CN115976004A - 一种黄体酮17α-羟化酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明通过定点突变技术对人源C17α‑羟化酶(CYP17A1)进行分子改造，获得一种羟化活性和特异性提高的黄体酮17α‑羟化酶突变体CYP17A1A105Y，其催化产物17α‑羟黄体酮产率显著高于野生型酶，并且无明显副产物积累。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄体酮17α-羟化酶突变体及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
甾体类化合物结构多样且种类众多，在维持人的正常生命活动及医药领域中扮演着至关重要的角色。例如人体中的甾体化合物包括：胆固醇、胆汁酸、性激素等。在医药领域：甾体类药物不仅能抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克，还可做为乳腺癌和前列腺癌重要的辅助治疗药物。对于黄体酮生物转化研究表明：传统化学法合成甾体类药物的工艺路线存在流程冗长、环保性能差、有机试剂毒性大等问题；而微生物转化因对甾体化合物的特异性高，常被用于生产多种甾体类衍生物，在活性医药中间体发掘过程中具有重大意义；而且大量甾体化合物生物转化研究也表明了微生物在甾体类化合物大规模转化应用中的可行性。
17α-羟黄体酮(又称17α-羟孕酮)是一种制备甾体激素类药物的重要中间体，可用于合成多种孕激素(如安宫黄体酮、醋酸甲地黄体酮、氯地黄体酮等)和皮质激素(如氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙等)，具有十分广阔的工业应用前景。17α-羟黄体酮的化学合成路线存在着较多缺陷：以薯蓣皂素作为起始原料的路线需要首先对薯蓣皂素进行结构修饰，生产路线繁琐；并且薯蓣皂素提取工艺复杂、成本较高。以雄烯二酮为原料的生产路线，原料成本较低、易获得，具有较好的经济效益，但是该路线往往需要使用剧毒的氰基化试剂，为工业化生产带来了较大的环保隐患。虽然近年来开发了一系列新型的合成路线，从源头上避免了氰基化试剂的使用，但新研发的工艺路线中也需采用如碳化钙等易燃易爆原料，安全隐患较大。因此，微生物转化法受到了越来越多的关注，微生物转化法绿色环保，生产路线简便克服了以上方法的不足。生物催化法由黄体酮17α-羟化酶P450C17(分为CYP17A1，CYP17A2两大类)进行生物转化一步获得17α-羟黄体酮。但是由于微生物转化法的羟化特异性低限制了其工业生产。
发明内容
针对目前工业生产17α-羟黄体酮工艺冗杂、成本高的现状，为了提高C17α-羟化酶对黄体酮的羟化特异性和催化活性，本发明通过定点突变技术对人源C17α-羟化酶(CYP17A1)进行分子改造，目的是获得羟化活性和特异性提高的新的C17α-羟化酶，以提高生产效率。
第一方面，本发明提供一种黄体酮17α-羟化酶突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
第二方面，本发明提供所述黄体酮17α-羟化酶突变体的编码基因。
在本发明一种具体实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
第三方面，本发明提供包含所述编码基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。
在本发明一种具体实施方式中，所述载体是pYES2。
第四方面，本发明提供包含所述编码基因或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是适合于从本发明的基因或载体生产本发明的黄体酮17α-羟化酶突变体的任何宿主，例如大肠杆菌，例如酿酒酵母，例如毕赤酵母。
第五方面，本发明提供用于反向PCR扩增所述编码基因的特异性引物对。
在本发明一种具体实施方式中，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示。
第六方面，本发明提供所述黄体酮17α-羟化酶突变体用于催化黄体酮生产17α-羟黄体酮的用途。
第七方面，本发明提供制备所述黄体酮17α-羟化酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述黄体酮17α-羟化酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述石黄体酮17α-羟化酶突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将黄体酮17α-羟化酶突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
第八方面，本发明提供一种制备17α-羟黄体酮的方法，该方法包括使黄体酮与本发明所述黄体酮17α-羟化酶突变体或与本发明所述宿主细胞接触的步骤，在能够通过所述黄体酮17α-羟化酶突变体或所述宿主细胞的酶促催化作用催化黄体酮发生羟化反应的条件下进行。
本发明的有益效果：
相同条件下，本发明黄体酮17α-羟化酶突变体的催化活性和羟化特异性显著提供，催化产物17α-羟黄体酮产率显著高于野生型酶，并且无明显的副产物积累。利用重组毕赤酵母发酵进行黄体酮转化实验，结果显示：野生型酶的17α-羟黄体酮产率为10.23％，副产物16α-羟黄体酮产率为3.03％，与之相比，本发明突变体的17α-羟黄体酮产率为26.66％，并且无16α-羟黄体酮副产物生成。本发明研究为开发绿色高效的17α-羟黄体酮生产工艺奠定了坚实的理论基础。
附图说明
图1：CYP17A1对黄体酮的生物转化。
图2：基因片段hCYP17A1琼脂糖凝胶电泳验证图；其中：M为DNA Marker；1-3为目的基因hCYP17A1扩增产物条带。
图3：pYES2-hCYP17A1重组酿酒酵母表达载体构建图。
图4：pYES2-hCYP17A1重组表达载体质粒酶切验证图；其中：M为DNA Marker，1-12为重组质粒的双酶切验证条带。
图5：重组表达载体A105Y突变扩增产物琼脂糖凝胶示例图；其中：M为DNA Marker，1-6是突变体PCR扩增产物条带。
图6：pYES2-hCYP17A1 A105Y突变体对黄体酮转化的TLC结果。
图7：pPIC-3.5k-hCYP17A1 A105Y突变体重组毕赤酵母表达载体质粒酶切验证图。
图8：pPIC3.5K-hCYP17A1 A105Y突变体重组毕赤酵母表达载体构建图。
图9：pYES2-hCYP17A1 A105Y突变体对黄体酮转化的HPLC结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明突变体的标识：氨基酸残基使用公认IUPAC命名法，DNA核酸序列使用公认IUPAC命名法。采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示黄体酮17α-羟化酶突变体中突变的氨基酸。如A105Y，表示第105位的氨基酸由亲本黄体酮17α-羟化酶的丙氨酸(A)替换成酪氨酸(Y)，位置的编号对应于SEQ ID NO：1中黄体酮17α-羟化酶的氨基酸序列编号。
本发明中涉及菌株：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae INVSc1)，大肠杆菌(Escherichia coli JM109)，毕赤酵母(Pichia pastoris GS115),天津科技大学应用微生物与酶工程研究室。
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。
实施例1：酿酒酵母CYP17A1 A105Y突变体的制备
1.hCYP17A1基因的扩增
以人源的CYP17A1基因作为模板，设计带有Bam HI和HindⅢ酶切位点的上下游引物，进行PCR扩增，引物由生物公司进行合成。
F：CCCAAGCTTATGTGGGAACTGGTTGCCTT；
R：CGCGGATCCTTAGGTAGAACCTTCAGCTTGGGC；
PCR反应体系：
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证正确，如图2所示。
2.PCR产物切胶回收及体外连接
PCR产物经Dpn I酶消化模板，在72℃的金属浴中放置15min(灭酶活)，利用小量DNA切胶回收试剂盒对PCR目的片段进行回收，方法如下：
(1)预先配制好回收的胶，将5μL的Loading Buffer缓冲液加入酶切体系中混匀,混匀后均匀点在胶孔中。将电泳仪电压调节至110V，运行30～40min。
(2)电泳结束后，将胶泡在含有EB的溶液中5min，然后放在紫外凝胶成像仪内，判断目的条带的位置，将需要的条带切下，放入1.5mL EP管中，称量凝胶重量然后根据切胶回收说明书向EP管中加入2.5倍体积溶胶液(0.1g加100μL)，放在60℃金属浴10min(每隔2min上下颠倒一次)直至凝胶全部溶解。
(3)将溶胶液拿出放至室温，将溶液全部转移到柱内，静置3min，13000r/min离心2min，将柱子下的液体重新倒入吸附柱中重复2～3次。
(4)倒掉溶胶的废液，加入700μL漂洗液W2至吸附柱，静置2min，13000r/min离心2min，去废液。
(5)加入500μL漂洗液W2至吸附柱，静置2min，13000r/min离心2min，去废液，13000r/min离1min。
(6)将吸附柱放入新的1.5mL EP管中，在金属电热套放10min晾干，加入40～60μL双蒸馏水，静置2min，13000r/min离心3min，将离心管底部从新吸到吸附柱上，离心收集得到目的片段。
将带有相同的Bam HI、HindⅢ酶切位点的上述PCR纯化片段和pYES2片段进行体外连接；载体pYES2-hCYP17A1构建如图3所示。
体外连接体系：
金属浴16℃过夜连接，进行大肠化转，涂布于含Amp(100μg/mL)的LB的固体平板中，37℃培养箱静置培养得到转化子。
3.转化子验证
待长出单菌落后挑大小均匀的单菌落在LB抗性板密集划线，提质粒后用Bam HI和HindⅢ进行双酶切验证，将得到正确酶切条带的重组质粒测序，得到重组表达载体pYES2-hCYP17A1质粒，如图4所示。
4.定点突变技术扩增目的片段
以质粒pYES2-hCYP17A1作为模板，设计定点突变引物进行聚合酶链式反应，引物由生物公司进行合成。定点突变引物如下：
A105Y-F(5’-3’)：GGATATTTATTCTAATAATAGAAAAGGTATTGC(SEQ ID NO：3)
A105Y-R(5’-3’)：TTATTAGAATAAATATCCAGGGTGGCCATC(SEQ IDNO：4)
按上述PCR扩增程序得到突变目的片段，取2μL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证条带大小7372bp，如图5所示。经PCR正确的质粒送至生物公司进行测序，突变成功的质粒用于后续操作。
突变体的基因突变位点如下：
5.醋酸锂转化法
将PCR产物经Dpn I酶消化后进行纯化，醋酸锂转化法转入酿酒酵母，利用组氨酸营养缺陷的SC培养基初步筛选转化子。挑取转化子密集划线至YPD平板，放置在30℃恒温培养箱48h后进行发酵培养，甾体底物黄体酮投料量为0.2g/L，30℃摇床振荡培养96h后取样，经TLC检测，转化结果见图6所示。突变体A105Y同基因野生型CYP17A1相比产物明显增多。
实施例2：毕赤酵母CYP17A1 A105Y突变体的重组表达与催化
1.pPIC-3.5k-hCYP17A1 A105Y突变体重组表达载体的构建
以构建好的突变体重组质粒pYES2-hCYP17A1突变体为模板，PCR扩增目的基因片段，将目的片段及3.5K质粒酶切后一起切胶回收，琼脂糖凝胶电泳检测条带浓度。根据条带亮度调整酶切连接体系大小，过夜连接后化转到大肠感受态细胞。挑取转化子密涂到LB平板并提取质粒，用Bam HI、和Not I酶切，用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，如图7所示。pPIC3.5K-hCYP17A1 A105Y突变体重组质粒，如图8所示。经过限制性内切酶SacⅠ线性化，后用试剂盒纯化片段后电转整合到毕赤酵母基因组。涂在MD筛选平板后，30℃培养3～4d。
2.转化子的挑选
从MD平板挑取转化子，依次转接到0.5mg/mL G418、2.0mg/mL G418、4.0mg/mLG418筛选平板，得到高拷贝数的转化子，从4.0mg/mL G418筛选平板上挑取长势较好的转化子于YPD平板密集培养，2～3d提取基因组进行PCR验证。
3.重组毕赤酵母pPIC-3.5k-hCYP17A1 A105Y突变体的底物转化效果
重组毕赤酵母A105Y突变体进行黄体酮转化实验72h后(投料量为0.2g/L)，取样萃取上清液，对产物进行定性分析，经三用紫外分析仪对色谱进行分析发现，突变体A105Y同基因野生型相比17α-羟黄体酮产量明显增加，且无16α-羟黄体酮副产物生成。将上述突变体发酵转化产物进行HPLC高效液相色谱检测，萃取发酵产物上清液100μL烘干，加200μL超声混合均匀的流动相液体，混合均匀后制备液相样品，进行HPLC检测，检测结果如图9所示。
液相条件如下：
流动相A：流动相B＝乙腈：水＝65％：35％；
温度：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：241nm；
进样时间：15min；
检测结果分析：
由液相结果分析可知：野生型酶的17α-羟黄体酮产率为10.23％，副产物16α-羟黄体酮产率为3.03％，与之相比，CYP17A1 A105Y突变体的17α-羟黄体酮产率为26.66％，并且无16α-羟黄体酮副产物生成。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
Claims (8)
1.一种黄体酮17α-羟化酶突变体，其特征在于，所述黄体酮17α-羟化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述黄体酮17α-羟化酶突变体的编码基因。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因或权利要求3所述重组载体。
5.如权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
6.一种用于反向PCR扩增权利要求2所述编码基因的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
7.权利要求1所述黄体酮17α-羟化酶突变体用于催化黄体酮生产17α-羟黄体酮的用途。
8.一种制备17α-羟黄体酮的方法，该方法包括使黄体酮与权利要求1所述黄体酮17α-羟化酶突变体或与权利要求4所述宿主细胞接触的步骤，在能够通过所述黄体酮17α-羟化酶突变体或所述宿主细胞的酶促催化作用催化黄体酮发生羟化反应的条件下进行。
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