CN117701600A - 一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生物合成白桦脂酸的方法 - Google Patents

一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生物合成白桦脂酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生物合成白桦脂酸的方法。所述基因组合包括以下基因：羽扇豆醇合酶基因LrLUPF；P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA或LrCYPB；P450细胞色素还原酶基因LrCPRH或LjCPR。本发明为取代传统的人工栽培或深层发酵获取提供了一种潜在的方法，为进一步通过代谢工程改造高效生物合成奠定基础。

Description

一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生 物合成白桦脂酸的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生物合成白桦脂酸的方法。具体地，涉及莲藕中白桦脂酸合成相关P450细胞色素氧化酶基因(LrCYP)、莲藕中白桦脂酸合成相关P450S细胞色素还原酶基因(LrCPR)和莲藕中白桦脂酸合成相关羽扇豆醇合酶基因(LrLUPs)、含有所述基因片段的重组表达载体、一种基因工程化的酿酒酵母，以及一种异源生物合成白桦脂酸的方法。
背景技术
白桦脂酸(C30H48O3，Betulinic acid)，又称为桦木酸，是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，最早从白桦树树皮中提取获得。白桦脂酸具有多种药理活性，现代药理研究表明，白桦脂酸及其衍生物具有如抗炎、抗肿瘤、抗HIV等多种药理活性，具有较好的成药前景。白桦脂酸的来源主要有两条途径，一是植物中提取，二是化学半合成方法，以白桦脂醇为底物来制备白桦脂酸。前者产量低、浪费自然资源、生产成本高。后者需从植物中提取白桦脂醇作为反应底物，原料耗费多、合成过程复杂、产物纯化困难、环境污染严重，不符合环境友好的原则。相比之下，采用微生物发酵法合成白桦脂酸具有更加绿色环保的优势。
莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn)是植物莲的肥大根茎，属睡莲科莲属，其作为药用植物在中国已有上千年的历史，《本草纲目》记载“藕可交心肾，厚肠胃，强筋骨，固精气，补虚损”。莲藕富含多种活性成分，包括黄酮、生物碱、萜类、多糖等，具有抗氧化、预防酒精性肝病、增强免疫力、抗炎、抗肿瘤等作用。从莲藕中发现的三萜类物质就包括羽扇豆醇、白桦脂酸、齐墩果酸等化合物。
莲藕中活性成分的研究大多集中在研究相关鉴定方法，对于该物质在莲藕中是如何合成，合成涉及到的基因等没有相关报道。白桦脂酸合成关键酶基因包括P450细胞色素氧化酶基因(CYP)、P450细胞色素还原酶基因(CPR)和羽扇豆醇合酶基因(LUPs)。已报道合成白桦脂酸的酶基因大多来源于模式物种，如长春花、拟南芥等，来源其他物种的酶基因报道较少，且相关功能的酶基因非合成白桦脂酸最适基因，利用这些酶基因发酵得到的生成量不足以用于生产。莲藕中具有多种白桦脂酸合成关键酶基因，可以扩大其合成酶基因的数量与种类，为后期大规模生产白桦脂酸奠定基础。
综上所述，当前亟需挖掘不同物种的P450s，增加具有合成白桦脂酸功能的酶基因，以构建合成白桦脂酸的重组菌株，为实现通过微生物发酵工程生产白桦脂酸奠定基础。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生物合成白桦脂酸的方法。
本发明的第一方面提供一种合成白桦脂酸的基因组合，包括以下基因片段：
羽扇豆醇合酶基因LrLUPF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQID NO：2所示；
P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA或LrCYPB，LrCYPA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，LrCYPB的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
P450细胞色素还原酶基因LrCPRH或LjCPR，LrCPRH的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，LjCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明中，所述羽扇豆醇合酶基因LrLUPF、P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA、P450细胞色素氧化酶基因LrCYPB、P450细胞色素还原酶基因LrCPRH来源于莲藕相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得；P450细胞色素还原酶基因LjCPR来源于百脉根相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得。
本发明的第二方面提供一种合成白桦脂酸的重组质粒组合，含有所述的基因组合中的基因片段；所述重组质粒为大肠杆菌表达载体和/或酿酒酵母表达载体；优选地，所述大肠杆菌表达载体以pET-28a为原始载体，所述酿酒酵母表达载体以pESC-URA和pESC-LEU为原始载体。
根据本发明一种优选实施方式，所述重组质粒组合选自以下组合中的至少一种：
(i)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合；
(ii)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPA-LjCPR与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合；
(iii)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合；
(iv)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPB-LjCPR与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合。
本发明的第三方面提供一种合成白桦脂酸的菌株，其中含有上述的重组质粒组合。所述菌株可以为大肠杆菌或酿酒酵母，所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)，所述酿酒酵母菌株优选为BY4741、MVA代谢途径改造的BY4741或BY4742。所述MVA代谢途径改造的BY4741的基因组HO位点中整合有酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20。构建所述MVA代谢途径改造的BY4741的方法包括：过表达酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20，将其整合至BY4741基因组HO位点，以提高白桦脂酸合成前体供应。
本发明的第四方面提供一种异源生物合成白桦脂酸的方法，包括：将上述的菌株进行发酵培养，合成得到白桦脂酸。优选地，所述发酵培养的条件包括：培养基初始pH为5.8-6.2，初始OD600值为0.8-1.2，发酵半乳糖浓度为5.5-6.5％，扩大发酵培养基体积为150-500mL，发酵时间为55-65h。
本发明的技术路线如图1所示：采用高通量测序平台(DNBSEQ)对“鄂莲五号”品种莲藕的六个不同生长时期进行转录组学分析，筛选可能参与白桦脂酸合成的P450细胞色素氧化酶基因(CYP)、P450细胞色素还原酶基因(CPR)和羽扇豆醇合酶基因(LUP)。从莲藕中克隆得到羽扇豆醇合酶基因LrLUP、P450细胞色素氧化酶基因LrCYP、P450细胞色素还原酶基因LrCPR，分别构建重组表达质粒。将酵母质粒转化入酿酒酵母中，构建重组酿酒酵母，进行异源表达。通过对转化后的菌株进行发酵筛选，筛选得到合成白桦脂酸的LrLUP-F、LrCYP-A、LrCYP-B、LrCPR-H。最后，通过特定基因优化、底盘菌株改造和发酵条件优化等方法，优化重组酿酒酵母，提升其白桦脂酸产量。
本发明所述的异源表达具体是指：以莲藕总RNA反转录后的cDNA为模板，通过PCR扩增候选的各个LrLUP、LrCYP、LrCPR表达序列片段，通过酶切的方法将各个LrLUP、LrCYP、LrCPR表达片段、大肠杆菌表达载体pET-28a和酿酒酵母表达载体pESC-URA和pESC-LEU连接，得到一系列重组表达载体，转入大肠杆菌BL21或酿酒酵母BY4741、BY4742进行表达验证。
本发明所述的发酵筛选具体是指：通过标准的醋酸锂转化法将各个表达质粒导入酿酒酵母后，通过YPD培养基发酵，随后对发酵产物经乙酸乙酯萃取，随后氮吹浓缩发酵样品，加入MSTFA硅烷化试剂衍生化反应冷却后加入色谱级乙腈重悬，通过GC-MS检测发酵样品，从而初步判断所转化的基因是否是所需的目的基因。
本发明所述的基因优化具体是指：基因优化是依据酿酒酵母的密码子偏好对具有酶活性质的基因进行碱基适应性优化。
本发明所述的底盘菌株改造是指组合百脉根的P450s还原酶基因和整合酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20基因至酵母基因组HO位点使其过表达等手段，改造重组菌株。
本发明所述的发酵条件优化是指对培养基初始pH条件、初始OD600条件、发酵半乳糖浓度、发酵时间、发酵体系等条件进行优化。
与现有技术相比，本发明通过从莲藕转录组中挖掘到一种羽扇豆醇合酶基因LrLUPF，两种P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA和LrCYPB，一种P450细胞色素还原酶基因LrCPRH。并利用基因工程技术和生物技术构建了酵母工程菌株BY4741G，实现白桦脂酸地异源生物合成。通过在BY4742菌株中组合LrCYPA、LjCPR和LrLUPF酶基因，同时对摇瓶阶段发酵条件进行优化，使生产的白桦脂酸含量达到10.65mg/L。为取代传统的人工栽培或深层发酵获取提供了一种潜在的方法，为进一步通过代谢工程改造高效生物合成奠定基础。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明技术路线图。
图2为本发明所述白桦脂酸生物合成途径图。
图3为本发明中所述基因的PCR扩增产物电泳结果，其中，A：RNA核酸质量检测图；B：CYP基因PCR扩增图；C：CPR基因PCR扩增图；D\E：LUP基因PCR扩增图，M：DNA marker。
图4为本发明中所述基因大肠杆菌表达质粒图谱(以LrLUP为例)。
图5为本发明所述基因酿酒酵母表达质粒图谱(以LrLUP为例)。
图6为本发明所述基因重组质粒载体原核表达SDS-PAGE结果(M：Marker；2\4：CYP蛋白表达图；6\8\10\12：LUP蛋白表达图)。
图7为本发明所述基因pESC-LEU-LrLUPs重组载体发酵产物GC-MS检测图。A\a：羽扇豆醇标准品GC-MS检测图；B\b：pESC-LEU-LrLUPF样品GC-MS检测图。
图8为本发明所述基因pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH重组载体发酵产物GC-MS检测图。A\a：白桦脂酸标准品GC-MS检测图；B\b：pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH样品GC-MS检测图；C\c：pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH样品GC-MS检测图。
图9为本发明中合成白桦脂酸的酿酒酵母菌株发酵产物HPLC检测图。其中，Methanol：甲醇空白对照组；AHF：pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-LEU-LrLUPF样品HPLC检测曲线；BHF：pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH、pESC-LEU-LrLUPF样品HPLC检测曲线；Betulinic：白桦脂酸标准品；Luoionl：羽扇豆醇标准品。
图10为HMG1和ERG20基因整合至酿酒酵母基因组HO位点的过程图。
图11为片段HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD的表达框图谱与扩增电泳图，A：HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD表达框图谱；B：1\2：片段HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD扩增电泳图。
图12为CYP和CPR双基因载体构建示意图。
图13为双基因载体双酶切电泳图；A：M：Marker；1\2：重组质粒pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPA-LjCPR双酶切图；B：M：Marker；1\2：重组质粒pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPB-LjCPR双酶切图；C：M：Marker；1\2：重组质粒pESC-URA-LrCYPB-LjCPR和pESC-LEU-LrLUPF双酶切图。
图14为不同发酵条件发酵生产白桦脂酸含量变化图。其中，图A、B、C、D、E、F分别是不同底盘菌株、不同pH、不同OD值、不同半乳糖浓度、不同培养基体积、不同培养时间下白桦脂酸含量变化；
AHF：pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH+pESC-LEU-LrLUPF载体组合；
ALF：pESC-URA-LrCYPA-LjCPR+pESC-LEU-LrLUPF载体组合；
BHF：pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH+pESC-LEU-LrLUPF载体组合；
BLF：pESC-URA-LrCYPB-LjCPR+pESC-LEU-LrLUPF载体组合。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
莲藕中白桦脂酸合成候选基因羽扇豆醇合酶基因LrLUPs，P450细胞色素氧化酶基因LrCYPs、P450细胞色素还原酶基因LrCPRs的克隆表达及酶活鉴定。
1.1莲藕样品来源
本实施中采用新鲜带泥“鄂莲五号”莲藕，取材武汉市江夏区棋良公司莲藕生产基地，根据生长状态，选取六个不同生长期。分别编号S1、S2、S3、S4、S5、S6，具体采样时间为2021年7月25日～2021年8月29日，每间6天采样一次。样品切割成小颗粒状采用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱冻存。
1.2克隆莲藕白桦脂酸合成候选基因
本发明依据本实验室前期获得的莲藕转录组测序数据，从中筛选出白桦脂酸生物合成相关候选酶基因，包括：CYP候选基因LrCYPA和LrCYPB；CPR候选基因LrCPRG和LrCPRH；LUP候选基因LrLUPC、LrLUPD、LrLUPE、LrLUPF。根据基因序列设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得了上述各个基因序列。
利用PCR技术，以莲藕总RNA反转录后的cDNA为模板，依据莲藕转录组测序获得的候选酶基因的序列信息，设计引物并在引物两端增加酶切位点，特异性引物序列如表1所示：
表1：扩增莲藕LUPs、CYPs、CPRs基因所用特异性引物序列
引物名称 序列(5’-3’)
LrCYP-93846A_F GGATCCATGAGCAGCAACGACATGGAG，SEQ ID NO：11
LrCYP-93846A_R CTCGAGTTAAGCTTTGTGAGCGTGAAGGC，SEQ ID NO：12
LrCYP-93852B_F GGATCCATGAGCGACAACGATATGGAACTGT，SEQ ID NO：13
LrCYP-93852B_R GTCGACTTAGGGTTTATGTGGTTGGAGGCG，SEQ ID NO：14
LrCPR-95501G_F GCGGCCGCATGAATTCTAATTCGATCTT，SEQ ID NO：15
LrCPR-95501G_R GAGCTCTCACCAGACATCCCTTAGATACCGT，SEQ ID NO：16
LrCPR-99186H_F GCGGCCGCATGGACTCGGAGTCCGTGAAG，SEQ ID NO：17
LrCPR-99186H_R GAGCTCTCACCACACATCACGGAGATACC，SEQ ID NO：18
LrLUP-89206C_F GGATCCATGTGGAGGCTTAAGATTGCCCA，SEQ ID NO：19
LrLUP-89206C_R GTCGACTTAATTTTTGAGGTTTTTGGAAG，SEQ ID NO：20
LrLUP-89208D_F GGATCCATGTGGAGGCTTAAAATTGCCCAAG，SEQ ID NO：21
LrLUP-89208D_R GTCGACTTAATTTTGGAGGATTTTGGAAG，SEQ ID NO：22
LrLUP-93853F_F GTCGACATGTGGAAGCTTAAGATCGCTGAAGG，SEQ ID NO：23
LrLUP-93853F_R CTCGAGTTAATAAAAAAGGACCTTCCTAC，SEQ ID NO：24
LrLUP-88379E_F GGATCCATGTGGAGGCTTAAAATCGCCG，SEQ ID NO：25
LrLUP-88379E_R GTCGACTCAATGAGCCTGAAGTACACGAGAG，SEQ ID NO：26
PCR反应体系如表2所示，总体系为100μL。设定反应条件如下：98℃，30s；98℃，10s，55℃，5s，72℃延伸，循环扩增28次，后72℃，10min结束反应。取部分反应液用于电泳，剩余的扩增反应液保存于-20℃并保存凝胶图像，电泳条件为：120v，25min。
表2：PCR反应体系
试剂名称 用量
Forward Primer(F) 10pmol
Reverse Primer(R) 10pmol
PrimeSTAR HS(Premix) 25μL
Template 150ng
RNase dH2O 至100μL
以反转录的cDNA为模板，分别扩增出1500bp左右的条带(图3的B)，2000bp左右的条带(图3的C)，2200bp左右的条带(图3的D/E)。根据候选基因的转录组结果，显示CYPs酶候选基因长度为1490bp左右，CPRs酶候选基因长度在2000bp左右，LUPs酶候选基因长度为2200bp左右，条带结果与理论结果基本一致。
1.3构建莲藕白桦脂酸合成候选基因原核表达载体和真核表达载体
[1]使用OMEGA公司PCR纯化试剂盒对1.2中得到的PCR产物进行纯化回收。
[2]使用限制性核酸内切酶(根据候选基因的设置选择)酶切质粒和目的基因片段，酶切反应体系如表3所示：
表3酶切反应体系
组分 用量
限制内核酸内切酶(2种) 1μL
DNA 5μg
0.1％BSA 10μL
10×H Buffer 10μL
RNase dH2O 至100μL
[3]将上述各组分加入离心管，涡旋混匀，在37℃水浴锅反应4-6h，各取10μL酶切产物进行凝胶电泳。
[4]酶连切除成功的质粒和目的基因载体片段，反应体系为12μL，加入试剂混匀，过夜连接(16℃)，得到一系列大肠杆菌重组质粒pET-28a-LrCYPs、pET-28a-LrCPRs、pET-28a-LrLUPs以及一系列酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPs-LrCPRs、pESC-LEU-LrLUPs(s表示不同的基因)。酶连成分如表4所示：
表4：酶连反应体系
组分 用量
T4 DNA Ligase 1μL
目的基因片段：载体片段 目的基因：载体片段＝6：1(摩尔数之比)
10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL
RNase dH2O 至12μL
[5]将连接混合液和空质粒载体分别转化至大肠杆菌/酿酒酵母中，大肠杆菌采用热激法转化，酿酒酵母采用醋酸锂转化法。挑取单菌落进行菌落PCR反应，取5μL体积反应液进行琼脂糖凝胶电泳并成像。扩大培养阳性菌落，质粒提取后送至测序公司进行测序，进行验证。
图4为本发明中所述基因大肠杆菌表达质粒图谱(以LrLUP为例)。图5为本发明所述基因酿酒酵母表达质粒图谱(以LrLUP为例)。
1.4构建白桦脂酸合成相关候选基因的大肠杆菌表达菌株和酿酒酵母表达菌株
将1.3中验证正确的重组质粒pET-28a-LrCYPA、pET-28a-LrCYPB、pET-28a-LrLUPC、pET-28a-LrLUPD、pET-28a-LrLUPE和pET-28a-LrLUPF转化至Rosetta大肠杆菌表达菌株，经菌落PCR验证后获得大肠杆菌表达菌株。
将1.3中构建成功的重组质粒pESC-URA-LrCYPA-LrCPRG、pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPB-LrCPRG、pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH、pESC-LEU-LrLUPC、pESC-LEU-LrLUPD、pESC-LEU-LrLUPE和pESC-LEU-LrLUPF通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母BY4741感受态中，转化后，将菌液涂布SC平板(缺少相应氨基酸)，置于生化培养箱中培养3-4天(28℃)。菌落PCR验证后获得酿酒酵母表达菌株。
1.5大肠杆菌表达菌株发酵产物SDS-PAGE测定
选择bioshap的SDS-PAGE试剂盒配制蛋白胶：
[1]从LB抗性平板中挑取前期鉴定完成的大肠杆菌单菌落(表达菌株)，接种至5mLLB抗性液体培养基，过夜培养(37℃，220rpm)。
[2]将种子液以2％的接种量接种至LB液体培养基中(含1％葡萄糖)，培养3-4h，达到OD600为0.6。
[3]吸取适量菌液，保存至1.5mL离心管中，剩余下菌液计算体积，加入IPTG(0.5mM)，继续培养4h。
[4]培养完成后，吸取1mL菌液，离心，保留菌体沉淀。
[5]选择PBS重悬菌体，洗涤菌体离心(重复两次)，加入200μL PBS重悬菌体，涡旋混匀。
吸取20μL菌体混合液至1.5mL离心管中，加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸10min，待溶液冷却后，用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况，按表5配制蛋白胶。结果如图6所示，图中M：Marker；2\4：CYP蛋白表达图；6\8\10\12：LUP蛋白表达图。同空白对照组相比，实验组中出现了特异性蛋白条带(图中红色方框内)，CYP酶基因重组蛋白大小分别在55kDa(理论预测值55.6kDa)，LUP酶基因重组质粒载体85kDa(理论预测值86.9kDa)左右，实际值与预测值较为接近。表明重组蛋白在大肠杆菌内成功表达，且蛋白大小和预测值大致相符。
表5：SDS-PAGE蛋白胶配方
成分 8％分离胶(mL) 5％堆积胶(mL)
10％APS 0.05 0.02
蒸馏水 1.7 1.4
1M Tris，pH 6.8 - 0.25
1M Tris，pH 8.8 1.9 -
30％Acr-Bis(29:1) 1.3 0.33
TEMED 0.003 0.002
10％SDS 0.05 0.02
1.6确定莲藕白桦脂酸合成候选基因以及利用酵母表达菌株的发酵来进行功能鉴定
[1]将1.4中构建的携带基因载体的酿酒酵母菌株发酵约3-4天，取10mL菌液于15mL离心管中，加入两倍体积的乙酸乙酯。
[2]上下颠倒混匀后置于超声清洗仪中超声破碎菌株60min，取出静置过夜。
[3]取过夜样品上层有机相于干净的离心管中，用于后期检测，其余样品保存。
[4]样品需要进行衍生化处理，取1mL样品(酿酒酵母菌液发酵样品)于干净的离心管中(10mL)，设置氮吹流速，吹干发酵样品，约40min。
[5]加入MSTFA硅烷化试剂100μL，75-80℃条件下衍生化反应30min，待冷却后加入400μL色谱级乙腈，样品制备完成。
[6]选择毛细管色谱柱型号HP-5MS，安捷伦GC-MS检测器。载气为氦气(1.0mL/min)，温度为250℃，进样量为1μL(不分流模式)，以80℃为起始温度，升温至300℃(20℃/min)，并保持15min。
[7]离子源温度为230℃，电子能量为70eV，对酵母体内功能验证的产物检测采用全扫描模式，扫描范围m/z为50～1000。
[8]收集菌液，加入等体积的乙酸乙酯，超声1h，萃取上层有机相，重复两次收集有机相，用氮吹仪浓缩至体积0.5mL。
[9]采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron液相柱，流动相10％纯水，90％乙腈等梯度洗脱，时间30min，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL，检测标品和反应产物。
利用实施例1中构建的酿酒酵母工程菌株，表达候选基因。根据GC-MS检测结果，具有酶活性的候选基因为pESC-LEU-LrLUPF、pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH，实验结果如图7和图8。将上述质粒共同转化至一株BY4741中，形成pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-LEU-LrLUPF和pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH、pESC-LEU-LrLUPF两种组合菌株，成功实现白桦脂酸在同一株酿酒酵母菌株中从头合成。实验结果如图9所示，其中，Methanol：甲醇空白对照组；AHF：pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-LEU-LrLUPF样品HPLC检测曲线；BHF：pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH、pESC-LEU-LrLUPF样品HPLC检测曲线；Betulinic：白桦脂酸标准品；Luoionl：羽扇豆醇标准品。
实施例2莲藕优化基因克隆及载体构建
2.1莲藕优化基因克隆
选择实施例1中鉴定成功的候选基因，即LrCYP-A、LrCYP-B、LrCPR-H和LrLUP-F，包括来源于百脉根的P450s还原酶基因LjCPR，送至南京金斯瑞生物科技股份有限公司进行碱基适应性优化，采用PrimeX软件设计引物，克隆优化基因。引物设计如表6。
表6：密码子优化基因引物序列表
2.2构建优化基因的酿酒酵母表达载体及双基因载体
重新构建酿酒酵母表达载体pESC-URA和pESC-LEU，且将LjCPR还原酶基因与LrCYPA、LrCYPB连接，构建以下组合的酿酒酵母质粒：pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPA-LjCPR、pESC-URA-LrCYPB-LjCPR及pESC-LEU-LrLUPF
双基因载体构建过程如图12所示。酿酒酵母载体构建方法与步骤同实施例1中1.3。
将构建完成的重组质粒载体进行菌落PCR，挑取阳性菌株进行培养，提取质粒进行双酶切。酶切结果如图13所示，均出现正确条带，表明双基因载体构建成功。
实施例3 BY4741酿酒酵母MVA代谢途径优化及构建优化菌株BY4741G
过表达酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20，将其整合至BY4741基因组HO位点，提高前体供应。图10为HMG1和ERG20基因整合至酿酒酵母基因组HO位点的过程图。
3.1 HMG1和ERG20整合表达框构建
表达框构建的详细步骤如下：
[1]从NCBI官网中下载BY4741酿酒酵母的基因组，进行BY4741基因组分析，选取HO位点并根据基因序列构建整合框。
[2]设计HO的引物，模板为酿酒酵母BY4741基因组，扩增HO，HMG1和ERG20基因。扩增选择连接载体为pMD19-T Simple，获得重组质粒Ts-ERG20，Ts-HO，Ts-HMG1。
[3]设计反向引物，添加XbaI酶切位点RHOF和RHOR，以质粒Ts-HO为模板，反向扩增得到片段HOU-Ts-HOD，凝胶回收后将片段HOU-Ts-HOD纯化。
[4]将HMG1和ERG20基因增加双酶切位点，与载体pESC-URA相连接，设计反向引物，扩增URA-HMG1-ERG20片段，并在两端加上XbaI酶切位点。
[5]将片段HOU-Ts-HOD与片段URA-HMG1-ERG20相连接，形成HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD片段。
[6]以pESC-URA质粒为载体骨架，该质粒为多克隆表达框，质粒命名为pESC-URA3-TADH1-ERG20-PGAL1,10-HMG1-TCYC1。
[7]将重组质粒作为模板，根据设计的引物HOF和HOR，扩增得到携带基因HMG1和ERG20整合框HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD。
图11为片段HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD表达框图谱与扩增电泳图，A：HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD表达框图谱；B：1\2：片段HOU-URA-HMG1-ERG20-HOD扩增电泳图。
3.2 HMG1和ERG20基因整合及菌株BY4741G的构建
以URA基因为筛选标记，以BY4741为主体菌株，将整合框分别转入相应的菌株中(醋酸锂转化法)。涂布MM固体培养基，提取基因组，筛选正确转化子，PCR验证，得到的菌株即为改造成功的BY4741G，其染色体HO位点整合酿酒酵母内源性HMG1和ERG20。
实施例4酿酒酵母发酵条件优化
酿酒酵母菌株生产白桦脂酸发酵条件优化具体操作步骤如下：
将实施例2中得到的基因优化后的各种质粒组合pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH、pESC-URA-LrCYPA-LjCPR、pESC-URA-LrCYPB-LjCPR及pESC-LEU-LrLUPF双质粒载体，转入不同的菌株中，探索发酵条件，通过HPLC检测白桦脂酸的含量。
所用菌株包括BY4741，实施例3构建的BY4741G，以及BY4742(中国科学院天津工业生物技术研究所(TIB)微生物代谢工程实验室赠与的高产鲨烯底盘菌株)。
[1]不同底盘菌株发酵生产白桦脂酸
将实施例2中构建完成的表达载体以pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH+pESC-LEU-LrLUPF(AHF)、pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH+pESC-LEU-LrLUPF(BHF)、pESC-URA-LrCYPA-LjCPR+pESC-LEU-LrLUPF(ALF)、pESC-URA-LrCYPB-LjCPR+pESC-LEU-LrLUPF(BLF)的组合形式分别转化至BY4741、BY4741G、BY4742三种菌株中，经发酵培养后，采用HPLC检测处理过的发酵样品，结果如图14的A所示。
[2]培养基初始pH条件的优化
挑取ALF酿酒酵母单菌落至含30mL YPD的250mL的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养24h作为种子液，控制初始pH分别为4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，取1mL种子液接种至含30mLYPD的250mL的摇瓶进行发酵实验，根据前期分离提取方式检测产量情况。实验结果如图14的B所示。
[3]初始OD600条件优化
挑取ALF酿酒酵母单菌落至含30mL YPD的250mL的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养24h至OD600为0.6作为种子液，分别取0.1mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL和3mL种子液，接种至含30mL YPD的250mL摇瓶中实验。实验结果如图14的C所示。
[4]发酵半乳糖浓度检测
发酵半乳糖浓度条件优化：挑取ALF酿酒酵母单菌落至含30mL YPD的250mL的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养24h至OD600为0.6作为种子液，控制半乳糖浓度为2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，分别取1mL种子液接种至含30mL YPD的250mL的摇瓶中，进行实验。实验结果如图14的D所示。
[5]摇瓶扩大发酵情况检测
综合前三个发酵条件，挑取ALF单菌落至含30mL YPD的250mL摇瓶中，30℃摇床220rpm培养24h作为种子，转接至含30mL、50mL、100mL、150mL、250mL、500mL发酵培养基中进行培养，30℃摇床220rpm培养，吸取样品进行制样检测。实验结果如图14的E所示。
[6]发酵时间条件检测
综合前四个条件，挑取ALF酿酒酵母单菌落至含30mL YPD的250mL的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养24h至OD600为0.6作为种子液，取适宜种子液接种至适当体积中，于30h，40h，50h，60h，70h，80h，90h，100h为时间点取样制备样品，检测产量情况。实验结果如图14的F所示。
HPLC检测结果显示，pH为6，初始OD值为1，半乳糖浓度为6％，培养基体积为250mL时，在BY4742菌株中白桦脂酸生成量达到8.66mg/L，扩大体积培养500mL时，时间在60h时BY4742白桦脂酸含量达到10.65mg/L。
实验表明，通过莲藕转录组的挖掘，得到莲藕羽扇豆醇合酶基因LrLUP、P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA和LrCYPB、P450细胞色素还原酶基因LrCPRH、羽扇豆醇合酶基因LrLUPF，并通过密码子适应性优化、MVA代谢途径改造、发酵条件优化等方法，在酵母中异源表达，实现了白桦脂酸的异源合成，最终产量为10.65mg/L。
本发明获得的莲藕CYP450s和LUP酶基因增加了合成白桦脂酸酶基因的多样性，为后期微生物代谢工程生产白桦脂酸奠定基础。由于酿酒酵母细胞生长快速，易于发酵，并且酿酒酵母的遗传操作有成熟的平台，今后通过代谢工程结合发酵工程技术，有望大幅度提升白桦脂酸的发酵产量，故本发明是一种有工业化前景的白桦脂酸生物合成及基因工程技术。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种合成白桦脂酸的基因组合，包括以下基因片段：
羽扇豆醇合酶基因LrLUPF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA或LrCYPB，LrCYPA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，LrCYPB的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
P450细胞色素还原酶基因LrCPRH或LjCPR，LrCPRH的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，LjCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
2.根据权利要求1所述的合成白桦脂酸的基因组合，其中，所述羽扇豆醇合酶基因LrLUPF、P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA、P450细胞色素氧化酶基因LrCYPB、P450细胞色素还原酶基因LrCPRH来源于莲藕相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得；P450细胞色素还原酶基因LjCPR来源于百脉根相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得。
3.一种合成白桦脂酸的重组质粒组合，含有权利要求1或2所述的基因组合中的基因片段；所述重组质粒为大肠杆菌表达载体和/或酿酒酵母表达载体；优选地，所述大肠杆菌表达载体以pET-28a为原始载体，所述酿酒酵母表达载体以pESC-URA和pESC-LEU为原始载体。
4.根据权利要求3所述的合成白桦脂酸的重组质粒组合，其中，所述重组质粒组合选自以下组合中的至少一种：
(i)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPA-LrCPRH与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合；
(ii)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPA-LjCPR与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合；
(iii)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPB-LrCPRH与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合；
(iv)酵母重组质粒pESC-URA-LrCYPB-LjCPR与酵母重组质粒pESC-LEU-LrLUPF的组合。
5.一种合成白桦脂酸的菌株，其中含有权利要求3或4所述的重组质粒组合。
6.根据权利要求5所述的菌株，其中，所述菌株为大肠杆菌或酿酒酵母，所述大肠杆菌为BL21(DE3)，所述酿酒酵母菌株为BY4741、MVA代谢途径改造的BY4741或BY4742。
7.根据权利要求6所述的菌株，其中，所述MVA代谢途径改造的BY4741的基因组HO位点中整合有酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20。
8.根据权利要求7所述的菌株，其中，构建所述MVA代谢途径改造的BY4741的方法包括：过表达酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20，将其整合至BY4741基因组HO位点，以提高白桦脂酸合成前体供应。
9.一种异源生物合成白桦脂酸的方法，包括：将权利要求5-8中任意一项所述的菌株进行发酵培养，合成得到白桦脂酸。
10.根据权利要求9所述的异源生物合成白桦脂酸的方法，其中，所述发酵培养的条件包括：培养基初始pH为5.8-6.2，初始OD600值为0.8-1.2，发酵半乳糖浓度为5.5-6.5％，扩大发酵培养基体积为150-500mL，发酵时间为55-65h。
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