CN108048494A

CN108048494A - 一种利用生物酶合成1,3-丙二醇的方法

Info

Publication number: CN108048494A
Application number: CN201711470812.2A
Authority: CN
Inventors: 江会锋; 杨群; 杨一群; 刘玉万; 卢丽娜; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin National Synthetic Biotechnology Innovation Center Co ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108048494B

Abstract

本发明公开了一种利用生物酶合成1,3‑丙二醇的方法。本发明提供了DERA蛋白或所述DERA蛋白相关生物材料在合成1,3‑丙二醇中的应用，以及利用DERA蛋白和yqhD蛋白生物合成1,3‑丙二醇的具体方法。本发明构建并实现了1,3‑丙二醇的新途径，此途径不需要辅酶B12的参与，有潜力成为1,3‑丙二醇工业生产的新方法。

Description

一种利用生物酶合成1,3-丙二醇的方法

技术领域

本发明涉及生物酶合成领域，具体涉及一种利用生物酶合成1,3-丙二醇的方法。

背景技术

1,3-丙二醇是一种重要的化学中间体，可以参与聚合反应生产聚醚、聚氨酯和聚酯。与1,2-丙二醇、丁醇和乙二醇为前体合成的聚合物相比，以1,3-丙二醇为前体合成的聚合物具有更好的性能和稳定性，因此被广泛应用于纺织业、塑剂、冷却剂等。如1,3-丙二醇和对苯二甲酸发生聚合反应形成的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，主要用于制造地毯、纺织纤维，用这种聚合物制成的纺织品具有良好的拉伸弹性、复苏性、防沾污性；在发动机冷却配方中加1,3-丙二醇，可以增强热稳定性并且减少腐蚀性，而且比用乙二醇作冷却剂毒性小。近来还发现1,3-丙二醇还可以用于热塑性塑料、涂料和胶片的制造，如用1,3-丙二醇合成的热塑性聚氨酯(TPU)，改善了热水解性和热稳定性。

1,3-丙二醇合成方法主要分为化学合成法和微生物合成法，化学法主要有环氧乙烷羰基化法和丙烯醛水合氢化法。目前通用的微生物法生产1,3-丙二醇主要是利用微生物将甘油转化为1,3-丙二醇。生物柴油生产过程中会生成一部分副产物甘油，以此为发酵底物生产1,3-丙二醇，可大大降低生产成本，但是该方法需要使用甘油脱水酶和辅酶B12。而甘油脱水酶(glycerol dehydratase)是甘油代谢还原途径中的限速酶，它是由dhaB1、dhaB2、dhaB3三个基因编码合成的三个亚基组成，并且在辅酶B12的参与下，催化甘油脱去一分子水形成3-羟基丙醛。辅酶B12易与甘油相互作用，使得C-Co键发生断裂，形成了5'-脱氧腺苷和烷基氰钴胺素类似物，烷基氰钴胺素类似物可以与甘油脱水酶紧密结合使之失去催化活性，甘油脱水反应停止。甘油脱水酶的这种现象严重影响甘油的转化。除了上述情况外，甘油脱水酶在氧存在的情况下也会失活，研究表明氧的存在对甘油脱水酶的酶活有强烈的影响，与无氧情况下的甘油脱水酶相比，暴露在氧中的甘油脱水酶在5min内酶活下降80％，并且在60min后酶活彻底丧失。同样甘油浓度对甘油脱水酶也有抑制作用，浓度越高抑制作用越大。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用生物酶DERA催化合成1,3-丙二醇的方法，该方法不需要辅酶B12的参与。

第一，本发明要求保护DERA蛋白或所述DERA蛋白相关生物材料在合成1,3-丙二醇中的应用。

其中，所述DERA蛋白具体可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述DERA蛋白相关生物材料为能够表达所述DERA蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

进一步地，所述应用为所述“DERA蛋白或所述DERA蛋白相关生物材料”和“yqhD蛋白或所述yqhD蛋白相关生物材料”在合成1,3-丙二醇中的应用。

其中，所述yqhD蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；

(B2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述yqhD蛋白相关生物材料为能够表达所述yqhD蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

进一步地，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述表达盒可由能够启动所述核酸分子转录的启动子，所述核酸分子，以及转录终止序列组成。

第二，本发明要求保护一种合成的1,3-丙二醇方法。

本发明所提供的合成的1,3-丙二醇方法，可为如下方法I或方法II。

方法I：一种合成的1,3-丙二醇方法，包括如下步骤：

(a1)以甲醛和乙醛作为底物，经DERA蛋白催化反应生成3-羟基丙醛；

(a2)以3-羟基丙醛作为底物，经yqhD蛋白催化反应生成1,3-丙二醇。

所述DERA蛋白为前文(A1)-(A4)任一所示蛋白；所述yqhD蛋白为前文(B1)-(B4)任一所示蛋白。

方法II：一种合成的1,3-丙二醇方法，包括如下步骤：

(b1)以乙醇为底物经yqhD蛋白催化反应生成乙醛；

(b2)以乙醛和甲醛作为底物，经DERA蛋白催化反应生成3-羟基丙醛；

(b3)以3-羟基丙醛作为底物，经yqhD蛋白催化反应生成1,3-丙二醇；

在所述方法中，所述DERA蛋白和所述yqhD蛋白均可以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用。

进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶均可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白，得到的重组细胞即为所述全细胞。

再进一步，所述重组细胞具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：向所述宿主细胞导入能够表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的所述重组细胞。

更进一步，所述“能够表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。其中，所述重组载体可为携带有所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

进一步地，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。

更进一步地，所述原核细胞具体可为细菌；所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。

在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞具体为大肠杆菌，更加具体的为E.coliBL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.1-2mM(具体如0.5mmol/L)，10℃-37℃(具体如16℃)诱导培养2-24小时(具体如16小时)。

在本发明中，所述方法I具体包括如下步骤：配制含有甲醛、乙醛、所述DERA蛋白和所述yqhD蛋白的反应体系，将所述反应体系于20℃-37℃(具体如37℃)反应0.5小时以上(具体如4h)，然后从反应产物中获得1,3-丙二醇。

其中，将所述反应体系于20℃-37℃(具体如37℃)反应0.5小时以上(具体如4h)，还包括60-100℃(具体如70℃)加热2min以上(具体如3min)使蛋白沉淀，后离心(如12000rpm离心25min)除去蛋白沉淀的步骤。

另外，所述方法I的反应体系中还可含有能够为反应外加还原力的物质以及NADPH。

在本发明中，所述能够为反应外加还原力的物质具体为葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。反应过程中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶将葡萄糖-6-磷酸脱氢的过程会为所述yqhD蛋白催化3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇的步骤提供还原力。

在所述方法中，所述反应可在pH为7-9的缓冲液中进行。

在本发明中，所述反应具体是在pH为8.0的50mM磷酸缓冲液中进行的。

更加具体地，所述反应体系组成如下：终浓度为1mg/ml的所述DERA蛋白；终浓度为0.5mg/mL的所述yqhD蛋白；终浓度为50mM的甲醛；终浓度为20mM的乙醛；终浓度为25mM的葡萄糖-6-磷酸，终浓度为1mM的NADPH；含量为5U的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；余量为pH为7-9的缓冲液(具体如pH为8.0的50mM磷酸缓冲液)。

在本发明中，所述方法II具体包括如下步骤：配制含有乙醇、甲醛、所述DERA蛋白和所述yqhD蛋白的反应体系，将所述反应体系于20℃-37℃(具体如37℃)反应0.5小时以上(具体如4h)，然后从反应产物中获得1,3-丙二醇。

另外，所述方法II的反应体系中还可含有NADPH。

在所述方法中，所述反应可在pH为7-9的缓冲液中进行。

更加具体地，所述反应体系组成如下：终浓度为1mg/ml的所述DERA蛋白；终浓度为0.5mg/mL的所述yqhD蛋白；终浓度为90mM的乙醇；终浓度为20mM的甲醛；终浓度为5mM的NADPH；余量为pH为7-9的缓冲液(具体如pH为8.0的50mM磷酸缓冲液)。

在本发明中，所述能够表达DERA蛋白的核酸分子为所述DERA蛋白的编码基因，具体可为如下任一：

(C1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(C2)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(C3)在严格条件下与(C1)或(C2)限定的DNA分子杂交且编码所述DERA蛋白的DNA分子；

(C4)与(C1)-(C3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述DERA蛋白的DNA分子。

所述能够表达yqhD蛋白的核酸分子为所述yqhD蛋白的编码基因，具体可为如下任一：

(D1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码所述yqhD蛋白的DNA分子；

(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述yqhD蛋白的DNA分子。

本发明构建并实现了1,3-丙二醇的新途径，此途径不需要辅酶B12的参与，有潜力成为1,3-丙二醇工业生产的新方法。

附图说明

图1为pET-28a-Dera的质粒图谱。

图2为体外纯酶反应GC-MS检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pET-28a由苏州鸿讯公司提供。

E.coli BL21(DE3)菌株为全式金公式产品，货号为CD601-03。

实施例1、DERA蛋白和yqhD蛋白的获得

一、DERA蛋白的获得

1、Dera基因获得

2-deoxyribose-5-phosphate aldolase简称DERA酶，在多种物种中存在，在短乳杆菌中发现Dera基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1，该基因可编码DERA蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2，在不改变DERA氨基酸序列的前提下，将上述野生型Dera基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后Dera基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列为SEQ ID No.3。

2、表达载体的构建

将SEQ ID No.3所示的优化后Dera基因克隆到pET-28a载体(Novagen，Kan⁺，)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-28a-Dera(图1)。

pET-28a-Dera的结构描述：将pET-28a载体酶切位点NdeI和XhoI之间的小片段替换为SEQ ID No.3所示DNA片段后得到的重组质粒。

3、基因的表达

为了体外检测DERA酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-Dera转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan⁺，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑取单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心10min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(pH为8.0的50mM磷酸缓冲液)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

4、蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下对于上述步骤3得到的菌体沉淀破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样。

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液(配方同上)平衡Ni亲和层析柱1个柱体积。

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次。

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液(配方同上)冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白缓冲液(配方同上)去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样。

d：洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM，200mM，300mM咪唑的蛋白缓冲液(配方同上)将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(10kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3500r/min)，浓缩至1mL。加15mL蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化的蛋白DERA。

(4)用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测浓缩后蛋白浓度，为20mg/mL。即得到纯化浓缩的DERA蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

二、yqhD蛋白的获得

本发明实验中用到的1.3-丙二醇氧化还原酶基因yqhD来源于大肠杆菌。采用PCR技术以Escherichia coli str.K-12substr.MG1655菌株基因组为模板扩增得到yqhD基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.4，将该基因克隆到pET-28a载体上，该基因编码的蛋白为yqhD蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.5，其表达载体构建及基因表达和蛋白纯化均同步骤一。此处不再赘述。

实施例2、DERA蛋白和yqhD蛋白在合成1.3-丙二醇中的应用

一、DERA参与的催化甲醛及乙醇缩合合成1.3-丙二醇

反应方程式如下：

二、体外DERA纯酶功能验证

空白对照反应体系(500μL)：50mM甲醛及20mM乙醛，25mM葡糖糖-6-磷酸，1mMNADPH，5U葡糖糖-6-磷酸脱氢酶，和蛋白缓冲液(50mM磷酸盐，pH＝8)。

DERA反应体系(500μL)：1mg/ml实施例1制备纯化的DERA蛋白及0.5mg/mL实施例1制备纯化的yqhD蛋白，50mM甲醛及20mM乙醛，25mM葡糖糖-6-磷酸，1mM NADPH，5U葡糖糖-6-磷酸脱氢酶，和蛋白缓冲液(50mM磷酸盐，pH＝8)。

将上述各组反应体系混匀后于37℃反应4h。反应结束后，70℃加热3min使蛋白沉淀，后于12000rpm下离心25min除去蛋白沉淀，取出上清进行液相检测。检测到1.3丙二醇。

检测方法如下：

采用Aminex HPX-87H色谱柱；

进样量：10μl；

柱温：40℃；

流动相：5mM稀硫酸；

流速：0.6mL/min。

然后将上清样品冷冻干燥除水衍生后进行GC-MS检测。结果如图2所示。图2中，A为无DERA蛋白对照气相色谱图；B为实验组气相色谱图；C为实验组二级质谱图。由图2可见，在DERA蛋白和yqhD蛋白存在的情况下，甲醛和乙醛能够转化为1.3-丙二醇。

气相色谱色谱条件：

进样量：1μL；

进样口温度：250℃；

分流比10:1；

载气流量：1.2mL/min；

程序升温条件：起始温度60℃，维持一分钟，以5℃/min升到100℃，以25℃/min升到300℃，维持5min。

质谱条件为：

离子源：EI，离子源温度：250℃，发射电流：9.6μA，电离能：70ev，溶剂延迟：3min，质量范围：50-450amu。

三、DERA联合yqhD参与的催化甲醛及乙醇缩合合成1.3-丙二醇

空白对照反应体系(500μL)：20mM甲醛及90mM乙醇，5mM NADPH，和蛋白缓冲液(50mM磷酸盐，pH＝8)。

混合酶反应体系(500μL)：1mg/ml实施例1制备纯化的DERA蛋白及0.5mg/mL实施例1制备纯化的yqhD蛋白，20mM甲醛及90mM乙醇，5mM NADPH，和蛋白缓冲液(50mM磷酸盐，pH＝8)。

将上述各组反应体系混匀后于37℃反应4h。反应结束后，70℃加热3min使蛋白沉淀，后于12000rpm下离心25min除去蛋白沉淀，取出上清进行液相检测，检测到1.3丙二醇。

检测方法如下：

采用Aminex HPX-87H色谱柱；

进样量：10μl；

柱温：40℃；

流动相：5mM稀硫酸；

流速：0.6mL/min。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种利用生物酶合成1,3-丙二醇的方法

<130> GNCLN172325

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> 短乳杆菌（Lactobacillus breris）

<400> 1

gtaaccagct ttagcatgac tgtcgtcacc cgttaagatg gctacggttg cactgacacc 60

catccgactg gcaccagcat cgatcatagc taaggcttct tcacgactgt ggataccacc 120

ggaagccttg acgcctaagc gatcgccaac tgtttcacgc atcaacttaa catcttcaac 180

cttagcacct gatgttgaga acccagtgga cgtcttaaca aagtcagcac cggctttttc 240

actcaactga caagcccgga caatttcatc cttcgttaac aacgcatttt ccaagataac 300

ttttagaatt ttacccttag cgtggactgc atcagctaga ccctgaatgt ctgccaagac 360

cttctcatca ttaccgcctt ttaattcacc tacgttcaag accatatcga tttcttcggc 420

cccttgatcg atggctgtcg tggcttcaaa gatttcactt tccgttgcca tggcccctag 480

tggaaaacca acgacagcga ttggattaac atcagttccc tttaattgct cagttacaaa 540

cggaatccaa taggagttta cgcagaccga agccgtgtta aatttcttag cttcgtcaca 600

agtttgcttg atatctgctt cagttgcatc tgcctttaaa ttagtgtgat caatgtactt 660

cgctaattgt tctgtggtta atgtcat 687

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 短乳杆菌（Lactobacillus breris）

<400> 2

Met Thr Leu Thr Thr Glu Gln Leu Ala Lys Tyr Ile Asp His Thr Asn

1 5 10 15

Leu Lys Ala Asp Ala Thr Glu Ala Asp Ile Lys Gln Thr Cys Asp Glu

20 25 30

Ala Lys Lys Phe Asn Thr Ala Ser Val Cys Val Asn Ser Tyr Trp Ile

35 40 45

Pro Phe Val Thr Glu Gln Leu Lys Gly Thr Asp Val Asn Pro Ile Ala

50 55 60

Val Val Gly Phe Pro Leu Gly Ala Met Ala Thr Glu Ser Lys Ile Phe

65 70 75 80

Glu Ala Thr Thr Ala Ile Asp Gln Gly Ala Glu Glu Ile Asp Met Val

85 90 95

Leu Asn Val Gly Glu Leu Lys Gly Gly Asn Asp Glu Lys Val Leu Ala

100 105 110

Asp Ile Gln Gly Leu Ala Asp Ala Val His Ala Lys Gly Lys Ile Leu

115 120 125

Lys Val Ile Leu Glu Asn Ala Leu Leu Thr Lys Asp Glu Ile Val Arg

130 135 140

Ala Cys Gln Leu Ser Glu Lys Ala Gly Ala Asp Phe Val Lys Thr Ser

145 150 155 160

Thr Gly Phe Ser Thr Ser Gly Ala Lys Val Glu Asp Val Lys Leu Met

165 170 175

Arg Glu Thr Val Gly Asp Arg Leu Gly Val Lys Ala Ser Gly Gly Ile

180 185 190

His Ser Arg Glu Glu Ala Leu Ala Met Ile Asp Ala Gly Ala Ser Arg

195 200 205

Met Gly Val Ser Ala Thr Val Ala Ile Leu Thr Gly Asp Asp Ser His

210 215 220

Ala Lys Ala Gly Tyr

225

<210> 3

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgaccctga ccaccgaaca gctggctaaa tacatcgacc acaccaacct gaaagctgac 60

gctaccgaag ctgacatcaa acagacctgc gacgaagcta aaaaattcaa caccgcttct 120

gtttgcgtta actcttactg gatcccgttc gttaccgaac agctgaaagg taccgacgtt 180

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gaagctacca ccgctatcga ccagggtgct gaagaaatcg acatggttct gaacgttggt 300

gaactgaaag gtggtaacga cgaaaaagtt ctggctgaca tccagggtct ggctgacgct 360

gttcacgcta aaggtaaaat cctgaaagtt atcctggaaa acgctctgct gaccaaagac 420

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atgatcgacg ctggtgcttc tcgtatgggt gtttctgcta ccgttgctat cctgaccggt 660

gacgactctc acgctaaagc tggttac 687

<210> 4

<211> 1164

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 4

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 5

Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val

20 25 30

Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp

35 40 45

Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly

50 55 60

Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu

65 70 75 80

Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser

85 90 95

Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu

100 105 110

Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys

115 120 125

Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser

130 135 140

Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg Lys Thr Thr Gly Asp Lys

145 150 155 160

Gln Ala Phe His Ser Ala His Val Gln Pro Val Phe Ala Val Leu Asp

165 170 175

Pro Val Tyr Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val

180 185 190

Val Asp Ala Phe Val His Thr Val Glu Gln Tyr Val Thr Lys Pro Val

195 200 205

Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu

210 215 220

Ile Glu Asp Gly Pro Lys Ala Leu Lys Glu Pro Glu Asn Tyr Asp Val

225 230 235 240

Arg Ala Asn Val Met Trp Ala Ala Thr Gln Ala Leu Asn Gly Leu Ile

245 250 255

Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu

260 265 270

Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val

275 280 285

Leu Pro Ala Leu Trp Asn Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu

290 295 300

Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Glu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln

325 330 335

Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser

340 345 350

Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu

355 360 365

Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu

370 375 380

Ala Ala Arg

385

Claims

1.DERA蛋白或所述DERA蛋白相关生物材料在合成1,3-丙二醇中的应用；

所述DERA蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为所述“DERA蛋白或所述DERA蛋白相关生物材料”和“yqhD蛋白或所述yqhD蛋白相关生物材料”在合成1,3-丙二醇中的应用；

所述yqhD蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

3.一种合成的1,3-丙二醇方法，包括如下步骤：

(a2)以3-羟基丙醛作为底物，经yqhD蛋白催化反应生成1,3-丙二醇；

所述DERA蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

所述yqhD蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；

4.一种合成的1,3-丙二醇方法，包括如下步骤：

(b1)以乙醇为底物经yqhD蛋白催化反应生成乙醛；

所述DERA蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

所述yqhD蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述DERA蛋白和所述yqhD蛋白均是以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的；

进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶；

进一步，所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白，得到的重组细胞即为所述全细胞；

再进一步，所述重组细胞是按照包括如下步骤的方法制备获得的：向所述宿主细胞导入能够表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的所述重组细胞；

更进一步，所述“能够表达所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的；所述重组载体为携带有所述DERA蛋白和/或所述yqhD蛋白的编码基因的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒；

和/或

所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞；

具体的，所述原核细胞为细菌；所述低等真核细胞为酵母细胞；

更加具体的，所述细菌为大肠杆菌。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：配制含有甲醛、乙醛、所述DERA蛋白和所述yqhD蛋白的反应体系，将所述反应体系于20-37℃反应0.5h以上，然后从反应产物中获得1,3-丙二醇。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述反应体系中还含有能够为反应外加还原力的物质以及NADPH。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：配制含有乙醇、甲醛、所述DERA蛋白和所述yqhD蛋白的反应体系，将所述反应体系于20-37℃反应0.5h以上，然后从反应产物中获得1,3-丙二醇。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述反应体系中还含有NADPH。

10.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述能够表达DERA蛋白的核酸分子为所述DERA蛋白的编码基因，为如下任一：

(C1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(C2)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(C4)与(C1)-(C3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述DERA蛋白的DNA分子；

所述能够表达yqhD蛋白的核酸分子为所述yqhD蛋白的编码基因，为如下任一：

(D1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；