CN113265381B

CN113265381B - 一种分离的cyp450蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN113265381B
Application number: CN202110423318.0A
Authority: CN
Inventors: 高伟; 王家典; 苏平
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-04-20
Also published as: CN113265381A

Abstract

本发明涉及一种雷公藤细胞色素p450氧化酶CYP81AM1，以及该酶在合成松香烷型二萜类化合物中的应用。所述酶具有催化脱氢松香酸进一步氧化生成15‑羟基脱氢松香酸的生物学功能。本发明还涉及所述酶的编码基因、包含所述基因表达载体及工程菌，本发明推动了雷公藤甲素生物合成途径全解析，对雷公藤甲素等二萜化合物的合成调控具有重要的意义。

Description

一种分离的CYP450蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种分离的蛋白，即雷公藤细胞色素p450氧化酶CYP81AM1，以及编码所述酶的多核苷酸，所述酶可用于二萜类化合物(松香烷型二萜类化合物，如催化15-羟基脱氢松香酸生物合成)的生物合成，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是卫矛科雷公藤属多年生藤本植物，具有良好的杀虫活性，在抗炎、抗肿瘤和免疫抑制等方面广泛应用。萜类成分是雷公藤的主要活性成分，其中松香烷型二萜类化合物雷公藤甲素被公认为雷公藤中最主要活性成分之一，多个雷公藤甲素衍生物已进入临床研究阶段。从中药的活性成分中开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢且药用成分含量很低，大大限制了其应用。近年来利用合成生物学技术设计和改造微生物菌株来生产天然活性产物已经成为一种极具潜力的获取方法。

萜类化合物在高等植物中的合成途径主要有两种，位于细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径和位于质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径,通过以上两个途径生成萜类的共同前体异戊烯基焦磷酸(IPP)及其同分异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)；在异戊烯转移酶的催化下，3个IPP分子与1个DMAPP分子发生首尾相连，生成GGPP前体，再由二萜合酶(Diterpene synthase)催化形成二萜烯中间体母核结构(Su P.*,Gao L.H.*,LiuS.,et al.Probing the function of protein farnesyltransferase in Tripterygiumwilfordii [J].Plant Cell Reports,2019,38(2):211-220)，然后母核在CYP450酶、转移酶等后修饰酶的作用下生成复杂多样的二萜类活性化合物。

细胞色素P450(cytochrome P450,简称P450)是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶。植物细胞色素P450具有广泛的催化活性，在植物体内催化多种初级和次级代谢反应，被人们称为“万能的生物催化剂”。在真核生物中，P450酶往往是通过N-端的疏水序列或者疏水环与线粒体内膜或内质网膜结合，因此很难分离纯化，其次由于P450蛋白质种类的多样性和底物催化的专一性，导致只有极少数的CYP450基因功能被鉴定。

苏平等人成功鉴定了雷公藤甲素生物合成途径首个CYP450基因(CYP728B70)，体外酶促研究证实其具备连续两步氧化雷公藤甲素二萜烯阿松香三烯形成脱氢松香酸的生物学功能 (TuL,SuP,et al.Genome of Tripterygium wilfordii and identificationof cytochrome P450 involved in triptolide biosynthesis.[J].NatureCommunications,2020.)。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种分离的蛋白，所述蛋白参与二萜类化合物的生物合成，尤其是松香烷型二萜类化合物，如15-羟基脱氢松香酸。

本发明中，所述分离的蛋白，是一种细胞色素p450氧化酶(或称为雷公藤细胞色素p450 氧化酶，以下可用CYP81AM1表示)，为一种参与雷公藤二萜类化合物的生物合成，尤其是雷公藤甲素生物合成的关键酶，所述酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或SEQ IDNO： 2所示氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸其功能相同的肽。

可以在CYP81AM1酶中进行氨基酸序列改变以便最少破坏对生物学活性必须的高级结构。例如，当CYP81AM1酶包含一个或多个螺旋时，将改变氨基酸残基以便不破坏螺旋的几何学和其中的构象改变将使一些关键功能(例如分子与其结合伙伴的结合)减弱的其它分子成分。氨基酸序列改变的效果可以通过例如以上公开的计算机模拟进行预测，或通过晶体结构分析进行测定(见例如Lapthorn等，Nat.Struct.Biol.2:266-268，1995)。本领域熟知的其它技术对改变蛋白和标准分子(例如天然蛋白)的折叠进行比较，例如，可以比较变体和标准分子中的半胱氨酸分布情况。质谱和使用还原和烷基化的化学修饰为测定与二硫键相关的或未形成这些键的半胱氨酸残基提供了方法(Bean等，Anal.Biochem.201:216-266, 1992；Gray，Protein Sci.2:1732-1748,1993；和Patterson等，Anal.Chem.66:3727-3732， 1994)。一般认为如果修饰的分子与标准分子具有不相同的半胱氨酸分布情况，则折叠受到影响。另一个用于测量这点的被接受的熟知方法是园二色谱(CD)。测量和比较修饰分子和标准分子产生的CD谱是常规的(Johnson,Proteins 7:205-214,1990)。晶体学是另一个分析折叠和结构的熟知方法，核磁共振(NMR)、消化肽作图和表位作图也是分析折叠及蛋白质和多肽之间的结构相似性的已知方法(Schaanan等，Science 257:961-964,1992)。

本发明中，CYP81AM1酶的变异体形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与CYP81AM1酶编码基因杂交的DNA 所编码的蛋白。

典型的突变情况，包括对CYP81AM1酶的第104位的Phe突变为Ala，或第107位的Lys突变为Ala，或第221位Ser突变为Ala，或第316位Thr突变为Ala，或378位Pro突变为 Ala，或第39位Met突变为Ala，或第380位Pro突变为Ala，或第381位Leu突变为Ala，或第382位Pro突变为Ala。

本发明的第二方面，提供了一种编码本发明所述酶的多核苷酸(或称雷公藤细胞色素p450 氧化酶编码基因，以下可用CYP81AM1表示)，所述多核苷酸优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列指位于SEQ ID NO：1序列核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与 SEQ ID NO：1核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：2所述酶的氨基酸序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸115-2406位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的雷公藤三萜合酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明的第三方面，提供了一种包含本发明第二方面所述多核苷酸的表达载体，所述的表达载体，如可以是选自pESC系列的表达载体。

本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在生产本发明CYP81AM1酶时，可以将CYP81AM1酶编码基因的核苷酸序列可操作地连接于表达调控序列，从而形成雷公藤三萜合酶表达载体。所述“可操作地连连接”当指DNA区段时表示这些区段按照一定方式排列以致它们可以协调地为其预期的目的发挥作用，例如在启动子中起始转录并前行通过编码区段到达终止子。也指这样一种状况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分活性，例如，如果信号肽DNA作为前提表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连接接于多肽DNA；如果启动子控制序列转录，那么它是可操作地连接于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连接”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明第四方面，提供了一种包含本发明第二方面所述多核苷酸、或本发明第三方面所述表达载体的重组宿主菌，所述宿主菌为酵母菌，如BY系酵母菌，WAT系酵母菌。

本发明述宿主菌，包含本发明所述编码CYP81AM1酶或其变体的多核苷酸分子，或在严谨条件下可与所述多核苷酸分子进行杂交的核苷酸分子，或包含本发明上述描述的表达载体。所述的宿主细胞选自：细菌、原核细胞(如大肠杆菌、)真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞，优选地，为酵母细胞或植物细胞。

特别有意义的酵母包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和Pichia methanolica。用外源DNA转化酿酒酵母细胞和从其中制备重组多肽的方法公开在例如Kawassaki，美国专利US4599311， US4931373、US4870008、US5037743、US4845075等中。通过选择标记所确定的表型，通常是药物抗性或在缺少特定养分(例如亮氨酸)时的生长能力，选择转化细胞。用于酿酒酵母的优选载体系统如可以是pESC系列表达载体。用于酵母的适宜启动子和终止子包括来自糖酵解基因(US4599311、US4615974和US4977092)和醇脱氢酶的那些。用于其它酵母，包括多形汉逊氏酵母、乳克鲁维氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、巴斯德毕赤酵母、PichiaMethanolica、季也蒙氏毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母的转化系统也是本领域已知的。

根据常规方法在含有养分和其它对于所选宿主细胞的生长必须的成分的培养基中培养转化的或转染的宿主细胞。多种适宜的培养基，包括已知成分培养基和复杂培养基，是本领域已知的，一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基还可以含有诸如生长因子或血清这样的成分。生长培养基一般通过例如药物筛选或缺少可由表达载体携带的或共转染至宿主细胞中的选择标记补充的必需养分来选择含有外源添加DNA的细胞。通过常规方式，如振摇小三角瓶或发酵罐喷气给液体培养物提供充足的空气。

本发明编码CYP81AM1酶的多核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法制备cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变体引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等，Solid-Phase Pedtide Synthesis,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154,1963)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明将克隆得到的CYP81AM1基因构建表达载体，经催化实验证实其具有催化脱氢松香酸进一步氧化生成15羟基脱氢松香酸的生物学功能。

因此，本发明的第五方面，提供了CYP81AM1，或CYP81AM1编码基因CYP81AM1、或包含所述编码基因CYP81AM1的表达载体、以及包含所述表达载体的宿主菌，在调节和/ 或合成二萜类化合物中的应用。

本发明中，所述的二萜类化合物优选为松香烷型二萜类化合物，如15-羟基脱氢松香酸或雷公藤甲素等。

本发明的第六方面，提供了一种组合物，所述组合物包含本发明第一方面所述的酶，以及选自其他细胞色素P450酶系的其它参与二萜类生物表达的酶，或其它二萜类化合物合成酶，如次丹参酮二烯合酶，丹参二萜合酶或雷公藤二萜合酶。所述雷公藤二萜合酶可以是TwCPS (如TwCPS1、TWCPS2、TWCPS3、TWCPS4)、TwMS、TwGES

本发明中，还可将CYP81AM1或其基因CYP81AM1与其它P450酶、雷公藤二萜合酶、次丹参酮二烯合酶或其基因联合使用，使用的方式，如可以是先后使用，也可以是同时使用，比如使用CYP81AM1和雷公藤二萜合酶组混合，以底物喂养的方式合成雷公藤二萜类化合物；也可以将基因CYP81AM1和雷公藤二萜合酶编码基因，同时插入到一个表达载体中，然后再导入到宿主菌中，以生物发酵表达的方式，生产目标产物雷公藤二萜类化合物。

还可以通过如下方式制备本发明所述松香烷型二萜类化合物，即采用生物合成方法，所述方法包括：将CYP81AM1的编码基因CYP81AM1导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到松香烷型二萜类化合物，所述酿酒酵母如为WAT11酵母。

本发明提供的松香烷型二萜类化合物的生物合成方法：如可以是利用“模块化酵母染色体整合技术”(Li S,et al.Development of a modularized two-step(M2S)chromosome integration technique for integration of multiple transcriptionunits in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnol Biofuels,2016,9:232.)将雷公藤CYP81AM1 基因表达盒整合到酵母菌中，通过酵母发酵生产15-羟基脱氢松香酸。本发明对于培育高品质的药用植物品种特别是培育具有高雷公藤甲素含量的雷公藤品种具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为雷公藤二萜类成分雷公藤甲素及其相关15位羟化衍生物的生物合成途径。

图2为雷公藤不同组织部位CYP81AM1基因的表达水平分析图。

图3为CYP81AM1催化产物15-羟基脱氢松香酸的GC-MS结果分析图。

图4丙氨酸突变后CYP81AM1产物含量变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.f.)悬浮细胞在文献“王家典,赵瑜君,张逸风,et al.TwHMGR过表达对雷公藤甲素和雷公藤红素生物合成的影响[J].药学学报,2018,v.53(08):37-44.”中公开过，公众可从首都医科大学分子生药与中药资源实验室获得。

下述实施例中的Gene JET Gel Extraction Kit试剂盒，E.Z.N.ATM plasmidmini kit I 试剂盒，pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit试剂盒，2×EasyTaq PCR SuperMix 试剂盒，EasyPure Genomic DNA Kit试剂盒，pEASY-BluntZerocloning vector试剂盒， 6×DNAloading buffer是北京全式金生物技术有限公司的产品；Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer和各种核酸内切酶均购自美国NEB公司；植物总RNA提取试剂盒购自上海普洛麦格生物产品有限公司；FastQuantcDNA第一链合成试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒，Sc-leu固体培养基购自北京新跃时代公司。

脱氢松香酸(Dehydroabietic acid)是云南西力生物公司产品，CAS号为1740-19-8； 15-羟基脱氢松香酸(15-Hydroxydehydroabietic acid)是云南西力生物公司产品，CAS号为54113-95-0。

WAT11菌株购买于北京新跃时代公司；pESC-Leu质粒购自北京华越洋生物，该载体通过BamHI单酶切后连接雷公藤TwCPR3基因，命名为pESC-Leu：：TwCPR3，保存于首都医科大学中药资源学与分子生药学实验室，具体构建方法见参考文献(Tu L,Su P,Zhang Z,etal. Genome of Tripterygium wilfordii and identification of cytochrome P450involved in triptolide biosynthesis[J].Nature Communications,2020,11(1).)。

实施例1、雷公藤CYP81AM1全长cDNA序列的克隆

1.雷公藤悬浮细胞总RNA提取及cDNA第一链的获得

使用植物总RNA提取试剂盒,按照说明书进行雷公藤悬浮细胞的总RNA提取。使用Fast QuantcDNA第一链合成试剂盒,按说明书将总RNA反转为cDNA。

2.引物设计

根据雷公藤转录组数据注释筛选得到基因ORF序列片段，设计CYP81AM1-F和CYP81AM1-R引物，引物序列如下：

CYP81AM1-F：ATGGAAACCCTTCACTACTTG(SEQ ID NO：3)

CYP81AM1-R：TCATAGGTGGGAAAGTGCAGC(SEQ ID NO：4)

3.PCR扩增

DNA聚合酶采用高保真DNA聚合酶(Phusion High-Fidelity PCR Master Mix)。

以步骤1获得的cDNA为模板，以CYP81AM1-F和CYP81AM1-R为，采用PhusionDNA高保真酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃ 10s，60℃ 15s，72℃ 2min，35个循环；72℃延伸5min。

取PCR产物与6×DNAloading buffer预混合，在1.5％琼脂糖凝胶上以低电压(约5Vcm-1) 电泳30-60min；用解剖刀或剃刀片切割含有DNA片段的凝胶，尽可能的靠近DNA片段切割，以减小凝胶的含量，将胶片放在事先称重的1.5mL离心管并称重。将凝胶按照GeneJET Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书操作回收。

4.克隆载体链接

使用pEASY-BluntZero cloning vector试剂盒，按照说明书将全长克隆得到的胶回收产物与克隆载体连接，转化至DH5α感受态细胞中，培养、鉴定阳性克隆并测序。

测序结果表明：PCR扩增产物的序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为CYP81AM1，其编码由499个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为CYP81AM1，该蛋白的氨基酸序列为序列2。该克隆载体命名为pEASY-Blunt-CYP81AM1质粒，存于-80冰箱。

实施例2、CYP81AM1基因组织表达分析

1.实验材料的处理

雷公藤根、茎、叶、花采自于福建永安国有林场五个不同植株。样品取回实验室清洗，液氮速冻后保存于负80冰箱。

2.总RNA的提取及RNA-seq法测定基因表达量

将存于负80冰箱的根、茎、叶、花在液氮环境下粉碎，采用改良CTAB法(CTABBuffer: 2％CTAB(W/V)；100mmol·L^-1Tris-HCl(pH 8.0)；25mmol·L^-1EDTA；2.0mol·L^- ¹NaCl； 0.5g·L^-1亚精胺)提取雷公藤不同组织部位的RNA，根据转录组测序，获得基因组表达量 RPMK值用来表示基因表达量。

结果如图2所示，CYP81AM1基因相对表达水平最高的是在去皮茎中，其次是根的木质部和韧皮部，然后是花，CYP81AM1基因相对表达量最低在根皮中。

实施例3、雷公藤TwCYP450生物学功能研究

1.真核表达载体构建

(1)线性化空载体制备：采用NEB公司限制性内切酶NotI对实验室留存的pESC-LEU：： TwCPR3空载体进行单酶切，切胶回收酶切产物；

(2)PCR产物(目的基因)的制备：以含有雷公藤CYP81AM1基因全长cDNA的载体pEASY-Blunt-CYP81AM1质粒为模板，在引物5’端加15-25bp载体同源臂序列(下划线部分)，采用PhusionDNA高保真酶进行PCR扩增基因编码区。PCR程序：98℃30s，1循环；98℃ 10s，60℃10s，72℃2min 30s，35循环；72℃5min；4℃维持。

CYP81AM1-leuNotI-F:CCCTCACTAAAGGGCGATGGAAACCCTTCAC(SEQ ID NO:5)

CYP81AM1-leuNotI-R:CCATCGATACTAGTGCTCATAGGTGGGAAAG(SEQ ID NO：6)

(3)胶回收线性载体及片段:取PCR产物与6×DNAloading buffer预混合，在1.5％琼脂糖凝胶上以低电压(约5Vcm^-1)电泳30-60min；用解剖刀或剃刀片切割含有DNA片段的凝胶，尽可能的靠近DNA片段切割，以减小凝胶的含量，将胶片放在事先称重的1.5mL离心管并称重。将凝胶按照Gene JET Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书操作回收。

(4)表达载体连接：

使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit试剂盒，按照说明书将线性化载体与 PCR产物的轻轻混合，50℃，20min反应，体系如下：

线性化空载体与目的基因片段的摩尔比为1:2，其中线性化空载体0.01-0.02pmols， pmols＝ng/(片段长度bp×0.65kDa)；

连接产物经转化、阳性克隆的初步筛选，送样测序鉴定，得到经测序核苷酸序列无突变重组质粒pESC-Leu：TwCPR3+CYP81AM1。

2.制备微粒体

(1)酵母感受态的制备：将实验室留存的WAT11甘油菌划在YPD固体培养基上，30℃暗培养两天。挑取单菌落在20mL YPD培养基里30℃，250rpm培养至OD600达0.8-1.0，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒按照说明书制备酵母感受态细胞。

(2)发酵流程：空载转化的酵母菌作为对照，挑取单菌落于5mL Sc-leu液体培养基30℃， 250rpm培养过夜，用于菌液PCR验证。将含有目的条带的菌保存为甘油菌，并取20uL菌液在50mL新的Sc-leu液体培养基30℃，250rpm培养2d，换为等体积Sc-leu诱导培养基(含2％半乳糖)，30℃，220rpm诱导培养12h。

(3)微粒体提取：诱导菌液于低温离心机中，2000g离心5min，弃上清，用20mL TEK溶液(包含50mM Tris-HCl,pH 7.4,1mM EDTA,0.1M KCl)重悬沉淀后，室温静置5min；重悬液再次2000g低温离心5min，弃上清，用50mL预冷的TESB溶液(包含50mM Tris-HCl,pH 7.4,1mM EDTA,0.6M sorbitol)重悬沉淀后，冰上静置10min；重悬液使用均质机，12000psi低温破碎7min后，12000g，低温离心15min后取上清；向上清液中加入氯化钠(终浓度0.15mM)和PEG-4000(终浓度0.1g mL-1)，冰中静置15min；上述溶液12000 g低温离心20min，弃上清，用2-4mL预冷的TEG溶液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,1mM EDTA,20％(v/v)glycerol)，溶解后得到的微粒体可于-80℃保存数月

3.酶促反应

根据参考文献报道(Guo J,Zhou YJ,Maet al.,CYP76AH1 catalyzes turnoverof miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologousproduction of ferruginol in yeasts[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(29):12108-12113.)，使用的微粒体酶促体系如下：

上述体系振荡混匀，30℃100rpm诱导培养3h。

4.产物GC-MS检测

酶促反应体系用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，氮气吹干后，加入100μL甲醇混匀后，再加入150μL重氮甲烷衍生化，室温静置10min后，氮气吹干，用100μL乙酸乙酯复溶后进GC-MS检测。GC-MS条件：进样量1uL，50℃保持1min，50℃·min-1升至260℃； 1℃·min-1升至272℃，保持4min。进样口温度250℃，离子源温度230℃，电子能量70ev，对样品进行10-550m/z范围扫描。GC-MS仪器为Agilent Technologies公司Agilent 7890B gaschromatograph，色谱柱为DB-5ms(15m×250um×0.1um)。

5.定点突变

除突变位点外，两条引物长度大约25-30bp，5’端重叠区包含15-20bp，3’端延伸区包含至少10bp；突变位点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区，反向突变引物5’端根据以上原则设计定点突变引物。根据分子对接的结果，将活性口袋周围的氨基酸位点突变为结构简单的甘氨酸，以考察该位点对酶活性的影响。设计引物如下：

(2)突变体发酵

将突变体及原始质粒pESC-Leu：：TwCPR3+CYP81AM1作为野生型对照转化进入的WAT11酵母感受态，涂SC-Leu固体平板后，30℃生长两天后，挑取单菌落于5mL Sc-leu液体培养基30℃，250rpm培养2d，测定菌液OD值，并计算加入相应体积的菌液于50mL含2％葡萄糖的Sc-leu液体培养基(保证菌液初始OD值为0.05)30℃，250rpm继续培养2d 后，更换等体积Sc-leu诱导培养基(含2％半乳糖)，30℃，220rpm诱导培养12h，加入用甲醇溶解的底物脱氢松香酸，计算相应体积，保证底物终浓度为50mM，30℃，120rpm培养2d。

(3)突变后产物含量检测

将菌液用等体积乙酸乙酯超声萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发去除溶剂后，加入100μL 甲醇混匀后，再加入150μL重氮甲烷衍生化，室温静置10min后，氮气吹干，用100μL乙酸乙酯复溶后进GC-MS检测。GC-MS条件同实施例3。

(4)标准曲线的配制及定量

以甲醇为溶剂，配制产物15-羟基脱氢松香酸的系列标准曲线(浓度分别设置为0.78125， 1.5625，3.125，6.25，12.5，25，50，100μg/mL)，将各个突变体的产物以此标准曲线进行定量分析，其结果如图4所示，突变后的酶具有将脱氢松香酸氧化为15-羟基脱氢松香酸的作用。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 首都医科大学

<120> 一种分离的CPY450蛋白及其编码基因与应用

<130> TQZX2021-ZL0116

<141> 2021-04-19

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 雷公藤(Tripterygium wilfordii)

<400> 1

atggaaaccc ttcactactt gggtctctta ctctcttttg ttattgtcac ctacaaactg 60

ctcttccaaa acaagaatgg taagcagtac aagaacctcc ctccgagccc tcccggtgca 120

cttcccataa taggccattt tctcactttg aagaaacccg tccacgaggg tttatacaat 180

ctctgcacca aatatgggcc tatactctat ctccgattag gtccacgacc ggctcttgtc 240

gtcggtagcc atgaggtcat cgaggaatgc ctgaccaagc atgacctcaa ttttgccaca 300

cgtcccatct ttctctccaa aaagcttgtc acctacgact tcaccaccct cggttacacc 360

ccctacggcc agcactggcg caatctccgc cgcctcacca ccctcgaaat attgtctaat 420

actcgtatgc agatgacttc ctatatccgg gtggaggagg tccggaagct taccaagaat 480

ctgtatgata acttcctcaa agcgggtgtt tcaaaggcca acatgaagtc tttcttttac 540

atgttcacgt ttaatactgt gataaagatg ctatcagggg agagatattt tggtgaggat 600

gacatgggtt ctgcgaaagg gaaggctaga ttggaggatc taatgaagat attctgttcg 660

agtgagggca tcaacttgag tgatttcttc ccaatgttga ggtggttgcc gttttacaga 720

gtggagaaga aaatgatgaa agaccacaaa aagagggatg ctttcttgca gggattcgtt 780

gaggatcaaa ggaagatgag agcagctaat cctaatcggg tcactgttaa ggacaagaga 840

ccaatcatcg atgtcttgtt gtcgttgcaa gaaacagatc ctgaattctg caccgacgag 900

gtcatcaagg ggattatact ggtaatgtta acggcaggaa cagacacgac agctcaggca 960

gcaacgtacg cagcgcaaga tctggtagct catccagagt gcttaaagaa ggcaagggaa 1020

gagatcgact ctgttgtcgg aacatctcgt ctcatcgaag acgcggatct taacaaactc 1080

ccatacctaa actgcttggt gaacgagtca cttagattgg gccccgcagc tccgatgcca 1140

ctcccacatc tcaacatgga ggattgcaca gtcggaggct acgacgttcc taaaggcacc 1200

atgttatttg tgaacatatg ggctttgcac agagatccta gtctgtggga ggacccttac 1260

gccttcaagc cagagagatt ccttggatac gaaggtgatc agaaagcagg gctaaagttt 1320

ataccatttg gagcaggaag aagacagtgc ccaggcatca ctatggggac aagagtcatg 1380

gccatcgctt tggggacact tatccagtgc ttcgattggg aaaagccaca aggagaatac 1440

gccaacgaaa ttatattcac tcctcgtcag cctctcaccg ctgcactttc ccacctatga 1500

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> 雷公藤(Tripterygium wilfordii)

<400> 2

Met Glu Thr Leu His Tyr Leu Gly Leu Leu Leu Ser Phe Val Ile Val

1 5 10 15

Thr Tyr Lys Leu Leu Phe Gln Asn Lys Asn Gly Lys Gln Tyr Lys Asn

20 25 30

Leu Pro Pro Ser Pro Pro Gly Ala Leu Pro Ile Ile Gly His Phe Leu

35 40 45

Thr Leu Lys Lys Pro Val His Glu Gly Leu Tyr Asn Leu Cys Thr Lys

50 55 60

Tyr Gly Pro Ile Leu Tyr Leu Arg Leu Gly Pro Arg Pro Ala Leu Val

65 70 75 80

Val Gly Ser His Glu Val Ile Glu Glu Cys Leu Thr Lys His Asp Leu

85 90 95

Asn Phe Ala Thr Arg Pro Ile Phe Leu Ser Lys Lys Leu Val Thr Tyr

100 105 110

Asp Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Thr Pro Tyr Gly Gln His Trp Arg Asn

115 120 125

Leu Arg Arg Leu Thr Thr Leu Glu Ile Leu Ser Asn Thr Arg Met Gln

130 135 140

Met Thr Ser Tyr Ile Arg Val Glu Glu Val Arg Lys Leu Thr Lys Asn

145 150 155 160

Leu Tyr Asp Asn Phe Leu Lys Ala Gly Val Ser Lys Ala Asn Met Lys

165 170 175

Ser Phe Phe Tyr Met Phe Thr Phe Asn Thr Val Ile Lys Met Leu Ser

180 185 190

Gly Glu Arg Tyr Phe Gly Glu Asp Asp Met Gly Ser Ala Lys Gly Lys

195 200 205

Ala Arg Leu Glu Asp Leu Met Lys Ile Phe Cys Ser Ser Glu Gly Ile

210 215 220

Asn Leu Ser Asp Phe Phe Pro Met Leu Arg Trp Leu Pro Phe Tyr Arg

225 230 235 240

Val Glu Lys Lys Met Met Lys Asp His Lys Lys Arg Asp Ala Phe Leu

245 250 255

Gln Gly Phe Val Glu Asp Gln Arg Lys Met Arg Ala Ala Asn Pro Asn

260 265 270

Arg Val Thr Val Lys Asp Lys Arg Pro Ile Ile Asp Val Leu Leu Ser

275 280 285

Leu Gln Glu Thr Asp Pro Glu Phe Cys Thr Asp Glu Val Ile Lys Gly

290 295 300

Ile Ile Leu Val Met Leu Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Gln Ala

305 310 315 320

Ala Thr Tyr Ala Ala Gln Asp Leu Val Ala His Pro Glu Cys Leu Lys

325 330 335

Lys Ala Arg Glu Glu Ile Asp Ser Val Val Gly Thr Ser Arg Leu Ile

340 345 350

Glu Asp Ala Asp Leu Asn Lys Leu Pro Tyr Leu Asn Cys Leu Val Asn

355 360 365

Glu Ser Leu Arg Leu Gly Pro Ala Ala Pro Met Pro Leu Pro His Leu

370 375 380

Asn Met Glu Asp Cys Thr Val Gly Gly Tyr Asp Val Pro Lys Gly Thr

385 390 395 400

Met Leu Phe Val Asn Ile Trp Ala Leu His Arg Asp Pro Ser Leu Trp

405 410 415

Glu Asp Pro Tyr Ala Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Gly Tyr Glu Gly

420 425 430

Asp Gln Lys Ala Gly Leu Lys Phe Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg

435 440 445

Gln Cys Pro Gly Ile Thr Met Gly Thr Arg Val Met Ala Ile Ala Leu

450 455 460

Gly Thr Leu Ile Gln Cys Phe Asp Trp Glu Lys Pro Gln Gly Glu Tyr

465 470 475 480

Ala Asn Glu Ile Ile Phe Thr Pro Arg Gln Pro Leu Thr Ala Ala Leu

485 490 495

Ser His Leu

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

Claims

1.分离的蛋白在催化脱氢松香酸生成15-羟基脱氢松香酸中的应用，所述蛋白氨基酸序列为：SEQ ID NO：2第221位Ser突变为Ala。

2.编码权利要求1所述的分离的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸可用于催化脱氢松香酸生成15-羟基脱氢松香酸。

3.包含权利要求2所述多核苷酸的表达载体，其包含启动子和转录终止子，其中所述启动子与所述多核苷酸可操作地连接，并且所述多核苷酸与所述转录终止子可操作地连接，所述表达载体可用于催化脱氢松香酸生成15-羟基脱氢松香酸。

4.重组宿主菌，其包含权利要求2所述多核苷酸分子、或权利要求3所述表达载体，所述宿主菌为酵母菌，所述酵母菌可用于催化脱氢松香酸生成15-羟基脱氢松香酸。

5.根据权利要求4所述的宿主菌，其中所述酵母菌为BY系酵母菌或WAT系酵母菌。