CN115725560B - 一种马尾松多功能萜类合成酶突变体及其在生产倍半萜产品中的应用 - Google Patents
一种马尾松多功能萜类合成酶突变体及其在生产倍半萜产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种马尾松多功能萜类合成酶突变体及其在生产倍半萜产品中的应用。本发明首次从马尾松中克隆得到一个多功能萜类合成酶突变体(PmTPS21‑mutation)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。该PmTPS21‑mutation能以法尼基焦磷酸(FPP)为底物，催化反应生成α‑长叶蒎烯、长叶烯、10s,11s‑Himachala‑3(12),4‑diene等倍半萜类活性物质，为今后利用基因工程或代谢工程技术在马尾松分子育种或萜类产品生产中的应用提供重要的理论依据，具有极为广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物(林木)基因工程技术领域，特别涉及一种马尾松多功能萜类合成酶突变体及其在生产倍半萜产品中的应用。
背景技术
马尾松(Pinus massoniana)是我国最重要的本土采脂树种，在松脂产业中占有举足轻重的地位。松脂的主要化学成分包括数百种萜类化合物，根据化合物结构可分为单萜、倍半萜、二萜等萜类化合物，是针叶树在长期适应生态环境变化以及响应病虫害侵犯过程中所形成的化学抵御物质，这些次生代谢产物在工业生产和人们生活中具有重要应用价值。随着国家在森林生态保护与新能源领域相关措施的实施，加大对马尾松等针叶树林的保护力度，亟需改善松脂的供给方式。
植物萜类合成酶基因(Terpene Synthase,TPS)的多样性直接导致自然界出现成千上万种萜类化合物。萜类合成酶基因是一类直接参与萜类化合物生物合成的功能基因，根据产物数量分为单功能、双功能、多功能酶等，即一个萜类合成酶可以控制不同数量的萜类化合物生物合成；根据产物类型，马尾松主要包括单萜合成酶(MonoTPS)、倍半萜合成酶(SesquiTPS)、二萜合成酶(DiTPS)等。根据萜类化合物的分类特征，马尾松等针叶树的萜类合成酶通常以香叶基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(GPPP)为底物，合成单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)等萜类化合物。
目前，绝大多数马尾松TPS基因的功能尚不清晰，现有技术中公开了两个萜类合成关键基因α-蒎烯合酶基因(PmTPS4,NCBI号:MN832901)和长叶烯合酶基因(PmTPS21,NCBI号:MN832900)(见中国专利201911253617.3，名称为“马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物及包含萜烯类化合物的产品中的应用”；中国专利201911254764.2，名称为“马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途”，以及文献：Two terpene synthases in resistant Pinusmassoniana contribute to defence against Bursaphelenchus xylophilus,DOI:10.1111/pce.13873)，其中PmTPS4是一种多产物的α-蒎烯合酶，可以同时合成α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯等4种单萜化合物；PmTPS21是一种具有双功能的长叶烯合酶，可同时合成倍半萜和单萜(长叶烯和α-蒎烯)。但到目前为止未见以α-长叶蒎烯等萜类化合物为主要产物的马尾松萜类合成酶基因及其应用技术或研究报道，因此，开展相关TPS鉴定与功能分析对萜类合成酶基因开展相关基础理论研究和实现基因工程、代谢工程及相关萜类化合物体外合成具有重要指导意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种马尾松多功能萜类合成酶突变体。
本发明的另一目的在于提供所述马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因。
本发明的再一目的在于提供所述马尾松多功能萜类合成酶突变体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种马尾松多功能萜类合成酶突变体，为PmTPS21蛋白的第72位Met突变为Ile，第169位Arg突变为Met，第245位Tyr突变为Asn，以及第313位Ile突变为Phe，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
含有所述马尾松多功能萜类合成酶突变体编码基因的重组载体或重组工程菌。
所述的载体包括表达载体或克隆载体。
所述的表达载体为pET28a载体。
所述的克隆载体为puc-BLUNT克隆载体。
所述的菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21(DE3)。
所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建重组载体
①将如SEQ ID NO.2所示的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因序列上添加Nde I与Hind III酶切位点，再连接至puc-BLUNT克隆载体，得到重组载体I；
或
②将SEQ ID NO.2所示的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化设计，获得SEQ ID NO.3所示的优化后的序列；然后在优化后的序列上添加Nde I与Hind III酶切位点，再连接至puc-BLUNT克隆载体，得到重组载体Ⅱ；
(2)构建重组表达载体
将重组载体I或克隆载体Ⅱ利用限制性内切酶Nde I与Hind III进行质粒双酶切，获得目的基因片段(酶切产物)；同时，将pET28a空载体利用限制性内切酶Nde I与Hind III进行双酶切，得到pET28a空载体酶切产物；然后将目的基因片段与pET28a空载体酶切产物连接，构建得到pET28a重组表达载体；
(3)诱导表达
将pET28a重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组表达工程菌；然后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，得到所述马尾松多功能萜类合成酶突变体。
步骤②中所述的添加Nde I与Hind III酶切位点通过上游引物F2和下游引物R2实现，其中，
上游引物F2:5′-CATATGATGGCACAGATTAGCATTGGCGCCCCG-3′，
下游引物R2:5′-AAGCTTTTAAATCGGCACCTGATCAATCAGA-3′。
步骤(3)中所述的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的添加量按其在反应体系的终浓度为0.2～1mmol/L添加计算。
步骤(3)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21(DE3)。
步骤(3)中所述的诱导表达的温度为15～37℃；
步骤(3)中所述的诱导表达的时间优选为5～15h。
所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的制备方法，在步骤(3)之后还包括将马尾松多功能萜类合成酶突变体进一步纯化的步骤；具体为：诱导表达结束后，离心收集菌体，重悬，超声破碎，然后将上清利用Ni柱亲和层析进行纯化，其平衡缓冲液为pH8.0的Tris-NaCl缓冲液，清洗缓冲液为pH8.0、含50mM咪唑的Tris-NaCl缓冲液，洗脱缓冲液为pH8.0、含500mM咪唑的Tris-NaCl缓冲液。
所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体和/或马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因在生产倍半萜产品中的应用。
所述的倍半萜为α-长叶蒎烯、长叶烯和10s,11s-Himachala-3(12),4-diene中的至少一种。
一种生产倍半萜类化合物的方法，利用上述马尾松多功能萜类合成酶突变体催化法尼基焦磷酸(FPP)，得到倍半萜类化合物；其中，倍半萜类化合物为α-长叶蒎烯、长叶烯和10s,11s-Himachala-3(12),4-diene中的至少一种。
所述的催化的温度为25～35℃；优选为30℃。
所述的催化的时间为1小时以上。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明针对现有马尾松萜类合成相关基础理论研究薄弱的现状，首次从马尾松克隆得到一个多功能萜类合成酶基因(PmTPS21-mutation)，其反应底物为FPP，主要产物为α-长叶蒎烯、长叶烯、10s,11s-Himachala-3(12),4-diene等，该基因属于马尾松倍半萜合成酶(SesquiTPS)途径的关键基因之一，目前，未见该基因相关报道。
(2)由于现有相关技术公开的萜类合成酶不能用于生产以α-长叶蒎烯为主的萜类化合物，如长叶烯合酶基因(PmTPS21)与本发明中PmTPS21-mutation相比在CDS区共存在4个碱基位点变异(分别是第216、506、733、937个碱基)，并且均为有义突变，即4个碱基变异均导致了氨基酸的改变，可能是这4个氨基酸的变异引起酶蛋白三维结构的差异，从而引起功能差异，本发明中的PmTPS21-mutation可用于同时生产α-长叶蒎烯、长叶烯、10s,11s-Himachala-3(12),4-diene等倍半萜类活性物质。
(3)本发明利用重组的工程菌与原核表达体系解析了该萜类合成酶基因的生物功能，对得到的PmTPS21-mutation基因建立了一种可用于体外生产含有α-长叶蒎烯、长叶烯、10s,11s-Himachala-3(12),4-diene等萜烯化合物的环保型技术方法与生产流程，减少因砍伐或破坏天然树木获取α-长叶蒎烯等相关萜类物质所造成的生态破坏。
(4)本发明中PmTPS21-mutation的发现与生物功能的研究为今后利用基因工程或代谢工程技术在马尾松分子育种或萜类产品生产中的应用提供重要的理论依据，具有极为广阔的应用前景与极大的应用价值，为相关基础研究与应用研究提供有益参考。
附图说明
图1是马尾松松脂倍半萜的种类及其含量图。
图2是马尾松萜类合成酶突变体(PmTPS21-mutation)的结构域图。
图3是马尾松萜类合成酶突变体(PmTPS21-mutation)的基因结构图。
图4是马尾松萜类合成酶突变体(PmTPS21-mutation)的进化与功能预测图。
图5是马尾松萜类合成酶突变体(PmTPS21-mutation)的诱导表达及纯化结果图；其中，A为不同诱导条件下的目的蛋白表达情况；B为Ni柱亲和层析纯化后的目的蛋白。
图6是酶促反应GC-MS检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
(1)目标化合物所在植物材料
利用割面采脂系统(即利用刀在马尾松树干通过割出伤口获得松脂)对149份马尾松种质资源收集松脂，通过GC-MS检测并计算松脂样品中各萜类化合物的含量，其中长叶烯、石竹烯、α-长叶蒎烯等倍半萜化合物含量较高(图1)，可利用相关植物组织材料进行TPS基因鉴定。其中，GC-MS检测参考文献(High vs.low yielding oleoresin Pinushalepensis Mill.trees GC terpenoids profiling as diagnostic tool.DOI:10.1051/forest/2009132)进行测定。
(2)基因序列获取、克隆及生信分析
①收集马尾松树干次生木质部、针叶、枝条等组织材料，利用植物RNA提取试剂盒(Tiangen)提取各组织RNA并等量混合完成PacBio全长转录组测序。接着，基于PacBio数据库并通过基因功能注释信息筛选TPS基因并获取全长CDS序列；利用反转录试剂盒(Promega)并参照使用说明书将树干次生木质部、针叶、枝条等马尾松组织提取的RNA反转录获得cDNA，根据CDS两端序列设计特异引物(上游引物F1:5′-CATATGATGGCTCAAATTTCTATAGGTGCACCA-3′，下游引物R1:5′-AAGCTTTCAGATGGGCACTTGATCGATAAGG-3′)，以cDNA为模板利用高保真Taq酶通过PCR进行TPS基因全长扩增，其中PCR反应体系(25μL)为：上下游引物F和R各0.5μL，cDNA 1μL，dNTP 0.5μL，Taq酶0.5μL，缓冲液5μL，dd H2O 17μL；PCR反应流程为：95℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃10min。
②利用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，对符合目标产物大小的条带进行割胶，利用凝胶回收试剂盒(Omega)并参照说明书回收PCR产物，将回收得到的DNA片段连接至puc-BLUNT克隆载体(Takara)，其中连接反应体系(10μL)为：载体1μL、DNA3μL、缓冲液2μL、ddH2O 4μL，室温连接3h。取-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰面，5min后将连接产物全部(10μL)加入到感受态细胞中，混匀后冰面静置0.5h，通过热激法进行质粒转化，其中转化条件为：42℃90sec、冰面2min，加入300μL无抗性LB液体培养基后37℃、200rpm进行摇菌。摇菌完毕后，5000rpm离心2min，弃200μL上清液，将菌体重悬后均匀涂抹至卡那霉素(kan)(50mg/L)抗性的LB固体培养基上，37℃条件下倒置培养。
③培养完毕后，随机挑选15个单克隆白色菌落，利用PCR进行阳性菌株筛选，其中PCR反应体系(25μL)为：上下游引物F和R各0.5μL，菌落1μL，PCR mix 8μL，dd H2O 15μL。PCR反应条件同上述步骤①，随后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测。将电泳条带符合目的大小的单克隆菌落移至2mL离心管中，并加入1.5mL含Kan(50mg/L)抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养，培养完毕后取500μL菌液进行Sanger测序(委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序)。同时加入终浓度为25％(v/v)的甘油，置于-80℃保存备用。
注：以上分子生物学实验所用培养基、枪头、离心管等试剂或材料均需进行高温高压灭菌后使用，灭菌条件为121℃，17min，并对操作平台进行紫外线灭菌。
④通过Sanger测序与序列拼接获得扩增产物的完整CDS序列，所获得的基因CDS长度为1743bp；通过基因或蛋白序列BLAST、保守结构域分析预测TPS的生物功能，同时，将该基因命名为PmTPS21突变体(PmTPS21-mutation)(图2)。利用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提取马尾松针叶基因组DNA，根据TPS基因两端序列设计的引物(同上述步骤①中的上游引物F和下游引物R)，以基因组DNA为模板扩增TPS基因全长序列；利用基因结构显示软件，结合PmTPS21-mutation的CDS序列与基因全长序列分析该基因的基因结构，PmTPS21-mutation共包括10个外显子与9个内含子(图3)。通过进一步与已知生物功能的马尾松或其它树种TPS基因的序列比对、进化分析等，该TPS基因与樟子松长叶烯合成酶基因(Pinussylvestris-longifolene synthase)、马尾松的长叶烯合成酶基因(PmTPS21)聚到一个分枝上，说明该TPS基因很可能直接参与长叶烯等倍半萜化合物的生物合成(图4)。
PmTPS21-mutation蛋白序列(SEQ ID NO.1)：
MAQISIGAPLSAEVNGSCINTHHHGNLWDDYFIQSLKSPYEAPECHERCEKMIEEVKHLLLSEMRDGNDDLIKRLQMVDIFECLGIDRHFHHEIQAALDYVYRYWNELEGIGVGTRDSLTKDLNATGLGFRALRLHRYNVSSAVLENFKNENGLFFHSSTVQEEEVRCMLTLLRASEISFPGEKVMDEAKAFATEYLNQLLTRVDIREVGESLLREVRYALDFPWYCSVPRWEARSFIEIFGQSNSWLNSTMNKKVLELAKLDFNILQSAHQRELQLLSRWWSQSDIEKQNFYRKRHVEFYFWMVIGTFEPEFSSSRIAFAKIATLMTVLDDLYDTHGTLEQLKIFTEAVKRWDLSLQDRLPDYIKITLEFFFNTSNELNAEVAKMQERDMSAYIRKAGWERYLEGYMQESEWMAARHVPTFDDYMKNGKPSSGMCILNLYSLLLMGQLVPDNILEQIHLPSKIHELVELTARLVDDSKDFQAKKDGGEFASGIECYLKEKPECTEEDAMNHLIGLLNLTAMELNWEFVKHDGVALCLKKFVFEVARGLRFIYKYRDGFDYSNEEMKSQITKILIDQVPI；
PmTPS21-mutation基因序列(SEQ ID NO.2)：
ATGGCTCAAATTTCTATAGGTGCACCACTATCTGCCGAGGTGAACGGATCCTGCATCAACACTCATCATCATGGAAATCTGTGGGACGACTATTTCATACAATCTCTTAAGTCGCCTTATGAGGCACCTGAATGTCATGAACGCTGTGAAAAGATGATTGAAGAAGTGAAGCATTTACTTTTGAGTGAGATGAGAGATGGCAACGATGATTTAATCAAACGTCTCCAGATGGTTGACATTTTTGAATGTCTAGGAATTGATCGGCACTTTCACCATGAAATACAAGCTGCTCTTGATTACGTGTACAGATATTGGAACGAGCTGGAAGGCATCGGTGTTGGAACAAGAGATTCCCTCACCAAAGATCTCAATGCTACGGGTTTGGGATTTCGGGCTCTCCGACTCCATCGATATAACGTATCCTCAGCTGTCTTGGAGAATTTCAAGAACGAAAATGGGCTGTTCTTCCACAGTTCCACGGTTCAAGAAGAAGAAGTGAGATGCATGTTGACGTTACTTAGGGCTTCAGAAATTTCATTTCCCGGAGAAAAGGTGATGGACGAGGCAAAGGCATTCGCAACAGAATATCTAAACCAACTTTTGACGAGAGTGGATATAAGGGAAGTGGGTGAAAGCCTTTTAAGAGAGGTTAGGTATGCCCTAGATTTTCCTTGGTACTGCAGTGTGCCGAGATGGGAGGCTAGGAGCTTCATCGAAATATTTGGACAAAGCAATTCATGGCTTAACTCAACTATGAACAAAAAAGTTTTAGAGTTGGCTAAATTGGACTTCAATATTCTGCAATCCGCACATCAAAGAGAGCTACAGCTTCTCTCAAGGTGGTGGTCACAATCGGATATAGAGAAGCAGAATTTCTACCGGAAGCGTCACGTGGAATTTTACTTTTGGATGGTTATAGGCACGTTCGAACCGGAGTTTTCGAGCAGCAGAATTGCATTCGCAAAAATTGCGACACTGATGACTGTCCTAGATGATCTCTATGATACTCACGGAACGTTGGAACAACTAAAAATCTTCACAGAAGCAGTCAAACGATGGGATCTTTCATTACAAGACCGTCTTCCAGACTACATAAAGATTACTCTGGAATTCTTCTTCAACACATCCAATGAATTGAATGCTGAAGTTGCTAAAATGCAAGAACGGGATATGTCAGCCTACATACGAAAAGCAGGCTGGGAACGATACCTTGAAGGGTATATGCAAGAGTCCGAATGGATGGCGGCTCGACATGTCCCTACCTTTGACGATTACATGAAGAATGGCAAACCCAGCTCTGGAATGTGTATACTAAATTTGTATTCGCTTCTGTTAATGGGGCAACTTGTACCTGACAACATTCTGGAGCAAATACACCTTCCATCCAAGATCCATGAACTTGTGGAATTGACGGCCAGACTGGTCGACGACTCAAAGGATTTCCAGGCGAAGAAGGATGGTGGGGAGTTTGCTTCAGGTATAGAGTGCTACTTGAAAGAGAAGCCTGAATGTACAGAGGAAGATGCAATGAATCATCTCATTGGGCTCCTCAATCTGACAGCGATGGAATTAAATTGGGAATTTGTAAAACATGACGGTGTGGCGCTGTGTCTCAAGAAGTTCGTCTTCGAAGTTGCACGAGGTCTCCGATTCATCTACAAATACAGAGACGGCTTTGACTATTCCAACGAGGAGATGAAGAGCCAGATAACCAAAATCCTTATCGATCAAGTGCCCATCTGA。
(3)密码子优化
①根据大肠杆菌BL21(DE3)菌株的密码子偏好性对PmTPS21-mutation基因序列(SEQ ID NO.2)进行优化，获得PmTPS21-mutation优化序列(SEQ ID NO.3)，并进行基因合成。
②利用上下游引物F和R(上游引物F2:5′-CATATGATGGCACAGATTAGCATTGGCGCCCCG-3′，下游引物R2:5′-AAGCTTTTAAATCGGCACCTGATCAATCAGA-3′)对合成的基因进行扩增，在引物F和R分别添加Nde I与Hind III酶切位点，再连接至puc-BLUNT克隆载体(连接方法同上述步骤(2))，得到含有目的基因的克隆载体。
PmTPS21-mutation优化序列(SEQ ID NO.3)：
ATGGCACAGATTAGCATTGGCGCCCCGCTGAGTGCCGAAGTTAATGGTAGTTGTATTAATACCCATCATCATGGCAATCTGTGGGATGATTACTTCATTCAGAGCCTGAAAAGCCCGTATGAAGCCCCGGAATGCCATGAACGTTGCGAAAAAATGATTGAAGAAGTTAAACACCTGCTGCTGAGCGAAATGCGCGATGGTAATGATGATCTGATTAAACGCCTGCAGATGGTGGATATCTTCGAATGTCTGGGTATTGATCGTCACTTCCATCATGAAATTCAGGCAGCCCTGGATTATGTGTATCGTTATTGGAATGAACTGGAAGGCATTGGTGTTGGTACCCGCGATAGCCTGACCAAAGATCTGAATGCAACCGGCCTGGGCTTCCGTGCCCTGCGTCTGCATCGCTATAATGTGAGCAGCGCCGTTCTGGAAAACTTCAAAAATGAAAATGGCCTGTTCTTCCATAGTAGCACCGTTCAGGAAGAAGAAGTTCGTTGCATGCTGACCCTGCTGCGTGCCAGTGAAATTAGCTTCCCGGGTGAAAAAGTTATGGATGAAGCAAAAGCATTCGCCACCGAATATCTGAATCAGCTGCTGACCCGTGTTGATATTCGTGAAGTTGGCGAAAGTCTGCTGCGTGAAGTGCGCTATGCACTGGACTTCCCGTGGTATTGTAGCGTTCCGCGCTGGGAAGCACGCAGCTTCATTGAAATCTTCGGCCAGAGTAATAGCTGGCTGAATAGCACCATGAATAAAAAAGTGCTGGAACTGGCCAAACTGGACTTCAATATTCTGCAGAGTGCCCATCAGCGCGAACTGCAGCTGCTGAGTCGTTGGTGGAGTCAGAGCGATATTGAAAAACAGAACTTCTATCGTAAGCGTCATGTGGAATTCTACTTCTGGATGGTGATTGGTACCTTCGAACCGGAATTCAGTAGCAGCCGCATTGCATTCGCCAAAATTGCAACCCTGATGACCGTTCTGGATGATCTGTATGATACCCATGGCACCCTGGAACAGCTGAAAATCTTCACCGAAGCAGTTAAACGTTGGGATCTGAGTCTGCAGGATCGTCTGCCGGATTATATTAAAATTACCCTGGAATTCTTCTTCAACACCAGTAATGAACTGAATGCAGAAGTGGCAAAAATGCAGGAACGTGATATGAGTGCATATATTCGTAAAGCAGGTTGGGAACGCTATCTGGAAGGTTATATGCAGGAAAGTGAATGGATGGCAGCCCGTCATGTTCCGACCTTCGATGATTATATGAAAAATGGCAAACCGAGCAGCGGCATGTGTATTCTGAATCTGTATAGTCTGCTGCTGATGGGTCAGCTGGTTCCGGATAATATTCTGGAACAGATTCATCTGCCGAGCAAAATTCATGAACTGGTGGAACTGACCGCACGCCTGGTTGATGATAGTAAAGACTTCCAGGCAAAAAAAGATGGCGGCGAATTCGCCAGTGGTATTGAATGTTATCTGAAAGAAAAGCCGGAATGTACCGAAGAAGATGCAATGAATCATCTGATTGGTCTGCTGAATCTGACCGCCATGGAACTGAATTGGGAATTCGTGAAACATGATGGTGTGGCCCTGTGTCTGAAAAAATTCGTGTTCGAAGTTGCACGTGGCCTGCGCTTCATCTATAAATATCGCGATGGCTTCGATTATAGTAATGAAGAAATGAAAAGCCAGATCACCAAAATTCTGATTGATCAGGTGCCGATTTAA。
(4)蛋白诱导表达与纯化
a、首先，根据大肠杆菌BL21(DE3)菌株的密码子偏好性进行PmTPS21-mutation(SEQ IDNO.3)的CDS序列设计与合成，根据PmTPS21-mutation与表达载体序列特征设计两端酶切位点(上游为Nde I(CATATG)，下游为Hind III(AAGCTT))。同时设计扩增引物F和R(上游引物F2:5′-CATATGATGGCACAGATTAGCATTGGCGCCCCG-3′，下游引物R2:5′-AAGCTTTTAAATCGGCACCTGATCAATCAGA-3′)两端添加Nde I与Hind III酶切位点，对合成的CDS优化全长序列进行克隆，原理同步骤(2)，最终同样得到含有目的基因优化序列克隆载体且测序正确的阳性菌株。接着，将阳性菌株加入LB液体培养基进行摇菌，完毕后利用质粒提取试剂盒(Tiangen)进行大肠杆菌质粒提取。同时，用限制性内切酶Nde I与Hind III(Promega)反应体系进行含有目的基因的克隆载体(步骤(3)获得)与pET28a空载体(Solarbio)双酶切，其中酶切体系(20μL)为：质粒/载体10μL、限制性内切酶Nde I与Hind III各0.5μL、牛血清白蛋白(BSA)0.2μL、限制性内切酶缓冲液2μL，ddH2O 6.8μL，酶切时间为3h。对酶切产物进行琼脂糖凝胶检测和凝胶回收，方法同上述步骤②。随后，利用T4 DNA连接酶(Promega)进行目的基因和pET28a空载体酶切产物的连接，其中连接体系(20μL)为：T4 DNA连接酶缓冲液2μL、T4 DNA连接酶1μL、pET28a空载体酶切产物4μL、目的基因13μL，混合后离心，4℃过夜连接，构建得到pET28a重组表达载体。
b、将构建的pET28a重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，以构建重组表达工程菌。筛选阳性菌株(具体步骤和引物同上述步骤(2)与(3)中阳性克隆载体筛选)并选取单克隆于LB液体培养基37℃培养至菌液OD600为0.6～0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，37℃培养4h后离心，利用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测，SDS-PAGE制备步骤(下同)：8％分离胶体系(5mL)：ddH2O 2.42mL，Acr-Bis 1.33mL，分离胶缓冲液1.25mL，过硫酸铵(APS)50μL，四甲基乙二胺(TEMED)3μL；5％浓缩胶体系(2mL)：ddH2O 1.14mL，Acr-Bis 0.34mL，浓缩胶缓冲液0.5mL，APS 20μL，TEMED 2μL。经SDS-PAGE检测，目的蛋白可正常表达；向菌液中加入IPTG至终浓度分别为0.2mM与1mM，分别在37℃和15℃、220rpm培养5h和15h，诱导融合蛋白表达，然后将菌液离心，并将获得的上清和沉淀分别制样，进行SDS-PAGE检测；再取上一步各条件菌液离心收集的菌体，破碎(PBS缓冲液)，制样，经SDS-PAGE检测，目的蛋白在上清液中表达(图5A)。
c、将表达最优的克隆菌株于37℃条件下扩大培养(1L)至OD600＝0.6～0.8，15℃诱导16h后停止培养；离心收菌，重悬菌体，超声破碎；离心后，上清进行Ni柱亲和层析纯化：平衡缓冲液：Tris-NaCl缓冲液，pH8.0；清洗缓冲液：含50mM咪唑的Tris-NaCl缓冲液，pH8.0；洗脱缓冲液：含500mM咪唑的Tris-NaCl缓冲液，pH8.0。SDS-PAGE检测亲和层析纯化得到的目的蛋白(图5B)。
(5)纯化蛋白酶学反应
在2mL样品瓶中按以下体系配制酶促反应液(100μL)：1M Tris-HCl(pH7.4)(5μL)、ddH2O(57.75μL)、2M MgCl2(0.75μL)、1M二硫苏糖醇(DTT)(0.5μL)、纯化后的蛋白样品35μL，分别加入底物香叶基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)各1μL，共进行3个重复实验，以不加PmTPS21-mutation的蛋白酶反应液为对照(表1)。30℃水浴1h并用50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取萃取头顶空萃取，萃取完后直接进行GC-MS检测。其中，GC-MS检测采用Agilent 6890N-5973MS，检测方法如下：手动上样，进样口温度270℃，解析时间4min，不分流进样，氦气流速1.0mL/min，DB-5MS毛细管柱分离(长30m×直径0.25mm×膜厚0.25μm)，起始温度50℃，保留2min，3℃/min升温到80℃，保留2min，5℃/min升温到180℃，保留1min，10℃/min升温到230℃，保留1min，20℃/min升温到250℃，保留3min。结果如图6所示。
表1酶促反应体系
经GC-MS检测，空白对照反应体系没有任何萜类物质产生，PmTPS21-mutation蛋白的作用底物为FPP，主要产物为α-longipinene(α-长叶蒎烯)、longifolene(长叶烯)、10s,11s-Himachala-3(12),4-diene等(图6)。3个产物出峰时间分别为23.14、24.89、26.95min，经3个重复实验结果相对含量计算分析，α-长叶蒎烯占总产物的58.45％，长叶烯占总产物的20.52％，10s,11s-Himachala-3(12),4-diene占总产物的18.18％(表2)。
表2 PmTPS21-mutation酶促反应产物与含量
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种马尾松多功能萜类合成酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.权利要求1所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
3.含有权利要求2所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因的重组载体或重组工程菌。
4.权利要求1所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建重组载体
①将如SEQ ID NO.2所示的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因序列上添加Nde I与Hind III酶切位点，再连接至puc-BLUNT克隆载体，得到重组载体I；
或
②将SEQ ID NO.2所示的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化设计，获得SEQ ID NO.3所示的优化后的序列；然后在优化后的序列上添加Nde I与Hind III酶切位点，再连接至puc-BLUNT克隆载体，得到重组载体Ⅱ；
（2）构建重组表达载体
将重组载体I或重组载体Ⅱ利用限制性内切酶Nde I与Hind III进行质粒双酶切，获得目的基因片段；同时，将pET28a空载体利用限制性内切酶Nde I与Hind III进行双酶切，得到pET28a空载体酶切产物；然后将目的基因片段与pET28a空载体酶切产物连接，构建得到pET28a重组表达载体；
（3）诱导表达
将pET28a重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组表达工程菌；然后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，得到所述马尾松多功能萜类合成酶突变体。
5.根据权利要求4所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的添加量按其在反应体系的终浓度为0.2～1mmol/L添加计算；
步骤（3）中所述的诱导表达的温度为15～37℃；
步骤（3）中所述的诱导表达的时间为5～15 h。
6.根据权利要求4所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的制备方法，其特征在于：在步骤（3）之后还包括将马尾松多功能萜类合成酶突变体进一步纯化的步骤；具体为：诱导表达结束后，离心收集菌体，重悬，超声破碎，然后将上清利用Ni柱亲和层析进行纯化，其平衡缓冲液为pH8.0的Tris-NaCl缓冲液，清洗缓冲液为pH8.0、含50 mM咪唑的Tris-NaCl缓冲液，洗脱缓冲液为pH8.0、含500 mM咪唑的Tris-NaCl缓冲液。
7.权利要求1所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体和/或权利要求2所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体的编码基因在生产倍半萜产品中的应用，其特征在于：所述的倍半萜为α-长叶蒎烯、长叶烯和10s,11s-Himachala-3(12),4-diene中的至少一种。
8.一种生产倍半萜类化合物的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的马尾松多功能萜类合成酶突变体催化法尼基焦磷酸FPP，得到倍半萜类化合物；其中，倍半萜类化合物为α-长叶蒎烯、长叶烯和10s,11s-Himachala-3(12),4-diene中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的生产倍半萜类化合物的方法，其特征在于：
所述的催化的温度为25～35℃；
所述的催化的时间为1小时以上。
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