또는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드;
    (e2) 서열번호 13 또는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 반복, 결실 또는 추가되고, 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및
    (e3) 서열번호 14 또는 서열번호 16로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코딩된 폴리펩타이드 중 어느 하나의 군으로부터 선택되는 재조합 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 고초균(Bacillus subtilis), 유산균 또는 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)으로부터 유래되는 재조합 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물의 제조 방법으로서,
    야생형 미생물 내 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 특이적 전달 단백질의 코딩 유전자에 대해 유전자 녹아웃 또는 녹다운을 수행하는 단계; 및
    타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 재조합 발현 벡터를 상기 재조합 미생물에 도입하는 단계, 또는, 상기 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 각각 발현하는 재조합 발현 벡터를 상기 재조합 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제조 방법은,
    상기 재조합 미생물 내 글루코키나아제의 코딩 유전자의 발현 수준을 향상시키는 단계;
    상기 재조합 미생물 내 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제의 코딩 유전자의 발현 수준을 향상시키는 단계;
    상기 재조합 미생물 내 프럭토스-6-포스페이트 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계;
    상기 재조합 미생물 내 피루베이트 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계;
    상기 재조합 미생물 내 포스포글루코뮤타제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계;
    상기 재조합 미생물 내 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계; 및
    상기 재조합 미생물 내 HPr 키나아제의 코딩 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계 중 적어도 하나를 더 포함하는 제조 방법.
  8. 타가토스 생산에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물, 또는 제6항 또는 7항에 따른 방법으로 제조된 재조합 미생물의 응용.
  9. 타가토스 생산 균주로서,
    상기 타가토스 생산 균주는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물, 또는 제6항 또는 제7항에 따른 방법으로 제조된 재조합 미생물인 타가토스 생산 균주.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 타가토스 생산 균주는 포도당 또는 포도당과 글리세롤(glycerol)을 기질로 하고;
    바람직하게는, 상기 타가토스 생산 균주는 대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰, 고초균, 유산균 또는 맥주효모균으로부터 유래되는 타가토스 생산 균주.
  11. 타가토스의 생산 방법으로서,
    포도당 또는 포도당과 글리세롤을 기질로 하고, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물, 제6항 또는 제7항에 따른 방법으로 제조된 재조합 미생물, 또는 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 타가토스 생산 균주를 이용하여 발효 반응을 진행하는 단계를 포함하는 타가토스의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 발효 반응이 종료된 후 상기 발효 반응액으로부터 타가토스를 분리하는 단계를 더 포함하는 타가토스의 생산 방법.
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