CN112725296B

CN112725296B - 一种黄体酮-17α-羟化酶及其应用

Info

Publication number: CN112725296B
Application number: CN202110122382.5A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 刘超; 陈可心; 王烨彤; 邵明龙; 杨套伟; 徐美娟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN112725296A

Abstract

本发明公开了一种黄体酮‑17α‑羟化酶及其应用，属于生物技术领域。本发明公开了一种新型的黄体酮‑17α‑羟化酶(MA_CYP450 17a2)，所述黄体酮‑17α‑羟化酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明还公开了包含该酶或其编码基因的表达载体、宿主细胞及其在合成17α‑羟基黄体酮中的应用。本发明首次在毕赤酵母细胞体系内异源表达了黄体酮‑17α‑羟化酶，且具有以黄体酮为底物生产17α‑羟基黄体酮的能力，在宿主细胞未经优化的条件下7d反应后生成16.5mg/L的17α‑羟基黄体酮，这为工业化生产17α‑羟基黄体酮奠定了坚实的基础。

Description

一种黄体酮-17α-羟化酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种黄体酮-17α-羟化酶及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

黄体酮(progesterone)及其衍生物是一类重要的甾体药物，17α-羟基黄体酮(17α-hydroxyprogesterone,17α-HP)是在黄体酮的C17位置发生羟基化修饰的衍生物，17α-羟基黄体酮可以预防婴儿早产，对月经不调、子宫内膜癌等疾病有很好的疗效；此外，17α-羟基黄体酮还是合成安宫黄体酮、羟化可的松、泼尼松等多种常见皮质激素类药物的中间体(Schindler et al.2005)。

目前，制备17α-羟基黄体酮的方法主要有两种：一是化学合成法，然而由于甾体化合物结构复杂，存在副产物多、回收率低、步骤繁琐、有毒物质使用等问题(参见公开号为CN104327146B的中国专利)；二是微生物转化法，以黄体酮为原料，利用特定的微生物通过羟基化反应生成目标产物17α-羟基黄体酮(Manosroi et al.2008)；与化学合成法相比，微生物转化法具有催化效率高、生产条件温和、环境友好和生物催化剂来源广泛等优势。在微生物转化法生产17α-羟基黄体酮的过程中，高选择特异性、高活性的黄体酮17α-羟化酶(progesterone 17-α-hydroxylase)是关键。

但是黄体酮17α-羟化酶又分为CYP450 17A1酶和CYP450 17A2酶，采用不同的黄体酮17α-羟化酶反应时，产物是完全不同的。在人以及哺乳动物体内，仅含有细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase，CYP450)17A1酶(Devore et al.2008；Voss etal.1993)，并且经研究表明，采用CYP450 17A1酶催化黄体酮发生两步氧化：第一步氧化，在C17进行羟基化反应，生成17α-羟基黄体酮；第二步氧化，在第一步氧化的基础上发挥C17α，20裂解酶功能，进一步生产雄甾烯酮(Devore et al.2008；Akhtar et al.2011)，可见CYP450 17A1酶反应制备目标产物17α-羟基黄体酮时，会有雄甾烯酮副产物的产生；而采用CYP450 17A2酶却可以仅实现上述第一步的氧化反应，即催化黄体酮的C17α羟基化反应，生成17α-羟基黄体酮(如图1所示)；可见采用CYP450 17A2酶生产17α-羟基黄体酮可实现专一制备17α-羟基黄体酮。

但是，目前研究表明，仅在罗非鱼(tilapia)、斑马鱼(zebrafish)等硬骨鱼类体内同时存在两种CYP450 17A酶，即CYP450 17A1和CYP450 17A2(Zhou et al.2007；Pallan etal.2015)，因此，CYP450 17A2存在酶来源少、难以获得的问题。

因此，目前急需寻找一种高催化活性、高产物特异性的黄体酮-17α-羟化酶CYP45017A2新酶源，实现以黄体酮或更廉价的植物甾醇为原料生产17α-羟基黄体酮，大幅降低生产成本，从而实现17α-羟基黄体酮的工业化生产。

发明内容

技术问题

本发明的技术问题是提供一种高产物特异性的黄体酮-17α-羟化酶CYP450 17A2新酶源，实现以黄体酮或更廉价的植物甾醇为原料生产17α-羟基黄体酮，大幅降低生产成本，从而实现17α-羟基黄体酮的工业化生产。

技术方案

本发明提供一种新型黄体酮-17α-羟化酶CYP450 17A2，所述新型黄体酮-17α-羟化酶为：

a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

b)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在本发明的一种实施方式中，b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在本发明的一种实施方式中，b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在本发明的一种实施方式中，b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成的且具有a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述黄体酮17α-羟化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一种实施方式中，利用本发明的羟化酶能够以黄体酮为原料合成17α-羟基黄体酮。

本发明还提供了携带上述黄体酮17α-羟化酶的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pPIC3.5K、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC或pAO815为表达载体。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞包含上述重组载体，或上述黄体酮17α-羟化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的宿主细胞包括但谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marecescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，以毕赤酵母为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为Pichia pastoris GS115、KM71、X33或SMD1168。

本发明还提供了一种制备17α-羟基黄体酮的方法，所述方法包括采用上述黄体酮-17α-羟化酶制备17α-羟基黄体酮的步骤。

本发明还提供了一种用于制备17α-羟基黄体酮的组合物，所属组合物包含上述黄体酮-17α-羟化酶和黄体酮。

本发明还提供了上述黄体酮17α-羟化酶，或上述重组载体，或上述重组细胞在制备含有17α-羟基黄体酮的产品中的应用。

本发明还提供了一种制备17α-羟基黄体酮的方法，所述方法为，将上述黄体酮17α-羟化酶，或上述重组细胞添加至含有黄体酮的反应体系中进行反应，制备得到17α-羟基黄体酮。

在本发明的一种实施方式中，所述黄体酮17α-羟化酶在反应体系中的添加量至少为0.5μM。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞在反应体系中的添加量至少为4.9g_CDW/L。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

有益效果

(1)本发明提供了一种新型的黄体酮-17α-羟化酶，该黄体酮-17α-羟化酶可实现高选择特异性的催化黄体酮的C17位羟基化生成17α-羟基黄体酮，而没有后续的C17,21位裂解反应；因此，本发明提供的黄体酮-17α-羟化酶对产物的选择性高。

(2)本发明提供的黄体酮-17α-羟化酶为CYP450 17A2，同时，本发明首次实现了黄体酮-17α-羟化酶在毕赤酵母中得到成功表达；此外，采用本发明提供的新型黄体酮-17α-羟化酶，能够以黄体酮为底物专一的合成17α-羟基黄体酮，可得到16.5mg/L的产物；产物纯度高，没有雄甾烯酮副产物的产生；因此，本发明提供了一种可实现工业化生产17α-羟基黄体酮的新途径。

附图说明

图1：细胞色素CYP450 17A酶催化过程。

图2：HPLC检测图；其中，a为整合有MA_CYP450 17a2以及Kozak序列的重组菌株全细胞催化液；b为整合有空质粒(仅含有Kozak序列)的重组菌株全细胞催化液；c为不含菌株的空白对照；d为标品。

图3：重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC3.5K-K-MA_CYP450 17a2粗酶液的SDS-PAGE图；其中，M为蛋白标样；1为含有MA_CYP450 17a2酶的粗酶液。

具体实施方式

本发明所涉及的术语解释如下：

1、黄体酮-17α-羟化酶

(1)本发明所采用的“黄体酮-17α-羟化酶”或“本发明的黄体酮-17α-羟化酶”具备相同的含义，均是指催化黄体酮合成17α-羟基黄体酮的羟化酶。具体地说，本发明的黄体酮-17α-羟化酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有黄体酮-17α-羟化酶的功能的衍生蛋白。

(2)本发明的黄体酮-17α-羟化酶具有高产物选择性和较高催化性能，能够在宿主细胞内催化黄体酮生成17α-羟基黄体酮，为17α-羟基黄体酮的工业化生产开拓了新的工艺路线。

(3)鉴于本发明以及现有技术的教导，本领域技术人员还应明白，本发明的“黄体酮-17α-羟化酶”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式是指，具有与“本发明的黄体酮-17α-羟化酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个或3个以内)氨基酸。例如本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签，例如，6×His标签通常不会改变所得蛋白质的功能。

“本发明的黄体酮-17α-羟化酶”多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“黄体酮-17α-羟化酶”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。

本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的黄体酮-17α-羟化酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的黄体酮-17α-羟化酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的黄体酮-17α-羟化酶”的氨基酸序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供了一种“黄体酮-17α-羟化酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的黄体酮-17α-羟化酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性蛋白。

修饰形式(通常不改变一级结构)包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“黄体酮-17α-羟化酶”的保守性变异多肽指与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示蛋白相同或相似的活性，即催化产生17α-羟基黄体酮的活性。

同时，本领域的技术人员都知道在上述取代、缺失、插入和添加一个或几个氨基酸残基并保持多肽初始功能的突变称为保守突变，而保守突变中的典型代表是保守取代，保守取代是下述突变，其中，如果取代位点是芳香族氨基酸，则在Phe、Trp和Tyr之间相互取代；如果是疏水性氨基酸，则在Leu、Ile和Val中相互取代；如果是极性氨基酸，则在Gln和Asn之间相互取代；如果是酸性氨基酸，则在Asp和Glu之间相互取代；如果是具有羟基的氨基酸则在Ser和Thr之间相互取代。具体而言，被视为保守取代的氨基酸残基之间的取代如表1所示。

表1：被视为保守取代的氨基酸残基之间的取代表

(4)本发明提供了一种制备17α-羟基黄体酮的方法，所述方法包括直接或间接利用本发明的黄体酮-17α-羟化酶(例如利用能够表达本发明的黄体酮-17α-羟化酶的宿主细胞)，以黄体酮为底物，或者以植物甾醇为底物制备17α-羟基黄体酮。

由于本发明的黄体酮-17α-羟化酶能够以黄体酮为底物催化产生17α-羟基黄体酮，在本发明的黄体酮-17α-羟化酶的基础上，本发明还提供一种用于制备17α-羟基黄体酮的组合物，所述组合物包括本发明的黄体酮-17α-羟化酶和黄体酮。

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸，及黄体酮-17α-羟化酶基因。属于“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

(5)黄体酮-17α-羟化酶基因可以是在严格的条件下与SEQ ID NO:1所示序列制备的探针，例如与SEQ ID NO:1所示序列的部分或者整个序列互补的序列杂交的DNA，只要保持其初始功能即可。所述“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成特异性杂交的条件。例如，同源性较高的DNA，例如具有80％以上同源性的DNA彼此杂交，同源性低于80％的DNA彼此不杂交的条件，或者通常的Southern杂交的清洗条件，即在相当于60℃、1*SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1*SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1*SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2-3次的条件。

此外，由于密码子的简并性因宿主而异，黄体酮-17α-羟化酶基因中的任意密码子可以用相应的等价密码子替换，也就是说，黄体酮-17α-羟化酶基因可以是由于遗传密码的简并性而在上面例如的任何黄体酮-17α-羟化酶基因的突变。例如，黄体酮-17α-羟化酶基因可以是经修饰的基因，使得其具有根据要使用的宿主中密码子频率的最佳密码子。

因此，在具体的实施方式中，所述黄体酮-17α-羟化酶基因可以是与编码SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的DNA同源性或序列相同性在90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的DNA。

2、本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

3、“对应于”

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位就可能是第46位。再如，如果在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的N末端位置处缺失一个残基时，那么所得突变体对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位就可能是第39位。此外，若在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的任意位置插入一个氨基酸残基而其功能未改变的情况下，所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第40位就可能是39位或者41位。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上。因此，与本发明的具体黄体酮-17α-羟化酶具有80％以上，优选90％以上，更优选95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性或同源性，并且具有黄体酮-17α-羟化酶功能的序列也包括在本发明的保护范围内。

4、任意氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的对应于位置可以通过氨基酸序列之间的比对确定。

本领域普通技术人员公知的测定比对方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis ofSequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAMJ.Applied Math.，48:1073(1988)。

测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.，F.等，1990)。公众可从NCBI和其他来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBINLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

5、宿主细胞

本文所用术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明黄体酮-17α-羟化酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的黄体酮-17α-羟化酶能在该宿主细胞中表达。所述宿主细胞可以是真菌或细菌；包括但不限于：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

YPD培养基(g/L)：酵母浸出物10，蛋白胨20，葡萄糖20；固体YPD培养基中加入1.5％-2％的琼脂粉，121℃灭菌20min；

10×GY：混合10mL甘油与90mL水，121℃灭菌20min；

10×YNB培养基：溶解134g酵母氮源碱(YNB)于1000mL水中，过滤除菌；

BMGY培养基(g/L)：酵母浸出物10，蛋白胨20，溶解于700mL水中，以每瓶14mL分装到250mL三角瓶中，每瓶加入2mL10×GY，2mL 1M磷酸缓冲液pH 6.0，115℃灭菌20min，使用时加入2mL 10×YNB，80μL 500×生物素；

BMMY培养基(g/L)：酵母浸出物10，蛋白胨20，溶解于700mL水中，以每瓶14mL分装于250mL三角瓶中，每瓶加入2mL 1M磷酸缓冲液pH 6.0，115℃灭菌20min，使用时加入2mL10×YNB，80μL 500×生物素，100μL过滤除菌后色谱纯的甲醇。

下述实施例中所涉及的溶液如下：

Tris-HCl缓冲液：100mM Tris-HCl，100mM NaCl，10％甘油，pH 7.4。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

黄体酮含量的检测：

样品处理：首先，将保存在-20℃冰箱的样品取出置于冰上融化，然后取1mL催化液于干净的5mL离心管内；加入2倍体积的乙酸乙酯进行萃取(振荡器上处理30-50s)；吸取1mL萃取液于干净的2mL离心管内，用氮吹仪将乙酸乙酯在通风橱内吹干，然后用80％甲醇复溶；样品全部用0.22μm的有机滤膜过滤至液相小瓶内衬管内，直接进行HPLC检测或暂放于4℃冰箱内备用。

HPLC检测：实验用的C₁₈柱子(Acclaim^TM120,5μm,

4.6×250mm)；流动相：0-15min 60-90％甲醇；15-20min 90％甲醇；20-25min 90-60％乙腈；25-30min 60％甲醇。一个样品检测需要30min；流速：1mL/min；样品进样量为20μL；温度为40℃，检测波长为254nm。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数按重量计算。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1：重组菌株P.pastoris GS115/pPIC3.5K-K-MA_CYP450 17a2的构建

具体步骤如下：

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的酶MA_CYP450 17a2(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示)；

(2)分别通过5’端采用EcoR I内切酶位点，3’端采用Not I内切酶位点将步骤(1)得到的目的基因MA_CYP450 17a2连接到大肠-酵母穿梭的高拷贝质粒pPIC3.5K，获得的重组质粒命名为pPIC3.5K-MA_CYP450 17a2；然后采用化学转化的方法将重组质粒pPIC3.5K-MA_CYP450 17a2导入大肠杆菌JM109感受态细胞内，其中MA_CYP450 17a2的氨基酸序列与已报道的斑马鱼来源的CYP450 17a2(PDB ID:4R20)identity为61.25％。

(3)为了提高MA_CYP450 17a2基因在毕赤酵母细胞内的表达效率，在目的基因序列5’端前面添加Kozak序列(GCCACCATGG)，获得的重组质粒命名为pPIC3.5K-K-MA_CYP45017a2，该分子操作在大肠杆菌JM109细胞内进行。

然后按照《毕赤酵母表达操作手册(精译版)》的实验操作，将重组质粒pPIC3.5K-K-MA_CYP450 17a2整合进毕赤酵母即Pichia pastoris GS115的基因组上，即：将基因插入到甲醇诱导型的AOX1启动子后，获得重组菌株P.pastoris GS115/pPIC3.5K-K-MA_CYP45017a2。

实施例2：黄体酮-17α-羟化酶的诱导表达

按照下述操作，对黄体酮-17α-羟化酶进行诱导表达：

细胞培养使用BMGY培养基，由于基因插入到甲醇诱导型的AOX1启动子后，故使用BMMY培养基进行诱导表达，具体操作如下：

(1)将高拷贝筛选得到的菌株在YPD平板上进行划线分离，得到单菌落；

(2)将步骤(1)得到的单菌落接种到BMGY培养基中，往复式摇床120rpm 30℃培养24h，得到菌液；

(3)将步骤(2)得到的菌液在5000rpm，20℃条件下离心10min收集菌体；

(4)吸取2-3mL BMMY培养基重悬菌体，将得到的重悬液全部转移至BMMY培养基中，放入往复式摇床在120rpm 30℃条件下培养；

(5)每隔24h向培养液中补充过滤除菌的色谱纯甲醇100μL；

(6)培养96-120h后离心收集菌体准备进行全细胞催化。

(7)将培养得到的菌体，采用高压匀浆破碎的方式，破碎细胞，将得到的粗酶液进行琼脂糖-凝胶电泳分析，结果如图3所示，MA_CYP450 17a2大小为58kDa左右(箭头指示处)，证明K-MA_CYP450 17a2酶得到了表达。

实施例3：以黄体酮为底物催化生成17α-羟基黄体酮

采用实施例2的步骤(6)所得到的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC3.5K-K-MA_CYP450 17a2进行全细胞催化黄体酮制备17α-羟基黄体酮，具体操作步骤如下：

(1)将实施例2步骤(6)所培养好的重组毕赤酵母在6000rpm，20℃条件下离心10min，收集菌体，然后用Tris-HCl缓冲液洗涤细胞一次，为全细胞催化做准备；

(2)将黄体酮溶解于纯乙醇中，获得浓度为50mM的黄体酮母液；

(3)全细胞催化体系为：

向含有100mM Tris-HCl、10％(v/v)甘油、100mM NaCl，黄体酮终浓度1mM(约0.3g/L，30mL反应液加入0.6mL的50mM黄体酮母液)，羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)1.2g/L(提前用Tris-HCl缓冲液溶解，与黄体酮摩尔比例约为1:1)的反应体系中添加98mg_CDW重的步骤(1)得到的P.pastoris GS115/pPIC3.5K-K-MA_CYP450 17a2，在pH 7.5，30℃，120rpm往复式摇床中培养7d，从第3天开始每24h取样一次检测17α-羟基黄体酮的含量，结果如表2和图2所示。

表2催化生产17α-羟基黄体酮

对比例1：

具体实施方式同实施例1-3，区别在于，将宿主细胞更换为大肠杆菌BL21(DE3)，质粒更换为pET21a，将制备得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-MA_CYP450 17a2，将得到的重组大肠杆菌，在本发明相同的条件下进行全细胞催化黄体酮制备17α-羟基黄体酮，结果显示，并没有检测到17α-羟基黄体酮的生成。

对比例2：

具体实施方式同实施例1-3，区别在于，采用Manosroi等人报道的Cunninghamella.blakesleeana、Curvularia lunata(0.3g/L黄体酮，转化率为11％-14％之间)菌株(Jiradej Manosroi,et al.Journal of Steroid Biochemistry andMolecular Biology,2008,112(4-5):201-204)直接进行全细胞催化，在本发明相同的条件下进行全细胞催化黄体酮制备17α-羟基黄体酮，结果显示，并没有检测到17α-羟基黄体酮的生成。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种黄体酮-17α-羟化酶及其应用

<130> BAA210004A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcaagtg gtcttcttgc ctcccttccc tcattcgtct catttcctcc tccttttccc 60

ttgtccttcc tacttgttcc cttggttcta tcagtgggcg tagtggtcgt ttggttcctt 120

atcactcacg gaagtatccc taaaacaaaa cgtggaggtc tgccaccaca catgctattc 180

tcacagcttg tgcatagata cggttcattg tttgcatttt acctgggacc tcactacacg 240

gtcgtagtaa ataaccatca tcacgctaaa gaggtattac tgcagagagg aagggacttt 300

gccggcaggc cctccatggt tacgactagt cttctgacga ggggcggcaa agacatcgca 360

ttcgcagatt attcccctct ttggaagctg cacaggcgtt tggtccataa ttctttcacc 420

ttgtttggag aaggaactag tcgtttgcaa gatattgtcc tgtcttcagt agattcactg 480

tgtgtggagc ttttttcagg aggccgtcgt ggcttcgatc caatgcctgc cgtaaccaga 540

gccgttacca atgtcgtgtg cacactagtg ttctcagcaa cgtaccgtcc tggcgatgca 600

gagttacaag aggtcatcca gtacaatgac tgtatagtac aaactataac taggggtgga 660

ttggtggaca tatatccatg gttaaaattt tttcctaatc gttcattatc taaactgaaa 720

gactccataa ccgtcaggga ccgtctttta acaaggaaac ttgaggagca taaggcatta 780

ctttcagatg gcgacccctg cgatctgctg gacgctttgt tgaaaggaca gaaggattct 840

gttcgtggcc gtcgttcctc aaccctagag gacgacagga ttaccgatga tcatgtactt 900

atgacagcag cagaggcttt cggcgcaggc gtagaaacaa cgtctactac gctgttgtgg 960

attcttgcct acctactaca tcaccccgag gtccaggaaa gagtccagaa agagctagat 1020

gagcaggtgg gcagtgagag accagtttcc atgtcagacc gtggtcgttt gccttatctg 1080

gactgcgtaa ttaatgaggg aatgcgtatc agacccgtgt cacctgtcct aatcccacac 1140

acagctctga ccgatacgtc tataggcggc cacgctgtag gtcgtggtac gcgtgtccta 1200

gtcaatatgt ggtctatcca ccatgatccc cgtttctggg ataagcccga tctgtttaca 1260

cccgacaggt tcctggacga ccatggtcgt cgtgtcactc cttcatgttt cctaccattc 1320

ggtgcaggcc cccgtgtttg cgtaggtgag tctttagcca ggctagagct ttttttgttt 1380

ctgtcctctc tgcttcaacg tatgtccttt aagttacctg atggagctcc cgctccaaat 1440

ctacagggac gtttaggtgt tgtccttcaa cctcttccct tcaaagtagt ggtcactcca 1500

aggccaggat gggaggcagg cacgaga 1527

<210> 2

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Ser Gly Leu Leu Ala Ser Leu Pro Ser Phe Val Ser Phe Pro

1 5 10 15

Pro Pro Phe Pro Leu Ser Phe Leu Leu Val Pro Leu Val Leu Ser Val

20 25 30

Gly Val Val Val Val Trp Phe Leu Ile Thr His Gly Ser Ile Pro Lys

35 40 45

Thr Lys Arg Gly Gly Leu Pro Pro His Met Leu Phe Ser Gln Leu Val

50 55 60

His Arg Tyr Gly Ser Leu Phe Ala Phe Tyr Leu Gly Pro His Tyr Thr

65 70 75 80

Val Val Val Asn Asn His His His Ala Lys Glu Val Leu Leu Gln Arg

85 90 95

Gly Arg Asp Phe Ala Gly Arg Pro Ser Met Val Thr Thr Ser Leu Leu

100 105 110

Thr Arg Gly Gly Lys Asp Ile Ala Phe Ala Asp Tyr Ser Pro Leu Trp

115 120 125

Lys Leu His Arg Arg Leu Val His Asn Ser Phe Thr Leu Phe Gly Glu

130 135 140

Gly Thr Ser Arg Leu Gln Asp Ile Val Leu Ser Ser Val Asp Ser Leu

145 150 155 160

Cys Val Glu Leu Phe Ser Gly Gly Arg Arg Gly Phe Asp Pro Met Pro

165 170 175

Ala Val Thr Arg Ala Val Thr Asn Val Val Cys Thr Leu Val Phe Ser

180 185 190

Ala Thr Tyr Arg Pro Gly Asp Ala Glu Leu Gln Glu Val Ile Gln Tyr

195 200 205

Asn Asp Cys Ile Val Gln Thr Ile Thr Arg Gly Gly Leu Val Asp Ile

210 215 220

Tyr Pro Trp Leu Lys Phe Phe Pro Asn Arg Ser Leu Ser Lys Leu Lys

225 230 235 240

Asp Ser Ile Thr Val Arg Asp Arg Leu Leu Thr Arg Lys Leu Glu Glu

245 250 255

His Lys Ala Leu Leu Ser Asp Gly Asp Pro Cys Asp Leu Leu Asp Ala

260 265 270

Leu Leu Lys Gly Gln Lys Asp Ser Val Arg Gly Arg Arg Ser Ser Thr

275 280 285

Leu Glu Asp Asp Arg Ile Thr Asp Asp His Val Leu Met Thr Ala Ala

290 295 300

Glu Ala Phe Gly Ala Gly Val Glu Thr Thr Ser Thr Thr Leu Leu Trp

305 310 315 320

Ile Leu Ala Tyr Leu Leu His His Pro Glu Val Gln Glu Arg Val Gln

325 330 335

Lys Glu Leu Asp Glu Gln Val Gly Ser Glu Arg Pro Val Ser Met Ser

340 345 350

Asp Arg Gly Arg Leu Pro Tyr Leu Asp Cys Val Ile Asn Glu Gly Met

355 360 365

Arg Ile Arg Pro Val Ser Pro Val Leu Ile Pro His Thr Ala Leu Thr

370 375 380

Asp Thr Ser Ile Gly Gly His Ala Val Gly Arg Gly Thr Arg Val Leu

385 390 395 400

Val Asn Met Trp Ser Ile His His Asp Pro Arg Phe Trp Asp Lys Pro

405 410 415

Asp Leu Phe Thr Pro Asp Arg Phe Leu Asp Asp His Gly Arg Arg Val

420 425 430

Thr Pro Ser Cys Phe Leu Pro Phe Gly Ala Gly Pro Arg Val Cys Val

435 440 445

Gly Glu Ser Leu Ala Arg Leu Glu Leu Phe Leu Phe Leu Ser Ser Leu

450 455 460

Leu Gln Arg Met Ser Phe Lys Leu Pro Asp Gly Ala Pro Ala Pro Asn

465 470 475 480

Leu Gln Gly Arg Leu Gly Val Val Leu Gln Pro Leu Pro Phe Lys Val

485 490 495

Val Val Thr Pro Arg Pro Gly Trp Glu Ala Gly Thr Arg

500 505

Claims

1.一种黄体酮17α-羟化酶，其特征在于，所述黄体酮17α-羟化酶的氨基酸序列如SEQID NO: 2所示。

2.编码权利要求1所述的黄体酮17α-羟化酶的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述重组载体的重组细胞。

5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的宿主细胞包括谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、粘质沙雷氏菌（Serratia marecescens）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia pastoris）。

6.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以毕赤酵母（Pichia pastoris）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为宿主细胞。

7.一种制备17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的黄体酮17α-羟化酶，或权利要求4~6任一所述的重组细胞添加至含有黄体酮的反应体系中进行反应，制备得到17α-羟基黄体酮。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述黄体酮17α-羟化酶在反应体系中的添加量至少为0.5 μM；所述重组细胞在反应体系中的添加量至少为4.9 g_CDW/L。

9.一种制备17α-羟基黄体酮的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的黄体酮17α-羟化酶和黄体酮。

10.权利要求1所述的黄体酮17α-羟化酶，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4~6任一所述的重组细胞在制备含有17α-羟基黄体酮的产品中的应用。