CN116515793A - 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其制备方法和用途 - Google Patents

一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其制备方法和用途，属于分子生物学和生物工程领域。本公开提供的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体是将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第121位发生突变的突变体。与SEQ ID NO:1所示序列的多肽相比，本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体催化能力显著增强，能更高效地催化烟酰胺单核苷酸合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，提高工业化生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生产效率，降低酶使用成本。

Description

一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其制备方法和用途
技术领域
本公开属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、细胞培养物，以及生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，也称氧化型辅酶Ⅰ，是生物体内非常常见的一种脱氢酶的辅酶，脱氢酶在生物体的新陈代谢中起到了决定性的作用，生物体许多基本的代谢运动，例如碳水化合物、蛋白质、脂肪的分解，都离不开脱氢酶。而脱氢酶必须在辅酶NAD的参与下才能促使代谢运动，故NAD在生物体代谢中不可或缺。NAD存在于人体的每个细胞中，介导参与各个生物过程，有超过300种酶依赖于NAD才能工作，例如，葡萄糖脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、亮氨酸脱氢酶等都需要NAD来协助完成反应。由此可以看出，NAD对维持全身健康和平衡都至关重要，新陈代谢、氧化还原、DNA的维持和修复、基因稳定性、表观遗传调控等等都需要NAD的参与。
目前，工业上合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法主要有化学合成、酵母提取和酶法制备三类。但是，利用化学法合成NAD通常会有步骤繁琐、化学性质不稳定、分离纯化困难、成本高等问题；利用酵母提取NAD也会有能耗高、生产效率低、能源和材料成本高等问题，限制了其大规模的生产和后续应用开发。
酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，主要是通过体外酶法催化前体烟酰胺单核苷酸(NMN)和三磷酸腺苷或者烟酰胺核甘(NR)和三磷酸腺苷而获得，例如，引用文献1中公开了一种氧化型辅酶I的制备方法，其使用烟酰胺核甘(NR)和三磷酸腺苷二纳盐(ATP-Na2)在pH为5.0～8.0的缓冲液中，在烟酰胺单核苷激酶的催化作用下反应生成NAD。野生型烟酰胺单核苷激酶往往催化效率较低，无法在实际生产中应用。故而前期已有不少研究对野生型进行改造，以期提升其催化性能。引用文献2公开了通过定点突变构建了烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，用5-10mM烟酰胺单核苷酸(NMN)、10mM的三磷酸腺苷二钠(ATP)、100mM Tris盐酸缓冲液和终浓度为10mM MgCl2，在pH至7.5条件下37℃反应10分钟反应得到NAD；引用文献3公开的方法中，通过定点突变构建的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，用5mM烟酰胺单核苷酸(NMN)、10mM的三磷酸腺苷二钠(ATP)、100mM Tris盐酸缓冲液和终浓度为10mM MgCl2，在pH至7.5条件下水浴25℃反应20小时反应得到NAD。但是，现有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶及其突变体，仍然存在底物浓度耐受低、酶活偏低、反应时间长的缺陷，不能满足工业化生产NAD的使用。
因此，提供一种有高催化活性、耐受高浓度底物的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶对于降低工业化生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸成本、提高生产效率具有非常重要的意义。
引用文献：
引用文献1：CN102605026A；
引用文献2：CN103710321B；
引用文献3：CN112574970A。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶酶活性低、底物耐受性较差等问题。为此，本公开提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其包含如SEQID NO:2所示序列。所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体酶活性及底物耐受性均较野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶有显著提高，催化效率高，具有重要的工业应用价值。
用于解决问题的方案
本公开记载了如下技术方案：
[1].一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述突变体选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体和SEQ ID NO:1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO:1所示序列的第121位处包含突变；
(ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO:1所示序列的突变体；
(iii)由多核苷酸编码的突变体，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
(a)编码如(i)所示氨基酸序列的突变体的多核苷酸；
(b)(a)的全长互补多核苷酸；
(iv)由(i)、(ii)或(iii)任一项所示的突变体的片段，并且所述片段仍然具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶活性。
[2].根据[1]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述突变体为包含如下(c)所示的突变的突变体：
(c)对应SEQ ID NO:1所示序列的第121位的氨基酸由精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)。
[3].根据[1]或[2]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体包括在(i)所示序列的突变体的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。
[4].一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括[1]～[3]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，以及与所述突变体融合的外源多肽。
[5].一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码[1]～[3]任一项所述突变体的核苷酸序列，或包含编码[4]所述重组多肽的核苷酸序列。
[6].一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含[5]所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，调控序列为包含启动子和/或核糖体结合位点的核苷酸序列，所述调控序列指导所述突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。
[7].一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含[5]所述的分离的多核苷酸，或[6]所述的核酸构建体。
[8].一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含[1]～[5]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、[6]所述的重组多肽、[7]所述的分离的多核苷酸、[8]所述的核酸构建体，或者[9]所述的重组表达载体。
[9].根据[8]所述的重组宿主细胞，其中，宿主细胞来源于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)或微杆菌属(Microbacterium)；优选地，所述宿主细胞或所述基因工程菌来源于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。
[10].一种包含根据[8]或[9]所述的重组宿主细胞的细胞培养物。
[11].根据[1]～[3]任一项所述的突变体，根据[4]所述的重组多肽、根据[5]所述的分离的多核苷酸、根据[6]所述的核酸构建体，根据[7]所述的重组表达载体，根据[8]或[9]所述的重组基因工程菌，或者根据[10]所述的细胞培养物在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其衍生物中的应用。
[12].一种生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，所述方法包括培养根据[1]～[3]任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，根据[4]所述的重组多肽、根据[5]所述的分离的多核苷酸、根据[6]所述的核酸构建体，根据[7]所述的重组表达载体，根据[8]或[9]所述的重组基因工程菌，或者根据[10]所述的细胞培养物的步骤；
可选地，所述方法以烟酰胺单核苷酸为原料，还包括纯化或分离所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤；
优选地，所述方法以三磷酸腺苷或其盐为磷酰基供体，所述烟酰胺单核苷酸与三磷酸腺苷或其盐的摩尔比为1:1.0～1:1.5，优选为1:1.0～1:1.2。
优选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤中，还包括镁离子，所述镁离子的浓度为5～40mM，优选为10～20mM；
优选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤中，底物浓度5～250mM、pH6.5～8.5、反应温度为30℃～50℃。
[13].一种制备[1]～[3]中任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的方法，所述方法包括培养含有[8]或[9]所述重组宿主细胞，然后从重组宿主细胞或其培养物中回收所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的步骤。
发明的效果
在一些实施方式中，本公开提供的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体包含SEQ IDNO:2所示序列，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体酶活性较野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶显著提高。
在一些实施方式中，所述突变体可将高浓度烟酰胺单核苷酸(100～250mM)催化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，底物耐受性好、催化效率高、反应时间短，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成节约了成本，提高了该产品的市场竞争力。
在一些实施方式中，本公开的重组多肽、分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体分别包含或表达上述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，可应用于NAD的工业生产。
在一些实施方式中，本公开的生产NAD的方法，利用了上述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，或重组多肽、重组宿主细胞等，能够实现NAD的稳定、高效生产。
附图说明
图1为烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶野生型和突变体全细胞转化结果图；
图2为烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶镁离子浓度优化结果图；
图3为烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的，尽管可以使用其他有机或无机催化剂，但术语“转化(converting)”是指主要由一种或多种的多肽(酶)催化从一个分子到另一个分子的化学转化；其也可以指期望产物的摩尔量与限量底物的摩尔量之间的比率(以％为单位)。
如本公开所使用的，术语“烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶”(nicotinamidemononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)和“烟酰胺核苷酸腺苷转移酶”在本文中可互换地使用，该酶在体外将前体烟酰胺单核苷酸(NMN)和三磷酸腺苷(TP)催化合成NAD。
如本公开所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形、分支或环状的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化、C端氨基酸的酰胺化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
如本公开所使用的，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。本发明中氨基酸及缩写和英文简称如下所示：
组氨酸(His，H)；丝氨酸(Ser，S)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；苏氨酸(Thr，T)；苯丙氨酸(Phe，F)；天冬氨酸(Asp，D)；酪氨酸(Tyr，Y)；亮氨酸(Leu，L)；异亮氨酸(Ile，I)；精氨酸(Arg，R)；丙氨酸(Ala，A)；缬氨酸(Val，V)；色氨酸(Trp，W)；甲硫氨酸(Met，M)；天冬酰胺(Asn，N)；半胱氨酸(Cys，C)；赖氨酸(Lys，K)；脯氨酸(Pro，P)。
如本公开所使用的，术语“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽或一个催化或碳水化合物结合模块。在本公开的技术方案中，所述片段具有DNA激酶活性。
如本公开所使用的，术语“原始序列”指氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶。
如本公开所使用的，术语“突变体”是指相对于“原始序列”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多核苷酸或多肽，其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。
如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本公开中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
在本公开中，“突变”还可以包含在对应SEQ ID NO:1所示序列的一个或几个位置处不影响蛋白活性的添加、缺失或取代的氨基酸。众所周知，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换、添加或缺失某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性。
在一些实施方式中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，示例性的，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
如本公开所使用的，在两种核酸或多肽比较中的术语“序列同一性”或“同一性百分比”，是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。
本公开涉及的测定“序列同一性”或“同一性百分比”的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
在一些实施方式中，本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体与包含SEQ IDNO:1所示序列的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶相比，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。在另外一些实施方式中，本公开的编码烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的多核苷酸与编码SEQ ID NO:1所示序列的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的多核苷酸(所述多核苷酸的序列为如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列)相比，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约50个残基的区域、至少约100个残基的区域，至少约200个残基的区域，至少约400个残基的区域，或至少约500个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
在本发明中，术语“密码子优化”是指编码多肽的核苷酸序列已被配置为包含宿主细胞或生物体优选的密码子，以改善宿主细胞或生物体中的基因表达并提高翻译效率。
如本公开所使用的，术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、突变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。例如宿主细胞可以被遗传修饰以表达本公开的多肽。来自宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。“重组多核苷酸”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的，术语“重组多核苷酸”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。含有重组多核苷酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”。
如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：
转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
如本公开所使用的，术语“载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供用于其表达的控制序列。
如本公开所使用的，术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
如本公开所使用的，术语“重组基因”是并非天然存在的基因。重组基因是人造的。重组基因包括可操作地连接到表达控制序列上的蛋白质编码序列。实施方案包括但不限于引入微生物的外源基因、可操作地连接到异源启动子的内源蛋白质编码序列和具有经修改的蛋白质编码序列的基因。重组基因保存在微生物的基因组、微生物中的质粒或微生物中的噬菌体上。
如本公开所使用的，术语“可操作地连接”是指如下的构造：调控序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该调控序列指导该编码序列的表达。示例性的，所述调控序列可以选自启动子和/或增强子编码的序列。
如本公开所使用的，术语“核酸构建体”包含与适合的调控序列有效地连接的编码多肽或结构域或模块的多核苷酸，该调控序列对于在所选细胞或者菌株进行多核苷酸的表达是必需的。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。
本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的突变体多肽、编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本公开的具有编码烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶活性的多肽、重组多肽的多核苷酸的细胞即可。在一些实施方案中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产辅酶的微生物，包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)或微杆菌属(Microbacterium)等的菌株。在一些实施方案中，所述宿主细胞来源于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。在一些优选的实施方案中，所述宿主细胞来源于埃希氏菌属(Escherichia)，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，包括大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Trans T1等，更优选为大肠杆菌DH5α。
本公开的术语“细胞的湿重”是指细胞在正常生活状态下的质量。
本公开的术语“细胞培养物”是指细胞和细胞培养基的组合，其中细胞培养在生物体外的细胞培养基中。
本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开的术语“转化、转染、转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开中的术语“NAD”、“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸”、“辅酶I”和“氧化型辅酶I”可互换地使用。本公开中的“NAD衍生物”包括但不限于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、吡咯基NAD、呋喃基NAD、carbaNAD、carbaNADP、吡咯烷基NAD等。
本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体
在一些实施方式中，本公开通过定点突变构建了Methanocaldococcusjannaschii来源的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，所述突变体具备较高的酶活性并可以耐受高浓度底物，具备良好的底物转化性能。
在一些实施方式中，本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体在高浓度底物(250mM)仍具备高催化性能，可以烟酰胺单核苷酸为底物，制备NAD。
在一些实施方式中，本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体的突变位点包括SEQ ID NO:1所示序列的第121位置的取代的氨基酸。
示例性的，对应SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸由精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)(记为R121K)。
在一些实施方式中，本公开提供了烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，包括与本公开的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性，且氨基酸序列不为SEQID NO:1所示序列的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。
在一些实施方式中，本公开提供了具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶活性的蛋白，包括烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体的N端和C端的至少一端起，存在氨基酸的添加或缺失。
在一些具体的实施方式中，上述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体的N端和C端的至少一端起，添加或缺失1-20个氨基酸，优选1-15个，更优选1-10个，更优选1-3个，最优选1个，并且具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶活性。
在一些实施方式中，本公开提供了编码烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体的多核苷酸，多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示序列的突变体。
NAD的制备方法
在一些实施方式中，本公开可以包括利用前述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、重组多肽、多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞制备目标辅酶或其衍生物。
在一些具体的实施方式中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体可以纯酶、粗酶液、表达其的宿主细胞、表达其的宿主细胞的细胞破碎物形式或者含有表达其的宿主细胞的发酵液，参与反应。宿主细胞可以通过离心或过滤的方式收集细胞，用于宿主细胞催化转化。
在一些优选的实施方式中，以全细胞的形式参与反应。
进一步的，所述全细胞通过IPTG诱导获得，具体为：将所述重组宿主细胞培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.02～0.5mM、优选为0.1mM的IPTG进行诱导，诱导过夜，优选地，诱导时间为15h。
在一些具体的生产NAD的步骤中，全细胞在初始反应体系中的浓度为20～60g/L，优选为40g/L。
在一些具体的生产NAD的步骤中，以烟酰胺单核苷酸为底物，以三磷酸腺苷或其盐为磷酰基供体；所述烟酰胺单核苷酸的浓度为5～250mM，优选为100～200mM。
进一步的，所述烟酰胺单核苷酸与三磷酸腺苷或其盐的摩尔比为1:1.0～1:1.5，优选为1:1.0～1:1.2。
在一些可选的实施方式中，所述三磷酸腺苷的盐包括三磷酸腺苷二钠。
在一些具体的生产NAD的步骤中，反应体系中还含有镁离子，所述镁离子以硫酸盐、氯化盐的形式提供，所述镁离子的浓度为5～40mM，优选为10～20mM，更优选为20mM。
在一些具体的生产NAD的步骤中，反应体系的pH可选择为6.0～8.5，优选为8.0。
在一些具体的生产NAD的步骤中，反应温度可选择30℃～50℃，优选为30℃～45℃，更优选为37℃。
在一些可选的实施方式中，反应体系中还含有缓冲溶液，所述反应体系以超纯水作为缓冲液，或者以磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液作为缓冲液，优选以磷酸缓冲液作为缓冲液，更优选地，磷酸缓冲液的浓度为10mM～200mM。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1
本公开所采用的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，将编码基因设计至载体pET28a上的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点间，并由上海生工生物工程公司合成，得到表达野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的重组质粒。
本公开提供的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体构建方法具体步骤如下：
(1)PCR扩增所用的模板选用合成的质粒作为模板，以R121K-F和R121K-R为引物，构建得到烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体R121K，PCR扩增程序按照DNA聚合酶说明书进行，延伸速率为5s/Kb；
所述使用的引物为：
R121K-F：AAAAAAGAATACAGCGGCACCG(SEQ ID NO:5)，
R121K-R：GCCGCTGTATTCTTTTTTGTTGTACATTTCCGGACG(SEQ ID NO:6)；
所使用的PCR程序为：
预变性98℃5分钟；变性98℃10秒；退火55℃15秒；延伸72℃35秒；后延伸72℃5分钟；共扩增30-35个循环。
(2)扩增结束后，用Seamless Cloning Kit(碧云天生物技术有限公司，D7010M)按照说明书将扩增获得的PCR片段与目标质粒于50℃进行连接15分钟得到含有PCR片段的重组质粒，将重组质粒通过化学转化法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化产物于含50mg/mL的卡那霉素的LB培养基平板37℃过夜培养。
挑取长出的单菌落进行PCR验证，将PCR验证无误的菌落于含50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养得到培养液，对培养液提取质粒后送测序验证，验证正确的即为表达相应烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的突变体质粒。
实施例2：烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的蛋白表达
将构建正确的表达野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的重组质粒、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体质粒分别转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，将转化产物分别于含50mg/mL的卡那霉素的LB培养基平板37℃过夜培养，挑取长出的单菌落进行PCR验证，经PCR验证正确后，挑取验证正确的单菌落于10毫升含50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养，待OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG于18℃、150rpm诱导15h，待诱导结束后，通过SDS-PAGE分析突变体的蛋白表达情况。结果如图3所示。
实施例3：烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的全细胞催化反应
将实施例2获得的诱导之后的表达野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的菌液、表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的菌液分别进行离心，并收集菌体，将菌体用20mM的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后备用。
向反应体系中加入5mM、100mM、300mM的烟酰胺单核苷酸，再分别向反应体系中对应加入5mM、110mM、300mM的三磷酸腺苷，20mM的镁离子(MgSO4)，添加菌体至其在反应体系中的浓度为40g/L，添加Triton X-100至终浓度为0.2％，以超纯水或20mM的PBS为缓冲液，于37℃、pH8.0、220rpm反应0.5h，取样检测，将反应液经HPLC检测分析。
HPLC检测分析步骤：用10％的三氯乙酸终止反应，后12000rpm离心2分钟，取上清液稀释过滤，用HPLC检测：流动相A:50mM KH2PO4，流动相B:乙腈。
洗脱条件：
时间(min) A相(％) B相(％)
1 96 4
4 80 20
5 80 20
6 96 4
9 96 4
流速：1.0ml/min运行时间9min；进样量：5ul；柱温箱温度：30℃；波长：254nm
色谱：Agilent SB-AQ 4.6mm*250mm*5um。
转化率％＝n(产物)/[n(产物)+n(剩余底物)]×100％；
其中，n为摩尔数。
结果如图1所示，在添加5mM的底物、反应0.5h后，野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的产物为4.52mM，底物还剩0.28mM，转化率为94.17％；烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体产物为4.90mM，底物无剩余，转化率为100％，转化率较野生型提高6.20％；在添加100mM的底物、反应0.5h后，野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的产物为19.44mM，底物还剩59.240mM，转化率为24.71％；烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体产物为36.34mM，底物还剩49.83mM，转化率为42.17％，转化率较野生型提高70.7％；在添加300mM的底物、反应0.5h后，野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的产物为28mM，底物还剩260mM，转化率为9.7％；烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体产物为52mM，底物还剩231mM，转化率为18.37％，转化率较野生型提高89.4％。
实施例4：不同镁离子浓度下烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的全细胞催化反 应
将实施例2获得的诱导之后的表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的菌液进行离心，并收集菌体，将菌体用20mM的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后备用。
加入5mM的烟酰胺单核苷酸、5mM的三磷酸腺苷或其盐，5mM、10mM、20mM、40mM的镁离子(MgSO4)，添加菌体至其在反应体系中的浓度为40g/L，添加Triton X-100至终浓度为0.2％，以超纯水或20mM的PBS为缓冲液，于37℃、pH8.0、220rpm反应1小时，HPLC检测分析。
结果如图2所示，镁离子终浓度为5mM时，转化率为79.4％；镁离子终浓度为10mM时，转化率为79.8％；镁离子终浓度为20mM时，转化率为80.2％；镁离子终浓度为40mM时，转化率为79.8％。
野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
MRGFIIGRFQPFHKGHLEVIKKIAEEVDEIIIGIGSAQKSHTLENPFTAGERILMITQSLKDYDLTYYPIPIKDIEFNSIWVSYVESLTPPFDIVYSGNPLVRVLFEERGYEVKRPEMFNRKEYSGTEIRRRMLNGEKWEHLVPKAVVDVIKEIKGVERLRKLAQTDK
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
MRGFIIGRFQPFHKGHLEVIKKIAEEVDEIIIGIGSAQKSHTLENPFTAGERILMITQSLKDYDLTYYPIPIKDIEFNSIWVSYVESLTPPFDIVYSGNPLVRVLFEERGYEVKRPEMFNKKEYSGTEIRRRMLNGEKWEHLVPKAVVDVIKEIKGVERLRKLAQTDK
野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：
ATGCGGGGTTTCATCATCGGCCGTTTCCAGCCGTTCCACAAAGGCCACCTGGAAGTTATCAAGAAAATCGCGGAAGAAGTTGATGAAATCATCATCGGCATCGGCAGCGCGCAGAAAAGCCACACCCTGGAAAACCCGTTCACCGCGGGCGAACGTATCCTGATGATCACCCAGAGCCTGAAAGATTACGATCTGACCTACTACCCGATCCCGATCAAAGATATCGAATTCAACAGCATCTGGGTTAGCTACGTTGAAAGCCTGACCCCGCCGTTCGATATCGTTTACAGCGGCAACCCGCTGGTTCGTGTTCTGTTCGAAGAACGTGGCTACGAAGTTAAACGTCCGGAAATGTTCAACCGTAAAGAATACAGCGGCACCGAAATCCGTCGTCGTATGCTGAACGGTGAAAAATGGGAACACCTGGTTCCGAAAGCGGTTGTTGATGTTATCAAAGAAATCAAAGGCGTTGAACGTCTGCGTAAACTGGCGCAGACCGATAAATAA
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
ATGCGGGGTTTCATCATCGGCCGTTTCCAGCCGTTCCACAAAGGCCACCTGGAAGTTATCAAGAAAATCGCGGAAGAAGTTGATGAAATCATCATCGGCATCGGCAGCGCGCAGAAAAGCCACACCCTGGAAAACCCGTTCACCGCGGGCGAACGTATCCTGATGATCACCCAGAGCCTGAAAGATTACGATCTGACCTACTACCCGATCCCGATCAAAGATATCGAATTCAACAGCATCTGGGTTAGCTACGTTGAAAGCCTGACCCCGCCGTTCGATATCGTTTACAGCGGCAACCCGCTGGTTCGTGTTCTGTTCGAAGAACGTGGCTACGAAGTTAAACGTCCGGAAATGTTCAACAAAAAAGAATACAGCGGCACCGAAATCCGTCGTCGTATGCTGAACGGTGAAAAATGGGAACACCTGGTTCCGAAAGCGGTTGTTGATGTTATCAAAGAAATCAAAGGCGTTGAACGTCTGCGTAAACTGGCGCAGACCGATAAATAA
本公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，本说明书所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

Claims (13)

1.一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述突变体选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体和SEQ ID NO:1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO:1所示序列的第121位处包含突变；
(ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO:1所示序列的突变体；
(iii)由多核苷酸编码的突变体，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
(a)编码如(i)所示氨基酸序列的突变体的多核苷酸；
(b)(a)的全长互补多核苷酸；
(iv)由(i)、(ii)或(iii)任一项所示的突变体的片段，并且所述片段仍然具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶活性。
2.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述突变体为包含如下(c)所示的突变的突变体：
(c)对应SEQ ID NO:1所示序列的第121位的氨基酸由精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)。
3.根据权利要求1或2所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体包括在(i)所示序列的突变体的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。
4.一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括权利要求1～3任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，以及与所述突变体融合的外源多肽。
5.一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码权利要求1～3任一项所述突变体的核苷酸序列，或包含编码权利要求4所述重组多肽的核苷酸序列。
6.一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含权利要求5所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，调控序列为包含启动子和/或核糖体结合位点的核苷酸序列，所述调控序列指导所述突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。
7.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含权利要求5所述的分离的多核苷酸，或权利要求6所述的核酸构建体。
8.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含权利要求1～5任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、权利要求6所述的重组多肽、权利要求7所述的分离的多核苷酸、权利要求8所述的核酸构建体，或者权利要求9所述的重组表达载体。
9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其中，宿主细胞来源于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)或微杆菌属(Microbacterium)；优选地，所述宿主细胞或所述基因工程菌来源于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。
10.一种包含根据权利要求8或9所述的重组宿主细胞的细胞培养物。
11.根据权利要求1～3任一项所述的突变体，根据权利要求4所述的重组多肽、根据权利要求5所述的分离的多核苷酸、根据权利要求6所述的核酸构建体，根据权利要求7所述的重组表达载体，根据权利要求8或9所述的重组基因工程菌，或者根据权利要求10所述的细胞培养物在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其衍生物中的应用。
12.一种生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括培养根据权利要求1～3任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，根据权利要求4所述的重组多肽、根据权利要求5所述的分离的多核苷酸、根据权利要求6所述的核酸构建体，根据权利要求7所述的重组表达载体，根据权利要求8或9所述的重组基因工程菌，或者根据权利要求10所述的细胞培养物的步骤；
可选地，所述方法以烟酰胺单核苷酸为原料，还包括纯化或分离所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤；
优选地，所述方法以三磷酸腺苷或其盐为磷酰基供体，所述烟酰胺单核苷酸与三磷酸腺苷或其盐的摩尔比为1:1.0～1:1.5，优选为1:1.0～1:1.2。
优选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤中，还包括镁离子，所述镁离子的浓度为5～40mM，优选为10～20mM；
优选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤中，底物浓度5～250mM、pH6.5～8.5、反应温度为30℃～50℃。
13.一种制备权利要求1～3中任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的方法，所述方法包括培养含有权利要求8或9所述重组宿主细胞，然后从重组宿主细胞或其培养物中回收所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的步骤。
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