CN110804596B

CN110804596B - 一种新型的脯氨酸3-羟化酶及其应用

Info

Publication number: CN110804596B
Application number: CN201910718473.8A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 赵晶; 刘超; 周文娟; 郑平; 郭轩; 刘娇; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2039-08-05
Also published as: CN110804596A

Abstract

本发明公开了一种新型的脯氨酸3‑羟化酶，所述脯氨酸3‑羟化酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。本发明还公开了包含该酶或其编码基因的表达载体、宿主细胞以及它们在生产反式‑3‑羟基‑L‑脯氨酸中的应用。本发明的脯氨酸3‑羟化酶具备高催化性能，从而能够以L‑脯氨酸或葡萄糖为底物生产反式‑3‑羟基‑L‑脯氨酸，大幅降低了生产成本，进而实现反式‑3‑羟基‑L‑脯氨酸的工业化生产。

Description

一种新型的脯氨酸3-羟化酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种新型的脯氨酸3-羟化酶，包含该酶或其编码基因的宿主细胞以及它们在生产反式-3-羟基-L-脯氨酸中的应用。

背景技术

反式-3-羟基-L-脯氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，也是一种重要的有机合成中间体。其结构如下：

反式-3-羟基-L-脯氨酸最早于1968年从Mediterranean Sponge的水解产物中被分离出来(Sheehan et al.1968)，其是一些生物活性化学物，如cyclothialidine、mucrorin-D、telomycin、polyhydroxylated alkaloids的重要成分和手性砌块(Sinha etal.2005)。Houwaart等人在抗真菌物质pneumocandins中也发现了反式-3-羟基-L-脯氨酸，pneumocandins已经用于临床上抗真菌感染的治疗中(L.Houwaart，2014)。Katsuyama等人于2017年报道了反式-3-羟基-L-脯氨酸可以用来合成一种具有抗菌活性的物质PlusbacinA(Katsuyama，2017)。此外，由于反式-3-羟基-L-脯氨酸是弹性蛋白的构成氨基酸，因此，也可在化妆品行业中应用(CN1328813A)。天然存在的反式-3-羟基-L-脯氨酸含量极低，其分离难度大。

目前主要通过化学法或者酶促反应进行反式-3-羟基-L-脯氨酸的生产。化学法涉及到不对称还原构建分子手性中心的选择问题，或剧毒物质(如氰化钾)的使用，且通常步骤繁琐(Huang，2004)。近来，周叶兵等人提出了一种采用工业级维生素C为原料经多步反应生产反式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，虽然其原料价格较低，但其总生产成本依然较高(CN106588739A，2017)。酶促法可以使用精氨酸羟化酶和鸟氨酸环化脱氨酶，以精氨酸为底物生产反式-3-羟基-L-脯氨酸，酶促法的原料通常价格昂贵(Hara，2015)。Houwaart等人在研究Echinocandin B(棘白菌素的一种)的生物合成过程时发现，来自真菌G.lozoyensis的脯氨酸羟化酶GloF可以催化脯氨酸合成反式-4-羟基-L-脯氨酸以及少量反式-3-羟基-L-脯氨酸(Houwaart，2014)；2018年他们发现来自曲霉Aspergillus pachycristatus的脯氨酸羟化酶HtyE能够合成的反式-3-羟基-L-脯氨酸的比例有所增加，但是主要产物仍然是反式4-羟脯氨酸(Houwaart，2018)。由于GloF和HtyE的酶活和反式-3-羟基-L-脯氨酸的选择性都较低，目前该酶的研究仅局限在分析规模催化很低浓度的底物，而没有用于反式-3-羟基-L-脯氨酸的制备,因此利用该酶进行反式-3-羟基-L-脯氨酸的工业化生产的可能性很低。

因此，本领域急需高催化性能的脯氨酸3-羟化酶，实现以脯氨酸或更廉价的葡萄糖为原料生产反式-3-羟基脯氨酸，大幅降低生产成本，从而实现反式-3-羟基-L-脯氨酸的工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型脯氨酸3-羟化酶，该酶可以在大肠杆菌等宿主细胞中高效表达，进而以L-脯氨酸或葡萄糖为底物生产反式-3-羟基-L-脯氨酸。

在第一方面，本发明提供一种脯氨酸3-羟化酶，所述脯氨酸3-羟化酶为：

a)具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

b)由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，本发明的羟化酶的比酶活高于250U/mg；优选地，高于500U/mg；更优选，高于700U/mg；最优选高于750U/mg。

在优选的实施方式中，利用本发明的羟化酶能够以脯氨酸，优选以葡萄糖为原料生产反式-3-羟基脯氨酸。

在第二方面，本发明提供一种制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法包括利用第一方面所述的脯氨酸3-羟化酶制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的步骤。

在第三方面，本发明提供一种用于制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的组合物，所述组合物包括第一方面所述的脯氨酸3-羟化酶和L-脯氨酸。

在第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码第一方面所述的脯氨酸3-羟化酶。

在第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第四方面所述的表达载体或其基因组上整合有编码第一方面所述的脯氨酸3-羟化酶的核苷酸序列。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是细菌；包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选大肠杆菌(E.coli)。

在优选的实施方式中，所述的宿主细胞中的谷氨酸激酶不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱。

在优选的实施方式中，所述特征在于，所述宿主细胞中谷氨酸激酶和/或谷氨酸半醛脱氢酶的活性增强。

在第六方面，本发明提供第一方面所述的羟化酶、第四方面所述的表达载体、或第五方面所述的宿主细胞在生产反式-3-羟基-L-脯氨酸中的用途。

在第七方面，本发明提供一种制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a.培养第五方面所述的宿主细胞，使之产生反式-3-羟基-L-脯氨酸；或

b.利用权利要求1-4所述的脯氨酸3-羟化酶，催化从脯氨酸合成反式-3-羟基-L-脯氨酸；和

c.任选从培养液中分离步骤a产生的反式-3-羟基-L-脯氨酸。

在优选的实施方式中，所述方法能够以脯氨酸或以葡萄糖为原料生产反式-3-羟基脯氨酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现新型的脯氨酸3-羟化酶，该酶具备高催化性能，从而能够以L-脯氨酸或葡萄糖为底物生产反式-3-羟基-L-脯氨酸，大幅降低了生产成本，进而实现反式-3-羟基-L-脯氨酸的工业化生产。在此基础上完成了本发明。

本发明的脯氨酸3-羟化酶

本文所用的“脯氨酸3-羟化酶”或“本发明的脯氨酸3-羟化酶”具备相同的含义，均是指能够用于生产反式-3-羟基-L-脯氨酸的羟化酶。具体地说，本发明的脯氨酸3-羟化酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有脯氨酸3-羟化酶的功能的衍生蛋白。

本发明的脯氨酸3-羟化酶具备高催化性能，从而能够以L-脯氨酸或葡萄糖为底物生产反式-3-羟基-L-脯氨酸，为反式-3-羟基-L-脯氨酸的工业化生产开辟了新的工艺路线。

本文所用的术语“比酶活”具有本领域技术人员通常理解的含义，是指在特定条件下，单位重量(mg)的蛋白所具有的酶活力单位数。一般来说，对同一种酶而言，比活力越高，表示酶的催化性能越好。如上所述，本发明的脯氨酸3-羟化酶具备高催化性能。在具体的实施方式中，本发明的脯氨酸3-羟化酶的比酶活高于700U/mg。

鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白，本发明的“脯氨酸3-羟化酶”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“本发明的脯氨酸3-羟化酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个或3个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签，例如，6his标签通常不会改变所得蛋白质的功能。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“脯氨酸3-羟化酶”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的脯氨酸3-羟化酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的脯氨酸3-羟化酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的脯氨酸3-羟化酶”的氨基酸序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供“脯氨酸3-羟化酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的脯氨酸3-羟化酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“脯氨酸3-羟化酶”的保守性变异多肽指与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示蛋白相同或相似的活性，即催化产生反式-3-羟基-L-脯氨酸的活性。

同时，本领域的技术人员都知道在上述取代、缺失、插入和添加一个或几个氨基酸残基并保持多肽初始功能的突变称为保守突变，而保守突变中的典型代表是保守取代，保守取代是下述突变，其中，如果取代位点是芳香族氨基酸，则在Phe、Trp和Tyr之间相互取代；如果是疏水性氨基酸，则在Leu、Ile和Val中相互取代；若果它是极性氨基酸，则在Gln和Asn之间相互取代；如果它是碱性氨基酸，则在Lys、Arg和His中相互取代；如果它是酸性氨基酸，则在Asp和Glu之间相互取代；如果它是具有羟基的氨基酸，则在Ser和Thr之间相互取代。具体而言，被视为保守取代的氨基酸残基之间的取代如下表所示。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的脯氨酸3-羟化酶可以高效、低成本地制备反式-3-羟基-L-脯氨酸。在具体的实施方式中，本发明的脯氨酸3-羟化酶的比酶活高于250U/mg；优选地，高于500U/mg；更优选，高于700U/mg；最优选高于750U/mg。因此，本发明提供了一种制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法包括直接或间接利用本发明的脯氨酸3-羟化酶(例如利用能够表达本发明的脯氨酸3-羟化酶的宿主细胞)，以L-脯氨酸，甚至以葡萄糖为原料制备反式-3-羟基-L-脯氨酸。

由于本发明的脯氨酸3-羟化酶能够以L-脯氨酸为底物催化产生反式-3-羟基-L-脯氨酸，在本发明的脯氨酸3-羟化酶的基础上，本发明还提供一种用于制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的组合物，所述组合物包括本发明的脯氨酸3-羟化酶和L-脯氨酸。

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸，即脯氨酸3-羟化酶基因。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

脯氨酸3-羟化酶基因可以是在严格的条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示序列制备的探针，例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示序列的部分或者整个序列互补的序列杂交的DNA，只要保持其初始功能即可。所述“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成非特异性杂交的条件。例如，同源性较高的DNA，例如具有80％以上同源性的DNA彼此杂交，同源性低于80％的DNA彼此不杂交的条件，或者通常的Southern杂交的清洗条件，即在相当于60℃、1*SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1*SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1*SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2-3次的条件。

此外，由于密码子的简并性因宿主而异，脯氨酸3-羟化酶基因中的任意密码子可以用相应的等价密码子替换，也就是说，脯氨酸3-羟化酶基因可以是由于遗传密码的简并性而在上面例如的任何脯氨酸3-羟化酶基因的突变。例如，脯氨酸3-羟化酶基因可以是经修饰的基因，使得其具有根据要使用的宿主中密码子频率的最佳密码子。

因此，在具体的实施方式中，所述脯氨酸3-羟化酶基因可以是与编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的DNA同源性或序列相同性在90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的DNA。

本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

“对应于”

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位就可能是第46位。再如，如果在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的N末端位置处缺失一个残基时，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位就可能是第39位。此外，若在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的任意位置插入一个氨基酸残基而其功能未改变的情况下，所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位就可能是39位或者41位。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，如本发明的SEQID NO:2所示氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列同源性为82％。因此，与本发明的具体脯氨酸3-羟化酶具有80％以上，优选90％以上，更优选95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性或同源性，并且具有脯氨酸3-羟化酶功能的序列也包括在本发明的保护范围内。

任意氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的对应于位置可以通过氨基酸序列之间的比对确定。本领域普通技术人员公知的测定比对方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis ofSequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAMJ.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

宿主细胞

本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明脯氨酸3-羟化酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的脯氨酸3-羟化酶能在该宿主细胞中表达。所述宿主细胞可以是细菌；包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明的优点：

1.本发明提供了一种新型的脯氨酸3-羟化酶；

2.本发明的新型脯氨酸3-羟化酶的催化活性高；

3.本发明的新型脯氨酸3-羟化酶能够以L-脯氨酸或葡萄糖为底物生产反式-3-羟基-L-脯氨酸；和

4.利用本发明的新型脯氨酸3-羟化酶，能够实现反式-3-羟基-L-脯氨酸的工业化生产。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例.

实施例1.脯氨酸3-羟化酶的合成及克隆表达

首先，发明人通过全基因合成了序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的基因(编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2和4)，分别通过5’端采用Nde I内切酶位点，3’端采用Hind III内切酶位点连接到高考贝质粒pET21a，获得的重组质粒命名为pET21a-Ubp4h和pET21a-Amp3h，然后采用化学转化的方法将重组质粒pET21a-Ubp4h、pET21a-Amp3h导入大肠杆菌BL21a(DE3)感受态细胞内，获得重组大肠杆菌BL21a(DE3)(pET21a-Ubp4h)、BL21a(DE3)(pET21a-Amp3h)。按照下述操作，对脯氨酸3-羟化酶进行诱导表达。

取5μl甘油菌液接种至5ml含有抗生素(100μg/ml氨苄青霉素)的LB培养基(10g/l蛋白胨，10g/l NaCl，5g/l酵母膏)，37℃、220rpm过夜培养；然后以1％的接种量，接种至装有100ml LB培养的500ml摇瓶中(含有抗生素100μg/ml氨苄青霉素)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8之间(2h左右)，加入0.1mM终浓度的IPTG，18℃、220rpm培养20h左右。

实施例2.脯氨酸3-羟化酶的酶活测定

将上述培养好的BL21a(DE3)(pET21a-Ubp4h)、BL21a(DE3)(pET21a-Amp3h)细胞在4℃、7000rpm条件下离心6min收集细胞，然后用100mM Tris-HCl、100mM NaCl、10％甘油、pH7.4的缓冲液洗涤细胞三次，立即破碎或者-80℃冰箱内保存备用。将收集好的细胞用适量的50mM MES、100mM NaCl、10％甘油、pH 6.5的缓冲液重悬后超声破碎。细胞破碎液在4℃、8000rpm条件下离心35min后将上清液转移至预冷的离心管内，然后用His SpinTrap^TMcolumns(GE Healthcare生产)镍柱纯化蛋白并用浓度梯度咪唑洗脱杂蛋白，去除咪唑后获得脯氨酸-3-羟化酶的纯酶，分装至预冷的小离心管内，-80℃保藏备用。

将上述保藏的纯酶冰上融化后，稀释至0.4g/l蛋白浓度，然后按照250μl的体系进行酶活检测反应，250μl酶活反应体系含有50mM MES(pH 6.5)、0.5mM FeSO₄、1.5mM抗坏血酸、5mM L-Pro、14mMα-酮戊二酸、8μg纯酶，30℃反应20min后煮沸6min停止反应。然后按照下述的反式-3-羟基-L-脯氨酸的含量检测方法，检测反式-3-羟基-L-脯氨酸的含量。

反式-3-羟基-L-脯氨酸的含量检测方法如下：

样品处理：40μl待检测样品与40μl四硼酸钾缓冲液(0.5M，pH 7.7)混匀后加入80μl 9-芴基-甲氧基羰基氯溶液(FMOC-Cl，1.5mM溶于乙腈)，震荡混匀后加入100μl的1-金刚烷胺溶液(ADAM，40mM溶解于乙腈与四硼酸钾(pH 7.7)缓冲液，1:1)，震荡混匀。检测前用140μl的HPLC用缓冲液A溶液(10％乙腈/90％50mM乙酸钠，pH5)稀释。

HPLC检测：所用的柱子为Agilent Edipse Plus C18(35μm,21×150mm)。HPLC运行过程中缓冲液A/缓冲液B(80％乙腈/20％50mM乙酸钠，pH 5)的浓度比例变化为：缓冲液B：0-3min，0％→15％；3-15min，15％→20％；15-18min，20％→30％；18-20min，30％→100％；20-26min，100％；26-30min，100％→0％；30-33min，0％。工作温度为45℃，进样量为5μl，流速为0.3ml/min。

本实施例的酶活1U定义为1min内生成1nmol反式-3-羟脯氨酸。

按照上述操作测得BL21a(DE3)(pET21a-Ubp4h)的比酶活为772.4U/mg，BL21a(DE3)(pET21a-Amp3h)的比酶活为270U/mg。

实施例3.以L-脯氨酸为底物催化生产反式-3-羟基-L-脯氨酸

首先按照实施例1中所述，对菌株BL21a(DE3)(pET21a-Ubp4h)进行摇瓶培养与诱导表达，将上述培养好的细胞在4℃、7000rpm条件下离心6min收集细胞，然后用100mMTris-HCl、100mM NaCl、10％甘油、pH 7.4的缓冲液洗涤细胞三次并收集细胞，将收集后的细胞以10ml反应缓冲液/100ml摇瓶悬浮后在30℃摇床内培养24h，反应缓冲液含有50mMMES(pH 6.5)、0.5mM FeSO₄、1.5mM抗环血酸、20mM L-Pro、14mMα-酮戊二酸。反应结束后，4℃、7000rpm离心7min分离上清，将上清液转移至干净的离心管内用于检测其中的反式-3-羟基-L-脯氨酸的产量，该实施例所用的空白对照菌株为BL21a(DE3)(pET21a)。按照实施例2所述的HPLC方法检测反式-3-羟基-L-脯氨酸的量，结果如下：

表1.催化生产反式3-羟基-L-脯氨酸

实施例4.以葡萄糖为底物发酵法生产反式-3-羟基-L-脯氨酸

根据文献(Gene.1988Apr 29；64(2):199-205.Nucleotide sequence of amutation in the proB gene of Escherichia coli that confers prolineoverproduction and enhanced tolerance to osmotic stress)报道，大肠杆菌的proB(NCBI-GI:16128228)基因107位Asp突变为Asn，即ProB74突变体可以解除L-脯氨酸对ProB的反馈抑制。根据文献(Shibasaki T,Hashimoto S,Mori H等,Construction of a novelhydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline4-hydroxylase gene.[J].J Biosci Bioeng.2000,90 5:522-525)报道，在大肠杆菌中过表达ProB74谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)、ProA谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)(NCBI-GI:16128229)和来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟基化酶基因可以生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

因此发明人按照上述文献的类似策略，构建本发明酶的生产性能评价菌株。在一个P15A复制原点并具有四环素抗性的质粒上基础上,构建了proB74(谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase))和proA(谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehydedehydrogenase))基因的过表达质粒pSW1,以及在质粒pSW2基础上进一步构建增加序列如SEQ ID NO:1所示基因的过表达质粒pSW2，pSW1和pSW2质粒上的所有基因所表达的蛋白都不带有任何标签。将pSW1和pSW2质粒分别导入E.coli MG1655ΔputA菌株，获得E.coliMG1655ΔputA(pSW1)和E.coli MG1655ΔputA(pSW2)菌株。

将上述菌株进行发酵测试生产性能。种子培养基为LB培养基(g/l)：酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10，100ml摇瓶20ml装液量；发酵罐培养基(g/l)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，磷酸氢二钾10，氯化钠5，柠檬酸3，氯化铵8，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.2，氯化钙0.05，VB10.00002。100ml的LB过夜培养的种子液，接入2L的发酵培养基，控制温度37℃，pH6.5，溶氧30％，添加葡萄糖控制葡萄糖浓度10g/L左右。参照实施例2的检测方法检测反式-3-羟基-L-脯氨酸的产量。发酵结果如表2所示，E.coli MG1655ΔputA(pSW2)菌株发酵40h反式-3-羟基-L-脯氨酸的产量达29.6g/L，而对照菌株不能产生反式-3-羟基-L-脯氨酸。

表2.菌株5L罐发酵的产量

本发明涉及的序列总结如下：

SEQ ID NO 1:

ATGGAACCCCACGACACACTCTCGCCCGCACAGGTCGACGAGTACCGAAAGAACGGATTCCTCGTCCAGGAGCACGTCTTCGATGAGGAGGAGATCGAACTGTTGCGGGCCGAGGCCGCGCAGGAGTTCGCCTCGGGAGGCGAGCGCGTCACGGTCGAGCAGAACACCGGCATCGTCCGCGGCGTGCACGGCTGTCACCTGTACTCCGAGGTGTTCGGCAGACTCGTTCGCTCGCCCCGGCTGCTCCCGATCGCCAGGCAACTGCTGCGGGACGACGTGTACGTCCACCAGTTCAAGATCAACGCGAAGCGCGCGTTCAAGGGTGAGGTCTGGGAGTGGCACCAGGACTACACGTTCTGGCACCACGAGGACGGGATGCCCGCGCCTCGCGCGTTGTCCGCGGCGATTTTCCTCGACGAGGTGACCGAGTTCAACGGCCCGCTGACCTTCGTGCCAGGCGGACACGGCAGCGGCATGATCGACGCCGACGTCAAGGGCGAGGGCTGGGCCAACACACTGACCGCGAGCCTCAAGTACTCGCTCGACGTCGAGACGATGCGCGGGCTGATCGAACGCAACGGCATGGTCGCGCCGAAGGGCCCGCGCGGCTCTGTGCTCTGGTTCGACGCCAACATCCCGCACAGCTCCGTTCCGAACATCTCCCCGTTCGACCGCGGCTTGGTGCTGATCACCTACAACAGCGTGGAGAACAAGACCGACGTCACACGCGGCACGCGCCCCGAATGGCTCGCGGCCCGCGACTTCACGCCGTTGACGGCCCTGCAGGCCACGTCCTTC

SEQ ID NO 2:

MEPHDTLSPAQVDEYRKNGFLVQEHVFDEEEIELLRAEAAQEFASGGERVTVEQNTGIVRGVHGCHLYSEVFGRLVRSPRLLPIARQLLRDDVYVHQFKINAKRAFKGEVWEWHQDYTFWHHEDGMPAPRALSAAIFLDEVTEFNGPLTFVPGGHGSGMIDADVKGEGWANTLTASLKYSLDVETMRGLIERNGMVAPKGPRGSVLWFDANIPHSSVPNISPFDRGLVLITYNSVENKTDVTRGTRPEWLAARDFTPLTALQATSF

SEQ ID NO 3:

ATGCTTTCTCCGAACCAGATCGACGAATACCGACGGAAGGGCTTTCTCGTCCAGGAACGGGTTTTCGACGAAGAAGAGATCCGGCTGATCAAGGCCGGCGCGGAACAGGAGTTCGCCGAAGGCGGCGAACGCGTCACGGTCGAGGCGGACACCGACGTGCCGCGCGGCGTGCACGGGTGCCACCTGCACGCCGAGGCGTTCGGCCGGCTCGTCCGGTCACGCCGCCTGCTGCCGATCGCCGAACAACTGCTGCAGGACCAGGTGTACGTCCACCAGTTCAAGATCAACGCCAAGCGCGCCTTCAAGGGCGAGGTCTGGGAGTGGCACCAGGACTACACGTTCTGGCACCACGAGGACGGGATGCCCGAGCCGCGCGCGCTGACCGCCGCGATCTTCCTCGACGACGTGACCGAGTTCAACGGGCCGCTGACCTTCGTCCCCGGCGGGCACGGCGGTGGCGAGATCGACGCCGAGGTCGAAGGGGACGGCTGGGCCAACACCCTGACCGCGAGCCTGAAGTACTCGATCGACATCGACACGATGCGGCAGCTGATCGCGCGCAACGGCATGGCCGCCCCGAAGGGGCCGCGCGGATCCGTGCTCTGGTTCGACGCCAACATCCCGCACGCGTCGGTGCCGAACATCTCCCCCGTCGACCGCGGCCTGGTGCTGATCACCTACAACAGCGTCGAGAACCGGATCGACCTCAGCCGCGGCACCCGGCCCGAATGGCTGGCCGCCCGGGACTTCACGCCGCTGACGGCCATGCACGCCGCGTCCTTCTGA

SEQ ID NO 4:

MLSPNQIDEYRRKGFLVQERVFDEEEIRLIKAGAEQEFAEGGERVTVEADTDVPRGVHGCHLHAEAFGRLVRSRRLLPIAEQLLQDQVYVHQFKINAKRAFKGEVWEWHQDYTFWHHEDGMPEPRALTAAIFLDDVTEFNGPLTFVPGGHGGGEIDAEVEGDGWANTLTASLKYSIDIDTMRQLIARNGMAAPKGPRGSVLWFDANIPHASVPNISPVDRGLVLITYNSVENRIDLSRGTRPEWLAARDFTPLTAMHAASF

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种新型的脯氨酸3-羟化酶及其应用

<130> P2019-1256

<150> CN2018108868010

<151> 2018-08-06

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaacccc acgacacact ctcgcccgca caggtcgacg agtaccgaaa gaacggattc 60

ctcgtccagg agcacgtctt cgatgaggag gagatcgaac tgttgcgggc cgaggccgcg 120

caggagttcg cctcgggagg cgagcgcgtc acggtcgagc agaacaccgg catcgtccgc 180

ggcgtgcacg gctgtcacct gtactccgag gtgttcggca gactcgttcg ctcgccccgg 240

ctgctcccga tcgccaggca actgctgcgg gacgacgtgt acgtccacca gttcaagatc 300

aacgcgaagc gcgcgttcaa gggtgaggtc tgggagtggc accaggacta cacgttctgg 360

caccacgagg acgggatgcc cgcgcctcgc gcgttgtccg cggcgatttt cctcgacgag 420

gtgaccgagt tcaacggccc gctgaccttc gtgccaggcg gacacggcag cggcatgatc 480

gacgccgacg tcaagggcga gggctgggcc aacacactga ccgcgagcct caagtactcg 540

ctcgacgtcg agacgatgcg cgggctgatc gaacgcaacg gcatggtcgc gccgaagggc 600

ccgcgcggct ctgtgctctg gttcgacgcc aacatcccgc acagctccgt tccgaacatc 660

tccccgttcg accgcggctt ggtgctgatc acctacaaca gcgtggagaa caagaccgac 720

gtcacacgcg gcacgcgccc cgaatggctc gcggcccgcg acttcacgcc gttgacggcc 780

ctgcaggcca cgtccttc 798

<210> 2

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Pro His Asp Thr Leu Ser Pro Ala Gln Val Asp Glu Tyr Arg

1 5 10 15

Lys Asn Gly Phe Leu Val Gln Glu His Val Phe Asp Glu Glu Glu Ile

20 25 30

Glu Leu Leu Arg Ala Glu Ala Ala Gln Glu Phe Ala Ser Gly Gly Glu

35 40 45

Arg Val Thr Val Glu Gln Asn Thr Gly Ile Val Arg Gly Val His Gly

50 55 60

Cys His Leu Tyr Ser Glu Val Phe Gly Arg Leu Val Arg Ser Pro Arg

65 70 75 80

Leu Leu Pro Ile Ala Arg Gln Leu Leu Arg Asp Asp Val Tyr Val His

85 90 95

Gln Phe Lys Ile Asn Ala Lys Arg Ala Phe Lys Gly Glu Val Trp Glu

100 105 110

Trp His Gln Asp Tyr Thr Phe Trp His His Glu Asp Gly Met Pro Ala

115 120 125

Pro Arg Ala Leu Ser Ala Ala Ile Phe Leu Asp Glu Val Thr Glu Phe

130 135 140

Asn Gly Pro Leu Thr Phe Val Pro Gly Gly His Gly Ser Gly Met Ile

145 150 155 160

Asp Ala Asp Val Lys Gly Glu Gly Trp Ala Asn Thr Leu Thr Ala Ser

165 170 175

Leu Lys Tyr Ser Leu Asp Val Glu Thr Met Arg Gly Leu Ile Glu Arg

180 185 190

Asn Gly Met Val Ala Pro Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Leu Trp Phe

195 200 205

Asp Ala Asn Ile Pro His Ser Ser Val Pro Asn Ile Ser Pro Phe Asp

210 215 220

Arg Gly Leu Val Leu Ile Thr Tyr Asn Ser Val Glu Asn Lys Thr Asp

225 230 235 240

Val Thr Arg Gly Thr Arg Pro Glu Trp Leu Ala Ala Arg Asp Phe Thr

245 250 255

Pro Leu Thr Ala Leu Gln Ala Thr Ser Phe

260 265

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctttctc cgaaccagat cgacgaatac cgacggaagg gctttctcgt ccaggaacgg 60

gttttcgacg aagaagagat ccggctgatc aaggccggcg cggaacagga gttcgccgaa 120

ggcggcgaac gcgtcacggt cgaggcggac accgacgtgc cgcgcggcgt gcacgggtgc 180

cacctgcacg ccgaggcgtt cggccggctc gtccggtcac gccgcctgct gccgatcgcc 240

gaacaactgc tgcaggacca ggtgtacgtc caccagttca agatcaacgc caagcgcgcc 300

ttcaagggcg aggtctggga gtggcaccag gactacacgt tctggcacca cgaggacggg 360

atgcccgagc cgcgcgcgct gaccgccgcg atcttcctcg acgacgtgac cgagttcaac 420

gggccgctga ccttcgtccc cggcgggcac ggcggtggcg agatcgacgc cgaggtcgaa 480

ggggacggct gggccaacac cctgaccgcg agcctgaagt actcgatcga catcgacacg 540

atgcggcagc tgatcgcgcg caacggcatg gccgccccga aggggccgcg cggatccgtg 600

ctctggttcg acgccaacat cccgcacgcg tcggtgccga acatctcccc cgtcgaccgc 660

ggcctggtgc tgatcaccta caacagcgtc gagaaccgga tcgacctcag ccgcggcacc 720

cggcccgaat ggctggccgc ccgggacttc acgccgctga cggccatgca cgccgcgtcc 780

ttctga 786

<210> 4

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Leu Ser Pro Asn Gln Ile Asp Glu Tyr Arg Arg Lys Gly Phe Leu

1 5 10 15

Val Gln Glu Arg Val Phe Asp Glu Glu Glu Ile Arg Leu Ile Lys Ala

20 25 30

Gly Ala Glu Gln Glu Phe Ala Glu Gly Gly Glu Arg Val Thr Val Glu

35 40 45

Ala Asp Thr Asp Val Pro Arg Gly Val His Gly Cys His Leu His Ala

50 55 60

Glu Ala Phe Gly Arg Leu Val Arg Ser Arg Arg Leu Leu Pro Ile Ala

65 70 75 80

Glu Gln Leu Leu Gln Asp Gln Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn

85 90 95

Ala Lys Arg Ala Phe Lys Gly Glu Val Trp Glu Trp His Gln Asp Tyr

100 105 110

Thr Phe Trp His His Glu Asp Gly Met Pro Glu Pro Arg Ala Leu Thr

115 120 125

Ala Ala Ile Phe Leu Asp Asp Val Thr Glu Phe Asn Gly Pro Leu Thr

130 135 140

Phe Val Pro Gly Gly His Gly Gly Gly Glu Ile Asp Ala Glu Val Glu

145 150 155 160

Gly Asp Gly Trp Ala Asn Thr Leu Thr Ala Ser Leu Lys Tyr Ser Ile

165 170 175

Asp Ile Asp Thr Met Arg Gln Leu Ile Ala Arg Asn Gly Met Ala Ala

180 185 190

Pro Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Leu Trp Phe Asp Ala Asn Ile Pro

195 200 205

His Ala Ser Val Pro Asn Ile Ser Pro Val Asp Arg Gly Leu Val Leu

210 215 220

Ile Thr Tyr Asn Ser Val Glu Asn Arg Ile Asp Leu Ser Arg Gly Thr

225 230 235 240

Arg Pro Glu Trp Leu Ala Ala Arg Asp Phe Thr Pro Leu Thr Ala Met

245 250 255

His Ala Ala Ser Phe

260

Claims

1.一种脯氨酸3-羟化酶、包含编码所述脯氨酸3-羟化酶的核苷酸序列的表达载体或包含所述表达载体或其基因组上整合有所述核苷酸序列的宿主细胞在生产反式-3-羟基-L-脯氨酸中的用途，所述脯氨酸3-羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示，所述宿主细胞是细菌。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述宿主细胞选自：大肠杆菌(E. coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。

4.一种制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法包括利用氨基酸序列如SEQ IDNO: 2或SEQ ID NO: 4所示的脯氨酸3-羟化酶制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的步骤。

5.一种用于制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的组合物，所述组合物包括氨基酸序列如SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的脯氨酸3-羟化酶和L-脯氨酸。

6.一种制备反式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 培养宿主细胞，使之产生反式-3-羟基-L-脯氨酸；或

b．利用氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的脯氨酸3-羟化酶，催化从脯氨酸合成反式-3-羟基-L-脯氨酸；和

c. 任选从培养液中分离步骤a产生的反式-3-羟基-L-脯氨酸；

所述宿主细胞包含表达载体或其基因组上整合有编码脯氨酸3-羟化酶的核苷酸序列；

所述表达载体包含所述编码脯氨酸3-羟化酶的核苷酸序列；

所述脯氨酸3-羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示；和

所述宿主细胞是细菌。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自：大肠杆菌(E. coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。