CN113528567B - Fba8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用 - Google Patents

Fba8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及FBA8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了FBA8蛋白或氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用，所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明通过将拟南芥野生型Col‑0用过表达载体进行转基因得到转基因植株，转基因植株的花序轴的横截面积和维管束数目得到改变。

Description

FBA8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或 花序轴横截面积中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及FBA8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用。
背景技术
FBA8(AT3G52930)是拟南芥中的一种果糖-1,6-二磷酸醛缩酶，是糖酵解过程中的关键酶。FBA8可以将果糖-1,6-二磷酸分解成磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸。
1924年，德国生理学家Warburg发现癌细胞相比其它的邻近组织，会通过糖酵解途径消耗大量的葡萄糖，该效应也被称为Warburg效应(On the origin of cancer cells，Warburg O，1956，Science，123(3191):309-314)。实际上，正在增殖的动物细胞中普遍存在增强的糖酵解现象。干细胞在产生新的子代细胞时，需要复制所有的细胞内容物，包括DNA，RNA，氨基酸和脂质等。因此，对于正在增殖的细胞，能量(ATP)、还原力(NADH/NADPH) 和基本生物合成原件(甘油醛-3-磷酸、甘油酸-3-磷酸等)是必不可少的。而糖酵解恰恰是产生ATP、NADH/NADPH、甘油醛-3-磷酸等物质的重要生物学过程。因此，糖酵解过程对于干细胞的生长发育至关重要。在拟南芥中，相比与其它四个细胞质同源蛋白，FBA8是表达丰度最高的一个醛缩酶，但 FBA8对于拟南芥维管束的生长发育有何影响，并没有被报道。
发明内容
本发明的目的在于提供FBA8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用。本发明通过将拟南芥野生型Col-0用过表达载体进行转基因得到转基因植株，转基因植株的花序轴的横截面积和维管束数目得到改变。
本发明提供了FBA8蛋白或氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用，所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的是，所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由 FBA8蛋白衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了过表达FBA8蛋白或沉默编码FBA8蛋白的基因在促进植物维管束分裂和/或缩小花序轴横截面积中的应用。
本发明还提供了过表达氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质在促进植物维管束分裂和/或增加花序轴横截面积中的应用，所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的是，所述植物包括拟南芥。
本发明还提供了一种由FBA8蛋白衍生的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
本发明还提供了编码上述技术方案所述由FBA8蛋白衍生的蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了制备上述技术方案所述基因用引物组，包括T35D上游引物、T35D下游引物、S266D上游引物、S266D下游引物、S303D上游引物和S303D下游引物，所述T35D上游引物、T35D下游引物、S266D上游引物、S266D下游引物、S303D上游引物和S303D下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了含上述技术方案所述基因的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述基因和骨架载体。
优选的是，所述骨架载体包括pET41b或pBI121。
本发明提供了FBA8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和 /或花序轴横截面积中的应用。本发明通过将拟南芥野生型Col-0用过表达载体进行转基因得到转基因植株，转基因植株的花序轴的横截面积和维管束数目得到改变。试验结果表明，过表达FBA8的转基因植株或者不表达FBA8 的突变体植物维管束数量增多，且花序轴横截面积缩小；过表达由FBA8衍生的FBA8M能够显著增加植物维管束数量，且增大花序轴横截面积。
附图说明
图1为本发明提供的各组维管束状态图；
图2为本发明提供的维管束数量统计图；
图3为本发明提供的花序轴横截面积统计图。
具体实施方式
本发明提供了FBA8蛋白或氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用，所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8 蛋白衍生的蛋白质的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.3所示，后文简称 FBA8M。在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。
本发明还提供了过表达FBA8蛋白或沉默编码FBA8蛋白的基因在促进植物维管束分裂和/或缩小花序轴横截面积中的应用。野生型Col-0过表达 FBA8的转基因植株以及不表达FBA8的突变体植株会出现维管束分裂的表型，但相比野生型其花序轴茎显著变细。在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。
本发明还提供了过表达氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质在促进植物维管束分裂和/或增加花序轴横截面积中的应用，所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。野生型Col-0 过表达FBA8M的转基因植株同样会出现维管束分裂的表型，但相比野生型其花序轴茎显著变粗。在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。
本发明还提供了一种由FBA8蛋白衍生的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。本发明由FBA8蛋白衍生的蛋白质是在FBA8氨基酸序列的基础上，进行T35D，S266D，S303D三处点突变得到的。突变后的蛋白能够显著促进植物维管束分裂和/或增加花序轴横截面积。
本发明还提供了编码上述技术方案所述由FBA8蛋白衍生的蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了制备上述技术方案所述基因用引物组，包括T35D上游引物、T35D下游引物、S266D上游引物、S266D下游引物、S303D上游引物和S303D下游引物，所述T35D上游引物、T35D下游引物、S266D上游引物、S266D下游引物、S303D上游引物和S303D下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了含上述技术方案所述基因的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述基因和骨架载体。在本发明中，所述骨架载体包括pET41b或pBI121。
具体的，本发明以拟南芥野生型Col-0花序轴茎的cDNA为模板，通过 PCR扩增FBA8基因，以表达载体pET41b为骨架，与FBA8基因进行同源重组，构建表达载体pET41b-FBA8-His。本发明以表达载体pET41b-FBA8-His 为模板，将FBA8基因对应氨基酸序列的三个位点(T35D，S266D，S303D) 进行点突变修饰，得到含修饰基因FBA8M的表达载体pET41b-FBA8M-His。本发明以表达载体pET41b-FBA8M-His为模板，通过PCR扩增FBA8M基因，以pBI121为骨架，与FBA8M基因进行同源重组，构建过表达载体 pBI121-FBA8M。本发明将拟南芥野生型Col-0用过表达载体pBI121-FBA8M进行转基因，经过卡那霉素筛选得到转基因植株。本发明转基因植株在花序轴的表型(横截面积和维管束数目)均显著优于野生型植株。
下面结合具体实施例对本发明所述的FBA8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
FBA8基因的克隆
1、拟南芥材料的获取
拟南芥培养在温度23℃，湿度50％，光周期16小时光/8小时暗的培养室。
2、拟南芥花序轴茎RNA的提取及反转录成cDNA
当植物高度接近20厘米，截取没有花的花序轴茎。将材料用液氮研碎后，用RNA提取试剂盒(艾德莱公司植物RNA快速提取试剂盒 RN38-EASYspin Plus)提取总RNA。利用反转录试剂盒(艾德莱公司第一链反转录试剂盒PC18-TRUEscript 1st Strand cDNASynthesis Kit)将提取的总RNA反转录成cDNA。
3、目的基因克隆
(1)引物设计
FBA8(AT3G52930)基因序列编码358个氨基酸，其CDS和氨基酸序列如下：
核苷酸序列SEQ ID NO.2:ATGTCTGCCTTCACAAGCAAATTCGCCGATGAGTTGATCGCCAACGCTGCCTACATCGGCACACCTGGAAAAGGTATTTTGGCTGCTGATGAG TCCACTGGTACCATTGGAAAGCGTCTTGCGAGCATCAACGTCGAGAAC GTTGAGACCAACAGACGTAACCTCCGTGAGCTTCTCTTCACCGCCCCT GGTGCTCTTCCATGCCTCAGTGGTGTCATCCTTTTCGAAGAGACTCTGT ACCAAAAGAGTTCCGATGGTAAGCTTTTCGTTGATATCTTGAAGGAAG GAGGAGTTCTTCCCGGTATCAAGGTTGACAAGGGTACCGTTGAGCTAG CTGGAACCGACGGTGAGACCACCACTCAAGGTCTTGACGGTCTCGGT GACAGATGCAAGAAGTACTACGAAGCTGGTGCTCGTTTCGCCAAGTGG CGTGCAGTCCTCAAGATCGGAGAGAACGAGCCATCTGAGCATTCCATT CATGAGAACGCTTACGGATTAGCTAGATACGCTGTTATCTGCCAAGAGA ACGGTCTTGTACCAATTGTCGAGCCTGAGATCCTAGTCGATGGATCCCA TGACATCCAGAAGTGTGCTGCCGTGACTGAGCGTGTCCTTGCAGCTTG CTACAAGGCTCTTAGCGACCACCACGTCTTGCTCGAGGGTACACTCTT GAAGCCTAACATGGTTACTCCCGGATCTGACAGCCCCAAGGTTTCACC TGAAGTCATCGCTGAGCACACCGTCCGTGCCCTTCAGAGAACCGTCCC AGCAGCTGTTCCAGCCATTGTCTTCTTATCTGGAGGACAGAGCGAGGA AGAAGCTACCAGGAACTTGAACGCCATGAACCAGTTGAAGACCAAGA AGCCATGGTCATTGTCTTTCTCATTCGGACGTGCGTTGCAGCAGTCTAC CTTGAAGACATGGGCAGGTAAAGAGGAGAATGTCAAGGCAGCTCAAG AGGCGTTGTATGTGAGGTGCAAGGCTAACTCTGAAGCCACACTCGGAA CCTACAAGGGTGACGCTAAGCTTGGTGATGGAGCAGCTGAGAGCCTTC ACGTGAAGGATTACAAGTACTGA。
氨基酸序列SEQ ID NO.1:MSAFTSKFADELIANAAYIGTPGKGILAADESTGTIGKRLASINVENVETNRRNLRELLFTAPGALPCLSGVILFEETLYQKSSDGKLFVDILKEGGV LPGIKVDKGTVELAGTDGETTTQGLDGLGDRCKKYYEAGARFAKWRAV LKIGENEPSEHSIHENAYGLARYAVICQENGLVPIVEPEILVDGSHDIQKCAAVTERVLAACYKALSDHHVLLEGTLLKPNMVTPGSDSPKVSPEVIAEHTV RALQRTVPAAVPAIVFLSGGQSEEEATRNLNAMNQLKTKKPWSLSFSFGR ALQQSTLKTWAGKEENVKAAQEALYVRCKANSEATLGTYKGDAKLGDGAAESLHVKDYKY。
根据该基因的序列特点，设计两端带有限制性酶切位点的引物，用于连接到pET41b载体上。
上游引物AGGAGATATACATATGTCTGCCTTCACAAGCAAATTC (SEQ ID NO.11)，划线部分为NdeI酶切位点；
下游引物GTGCGGCCGCAAGCTTGTACTTGTAATCCTTCACGTG (SEQ ID NO.12)，划线部分为HindIII酶切位点；
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成这一对引物用于克隆FBA8 基因，克隆基因采用PCR扩增的方法。
(2)目的基因的PCR扩增和纯化
在50μl PrimeSTAR Max(TAKARA公司，配置方法参见试剂说明书) 反应体系中，以步骤2中获得的cDNA为模板，上述引物作为扩增引物，通过PCR的方法进行扩增，PCR反应条件：
预变性98℃2分钟；热循环98℃30秒，55℃15秒，72℃10秒，反应30 个循环；72℃延伸10分钟。
(3)通过PCR扩增的该基因全长为1102bp，用1％琼脂糖凝胶电泳证实得到目的基因的DNA扩增产物后，使用PCR产物纯化回收试剂盒(艾德莱公司DR02-PCR)回收，纯化扩增产物。
4、重组表达质粒的构建
将载体pET41b(购于Thermo Fisher公司)，用NdeI和HindIII(购于NEB公司)进行双酶切，然后将得到的骨架片段和步骤3纯化的DNA片段用无缝克隆试剂盒(碧云天公司D7010S)进行同源重组。
将连接产物转入大肠杆菌E.coli DH5α(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，在含有30μg/ml的卡那霉素的固体LB培养基上涂布，37℃过夜倒置培养，挑选单菌落在含有30μg/ml的卡那霉素的液体LB培养基中 37℃，220rpm过夜震荡培养。用质粒提取试剂盒(艾德莱公司PL02)提取菌液中的重组质粒。质粒PCR验证该重组质粒中含有目的片段。构建好的重组质粒pET41b-FBA8-His委托北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。测出序列与FBA8的CDS进行比对，完全匹配。说明重组质粒 pET41b-FBA8-His构建成功。
5、重组突变表达质粒的构建
(1)引物设计
以重组质粒pET41b-FBA8-His为模板，根据该基因的氨基酸序列对应的 DNA序列，设计T35D，S266D，S303D三对点突变引物来进行三突变，从而最终产生突变质粒pET41b-FBA8M-His。
T35D上游引物CTGATGAGTCCACTGGTGATATTGGAAAGC(SEQ ID NO.5)；
T35D下游引物ATCACCAGTGGACTCATCAGCAGCCAAAAT(SEQ ID NO.6)。
S266D上游引物CAGCCATTGTCTTCTTAGATGGAGGACAGA(SEQ ID NO.7)；
S266D下游引物ATCTAAGAAGACAATGGCTGGAACAGCTGC(SEQ ID NO.8)。
S303D上游引物GACGTGCGTTGCAGCAGGATACCTTGAAGA(SEQ ID NO.9)；
S303D下游引物ATCCTGCTGCAACGCACGTCCGAATGAGAA(SEQ ID NO.10)。
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成这3对引物用于突变FBA8 基因，突变基因采用基于PCR扩增的方法。
(2)突变基因的PCR扩增和纯化
在50μl PrimeSTAR Max(TAKARA公司，配置方法参见试剂说明书) 反应体系中，以pET41b-FBA8-His为模板，上述T35D引物对作为扩增引物，通过PCR的方法进行扩增，PCR反应条件：预变性98℃2分钟；热循环98℃30 秒，55℃15秒，72℃90秒，反应30个循环；72℃延伸10分钟。
反应结束后，向反应体系中加入1μl DpnI(NEB公司#R0176V)，37℃孵育1小时。将PCR产物转入大肠杆菌E.coli DH5α(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，在含有30μg/ml的卡那霉素的固体LB培养基上涂布，37℃过夜倒置培养，挑选单菌落在含有30μg/ml的卡那霉素的液体LB 培养基中37℃，220rpm过夜震荡培养。用质粒提取试剂盒(艾德莱公司 PL02)提取菌液中的突变质粒。质粒PCR验证该重组质粒中含有目的片段。构建好的突变质粒委托北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。测出序列与FBA8T35D的CDS进行比对，完全匹配。说明第一次突变质粒成功。以该突变质粒为模板，用S266D引物对按照上述步骤把第一次突变质粒再次进行突变；进而再用S303D引物对，以第二次突变质粒为模板进行突变，最终得到三突变质粒pET41b-FBA8M-His。将最终构建好的突变质粒委托北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。测出序列与FBA8M的CDS进行比对，完全匹配。说明突变质粒pET41b-FBA8M-His构建成功。突变后的基因(FBA8M) 的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示： ATGTCTGCCTTCACAAGCAAATTCGCCGATGAGTTGATCGCCAACGCT GCCTACATCGGCACACCTGGAAAAGGTATTTTGGCTGCTGATGAGTCC ACTGGTGATATTGGAAAGCGTCTTGCGAGCATCAACGTCGAGAACGTT GAGACCAACAGACGTAACCTCCGTGAGCTTCTCTTCACCGCCCCTGGT GCTCTTCCATGCCTCAGTGGTGTCATCCTTTTCGAAGAGACTCTGTACC AAAAGAGTTCCGATGGTAAGCTTTTCGTTGATATCTTGAAGGAAGGAG GAGTTCTTCCCGGTATCAAGGTTGACAAGGGTACCGTTGAGCTAGCTG GAACCGACGGTGAGACCACCACTCAAGGTCTTGACGGTCTCGGTGAC AGATGCAAGAAGTACTACGAAGCTGGTGCTCGTTTCGCCAAGTGGCGT GCAGTCCTCAAGATCGGAGAGAACGAGCCATCTGAGCATTCCATTCAT GAGAACGCTTACGGATTAGCTAGATACGCTGTTATCTGCCAAGAGAAC GGTCTTGTACCAATTGTCGAGCCTGAGATCCTAGTCGATGGATCCCATG ACATCCAGAAGTGTGCTGCCGTGACTGAGCGTGTCCTTGCAGCTTGCT ACAAGGCTCTTAGCGACCACCACGTCTTGCTCGAGGGTACACTCTTGAAGCCTAACATGGTTACTCCCGGATCTGACAGCCCCAAGGTTTCACCTG AAGTCATCGCTGAGCACACCGTCCGTGCCCTTCAGAGAACCGTCCCAG CAGCTGTTCCAGCCATTGTCTTCTTAGATGGAGGACAGAGCGAGGAAG AAGCTACCAGGAACTTGAACGCCATGAACCAGTTGAAGACCAAGAAG CCATGGTCATTGTCTTTCTCATTCGGACGTGCGTTGCAGCAGGATACCT TGAAGACATGGGCAGGTAAAGAGGAGAATGTCAAGGCAGCTCAAGAG GCGTTGTATGTGAGGTGCAAGGCTAACTCTGAAGCCACACTCGGAACC TACAAGGGTGACGCTAAGCTTGGTGATGGAGCAGCTGAGAGCCTTCAC GTGAAGGATTACAAGTACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACCACCACTAA；突变后的基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示： MSAFTSKFADELIANAAYIGTPGKGILAADESTGDIGKRLASINVENVETN RRNLRELLFTAPGALPCLSGVILFEETLYQKSSDGKLFVDILKEGGVLPGIK VDKGTVELAGTDGETTTQGLDGLGDRCKKYYEAGARFAKWRAVLKIGE NEPSEHSIHENAYGLARYAVICQENGLVPIVEPEILVDGSHDIQKCAAVTER VLAACYKALSDHHVLLEGTLLKPNMVTPGSDSPKVSPEVIAEHTVRALQ RTVPAAVPAIVFLDGGQSEEEATRNLNAMNQLKTKKPWSLSFSFGRALQQDTLKTWAGKEENVKAAQEALYVRCKANSEATLGTYKGDAKLGDGAAES LHVKDYKYKLAAALEHHHHHHHH。
实施例2
过表达的FBA8及FBA8M转基因拟南芥的创制
1、目的基因克隆
(1)引物设计
根据FBA8及FBA8M基因的序列特点，设计同源重组引物，用于将FBA8 及FBA8M连接到pBI121载体上。
第一引物对：
上游引物GGTCAGTCCCTTATGTCTGCCTTCACAAGCAAATT(SEQ ID NO.13)；
下游引物AGAGTTGTTGATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT(SEQ ID NO.14)；
根据pBI21序列特点，设计同源重组引物，用于扩增pBI121骨架片段并连接目的基因片段。
第二引物对：
上游引物TGAATCAACAACTCTCCTGG(SEQ ID NO.15)；
下游引物CATAAGGGACTGACCACC(SEQ ID NO.16)；
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成这两对引物用于克隆 FBA8、FBA8M基因及pBI121骨架片段，克隆基因采用PCR扩增的方法。
(2)目的基因的PCR扩增和纯化
在50μl PrimeSTAR Max(TAKARA公司，配置方法参见试剂说明书) 反应体系中，以实施例1步骤4、5中获得的重组表达质粒pET41b-FBA8-His、重组突变表达质粒pET41b-FBA8M-His分别为模板，以上述第一引物对作为扩增引物，通过PCR的方法进行扩增。FBA8基因的PCR反应条件：预变性98℃2分钟；热循环98℃30秒，55℃15秒，72℃10秒，反应30个循环； 72℃延伸10分钟。
以载体pBI121为模板，以上述第二引物对作为扩增引物，通过PCR的方法进行扩增。pBI121骨架片段的PCR反应条件：预变性98℃2分钟；热循环98℃30秒，55℃15秒，72℃90秒，反应30个循环；72℃延伸10分钟。
(3)通过PCR扩增的FBA8基因及突变基因FBA8M全长均为1146bp，通过PCR扩增pBI121骨架片段的全长为12915bp，用1％琼脂糖凝胶电泳证实得到目的基因的DNA扩增产物后，使用PCR产物纯化回收试剂盒(艾德莱公司DR02-PCR)回收，纯化扩增产物。
2、过表达载体质粒的构建
将步骤1纯化的pBI121骨架片段和两个目的基因片段分别用无缝克隆试剂盒(碧云天公司D7010S)进行同源重组。将连接产物转入大肠杆菌E.coli DH5α(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，在含有30μg/ml的卡那霉素的固体LB培养基上涂布，37℃过夜倒置培养，挑选单菌落在含有 30μg/ml的卡那霉素的液体LB培养基中37℃，220rpm过夜震荡培养。用质粒提取试剂盒(艾德莱公司PL02)提取菌液中的重组质粒。质粒PCR验证该重组质粒中含有目的片段。构建好的重组质粒pBI121-FBA8及 pBI121-FBA8M委托北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。测出序列与 FBA8及FBA8M的CDS进行比对，完全匹配。说明重组质粒pBI121-FBA8 及pBI121-FBA8M构建成功。
3、过表达FBA8及其修饰基因转基因植株的创制
(1)拟南芥的转化
将组质粒pBI121-FBA8和pBI121-FBA8M分别利用浸花法进行转化野生型Col-0，fba8纯合突变体(SALK_062382)的转基因操作(Floral dip:a simplified method forAgrobacterium mediated transformation of Arabidopsisi thaliana，Clough andBent，1998，Plant Journal 16(6):735-743)。
注：fba8纯合突变体(SALK_062382)中T-DNA插到CDS里，导致 FBA8不能被完整翻译，相当于不表达FBA8，是一个knock-out突变体。对应特征：植株矮小，育性差。
(2)转基因拟南芥的筛选(Floral dip:a simplified method forAgrobacterium mediated transformation of Arabidopsisi thaliana，Clough andBent，1998，Plant Journal 16(6):735-743)。筛选培养基中加入50μg/ml 卡那霉素，并通过PCR卡那抗性基因NPT进一步验证阳性苗。野生型Col-0 转化pBI121-FBA8和pBI121-FBA8M的植株分别称为OEFBA8-Col-0和OE FBA8M-Col-0；fba8突变体转化pBI121-FBA8的植株称为OEFBA8-fba8。
实施例3
拟南芥过表达的FBA8及FBA8M转基因植株表型分析
将各转基因T3代种子及野生型Col-0、fba8纯合突变体(在卡那霉素筛选培养基上不能生存)种子同时种下。各转基因T3代种子不经过卡那霉素筛选直接在无抗培养基及后续培养土中培养，待其生长过程中提取叶片 DNA，通过PCR卡那抗性基因NPT鉴定阳性苗。待转基因阳性苗及野生型Col-0、fba8突变体长至萌发后30天，截取距莲座叶1cm至2cm左右的花序轴茎，进行50％FAA固定、石蜡包埋及甲苯胺蓝染色。
如图1所示，野生型Col-0始终维持8个维管束的稳定状态。与野生型 Col-0相比，OEFBA8-Col-0(过表达FBA8的转基因植株)出现多次维管束分裂活动及更多的维管束，但横截面积显著变小，与fba8突变体表型极为相似。而OEFBA8-fba8(在fba8突变体中过表达FBA8的植株)能弥补突变体的缺陷(其横截面积与野生型Col-0相当)，但也使得其维管束出现分裂情况(维管束总数超过8个)。统计信息见图2(柱状图上方数字表示维管束起始分裂平均次数，n＝3)和图3(柱状图上方字母表示显著性差异，two-sided Student’st-test，P<0.05，n＝3)。
与野生型Col-0相比，OEFBA8M-Col-0(过表达FBA8M的转基因植株) 也会出现维管束分裂活动及较多的维管束，不过横截面积显著变大；虽然其维管束分裂活动和数目均不如OEFBA8-Col-0，但其横截面积更显著大于 OEFBA8-Col-0。统计信息见图2和图3。
最终结论：野生型Col-0过表达FBA8的转基因植株以及不表达FBA8 的突变体植株会出现维管束分裂的表型，但相比野生型其花序轴茎显著变细。野生型Col-0过表达FBA8M的转基因植株同样会出现维管束分裂的表型，但相比野生型其花序轴茎显著变粗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> FBA8蛋白或由其衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Ala Phe Thr Ser Lys Phe Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asn Ala
1 5 10 15
Ala Tyr Ile Gly Thr Pro Gly Lys Gly Ile Leu Ala Ala Asp Glu Ser
20 25 30
Thr Gly Thr Ile Gly Lys Arg Leu Ala Ser Ile Asn Val Glu Asn Val
35 40 45
Glu Thr Asn Arg Arg Asn Leu Arg Glu Leu Leu Phe Thr Ala Pro Gly
50 55 60
Ala Leu Pro Cys Leu Ser Gly Val Ile Leu Phe Glu Glu Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Gln Lys Ser Ser Asp Gly Lys Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Glu Gly
85 90 95
Gly Val Leu Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Thr Val Glu Leu Ala
100 105 110
Gly Thr Asp Gly Glu Thr Thr Thr Gln Gly Leu Asp Gly Leu Gly Asp
115 120 125
Arg Cys Lys Lys Tyr Tyr Glu Ala Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp Arg
130 135 140
Ala Val Leu Lys Ile Gly Glu Asn Glu Pro Ser Glu His Ser Ile His
145 150 155 160
Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Val Ile Cys Gln Glu Asn
165 170 175
Gly Leu Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu Val Asp Gly Ser His
180 185 190
Asp Ile Gln Lys Cys Ala Ala Val Thr Glu Arg Val Leu Ala Ala Cys
195 200 205
Tyr Lys Ala Leu Ser Asp His His Val Leu Leu Glu Gly Thr Leu Leu
210 215 220
Lys Pro Asn Met Val Thr Pro Gly Ser Asp Ser Pro Lys Val Ser Pro
225 230 235 240
Glu Val Ile Ala Glu His Thr Val Arg Ala Leu Gln Arg Thr Val Pro
245 250 255
Ala Ala Val Pro Ala Ile Val Phe Leu Ser Gly Gly Gln Ser Glu Glu
260 265 270
Glu Ala Thr Arg Asn Leu Asn Ala Met Asn Gln Leu Lys Thr Lys Lys
275 280 285
Pro Trp Ser Leu Ser Phe Ser Phe Gly Arg Ala Leu Gln Gln Ser Thr
290 295 300
Leu Lys Thr Trp Ala Gly Lys Glu Glu Asn Val Lys Ala Ala Gln Glu
305 310 315 320
Ala Leu Tyr Val Arg Cys Lys Ala Asn Ser Glu Ala Thr Leu Gly Thr
325 330 335
Tyr Lys Gly Asp Ala Lys Leu Gly Asp Gly Ala Ala Glu Ser Leu His
340 345 350
Val Lys Asp Tyr Lys Tyr
355
<210> 2
<211> 1077
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctgcct tcacaagcaa attcgccgat gagttgatcg ccaacgctgc ctacatcggc 60
acacctggaa aaggtatttt ggctgctgat gagtccactg gtaccattgg aaagcgtctt 120
gcgagcatca acgtcgagaa cgttgagacc aacagacgta acctccgtga gcttctcttc 180
accgcccctg gtgctcttcc atgcctcagt ggtgtcatcc ttttcgaaga gactctgtac 240
caaaagagtt ccgatggtaa gcttttcgtt gatatcttga aggaaggagg agttcttccc 300
ggtatcaagg ttgacaaggg taccgttgag ctagctggaa ccgacggtga gaccaccact 360
caaggtcttg acggtctcgg tgacagatgc aagaagtact acgaagctgg tgctcgtttc 420
gccaagtggc gtgcagtcct caagatcgga gagaacgagc catctgagca ttccattcat 480
gagaacgctt acggattagc tagatacgct gttatctgcc aagagaacgg tcttgtacca 540
attgtcgagc ctgagatcct agtcgatgga tcccatgaca tccagaagtg tgctgccgtg 600
actgagcgtg tccttgcagc ttgctacaag gctcttagcg accaccacgt cttgctcgag 660
ggtacactct tgaagcctaa catggttact cccggatctg acagccccaa ggtttcacct 720
gaagtcatcg ctgagcacac cgtccgtgcc cttcagagaa ccgtcccagc agctgttcca 780
gccattgtct tcttatctgg aggacagagc gaggaagaag ctaccaggaa cttgaacgcc 840
atgaaccagt tgaagaccaa gaagccatgg tcattgtctt tctcattcgg acgtgcgttg 900
cagcagtcta ccttgaagac atgggcaggt aaagaggaga atgtcaaggc agctcaagag 960
gcgttgtatg tgaggtgcaa ggctaactct gaagccacac tcggaaccta caagggtgac 1020
gctaagcttg gtgatggagc agctgagagc cttcacgtga aggattacaa gtactga 1077
<210> 3
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Ala Phe Thr Ser Lys Phe Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asn Ala
1 5 10 15
Ala Tyr Ile Gly Thr Pro Gly Lys Gly Ile Leu Ala Ala Asp Glu Ser
20 25 30
Thr Gly Asp Ile Gly Lys Arg Leu Ala Ser Ile Asn Val Glu Asn Val
35 40 45
Glu Thr Asn Arg Arg Asn Leu Arg Glu Leu Leu Phe Thr Ala Pro Gly
50 55 60
Ala Leu Pro Cys Leu Ser Gly Val Ile Leu Phe Glu Glu Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Gln Lys Ser Ser Asp Gly Lys Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Glu Gly
85 90 95
Gly Val Leu Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Thr Val Glu Leu Ala
100 105 110
Gly Thr Asp Gly Glu Thr Thr Thr Gln Gly Leu Asp Gly Leu Gly Asp
115 120 125
Arg Cys Lys Lys Tyr Tyr Glu Ala Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp Arg
130 135 140
Ala Val Leu Lys Ile Gly Glu Asn Glu Pro Ser Glu His Ser Ile His
145 150 155 160
Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Val Ile Cys Gln Glu Asn
165 170 175
Gly Leu Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu Val Asp Gly Ser His
180 185 190
Asp Ile Gln Lys Cys Ala Ala Val Thr Glu Arg Val Leu Ala Ala Cys
195 200 205
Tyr Lys Ala Leu Ser Asp His His Val Leu Leu Glu Gly Thr Leu Leu
210 215 220
Lys Pro Asn Met Val Thr Pro Gly Ser Asp Ser Pro Lys Val Ser Pro
225 230 235 240
Glu Val Ile Ala Glu His Thr Val Arg Ala Leu Gln Arg Thr Val Pro
245 250 255
Ala Ala Val Pro Ala Ile Val Phe Leu Asp Gly Gly Gln Ser Glu Glu
260 265 270
Glu Ala Thr Arg Asn Leu Asn Ala Met Asn Gln Leu Lys Thr Lys Lys
275 280 285
Pro Trp Ser Leu Ser Phe Ser Phe Gly Arg Ala Leu Gln Gln Asp Thr
290 295 300
Leu Lys Thr Trp Ala Gly Lys Glu Glu Asn Val Lys Ala Ala Gln Glu
305 310 315 320
Ala Leu Tyr Val Arg Cys Lys Ala Asn Ser Glu Ala Thr Leu Gly Thr
325 330 335
Tyr Lys Gly Asp Ala Lys Leu Gly Asp Gly Ala Ala Glu Ser Leu His
340 345 350
Val Lys Asp Tyr Lys Tyr Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His
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His His His His His
370
<210> 4
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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gccattgtct tcttagatgg aggacagagc gaggaagaag ctaccaggaa cttgaacgcc 840
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gctaagcttg gtgatggagc agctgagagc cttcacgtga aggattacaa gtacaagctt 1080
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<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaatcaaca actctcctgg 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cataagggac tgaccacc 18

Claims (8)

1. FBA8蛋白或氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质在调节植物维管束分裂和/或花序轴横截面积中的应用，所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述植物为拟南芥。
2.过表达FBA8蛋白或沉默编码FBA8蛋白的基因在促进植物维管束分裂和/或缩小花序轴横截面积中的应用；所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述植物为拟南芥。
3.过表达氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质在促进植物维管束分裂和/或增加花序轴横截面积中的应用，所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由FBA8蛋白衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述植物为拟南芥。
4.一种由FBA8蛋白衍生的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
5.编码权利要求4所述由FBA8蛋白衍生的蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.制备权利要求5所述基因用引物组，其特征在于，包括T35D上游引物、T35D下游引物、S266D上游引物、S266D下游引物、S303D上游引物和S303D下游引物，所述T35D上游引物、T35D下游引物、S266D上游引物、S266D下游引物、S303D上游引物和S303D下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.10所示。
7.含权利要求5所述基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5所述基因和骨架载体。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述骨架载体包括pET41b或pBI121。
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