KR20140145397A - 1,3-프로판디올 생성 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조 방법 - Google Patents

1,3-프로판디올 생성 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조 방법 Download PDF

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이승환
오영훈
제갈종건
송봉근
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한국화학연구원
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Abstract

본 발명은 1,3-프로판디올 생성 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명은 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB) 효소 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(dehydrogenase; DhaT) 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 1,3-프로판디올 생성능이 결여된 균주에 형질전환시켜 제조한 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물에 관한 것으로, 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 함유한 배지에서 배양할 경우 1,3-프로판디올 대량생산 산업화 기술 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

1,3-프로판디올 생성 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조 방법{Recombinant microorganisms producing 1,3-propanediol and the method for preparing 1,3-propanediol using the same}
본 발명은 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생성 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주 및 상기 재조합 균주를 이용한 1,3-프로판디올 생성 방법에 관한 것이다.
근래의 전 세계적인 국제 원유가격 상승과 기존의 화석연료 기반 산업으로 인한 환경오염 등의 문제로 인해 친환경적인 화합물 생산에 대한 연구 개발이 가속화되고 있다. 이에 미국과 브라질, 유럽 등을 중심으로 많은 국가에서 다양한 생물공정이 개발되고 있다. 바이오디젤은 바이오에탄올과 함께 가장 보편화된 바이오연료로써 폐식용유와 같은 식물성 기름이나 해양 미세조류 등으로부터 생산되는데 1990년대 초반부터 미국과 유럽을 중심으로 보급되기 시작하여 2008년에는 세계 바이오디젤 생산 총량이 9300만 kl가 될 정도로 성장하였다. 우리나라에서도 2007년 정부차원에서의 '바이오디젤 중장기 보급계획'을 수립하는 등 지속적인 바이오디젤 시장의 확대가 기대되고 있다. 바이오디젤의 생산과정에서 바이오디젤 생산량의 10분의 1에 달하는 글리세롤이 발생하는데, 이로 인한 2차적인 환경 및 경제문제의 발생을 줄이기 위해 여러 가지 방안이 고안되고 있다.
1,3-프로판디올은 다양한 정밀화학제품의 원료가 되는 화합물로써 접착제, 윤활유, 용매, 부동액, 식품, 고분자, 화장품 및 의약품(예: 퍼스널케어, 홈케어) 등의 다양한 화학제품의 원료로 사용된다. 기존의 1,3-프로판디올 시장은 다른 벌크화합물에 비해 상대적으로 높은 생산단가와 낮은 생산량으로 인해 작은 편이었으나, 최근에 재생 가능한 원료로부터 생물학적 전환을 이용한 경제적인 생산공정이 개발됨에 따라 확대되고 있다. 1,3-프로판디올은 화학적인 전환 및 생물학적 전환을 통해 생산이 가능하고, 특히 1,3-프로판디올은 생물학적 전환을 통한 생산이 화학적 전환을 통한 생산에 대해 경제적인 관점에서 비교 우위를 점할 수 있는 몇 안 되는 화합물 중의 하나이다.
1,3-프로판디올은 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 등의 미생물에 의해 생산이 가능하다. 클로스트리디움 속 미생물 중에서, 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 및 클로스트리디움 파스튜리아눔(C. pasteurianum)이 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생산할 수 있다.
클로스트리디움 베이저링키(C. beijerinckii)는 발효산업에서 주목받고 있는 미생물 종 중의 하나로서 몇 가지 두드러진 특징을 갖는다. 첫째, 클로스트리디움 베이저링키는 농업부산물을 포함한 다양한 탄소원을 이용하여 성장 가능하며 고농도의 발효산물을 생산한다. 둘째, 또 다른 클로스티리디움 속 산업미생물인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) 등에서 균의 퇴화(degeneration of the strain)를 야기하는 별도의 플라스미드(plasmid)를 갖지 않으며, 모든 대사관련 유전자들이 염색체 상에 존재한다. 셋째, 염색체 상의 모든 유전정보가 밝혀져 유전공학, 혹은 대사공학적 균주 개량이 용이하다.
전세계적으로 1,3-프로판디올의 시장이 확대됨에 따라 보다 경쟁력 있는, 기존에 개발된 1,3-프로판디올 생산 균주가 갖지 못하는 장점을 갖고 있는 새로운 산업 균주를 개발이 현재의 1,3-프로판디올 산업계 및 학계에 의해 요구되고 있고, 클로스트리디움 베이저링키와 동일한 속에 속하는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이 대사공학적인 개량을 통해 자연생산종과 비견될만한 양의 1,3-프로판디올을 생산한 것을 고려할 때, 산업미생물로서 상기와 같은 장점을 갖는 클로스트리디움 베이저링키도 대사공학적인 개량을 통해 많은 양의 1,3-프로판디올을 생산할 것으로 기대할 수 있으나 아직까지 클로스트리디움 베이저링키를 이용한 1,3-프로판디올의 생산은 보고된 적이 없다.
이에 본 발명자들은 1,3-프로판디올을 생산하는 재조합 미생물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 1,3-프로판디올을 생산하지 못하지만 산업미생물로서 많은 장점을 갖는 클로스트리디움 베이저링키 균주에 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생산하는데 관여하는 효소인 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB) 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(1,3-propanediol dehydrogenase; DhaT) 효소를 암호화하는 유전자를 도입한 결과, 상기 재조합 미생물은 글리세롤 대사능력이 향상되고, 1,3-프로판디올을 유의적으로 생산함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은,
글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(1,3-propanediol dehydrogenase; DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 제조된 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 미생물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
1) 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 또는
2) 상기 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 클로스트리움 속 균주에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 클로스트리디움 속 균주 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 제조된 1,3-프로판디올 생산용 재조합 클로스트리디움 속 균주를 글리세롤(glycerol)을 포함하는 배지에 배양하는 1,3-프로판디올 생산 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(1,3-propanediol dehydrogenase; DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 클로스트리디움 속 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 클로스트리디움 속 균주에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 재조합 클로스트리디움 속 균주를 글리세롤(glycerol)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB) 효소 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(dehydrogenase; DhaT) 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 1,3-프로판디올 생성능이 결여된 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) 균주에 형질전환시켜 제조한 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물에 관한 것으로, 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 함유한 배지에서 배양할 경우 1,3-프로판디올 대량생산 산업화 기술 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB)를 과발현시키기 위한 발현 벡터의 지도를 나타낸 도이다.
도 2는 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 및 디하이드로지네이즈(dehydrogenase; DhaT)를 동시에 과발현시키기 위한 발현 벡터의 지도를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은,
1) 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(1,3-propanediol dehydrogenase; DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 1,3-프로판디올 생성능이 결여된 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 클로스트리디움 속 균주는 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB)는 비타민 B12 독립성(independent) 1,3-프로판디올 경로와 관련된 것이 바람직하고, 클로스트리디움 속 균주 유래의 비타민 B12 독립성 1,3-프로판디올 경로와 관련된 것이 보다 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB)는 서열번호 11로 기재되는 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT)는 서열번호 12로 기재되는 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 이용하여 재조합 벡터를 제작하였다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 1,3-프로판디올 생성능이 결여된 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) 균주에 상기 재조합 벡터를 각각 형질전환시켜 재조합 클로스트리디움 속 균주를 생성한 결과, 상기 재조합 클로스트리디움 속 균주는 글리세롤 대사 능력이 향상되고 1,3-프로판디올을 유의적으로 생산함을 확인하였다(표 1 참조).
따라서, 본 발명에 따른 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) 균주에서 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 발현함으로써, 향상된 글리세롤 대사 능력을 가지고 1,3-프로판디올을 유의적으로 생산하므로, 상기 재조합 미생물을 1,3-프로판디올 대량생산 산업화 기술 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은,
1) 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 클로스트리디움 속 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB)는 비타민 B12 독립성(independent) 1,3-프로판디올 경로와 관련된 것이 바람직하고, 클로스트리디움 속 균주 유래의 비타민 B12 독립성 1,3-프로판디올 경로와 관련된 것이 보다 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 발현 벡터는,
글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 또는
글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB)는 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT)는 서열번호 12로 기재되는 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은,
1) 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 1,3-프로판디올 생산용 재조합 클로스트리디움 속 균주를 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 재조합 클로스트리디움 속 균주를 글리세롤(glycerol)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올 생산 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 발현 벡터는,
글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 및
글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 배지는 클로스트리디움 속 균주 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용 가능하나, RCM 및 2YTG 배지가 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 배양은 24 내지 72 시간인 것이 바람직하고 48 시간인 것이 보다 바람직하며, 배양온도는 30 내지 40℃에서 실시하는 것이 바람직하고, 37℃인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 글리세롤 디하이드라타아제 ( glycerol dehydratase ) 및 1,3- 프로판디올 디하이드로지네이즈(1,3- propanediol dehydrogenase )의 분리
클로스티리디움(Clostridium) 속 균주인 클로스티리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) VPI 1718의 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB)를 암호화하는 유전자인 DhaB 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(1,3-propanediol dehydrogenase; DhaT)를 암호화하는 유전자인 DhaT를 포함하는 벡터를 합성(Bioneer, 한국)하고 이를 분리하기 위하여 PCR 및 전기영동을 수행하였다.
구체적으로, 합성한 DhaB와 DhaT를 포함하는 벡터를 주형으로 하고, 하기 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4의 프라이머들을 사용하여 최종부피가 20 ㎕가 되도록 PCR 반응을 위한 혼합액을 제조한 뒤 혼합액을 94℃에서 5 분간 변성, 94℃에서 30 초간 변성, 54℃에서 30 초간 재결합, 72℃에서 150 초간 신장 과정을 30회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10 분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 상기와 같은 방법으로 PCR을 통해 유전자 DhaB(서열번호: 11) 및 DhaT(서열번호: 12)를 젤 전기영동을 통해 분리하였다.
서열번호 1(DhaB 정방향): 5'-GGTACCTTGGAGGAGTAAAAATGATAAGTAA-3'
서열번호 2(DhaB 역방향): 5'-GGATCCTTACTCAGCTCCAATTGTGC-3'
서열번호 3(DhaT 정방향): 5'-GGATCCAGGAGAAGATTGCATATGAGAAT-3'
서열번호 4(DhaT 역방향): 5'-GCATGCTTAATAAGCAGCCTTAAAAATATTT-3'
< 실시예 2> 재조합 벡터의 제조
<2-1> 재조합 벡터 pKBE411 - DhaB 의 제조
클로스티리디움 유래의 글리세롤 디하이드라타아제를 암호화하는 DhaB 유전자를 포함한 발현 벡터를 제작하기 위하여, PCR 및 제한효소를 이용한 클로닝을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 증폭된 유전자 DhaB를 포함하는 PCR 절편을 제한효소인 KpnI 및 BamHI으로 절단하고, 이를 같은 제한효소로 절단한 클로스트리디움-대장균 셔틀벡터인 pKBE411-MCS와 결합시켜 pKBE411-DhaB를 제작하였다. 이때, 상기 pKBE411-MCS는, pKE12-MCS(Park et al. Appl . Microbiol . Biotechnol. 93, 273-283, 2012)을 주형 벡터로 사용하여 제작하였다. pMTL-500E(Outtram et al. FEMS Microbiol . lett . 56, 83-88, 1988)를 주형 DNA로 사용하였고, 서열번호 5 및 6을 프라이머 서열로 이용하였으며, 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 PCR 반응을 위한 혼합용액을 만든 뒤 94℃에서 5 분 동안 DNA를 변성시킨 후, 94℃에서 30 초 변성, 54℃에서 60 초 재결합, 및 72℃에서 90 초 신장 과정을 30회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10 분간 확장의 조건으로 PCR을 수행하여 pAMβ1 replicon을 수득한 후, pAMβ1 replicon을 pKE12-MCS의 XhoI 및 AatII의 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 그런 다음, 항생제인 에리트로마이신(erythromycin)에 대한 저항성 유전자를 얻기 위해 pMTL-500E를 주형 DNA로 하고, 서열번호 7 및 8을 프라이머 서열로 이용하였으며, 최종 부피가 20 μl가 되도록 PCR 반응을 위한 혼합용액을 만든 뒤 94℃에서 5 분동안 DNA를 변성시킨 후, 94℃에서 30 초 변성, 54℃에서 60 초 재결합, 및 72℃에서 90 초 신장 과정을 30회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10 분간 확장의 조건으로 PCR을 수행하여 에리트로마이신 저항성 유전자를 수득한 뒤, 상기 변형된 pKE12-MCS 플라스미드의 엠피실린(ampicillin) 저항성 유전자와 AatII 및 SpeI 제한효소를 이용하여 치환하였다. 또한, 클로스티리디움 베이저링키(C. beijerinckii) NCIMB8052(NCIMB, Ltd, 스코틀랜드)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머(서열번호: 9 및 서열번호: 10)를 포함한 PCR 반응을 위한 혼합용액(최종 부피가 20 μl)을 준비한 뒤 94℃에서 5 분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30 초 변성, 54℃에서 60 초 재결합, 및 72℃에서 90 초 신장 과정을 30 회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 10 분간 확장시키는 조건으로 PCR을 수행하여 pta 프로모터를 수득하였다. 수득한 pta 프로모터를 상기 변형된 pKE12-MCS 플라스미드의 PLlacO -1과 XhoI 및 EcoRI 제한효소를 이용하여 치환함으로써 pKBE411-MCS 벡터를 완성하였다.
서열번호 5(pAMβ1 정방향): 5'-CTGAGTATTTAATCACTTTGACTAGCAAATACTAAC-3'
서열번호 6(pAMβ1 역방향): 5'-GACGTCCCAACTAACTCAACGCTAGTAGTGG-3'
서열번호 7(ER 정방향): 5'-ATGACGTCCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG-3'
서열번호 8(ER 역방향): 5'-GCACTAGTTAGCAGCACGCCATAGTGAC-3'
서열번호 9(pta 정방향): 5'-CTCGAGTATTCAGAACATTAAAAGAATGGTG-3'
서열번호 10(pta 역방향): 5'-GAATTCCCTCCAACATTTCTCTATATCCTATCTCTAATAC-3'
<2-2> 재조합 벡터 pKBE411 - DhaBT 의 제조
클로스티리디움 유래의 글리세롤 디하이드라타아제를 암호화하는 유전자 DhaB 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈를 암호화하는 유전자 DhaT 모두 포함하는 발현 벡터를 제작하기 위해서, PCR 및 제한효소를 이용한 클로닝을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 증폭된 DhaT를 포함하는 PCR 절편을 제한효소인 BamHI 및 SphI으로 절단하고, 이를 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 pKBE411-DhaB를 같은 제한효소로 절단해 얻은 단편과 접합하여 pKBE411-DhaBT를 제작하였다.
< 실시예 3> 재조합 균주의 제조
<3-1> 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052 / pKBE411 - DhaB 균주의 제작
글리세롤 대사능력이 미약한 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052(NCIMB, Ltd, 스코틀랜드)를 숙주세포로 이용하여 재조합 균주를 제조하기 위해, 형질전환을 수행하여 글리세롤 디하이드라타아제를 암호화하는 유전자 DhaB를 포함한 발현 벡터인 pKBE411-DhaB를 도입하였다.
클로스티리디움 베이저링키(C. beijerinckii) NCIMB8052를 RCM (Reinforced Clostridial Medium, BD 218081) 고체 배지에 도말하여 37℃에서 혐기 배양한 다음, 자란 콜로니를 2YTG 배지(Trypton 16 g/L, 효모 추출물(Yeast Extract) 10 g/L, 글루코스(Glucose) 5 g/L, NaCl 5 g/L)에서 액체 혐기 배양하였다. 배양액 OD(600 nm)가 2 내지 3 정도가 되면 동일한 2YTG 배지 40 ml에 2 ml 접종하고 OD(600 nm)가 0.6~0.8 정도가 되면 4℃에서, 3000 g 및 10 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 그런 다음, 수득한 세포를 40 ml 일렉트로포레이션(electroporation) 완충용액(270 mM 수크로스(sucrose), 1 mM MgCl2, 7 mM NaHPO4)으로 재현탁한 후, 동일한 조건으로 다시 한 번 원심분리하여 세포를 수득하였고, 이에 1.6 ml 일렉트로포레이션 완충용액을 가해 재현탁하여 세포 농축액을 수득하였다. 상기 수득한 세포 농축액과 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 pKBE411-DhaB 플라스미드를 혼합한 후 Gene Pulser II(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 사용하여, 2.0 kV, 200 Ω, 25 μF의 조건으로 전기 충격을 가하였다. 그런 다음, 8 mL의 2YTG 배지를 첨가하여 3 시간 동안 배양한 후, 항생제인 에리트로마이신을 포함한 고체 RCM 배지에 도말하고 37℃에서 1일 동안 배양하여 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052/pKBE411-DhaB를 준비하였다.
<3-2> 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052 / pKBE411 - DhaBT 균주의 제작
클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052(NCIMB, Ltd, 스코틀랜드)를 숙주세포로 이용하여 글리세롤 디하이드라타아제를 암호화하는 유전자 DhaB 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈를 암호화하는 유전자 DhaT를 둘 다 포함한 발현 벡터인 pKBE411-DhaB를 포함하는 재조합 균주의 제조를 위해 형질전환하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 글리세롤 디하이드라타아제를 암호화하는 유전자 DhaB와 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈를 암호화하는 유전자 DhaT를 모두 포함하는 pKBE411-DhaBT 플라스미드를 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052 균주에 형질전환을 통해 도입하여 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052/pKBE411-DhaBT를 제작하였다.
< 실시예 4> 상기 재조합 균주를 이용한 1,3- 프로판디올의 생산
상기 <실시예 3>에서 제작한 재조합 미생물의 글리세롤 대사 능력 및 1,3-프로판디올 생산 능력을 확인하기 위하여, 액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서 제작된 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052/pKBE411-DhaB, 상기 실시예 <3-2>에서 제작된 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052/pKBE411-DhaBT, 및 모균주인 클로스티리디움 베이저링키 NCIMB8052를 각각 멸균 처리한 2YTG 배지 5 mL에 접종, 37℃ 8 시간 정도 혐기배양하고 200 ㎕를 수득하여 멸균처리한 변형된 P2 배지(글리세롤 20 g/l 함유, Annous A&Blaschek HP, Appl. Environ. Microbiol. 56:2559-2561, 1990) 10 mL에 접종하여 37℃에서 48 시간 동안 혐기 배양하였다. 모든 배양과정에 항생제인 에리트로마이신 5 ug/mL을 첨가하였다. 그런 다음, 발효 중 배양액 내의 세포 농도는 분광광도계를 이용하여 OD(600 nm)의 값으로 측정하였고, 배양액 내의 글리세롤 및 대사 산물의 농도는 채취한 배양액 시료를 13000 rpm에서 3 분 동안 원심분리한 상등액을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 무처리 대조군에서는 배양 48 시간 후 최종 1,3-프로판디올이 생성되지 않는 것과 달리, DhaB 효소만 단일 발현되었을 경우, 및 DhaB 및 DhaT가 모두 발현되었을 경우 각각 3.22 및 3.31 g/l의 농도로 측정됨으로써, pKBE411-DhaB 및 pKBE411-DhaBT 재조합 미생물 모두 유의적으로 1,3-프로판디올을 생산하였음을 확인하였다(표 1).
균주 플라스미드 OD 48 시간 동안 소비한 글리세롤 농도(g/l) 48 시간 후 최종 1,3-프로판디올 농도(g/l)
NCIMB8052 - 0.08 0.24 -
NCIMB8052 pKBE411-DhaB 1.07 6.12 3.22
NCIMB8052 pKBE411-DhaBT 1.21 6.62 3.31
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Recombinant microorganisms producing 1,3-propanediol and the method for preparing 1,3-propanediol using the same <130> 13p-05-024 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DhaB forward <400> 1 ggtaccttgg aggagtaaaa atgataagta a 31 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DhaB reverse <400> 2 ggatccttac tcagctccaa ttgtgc 26 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DhaT forward <400> 3 ggatccagga gaagattgca tatgagaat 29 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DhaT reverse <400> 4 gcatgcttaa taagcagcct taaaaatatt t 31 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAMbeta1 forward <400> 5 ctgagtattt aatcactttg actagcaaat actaac 36 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAMbeta1 reverse <400> 6 gacgtcccaa ctaactcaac gctagtagtg g 31 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER forward <400> 7 atgacgtcca tttatcaggg ttattgtctc atg 33 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER reverse <400> 8 gcactagtta gcagcacgcc atagtgac 28 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pta forward <400> 9 ctcgagtatt cagaacatta aaagaatggt g 31 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pta reverse <400> 10 gaattccctc caacatttct ctatatccta tctctaatac 40 <210> 11 <211> 3306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DhaB <400> 11 atgataagta aaggatttag tacccaaaca gaaagaataa atattttaaa ggctcaaata 60 ttaaatgcta aaccatgtgt tgaatcagaa agagcaatat taataacaga atcatttaaa 120 caaacagaag gccagccagc aattttaaga agagcattgg cattgaaaca catacttgaa 180 aatatcccta taacaattag agatcaagaa cttatagtgg gaagtttaac taaagaacca 240 aggtcttcac aagtatttcc tgagttttct aataagtggt tacaagatga attggataga 300 ttaaataaga gaactggaga tgcattccaa atttcagaag aaagtaaaga aaaattaaaa 360 gatgtctttg agtattggaa tggaaagaca 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cattagtttc tagaggtctt 1260 acattagaag atgcaagaga ctacggaata attggatgtg ttgaaccaca aaagccagga 1320 aaaacagaag gatggcatga ttcagcattc tttaatcttg caagaatagt agagttaact 1380 ataaattctg gatttgataa aaataaacag attggaccta aaactcaaaa ttttgaagaa 1440 atgaaatcct ttgatgaatt catgaaagct tataaagctc aaatggagta ttttgtaaaa 1500 catatgtgct gtgctgataa ttgcatagat attgcacatg cagaaagagc tccattacct 1560 ttcttgtcat caatggttga taattgtatc ggaaaaggaa agagccttca agatggtggt 1620 gcagaatata acttcagtgg accacaaggt gttggagtag ctaatattgg agattcatta 1680 gttgcagtta aaaaaattgt gtttgatgaa aataagatta ctccttcaga attaaagaaa 1740 acattaaata atgattttaa aaattcagaa gaaatacaag ccttactaaa aaatgctcct 1800 aagtttggaa atgatattga tgaagttgat aatttagcta gagagggtgc attagtatac 1860 tgtagagaag ttaataaata tacaaatcca aggggaggaa attttcaacc aggattatat 1920 ccatcttcaa ttaatgtata ttttggaagc ttaacaggtg ctactccaga tggaaggaaa 1980 tccggacaac cattagctga tggggtttct ccatcaagag gctgtgatgt atctggacct 2040 actgcagctt gtaactcagt tagtaaatta gatcatttta 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catatataga tctggctatg 2940 attgatataa aaagtatgaa tgatgaaatc cataggaaat ttacaggagt gagtaacgaa 3000 ataatattac aaaacattaa attaagtgat gaattagcta aagaaataat aatcagaatt 3060 cctgtaatag aaggatttaa tgcagattta caaagtatag gagcaatagc tcaattttca 3120 aaatcattaa caaatcttaa aagaatagat cttcttccat accataatta tggagaaaat 3180 aagtatcaag caattggaag agagtattct ttgaaagaac taaaatcacc tagtaaagac 3240 aaaatggaaa gattaaaagc tttagttgaa atcatgggaa taccgtgcac aattggagct 3300 gagtaa 3306 <210> 12 <211> 1158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DhaT <400> 12 atgagaatgt atgattattt agtaccaagt gtaaacttta tgggagcaaa ttcagtatca 60 gtagtaggtg aaagatgcaa aatattaggt ggaaaaaaag cattgatagt tacagataag 120 tttctaaaag atatggaagg tggagctgtt gaattaacag ttaaatattt aaaagaagct 180 ggattagatg ttgtatatta tgacggagtt gaaccaaatc caaaagatgt taatgttata 240 gaaggattaa aaatatttaa agaagaaaat tgtgacatga tagtaactgt aggtggagga 300 agttcgcatg attgcggtaa gggaatagga attgctgcaa cacatgaagg agatctttat 360 gattatgcag gaatagaaac acttgtcaat ccattgccac caatagtagc tgtaaatact 420 actgcaggaa ctgctagtga attaactcgt cattgtgtat tgactaatac aaaaaagaaa 480 ataaaatttg ttatagttag ctggagaaat ttgcctctag tatctataaa tgatccaatg 540 cttatggtca aaaaacctgc aggattaaca gcagctacag gaatggatgc tttaacacat 600 gcaatagaag catatgtatc aaaagatgca aatccagtaa cagatgcttc agcaatacaa 660 gctattaaat taatttcaca aaatttaaga caagctgtag ctttaggaga aaatcttgaa 720 gcaagagaaa atatggctta tgcatcatta ctagcgggaa tggcatttaa taatgctaat 780 ttaggatatg tacatgcaat ggctcatcaa ttagggggac tgtatgatat gcctcatgga 840 gttgctaatg ctatgctatt accacatgtt gaacgttata atatgctatc aaatcctaag 900 aagtttgcag atatagcaga atttatggga gaaaatatat ctggactttc tgtaatggaa 960 gcagcagaga aagccataaa tgcaatgttc aggctttcag aggatgttgg aattccgaaa 1020 agtctaaagg agatgggagt gaaacaagaa gattttgagc atatggcaga actagctctt 1080 ttagatggaa atgcctttag caatccaaga aaaggaaatg caaaagatat tataaatatt 1140 tttaaggctg cttattaa 1158

Claims (10)

1) 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase; DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(1,3-propanediol dehydrogenase; DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 미생물은 1,3-프로판디올 생성능이 결여된 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주인 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 2항에 있어서, 상기 클로스트리디움 속 균주는 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii)인 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 발현 벡터는 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 또는
글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB)는 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT)는 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
1) 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 생산용 재조합 클로스트리디움 속 균주 제조 방법.
1) 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자 또는 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 발현 벡터를 클로스트리디움 속 균주에 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 재조합 클로스트리디움 속 균주를 글리세롤(glycerol)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올 생산 방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 1)의 발현 벡터는 글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 또는
글리세롤 디하이드라타아제(DhaB) 효소 및 1,3-프로판디올 디하이드로지네이즈(DhaT) 효소를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산 방법.
제 8항에 있어서 상기 단계 3)의 배양은 24 내지 72 시간 동안 30 내지 40℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산 방법.
KR20130067801A 2013-06-13 2013-06-13 1,3-프로판디올 생성 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조 방법 KR20140145397A (ko)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636156A (zh) * 2016-12-26 2017-05-10 齐鲁工业大学 一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法
CN106906248A (zh) * 2017-03-28 2017-06-30 清华大学 一种利用重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇的方法
CN108048494A (zh) * 2017-12-29 2018-05-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种利用生物酶合成1,3-丙二醇的方法
WO2019143089A1 (ko) * 2018-01-16 2019-07-25 한국과학기술원 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이미생물 및 이를 이용한 1,3-pdo의 제조방법

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636156A (zh) * 2016-12-26 2017-05-10 齐鲁工业大学 一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法
CN106636156B (zh) * 2016-12-26 2021-03-19 齐鲁工业大学 一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法
CN106906248A (zh) * 2017-03-28 2017-06-30 清华大学 一种利用重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇的方法
CN108048494A (zh) * 2017-12-29 2018-05-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种利用生物酶合成1,3-丙二醇的方法
WO2019143089A1 (ko) * 2018-01-16 2019-07-25 한국과학기술원 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이미생물 및 이를 이용한 1,3-pdo의 제조방법
US11898188B2 (en) 2018-01-16 2024-02-13 Hanwha Solutions Corporation Mutant microorganism having ability to produce 1,3-propanediol, and method for preparing 1,3-PDO by using same

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