CN116555217A - Nad激酶突变体及其制备方法和用途 - Google Patents

Nad激酶突变体及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及NAD激酶突变体及其制备方法和用途，属于生物技术及分子生物学领域。本公开具体涉及NAD激酶突变体、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、细胞培养物，以及生产NADP的方法。本公开提供的NAD激酶突变体可以ploy(P)作为膦酰基供体，具备高效催化NAD合成NADP的能力，解决了目前存在的NAD激酶底物耐受能力差、催化效率低的问题，降低了NADP的生物催化合成成本，具有重要的工业应用价值。

Description

NAD激酶突变体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物技术及分子生物学领域，涉及NAD激酶突变体及其制备方法和用途，具体涉及NAD激酶突变体、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、细胞培养物，以及生产NADP的方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称：氧化型辅酶Ⅱ，英文名：Nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADP)，是一种极为重要的核苷酸类辅酶。NADP在氧化还原反应中传递质子、电子及能量，并且参与到很多细胞代谢反应中，是生物体内不可缺少的重要辅酶。NADP在生命科学、酶催化不对称合成、医疗保健领域具有广泛的应用。
NADP在生物中广泛存在，但含量极低。目前合成NADP的方法主要分为化学法和生物法。其中，化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出NADP，但化学法存在反应路线长、反应条件苛刻、选择性差、副产物多、收率低、污染环境、生产成本高等问题。
生物法又分为传统的发酵法和酶法，其中发酵法是采用发酵或其它微生物培养技术，通过对酵母或其它微生物的分离、提取，得到NADP，但是该路线的NADP产率低、原料及能源消耗大，生产成本高，限制了NADP的生产。而酶催化合成NADP是一种更为高效的反应，具有反应条件温和、立体选择性强、相比于发酵法转化率高等优点。
NADP在生物体内的合成，主要在NAD激酶的作用下，利用ATP或多聚磷酸(poly(P))衍生物作为磷酸供体，催化NAD磷酸化而获得。NAD激酶分为两类，一类是以ATP作为磷酰基供体的酶催化NAD磷酸化的ATP-NAD激酶，另一类是以ploy(P)和ATP作为磷酰基供体的酶催化NAD磷酸化的poly(P)/ATP-NAD激酶。
目前已有许多的研究利用NAD激酶合成NADP，但是天然来源的NAD激酶催化能力较弱。为了提升NAD激酶的催化性能，研究者尝试对NAD激酶进行改造，以期提升其性能，例如，引用文献1中公开了对来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶进行改造，使酶活提升1-1.5倍，但需以昂贵的ATP为磷酰基供体，NADP产量最高为14.5g/L；引用文献2中公开了对来源于闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的NAD激酶进行改造，NADP转化率能够从80％提高至99％，提高了催化效能，降低了底物残留，但需以昂贵的ATP为磷酰基供体，反应时间长达18h，NAD底物浓度仅40g/L，底物浓度耐受较低；引用文献3中公开了对来源于Myxococcus xanthus的NAD激酶进行改造，提高了催化活性，以聚磷酸钠为磷酰基供体实现了底物最高42g/L的NAD底物催化，但底物浓度耐受仍较低。在引用文献4中首次报道了来自Micrococcus flavus的poly(P)/ATP-NAD激酶为NAD激酶，相比于以昂贵的ATP为磷酰化供体的NAD激酶，该酶可同时以ATP和ploy(P)为膦酰基供体，但是NAD激酶底物耐受能力仍然比较差，生产效率低。
因此，现有报道的NAD激酶在制备NADP的转化中普遍存在需以昂贵的ATP作为磷酰基供体，底物浓度耐受低，反应时间较长等问题，即使可以ploy(P)为膦酰基供体，但仍存在底物耐受能力差、生产效率低的问题。为了提升以poly(P)为磷酰化供体的NAD激酶的催化效率，缩短反应时间，提升NAD激酶底物浓度耐受能力，提高合成液NADP浓度，降低NADP的生物催化合成成本，提高NAD激酶的工业应用价值。本发明对氨基酸进行改造，以期获得高底物浓度耐受、高催化活性的NAD激酶突变体。
引用文献：
引用文献1：CN103409442B；
引用文献2：CN114277013A；
引用文献3：CN115109764A；
引用文献4：Kawai S,Mori S,Mukai T,Suzuki S,Yamada T,Hashimoto W,MurataK.Inorganic Polyphosphate_ATP-NAD Kinase of Micrococcus flavus andMycobacterium tuberculosis H37Rv.Biochem Biophys Res Commun.2000Sep 16；276(1):57-63。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，NAD激酶底物耐受能力差、催化效率低。为此，本公开在野生型NAD激酶的基础上，通过人工引入突变，改善其底物耐受能力、提升催化性能。
本公开提供的NAD激酶突变体，该NAD激酶突变体可以ploy(P)为膦酰基供体，具备在高底物浓度条件下高效催化底物制备NADP的能力，缩短了反应时间、提升了生产效率，降低NADP的生物催化合成成本，具有重要的工业应用价值。
用于解决问题的方案
本公开提供了如下技术方案：
[1].NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体包含如下(i)～(iv)组成的组中的任一项：
(i)所述NAD激酶突变体与SEQ ID NO:1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO:1所示所示序列的至少第18、210、219或288位中的一个或多个位置处包含突变；
(ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO:1所示序列的突变体；
(iii)由多核苷酸编码的突变体，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
(a)编码如(i)所示氨基酸序列的突变体的多核苷酸；
(b)与(a)的全长互补的多核苷酸；
(iv)由(i)、(ii)或(iii)任一项所示的突变体的片段，并且所述片段仍然具有NAD激酶活性。
[2].根据[1]所述的NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体为包含如下(c)～(f)中至少一项所示的突变的突变体：
(c)对应SEQ ID NO:1所示序列的第18位的氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)；
(d)对应SEQ ID NO:1所示序列的第210位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)；
(e)对应SEQ ID NO:1所示序列的第219位的氨基酸由异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)；
(f)对应SEQ ID NO:1所示序列的第288位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)。
[3].根据[1]或[2]所述的NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体包括在(i)所示序列的突变体的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。
[4].一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括[1]～[3]任一项所述的NAD激酶突变体，以及与所述NAD激酶突变体融合的外源多肽。
[5].一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码[1]～[4]任一项所述的NAD激酶突变体的核苷酸序列，或包含编码[4]所述重组多肽的核苷酸序列。
[6].一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含[5]所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列为包含启动子和/或核糖体结合位点的核苷酸序列，并且所述调控序列指导所述NAD激酶突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。
[7].一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含[5]所述的分离的多核苷酸，或[6]所述的核酸构建体。
[8].一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含[1]～[3]任一项所述的NAD激酶突变体、根据[4]所述的重组多肽、根据[5]所述的分离的多核苷酸、根据[6]所述的核酸构建体，或者根据[7]所述的重组表达载体。
[9].根据[8]所述的重组宿主细胞，其中，宿主细胞来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；优选地，所述宿主细胞来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。
[10].一种包含根据[8]或[9]所述的重组宿主细胞的细胞培养物。
[11].根据[1]～[3]任一项所述的NAD激酶突变体，根据[4]所述的重组多肽、根据[5]所述的分离的多核苷酸、根据[6]所述的核酸构建体，根据[7]所述的重组表达载体，根据[8]或[9]所述的重组宿主细胞，或者根据[10]所述的细胞培养物在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的应用。
[12].一种生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，所述方法包括培养根据[1]～[3]任一项所述的NAD激酶突变体，根据[4]所述的重组多肽、根据[5]所述分离的多核苷酸、根据[6]所述的核酸构建体，根据[7]所述的重组表达载体，根据[8]或[9]所述的重组宿主细胞，或者根据[10]所述的细胞培养物的步骤；
可选地，所述方法以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物；
可选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，还包括磷酰基供体，优选地，以三偏磷酸盐、六偏磷酸盐、多聚磷酸盐或四聚磷酸盐中的一种或多种为磷酰基供体，更优选地，以四聚磷酸盐为磷酰基供体；
可选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，还包括锰离子；
优选地，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为20～200g/L，进一步优选为50～200g/L，更优选为100～200g/L；
优选地，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与膦酰基供体的质量比为1:0.42～1.06，更优选为1:0.57～0.78；
优选地，所述锰离子浓度为0.4mM～40mM，优选为2.5mM～20mM；
优选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，pH值为5.0～8.0，更优选为5.5～7.5；
优选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，反应温度为30～60℃，更优选为37℃～55℃；
可选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，反应时间为1.0h～10.0h，优选为2.0h～7.0h。
[13].一种制备[1]～[3]中任一项所述的NAD激酶突变体的方法，所述方法包括培养含有[8]或[9]所述重组宿主细胞，然后从重组宿主细胞或其培养物中回收所述NAD激酶突变体的步骤。
发明的效果
在一些实施方式中，本公开提供的NAD激酶突变体可以ploy(P)作为膦酰基供体，其催化NAD合成NADP的性能得以提升；
在一些实施方式中，本公开提供的NAD激酶突变体底物耐受能力显著提升，可耐受高浓度底物，实现了在底物NAD浓度为200g/L时的仍具备良好的催化性能；
在一些实施方式中，本公开提供的NAD激酶突变体用于NAD合成NADP的方法，催化时间短、合成效率高、转化率高；
在一些实施方式中，本公开提供的利用NAD激酶突变体催化NAD合成NADP的方法，可以纯水作为合成反应介质，合成反应体系简单，降低了生产成本，具有重大的工业化应用价值。
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在某一特定数值或范围的±10％、±5％、±1％或±0.5％之内。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的，尽管可以使用其他有机或无机催化剂，但术语“转化(converting)”是指主要由一种或多种的多肽(酶)催化从一个分子到另一个分子的化学转化；其也可以指期望产物的摩尔量与限量底物的摩尔量之间的比率(以％为单位)。
如本公开所使用的，术语“NAD激酶”(NAD kinase)在本文中指的是ATP/多聚磷酸依赖型NAD激酶(又称为poly(P)/ATP-NAD激酶)(Inorganic Polyphosphate/ATP-NADkinase，MfnK)，该酶可同时以ATP和ploy(P)为膦酰基供体。在一些实施方式中，所述NAD激酶来源于黄色微球菌(Micrococcus flavus)，NCBI的登录号为WP_135030347。
如本公开所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形、分支或环状的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化、C端氨基酸的酰胺化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
在本发明中，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。本发明中氨基酸及缩写和英文简称如下所示：
组氨酸(His，H)；丝氨酸(Ser，S)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；苏氨酸(Thr，T)；苯丙氨酸(Phe，F)；天冬氨酸(Asp，D)；酪氨酸(Tyr，Y)；亮氨酸(Leu，L)；异亮氨酸(Ile，I)；精氨酸(Arg，R)；丙氨酸(Ala，A)；缬氨酸(Val，V)；色氨酸(Trp，W)；甲硫氨酸(Met，M)；天冬酰胺(Asn，N)；半胱氨酸(Cys，C)；赖氨酸(Lys，K)；脯氨酸(Pro，P)。
如本公开所使用的，术语“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽或一个催化或碳水化合物结合模块。在本公开的技术方案中，所述片段具有DNA激酶活性。
如本公开所使用的，术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。
如本公开所使用的，术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多核苷酸或多肽，其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。
如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本公开中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
在本公开中，“突变”还可以包含在对应SEQ ID NO:1所示序列的一个或几个位置处不影响蛋白活性的添加、缺失或取代的氨基酸。众所周知，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换、添加或缺失某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性。
在一些实施方式中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，示例性的，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
如本公开所使用的，在两种核酸或多肽比较中的术语“序列同一性”或“同一性百分比”，是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。
本公开涉及的测定“序列同一性”或“同一性百分比”的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
在一些实施方式中，本公开的NAD激酶突变体与包含SEQ ID NO:1所示序列的NAD激酶相比，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。在另外一些实施方式中，本公开的编码NAD激酶突变体的多核苷酸与编码SEQ ID NO:1所示序列的NAD激酶的多核苷酸(所述多核苷酸的序列为如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列)相比，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约50个残基的区域、至少约100个残基的区域，至少约200个残基的区域，至少约400个残基的区域，或至少约500个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
在本发明中，术语“密码子优化”是指编码多肽的核苷酸序列已被配置为包含宿主细胞或生物体优选的密码子，以改善宿主细胞或生物体中的基因表达并提高翻译效率。
如本公开所使用的，术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、突变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。例如宿主细胞可以被遗传修饰以表达本公开的多肽。来自宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。“重组多核苷酸”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的，术语“重组多核苷酸”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。含有重组多核苷酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”。
如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
如本公开所使用的，术语“载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供用于其表达的控制序列。
如本公开所使用的，术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
如本公开所使用的，术语“重组基因”是并非天然存在的基因。重组基因是人造的。重组基因包括可操作地连接到表达控制序列上的蛋白质编码序列。实施方案包括但不限于引入微生物的外源基因、可操作地连接到异源启动子的内源蛋白质编码序列和具有经修改的蛋白质编码序列的基因。重组基因保存在微生物的基因组、微生物中的质粒或微生物中的噬菌体上。
如本公开所使用的，术语“可操作地连接”是指如下的构造：调控序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该调控序列指导该编码序列的表达。示例性的，所述调控序列可以选自启动子和/或增强子编码的序列。
如本公开所使用的，术语“核酸构建体”包含与适合的调控序列有效地连接的编码多肽或结构域或模块的多核苷酸，该调控序列对于在所选细胞或者菌株进行多核苷酸的表达是必需的。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。
本公开中的术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
术语“重组宿主细胞”涵盖导入多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。
本公开的术语“细胞的湿重”是指细胞在正常生活状态下的质量。
本公开的术语“细胞培养物”是指细胞和细胞培养基的组合，其中细胞培养在生物体外的细胞培养基中。
本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开的术语“转化、转染、转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开中的术语“NADP”指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
本公开中的术语“NAD”指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，也称氧化型辅酶Ⅰ，是生物体内常见的一种脱氢酶的辅酶。
本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
NAD激酶突变体
在一些实施方式中，本公开通过定点突变构建了黄色微球菌(Micrococcusflavus)中编码NAD激酶的突变体，所述突变体可以耐受高浓度底物，具备良好的底物转化性能。
在一些实施方式中，本公开的NAD激酶在高底物浓度(50g/L以上)的催化条件下仍然具有高酶活的特点，可高效以NAD为底物、以廉价的三偏磷酸钠、六偏磷酸钠、多聚磷酸钠或四聚磷酸钠等为膦酰基供体，制备NADP。
在一些实施方式中，本公开的NAD激酶的突变体的突变位点包括SEQ ID NO:1所示序列的第18、210、219或288位中的一个或多个位置的取代的氨基酸。
示例性的，对应SEQ ID NO:1所示序列的第18位的氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)(记为Q18E，编号为Mu01)。
对应SEQ ID NO:1所示序列的第210位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)(记为G210E，编号为Mu02)。
对应SEQ ID NO:1所示序列的第219位的氨基酸由异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)(记为I219N，编号为Mu03)。
对应SEQ ID NO:1所示序列的第288位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)(记为D288E，编号为Mu04)。
在一些实施方式中，本公开提供了NAD激酶突变体，包括与本公开的NAD激酶的突变体具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性，且氨基酸序列不为SEQ ID NO:1所示序列的NAD激酶突变体。
在一些实施方式中，本公开提供了具有NAD激酶活性的蛋白，包括NAD激酶的突变体的N端和C端的至少一端起，存在氨基酸的添加或缺失。
在一些具体的实施方式中，上述NAD激酶的突变体的N端和C端的至少一端起，添加或缺失1-20个氨基酸，优选1-15个，更优选1-10个，更优选1-3个，最优选1个，并且具有NAD激酶活性。
在一些实施方式中，本公开提供了编码NAD激酶的突变体的多核苷酸，多核苷酸编码如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示序列的突变体。
在一些具体的实施方式中，所述多核苷酸分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:9或SEQ ID NO:11所示。
NADP的制备方法
在一些实施方式中，本公开可以包括利用前述NAD激酶突变体、重组多肽、多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞制备NADP。
在一些具体的实施方式中，所述NAD激酶突变体可以纯酶、粗酶液、表达其的宿主细胞、表达其的宿主细胞的细胞破碎物形式或者含有表达其的宿主细胞的发酵液，参与反应。宿主细胞可以通过离心或过滤的方式收集细胞，用于宿主细胞催化转化。
在一些优选的实施方式中，以全细胞的形式参与反应。
在一些具体的生产NADP的步骤中，以NAD为底物；所述NAD的浓度为20～200g/L，优选为50～200g/L，更优选为100～200g/L。
在一些具体的生产NADP的步骤中，以三偏磷酸盐、六偏磷酸盐、多聚磷酸盐或四聚磷酸盐中的一种或多种为磷酰基供体，优选以四聚磷酸盐为磷酰基供体，所述四聚磷酸盐包括四聚磷酸钠、四聚磷酸钾，更优选为四聚磷酸钠。
进一步的，所述NAD与膦酰基供体的质量比为1:0.42～1.06，优选为1:0.57～0.78。
在一些具体的生产NADP的步骤中，反应体系中还含有锰离子，锰离子浓度为0.4mM～40mM，优选为2.5mM～20mM，更优选为5mM。
可选的，所述锰离子由包括硫酸锰、氯化锰、硝酸锰在内的所提供，优选为氯化锰。
在一些具体的生产NADP的步骤中，反应体系的pH通过碱溶液或酸溶液调节，优选为碱溶液，更优选为氢氧化钠或氢氧化钾。
在一些具体的生产NADP的步骤中，反应体系的pH可选择5.0～8.0，优选为5.5～7.5，更优选为6.5。
在一些具体的生产NADP的步骤中，反应温度可选择30℃～60℃，优选为37℃～55℃，更优选为45℃。
在一些具体的生产NADP的步骤中，反应时间为1.0h～10.0h，优选为2.0h～7.0h。
在一些可选的实施方式中，生产NADP的反应体系中还可含有曲拉通，以提升细胞膜的通透性，增加酶与底物的接触。
在一些可选的实施方式中，生产NADP的反应体系中还可包括磷酸缓冲盐、Tris-HCl缓冲液等缓冲溶液。
在本领域，用于操纵微生物的方法是已知的，如《分子生物学现代方法》(OnlineISBN：9780471142720,John Wiley and Sons,Inc.)、《微生物代谢工程：方法和规程》(Qiong Cheng Ed.,Springer)和《系统代谢工程：方法和规程》(Hal S.Alper Ed.,Springer)等出版物中被解释。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1：野生型NAD激酶的诱导表达
(1)野生型重组质粒的构建
将NAD激酶的对应的编码基因MfnK进行密码子优化，优化后的序列如SEQ ID NO:3所示，在优化后序列的两端分别引入NdeI和HindⅢ限制性内切酶位点，从而实现将密码子优化的NAD激酶的编码基因MfnK直接设计在pET28a上，由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成，得到重组质粒pET28a-MfnK。
(2)表达野生型MfnK的重组菌株的构建
将得到的重组质粒pET28a-MfnK转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得重组菌株。利用通用引物T7/T7-ter菌落PCR验证正确后，进一步进行下游的蛋白表达。
T7：TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO:12)
T7-ter：GCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO:13)
(3)表达野生型MfnK的重组菌株的诱导表达
将转化平板上的阳性单克隆转入有50μg/mL卡那霉素抗性的LB试管中，37℃下培养过夜得种子液。将种子液按照0.2％(v/v)的接种量转接到含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基中，在37℃下培养细菌，待生物量OD600值达到0.6～0.8时，利用终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，温度降低到30℃，在30℃下表达15h后结束培养。
实施例2：NAD激酶突变体的构建
通过定点突变计出一系列突变体：Q18E，G210E，I219N，D288E。根据理性设计的突变体，利用软件构建出突变的引物，具体序列见表1，表中下划线部分为突变后的氨基酸的密码子。
表1.定点突变引物核酸序列
利用PCR的常规技术，在TaKaRa高保真DNA聚合酶(Max DNAPolymerase)的作用下，利用不同温度退化并延伸，实现全长质粒的扩增。每对引物都能完好的扩增出全质粒片段。
将PCR扩增产物在DpnI限制性内切酶的消化下，除去野生型的模板DNA序列，在碧云天无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)作用下，完成全质粒片段连接，连接产物转入到BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有50μg/mL的卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆进行测序鉴定位点是否突变正确，选取突变正确的单克隆作为阳性菌株进行后续实验。
实施例3：NAD激酶突变体的催化活性测试
将实施例2中得到的测序正确的阳性菌株进行突变体的诱导表达，表达条件与实施例1中表达野生型MfnK的重组菌株的诱导表达条件相同，分别获得含有突变体Q18E、G210E、I219N、D288E的重组细胞。将重组细胞在5000rpm下离心5min，收集菌体用于全细胞催化反应。
在1mL的反应体系中，进行全细胞催化酶活比较，湿细胞终浓度为30g/L，NAD底物浓度分别设置为50g/L和200g/L，以四聚磷酸钠为磷酰基供体，NAD与四聚磷酸钠的质量比为1:0.71，锰离子终浓度5.0mM，以纯水溶解上述物质，利用0.1M KOH溶液调节反应液pH值为6.5，反应体系见表2，在45℃、220rpm的震荡器中反应，在反应0.5h和2.0h时间段分别取样分析转化效果，数据见表3，最终获得Q18E、G210E、I219N、D288E突变体底物浓度耐受及催化活性发生显著提高。
表2.全细胞催化比较酶活反应体系
表3.不同突变体催化活性
实施例4：野生型NAD激酶的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 5.00g，四聚磷酸钠3.55g，无水MnCl2 0.06g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至6.5，最后加入表达野生型NAD激酶的细胞3.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在6.5。反应5.0h后转化率为96.4％。
实施例5：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 10.00g，四聚磷酸钠7.10g，无水MnCl2 0.06g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至6.5，最后加入表达突变体(Mu01)NAD激酶的细胞3.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在6.5。反应4.0h后转化率为97.7％。
实施例6：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 10.00g，四聚磷酸钠7.10g，无水MnCl2 0.06g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至6.5，最后加入表达突变体(Mu02)NAD激酶的细胞3.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在6.5。反应4.0h后转化率为98.2％。
实施例7：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 10.00g，四聚磷酸钠7.10g，无水MnCl2 0.06g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至6.5，最后加入表达突变体(Mu03)NAD激酶的细胞3.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在6.5。反应4.0h后转化率为97.5％。
实施例8：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 10.00g，四聚磷酸钠7.10g，无水MnCl2 0.06g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至6.5，最后加入表达突变体(Mu04)NAD激酶的细胞3.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在6.5。反应4.0h后转化率为98.9％。
实施例9：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 2.00g，四聚磷酸钠0.84g，无水MnCl2 0.006g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至5.5，最后加入表达突变体(Mu01)NAD激酶的细胞0.50g，搅拌均匀并定容，在37℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在5.5。反应2.0h后转化率为99.6％。
实施例10：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 20.00g，四聚磷酸钠21.2g，无水MnCl2 0.24g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至7.5，最后加入表达突变体(Mu04)NAD激酶的细胞5.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在7.5。反应7.0h后转化率为98.4％。
实施例11：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 15.00g，四聚磷酸钠8.55g，无水MnCl2 0.12g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至6.5，最后加入表达突变体(Mu03)NAD激酶的细胞3.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在6.5。反应5.0h后转化率为98.7％。
实施例12：NAD激酶突变体的转化
在100mL的反应体系中，称取NAD 15.00g，四聚磷酸钠11.7g，无水MnCl2 0.12g，量取曲拉通X-100 0.2mL，用纯水溶解上述原料，利用0.1M的KOH溶液调节反应体系pH至6.0，最后加入表达突变体(Mu02)NAD激酶的细胞4.00g，搅拌均匀并定容，在45℃的水浴下控制反应温度并进行磁力搅拌，利用0.1M的KOH控制反应过程中的pH稳定在6.0。反应5.0h后转化率为99.4％。
SEQ ID NO:1(野生型氨基酸序列)：
MSETPARRVLVLAHTGRQDAIDAALQAIRILDEEGLDSVMPAADVAAVRAAVGEDPGFRPLSLGEDCALSDVSLGLVLGGDGSVLRAADLVRGHGIPLLAVNLGHVGFLAESERTDLHRTVKAIADEAYVVIERMALDVVVRVDGREAARTWALNEASVEKSNRERMLEVVVSVDDSPLTAFGCDGVVLGTPTGSTAYAFSAGGPVVWPGVEALLFVPISAHALFARPLVVGPHSTIAVDIMTRTRETGVLWCDGRRTVDLPPNARVEVTRSTEPVRLARLSPVPFADRLVRKFRLPTEGWRGPVTDEDVRAREATAVAEVETVEPRHAGPRPDVVPPPTSALPVLTPEDLERYRSRDGRGGDRTS*
SEQ ID NO:2(野生型核苷酸序列)：
ATGTCCGAGACCCCCGCACGCCGCGTGCTCGTGCTCGCCCACACGGGGCGGCAGGACGCCATCGACGCGGCCCTGCAGGCCATCCGCATCCTCGACGAGGAGGGCCTGGACAGCGTCATGCCCGCCGCGGACGTGGCGGCCGTGCGCGCCGCAGTGGGGGAGGACCCCGGCTTCCGCCCCCTCTCGCTCGGCGAGGACTGCGCGCTGTCCGACGTGAGCCTCGGACTGGTCCTCGGCGGGGACGGCTCCGTCCTGCGCGCCGCCGACCTGGTGCGCGGCCACGGCATCCCGCTCCTGGCGGTCAACCTCGGCCACGTCGGGTTCCTCGCCGAGTCCGAGCGCACGGACCTGCACCGCACCGTCAAGGCGATCGCCGACGAGGCCTACGTGGTCATCGAACGGATGGCGCTCGACGTCGTGGTGCGCGTGGACGGCCGGGAGGCGGCCCGGACGTGGGCCCTGAACGAGGCCTCCGTGGAGAAGTCCAACCGGGAGCGCATGCTGGAGGTCGTGGTCTCCGTGGACGACTCGCCGCTGACCGCGTTCGGCTGCGACGGCGTGGTGCTGGGCACCCCCACGGGGTCCACCGCCTACGCGTTCTCCGCGGGCGGACCCGTGGTGTGGCCGGGGGTGGAGGCCCTGCTGTTCGTGCCCATCAGCGCGCACGCGCTGTTCGCCCGTCCCCTCGTGGTGGGACCGCACTCCACCATCGCCGTGGACATCATGACCCGCACCCGCGAGACGGGCGTGCTGTGGTGCGACGGGCGCCGCACGGTGGACCTCCCGCCGAACGCCCGCGTCGAAGTCACCCGCTCCACGGAGCCGGTCCGCCTGGCCCGCCTGAGCCCGGTCCCCTTCGCGGACCGCCTGGTGCGCAAGTTCCGCCTGCCCACGGAGGGCTGGCGCGGCCCCGTGACGGACGAGGACGTCCGCGCGCGGGAGGCCACCGCCGTGGCCGAGGTGGAGACCGTCGAGCCGCGGCACGCCGGCCCCCGGCCGGACGTGGTGCCGCCGCCCACCTCGGCGCTGCCCGTGCTCACCCCCGAGGACCTCGAGCGCTACCGCAGCCGCGACGGCCGGGGAGGGGATCGGACCTCATGA
SEQ ID NO:3(野生型密码子优化核苷酸序列)：
ATGAGCGAAACCCCGGCGCGTCGTGTTCTGGTTCTGGCGCACACCGGTCGTCAGGACGCTATTGATGCGGCGCTGCAGGCGATCCGTATTCTGGATGAAGAAGGCCTGGACAGCGTTATGCCGGCGGCGGACGTTGCTGCGGTTCGTGCTGCGGTTGGTGAAGATCCGGGCTTCCGTCCGCTGAGCCTGGGCGAAGATTGTGCTCTGTCTGATGTGTCCCTGGGTCTGGTGCTGGGCGGCGATGGCTCCGTGCTGCGTGCGGCGGATCTGGTTCGTGGCCACGGCATCCCGCTGCTGGCGGTTAACCTGGGCCACGTTGGCTTCCTGGCAGAATCTGAACGTACTGATCTGCATCGTACCGTTAAAGCGATTGCGGATGAAGCGTACGTTGTTATCGAACGTATGGCACTGGACGTTGTTGTGCGTGTTGATGGTCGTGAAGCGGCGCGCACCTGGGCGCTGAACGAAGCGTCCGTTGAAAAAAGCAACCGTGAACGCATGCTGGAAGTGGTTGTTAGCGTGGATGATTCTCCGCTGACTGCTTTCGGCTGCGATGGCGTTGTTCTGGGTACCCCGACCGGTTCCACCGCCTACGCATTCTCCGCGGGCGGCCCGGTTGTGTGGCCGGGCGTTGAAGCGCTGCTGTTTGTACCGATCTCTGCGCACGCGCTGTTCGCTCGCCCGCTGGTTGTTGGCCCGCACTCTACCATCGCGGTGGACATCATGACCCGTACCCGTGAAACCGGTGTTCTGTGGTGCGACGGCCGTCGCACCGTGGACCTGCCGCCGAACGCGCGTGTTGAAGTTACTCGCAGCACCGAACCGGTCCGTCTGGCGCGTCTGTCTCCGGTGCCGTTCGCGGATCGTCTGGTTCGTAAATTCCGCCTGCCGACCGAAGGCTGGCGCGGTCCGGTTACCGACGAAGATGTTCGTGCGCGCGAAGCGACCGCGGTGGCTGAAGTTGAAACCGTTGAACCGCGTCACGCGGGCCCGCGTCCGGATGTTGTTCCGCCGCCGACCAGCGCGCTGCCGGTTCTGACCCCGGAAGATCTGGAACGTTACCGTAGCCGTGATGGTCGTGGCGGTGATCGTACCTCT
SEQ ID NO:4(Mu01-Q18E氨基酸序列，下划线处为突变位点)：
MSETPARRVLVLAHTGREDAIDAALQAIRILDEEGLDSVMPAADVAAVRAAVGEDPGFRPLSLGEDCALSDVSLGLVLGGDGSVLRAADLVRGHGIPLLAVNLGHVGFLAESERTDLHRTVKAIADEAYVVIERMALDVVVRVDGREAARTWALNEASVEKSNRERMLEVVVSVDDSPLTAFGCDGVVLGTPTGSTAYAFSAGGPVVWPGVEALLFVPISAHALFARPLVVGPHSTIAVDIMTRTRETGVLWCDGRRTVDLPPNARVEVTRSTEPVRLARLSPVPFADRLVRKFRLPTEGWRGPVTDEDVRAREATAVAEVETVEPRHAGPRPDVVPPPTSALPVLTPEDLERYRSRDGRGGDRTS
SEQ ID NO:5(Mu01-Q18E核酸序列，下划线处为突变位点)：
ATGAGCGAAACCCCGGCGCGTCGTGTTCTGGTTCTGGCGCACACCGGTCGTGAAGACGCTATTGATGCGGCGCTGCAGGCGATCCGTATTCTGGATGAAGAAGGCCTGGACAGCGTTATGCCGGCGGCGGACGTTGCTGCGGTTCGTGCTGCGGTTGGTGAAGATCCGGGCTTCCGTCCGCTGAGCCTGGGCGAAGATTGTGCTCTGTCTGATGTGTCCCTGGGTCTGGTGCTGGGCGGCGATGGCTCCGTGCTGCGTGCGGCGGATCTGGTTCGTGGCCACGGCATCCCGCTGCTGGCGGTTAACCTGGGCCACGTTGGCTTCCTGGCAGAATCTGAACGTACTGATCTGCATCGTACCGTTAAAGCGATTGCGGATGAAGCGTACGTTGTTATCGAACGTATGGCACTGGACGTTGTTGTGCGTGTTGATGGTCGTGAAGCGGCGCGCACCTGGGCGCTGAACGAAGCGTCCGTTGAAAAAAGCAACCGTGAACGCATGCTGGAAGTGGTTGTTAGCGTGGATGATTCTCCGCTGACTGCTTTCGGCTGCGATGGCGTTGTTCTGGGTACCCCGACCGGTTCCACCGCCTACGCATTCTCCGCGGGCGGCCCGGTTGTGTGGCCGGGCGTTGAAGCGCTGCTGTTTGTACCGATCTCTGCGCACGCGCTGTTCGCTCGCCCGCTGGTTGTTGGCCCGCACTCTACCATCGCGGTGGACATCATGACCCGTACCCGTGAAACCGGTGTTCTGTGGTGCGACGGCCGTCGCACCGTGGACCTGCCGCCGAACGCGCGTGTTGAAGTTACTCGCAGCACCGAACCGGTCCGTCTGGCGCGTCTGTCTCCGGTGCCGTTCGCGGATCGTCTGGTTCGTAAATTCCGCCTGCCGACCGAAGGCTGGCGCGGTCCGGTTACCGACGAAGATGTTCGTGCGCGCGAAGCGACCGCGGTGGCTGAAGTTGAAACCGTTGAACCGCGTCACGCGGGCCCGCGTCCGGATGTTGTTCCGCCGCCGACCAGCGCGCTGCCGGTTCTGACCCCGGAAGATCTGGAACGTTACCGTAGCCGTGATGGTCGTGGCGGTGATCGTACCTCT
SEQ ID NO:6(Mu02-G210E氨基酸序列，下划线处为突变位点)：
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SEQ ID NO:7(Mu02-G210E核酸序列，下划线处为突变位点)：
ATGAGCGAAACCCCGGCGCGTCGTGTTCTGGTTCTGGCGCACACCGGTCGTCAGGACGCTATTGATGCGGCGCTGCAGGCGATCCGTATTCTGGATGAAGAAGGCCTGGACAGCGTTATGCCGGCGGCGGACGTTGCTGCGGTTCGTGCTGCGGTTGGTGAAGATCCGGGCTTCCGTCCGCTGAGCCTGGGCGAAGATTGTGCTCTGTCTGATGTGTCCCTGGGTCTGGTGCTGGGCGGCGATGGCTCCGTGCTGCGTGCGGCGGATCTGGTTCGTGGCCACGGCATCCCGCTGCTGGCGGTTAACCTGGGCCACGTTGGCTTCCTGGCAGAATCTGAACGTACTGATCTGCATCGTACCGTTAAAGCGATTGCGGATGAAGCGTACGTTGTTATCGAACGTATGGCACTGGACGTTGTTGTGCGTGTTGATGGTCGTGAAGCGGCGCGCACCTGGGCGCTGAACGAAGCGTCCGTTGAAAAAAGCAACCGTGAACGCATGCTGGAAGTGGTTGTTAGCGTGGATGATTCTCCGCTGACTGCTTTCGGCTGCGATGGCGTTGTTCTGGGTACCCCGACCGGTTCCACCGCCTACGCATTCTCCGCGGGCGGCCCGGTTGTGTGGCCGGAAGTTGAAGCGCTGCTGTTTGTACCGATCTCTGCGCACGCGCTGTTCGCTCGCCCGCTGGTTGTTGGCCCGCACTCTACCATCGCGGTGGACATCATGACCCGTACCCGTGAAACCGGTGTTCTGTGGTGCGACGGCCGTCGCACCGTGGACCTGCCGCCGAACGCGCGTGTTGAAGTTACTCGCAGCACCGAACCGGTCCGTCTGGCGCGTCTGTCTCCGGTGCCGTTCGCGGATCGTCTGGTTCGTAAATTCCGCCTGCCGACCGAAGGCTGGCGCGGTCCGGTTACCGACGAAGATGTTCGTGCGCGCGAAGCGACCGCGGTGGCTGAAGTTGAAACCGTTGAACCGCGTCACGCGGGCCCGCGTCCGGATGTTGTTCCGCCGCCGACCAGCGCGCTGCCGGTTCTGACCCCGGAAGATCTGGAACGTTACCGTAGCCGTGATGGTCGTGGCGGTGATCGTACCTCT
SEQ ID NO:8(Mu03-I219N氨基酸序列，下划线处为突变位点)：
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SEQ ID NO:9(Mu03-I219N核酸序列，下划线处为突变位点)：
ATGAGCGAAACCCCGGCGCGTCGTGTTCTGGTTCTGGCGCACACCGGTCGTCAGGACGCTATTGATGCGGCGCTGCAGGCGATCCGTATTCTGGATGAAGAAGGCCTGGACAGCGTTATGCCGGCGGCGGACGTTGCTGCGGTTCGTGCTGCGGTTGGTGAAGATCCGGGCTTCCGTCCGCTGAGCCTGGGCGAAGATTGTGCTCTGTCTGATGTGTCCCTGGGTCTGGTGCTGGGCGGCGATGGCTCCGTGCTGCGTGCGGCGGATCTGGTTCGTGGCCACGGCATCCCGCTGCTGGCGGTTAACCTGGGCCACGTTGGCTTCCTGGCAGAATCTGAACGTACTGATCTGCATCGTACCGTTAAAGCGATTGCGGATGAAGCGTACGTTGTTATCGAACGTATGGCACTGGACGTTGTTGTGCGTGTTGATGGTCGTGAAGCGGCGCGCACCTGGGCGCTGAACGAAGCGTCCGTTGAAAAAAGCAACCGTGAACGCATGCTGGAAGTGGTTGTTAGCGTGGATGATTCTCCGCTGACTGCTTTCGGCTGCGATGGCGTTGTTCTGGGTACCCCGACCGGTTCCACCGCCTACGCATTCTCCGCGGGCGGCCCGGTTGTGTGGCCGGGCGTTGAAGCGCTGCTGTTTGTACCGAACTCTGCGCACGCGCTGTTCGCTCGCCCGCTGGTTGTTGGCCCGCACTCTACCATCGCGGTGGACATCATGACCCGTACCCGTGAAACCGGTGTTCTGTGGTGCGACGGCCGTCGCACCGTGGACCTGCCGCCGAACGCGCGTGTTGAAGTTACTCGCAGCACCGAACCGGTCCGTCTGGCGCGTCTGTCTCCGGTGCCGTTCGCGGATCGTCTGGTTCGTAAATTCCGCCTGCCGACCGAAGGCTGGCGCGGTCCGGTTACCGACGAAGATGTTCGTGCGCGCGAAGCGACCGCGGTGGCTGAAGTTGAAACCGTTGAACCGCGTCACGCGGGCCCGCGTCCGGATGTTGTTCCGCCGCCGACCAGCGCGCTGCCGGTTCTGACCCCGGAAGATCTGGAACGTTACCGTAGCCGTGATGGTCGTGGCGGTGATCGTACCTCT
SEQ ID NO:10(Mu04-D288E氨基酸序列，下划线处为突变位点)：
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SEQ ID NO:11(Mu04-D288E核酸序列，下划线处为突变位点)：
ATGAGCGAAACCCCGGCGCGTCGTGTTCTGGTTCTGGCGCACACCGGTCGTCAGGACGCTATTGATGCGGCGCTGCAGGCGATCCGTATTCTGGATGAAGAAGGCCTGGACAGCGTTATGCCGGCGGCGGACGTTGCTGCGGTTCGTGCTGCGGTTGGTGAAGATCCGGGCTTCCGTCCGCTGAGCCTGGGCGAAGATTGTGCTCTGTCTGATGTGTCCCTGGGTCTGGTGCTGGGCGGCGATGGCTCCGTGCTGCGTGCGGCGGATCTGGTTCGTGGCCACGGCATCCCGCTGCTGGCGGTTAACCTGGGCCACGTTGGCTTCCTGGCAGAATCTGAACGTACTGATCTGCATCGTACCGTTAAAGCGATTGCGGATGAAGCGTACGTTGTTATCGAACGTATGGCACTGGACGTTGTTGTGCGTGTTGATGGTCGTGAAGCGGCGCGCACCTGGGCGCTGAACGAAGCGTCCGTTGAAAAAAGCAACCGTGAACGCATGCTGGAAGTGGTTGTTAGCGTGGATGATTCTCCGCTGACTGCTTTCGGCTGCGATGGCGTTGTTCTGGGTACCCCGACCGGTTCCACCGCCTACGCATTCTCCGCGGGCGGCCCGGTTGTGTGGCCGGGCGTTGAAGCGCTGCTGTTTGTACCGATCTCTGCGCACGCGCTGTTCGCTCGCCCGCTGGTTGTTGGCCCGCACTCTACCATCGCGGTGGACATCATGACCCGTACCCGTGAAACCGGTGTTCTGTGGTGCGACGGCCGTCGCACCGTGGACCTGCCGCCGAACGCGCGTGTTGAAGTTACTCGCAGCACCGAACCGGTCCGTCTGGCGCGTCTGTCTCCGGTGCCGTTCGCGGAACGTCTGGTTCGTAAATTCCGCCTGCCGACCGAAGGCTGGCGCGGTCCGGTTACCGACGAAGATGTTCGTGCGCGCGAAGCGACCGCGGTGGCTGAAGTTGAAACCGTTGAACCGCGTCACGCGGGCCCGCGTCCGGATGTTGTTCCGCCGCCGACCAGCGCGCTGCCGGTTCTGACCCCGGAAGATCTGGAACGTTACCGTAGCCGTGATGGTCGTGGCGGTGATCGTACCTCT
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

Claims (13)

1.NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体包含如下(i)～(iv)组成的组中的任一项：
(i)所述NAD激酶突变体与SEQ ID NO:1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO:1所示所示序列的至少第18、210、219或288位中的一个或多个位置处包含突变；
(ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO:1所示序列的突变体；
(iii)由多核苷酸编码的突变体，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
(a)编码如(i)所示氨基酸序列的突变体的多核苷酸；
(b)与(a)的全长互补的多核苷酸；
(iv)由(i)、(ii)或(iii)任一项所示的突变体的片段，并且所述片段仍然具有NAD激酶活性。
2.根据权利要求1所述的NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体为包含如下(c)～(f)中至少一项所示的突变的突变体：
(c)对应SEQ ID NO:1所示序列的第18位的氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)；
(d)对应SEQ ID NO:1所示序列的第210位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)；
(e)对应SEQ ID NO:1所示序列的第219位的氨基酸由异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)；
(f)对应SEQ ID NO:1所示序列的第288位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)。
3.根据权利要求1或2所述的NAD激酶突变体，其中，所述NAD激酶突变体包括在(i)所示序列的突变体的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。
4.一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括权利要求1～3任一项所述的NAD激酶突变体，以及与所述NAD激酶突变体融合的外源多肽。
5.一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码权利要求1～4任一项所述的NAD激酶突变体的核苷酸序列，或包含编码权利要求4所述重组多肽的核苷酸序列。
6.一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含权利要求5所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列为包含启动子和/或核糖体结合位点的核苷酸序列，并且所述调控序列指导所述NAD激酶突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。
7.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含权利要求5所述的分离的多核苷酸，或权利要求6所述的核酸构建体。
8.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含权利要求1～3任一项所述的NAD激酶突变体、根据权利要求4所述的重组多肽、根据权利要求5所述的分离的多核苷酸、根据权利要求6所述的核酸构建体，或者根据权利要求7所述的重组表达载体。
9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其中，宿主细胞来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；优选地，所述宿主细胞来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。
10.一种包含根据权利要求8或9所述的重组宿主细胞的细胞培养物。
11.根据权利要求1～3任一项所述的NAD激酶突变体，根据权利要求4所述的重组多肽、根据权利要求5所述的分离的多核苷酸、根据权利要求6所述的核酸构建体，根据权利要求7所述的重组表达载体，根据权利要求8或9所述的重组宿主细胞，或者根据权利要求10所述的细胞培养物在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的应用。
12.一种生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括培养根据权利要求1～3任一项所述的NAD激酶突变体，根据权利要求4所述的重组多肽、根据权利要求5所述分离的多核苷酸、根据权利要求6所述的核酸构建体，根据权利要求7所述的重组表达载体，根据权利要求8或9所述的重组宿主细胞，或者根据权利要求10所述的细胞培养物的步骤；
可选地，所述方法以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物；
可选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，还包括磷酰基供体，优选地，以三偏磷酸盐、六偏磷酸盐、多聚磷酸盐或四聚磷酸盐中的一种或多种为磷酰基供体，更优选地，以四聚磷酸盐为磷酰基供体；
可选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，还包括锰离子；
优选地，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为20～200g/L，进一步优选为50～200g/L，更优选为100～200g/L；
优选地，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与膦酰基供体的质量比为1:0.42～1.06，更优选为1:0.57～0.78；
优选地，所述锰离子浓度为0.4mM～40mM，优选为2.5mM～20mM；
优选地，在生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的步骤中，pH值为5.0～8.0，反应温度为30～60℃。
13.一种制备权利要求1～3中任一项所述的NAD激酶突变体的方法，所述方法包括培养含有权利要求8或9所述重组宿主细胞，然后从重组宿主细胞或其培养物中回收所述NAD激酶突变体的步骤。
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