CN105132400A - 具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶及其制备方法 - Google Patents

具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶，选自如下(a)～(c)所述的多肽：(a)由SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能由(a)衍生的多肽；(c)与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的多肽。建立了一种新的1,3-二羟基丙酮合成方法。

Description

具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶及其制备和应用。
背景技术
1,3-二羟基丙酮(1,3-dihydroxyacetone)，是自然界存在的最简单的三碳酮糖，用途比较广泛。1,3-二羟基丙酮本身具有防晒功能，能有效阻止皮肤中的水分过度蒸发到空气中，对皮肤具有保湿、防晒和防止太阳中紫外线辐射的作用，因此1,3-二羟基丙酮可以用作制造化妆品的原料。另外，1，3-二羟基丙酮是糖类在体内代谢的中间产物之一，它在体内糖代谢过程中起着非常重要的作用，它可以降低猪体内脂肪，促进体内脂肪的消耗，减少蛋白质的消耗，而使蛋白质的含量增加从而提高瘦肉率。1，3-二羟基丙酮还可以和角质层的角朊作用形成一种色素，这种色素可以使白斑处的皮肤与正常的皮肤颜色相近从而使白斑得到治疗，因此1，3-二羟基丙酮有色素促进剂的作用。1，3-二羟基丙酮可以作为一种抗病毒试剂，如二羟基丙酮用于鸡胚胎培养中，能很大程度的抑制鸡瘟病毒的感染，而且可以杀死51％以上的鸡瘟病毒，同时以1，3-二羟基丙酮为底物合成相应的1，3-二羟基丙酮的衍生物并由此制成的药，具有抗艾滋病的作用。由于1，3-二羟基丙酮含有一个羰基和两个羟基，所以它的化学性质活泼，广泛用于多种有机化合物的合成，所以它是一个重要的化学合成中间体，广泛应用于化妆品制造、食品研制、医药和化学合成等行业。
1,3-二羟基丙酮的生产方法有化学法和微生物法，化学法有催化氧化法和甲醛缩合法。目前，商业上生产1,3-二羟基丙酮的方法是利用葡糖杆菌属类微生物发酵甘油制备1,3-二羟基丙酮的微生物法，该法的优点是条件温和、专一性强、产率高，但是生产能力很低，提纯工艺复杂，生产装置要求严格，大大增加了生产成本且易造成环境污染。催化氧化法是利用贵金属制备金属催化剂，选择性地氧化甘油，从而得到1,3-二羟基丙酮，但此方法采用的催化剂价格较高，副产物多，后续分离纯化难度大。早期研究的甲醛缩合法主要是局限于采用无机碱作催化剂和以甲醛水溶液作原料合成1,3-二羟基丙酮，但由于甲醛在反应初期发生醇醛缩合反应生成乙醇醛，还有甲醛水溶液的聚糖反应，产物中主要是C2～C7的直链糖和支链糖，其组分多达47种，以及糖分子内和糖分子间的羰基重排可逆反应等，导致副反应很多，无法通过普通方法进行分离提纯，DHA的选择性低于10％。即使甲醛缩合法发展到现在，以多聚甲醛为原料，有机碱为催化剂，1,3-二羟基丙酮产量及选择性得到了极大改善，但还不能用于工业化生产。
因此，探索以甲醛为原料，以酶为催化剂合成1,3-二羟基丙酮具有重要的意义。首先，地球上的碳一资源丰富，2013年全球甲醛产能约6400万吨，全球甲醇产能10324万吨，天然气可采储量185.7万亿立方米，原煤可采储量8915.31亿吨。同时，酶催化剂具有活性高，化学选择性高等特点，越来越受到人们的青睐。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶，本发明中，将这种具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶命名为BFD，选自如下(a)～(c)所述的多肽：
(a)由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能由(a)衍生的多肽；
例如：在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。
(c)与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的多肽。
另外还包括如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多肽的基础上的活性片段、或其活性衍生物、类似物。所述“活性片段”、“活性衍生物”和“活性类似物”是指在基本上保持本发明BFD多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的另一目的在于提供一种多核苷酸，选自如下(a)～(c)：
(d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸；优选的，其基因序列为SEQIDNO.2或SEQIDNO.3中所示序列。
(e)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；
(f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能多肽的多核苷酸；
上述条件(g)中的严格条件是指：(1)在较低的离子强度和较高的温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，优选为在97％以上时才发生杂交；并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO.1所示的成熟多肽具有相同的生物学活性和功能。
(h)与(d)或(e)或(f)或(g)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述(d)或(e)或(f)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。
进一步地，上述多核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以单链的或者是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码链中编码SEQIDNO.1所示多肽的编码区序列可以是与SEQIDNO.2所示的序列相同或简并的变异体，简并变异体是指编码具有SEQIDNO.1多肽，但与SEQIDNO.2所示的序列有差别的核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供一种含有编码BFD多肽多核苷酸的重组载体。
所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。
优选地，所述重组载体为在pET-28a载体的多克隆位点，插入序列表中SEQIDNO.2所示DNA片段后，得到的重组质粒(pET-28a-bfd)。可选的，克隆位点为NdeI酶切位点和XhoI酶切位点。
本发明的另一目的在于提供一种转入了含有编码BFD多肽多核苷酸的重组载体的重组宿主细胞。
所述重组宿主细胞包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选地为大肠杆菌、酵母。
本发明的另一目的在于提供一种具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶的制备方法，其特征在于，包括以下工序：
(1)合成具有编码催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶的基因，并将其构建在载体上；
(2)将重组载体在宿主细胞中表达；
(3)从表达成功的重组宿主细胞中提取纯化具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶。
本发明的另一目的在于提供一种产生1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，选自以下工艺的任一种：
(1)利用权利要求1中(a)～(c)任一项所述的多肽，以甲醛为底物，体外反应产生1,3-二羟基丙酮；
(2)利用权利要求6所述的重组细胞，以甲醛为底物，反应产生1,3-二羟基丙酮。
附图说明：
图1为重组质粒pET-28a-bfd的质粒图谱示意图
图2为BFD纯化SDS-PAGE示意图
图3为BFD催化甲醛产物GC-MS分析的色谱图
图4为BFD催化甲醛产物GC-MS分析的质谱图
具体实施方式：
在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。
实施例1BFD基因获得、载体构建
BFD种属来源为Pseudomonasputida，其基因序列如SEQIDNO.2所示，在不改变BF氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如SEQIDNO.3所示。
将该基因序列直接合成在pET-28a载体(Novagen，Kan+，见图1)上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒命名为pET-28a-bfd。
实施例2基因的表达
为了体外检测BFD酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。
(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-bfd转入E.coliBL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；
(2)挑单克隆至5mLLB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD600为0.6-0.8。将5mLLB培养基中菌液转接至800mL2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；
(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；
(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，5mMMgCl2，0.5mMTPP，pH7.5)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。
实施例3蛋白纯化
(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；
(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
a：柱平衡：挂上清前，先用ddH2O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；
b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；
c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；
d：洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM，200mM，300mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测，结果如图2所示。
(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mLAmicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加10mL蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白BFD。
(4)用Nondrop2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为10mg/mL。即得到纯化浓缩的BFD蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
实施例4目标产物1,3-二羟基丙酮的检测
(1)BFD可催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮。反应方程式如下：
(2)反应条件：
反应体系混匀后，置于37℃反应1h。反应结束后，利用冷冻干燥机将反应体系冻干。
(3)GC-MS检测条件：
进样量：1μL；不分流进样；
进样口温度：250℃
色谱柱：J&WHP-5(30mx250μmx0.25μm)
柱箱温度：80℃保持1min，以20℃/min升至280℃；以10℃/min升至310℃，保持6min
GC/MS接口温度：280℃
EI离子源温度：230℃
电离能：70eV
溶剂延迟：2.5min
扫描范围：50-500amu
采集速率：5spectra/s
通过GC-MS分析可知，BFD可以催化甲醛生成1,3-二羟基丙酮，结果如图3所示。

Claims (10)

1.一种具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶，其特征在于，选自如下（a）～（c）所述的多肽：
（a）由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；
（b）由（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能由（a）衍生的多肽；
（c）与（a）中的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的多肽。
2.一种多核苷酸，其特征在于，选自如下（d）～（f）：
（d）编码权利要求1中（a）～（c）所述多肽的多核苷酸；
（e）编码权利要求1中（a）～（c）所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；
（f）在严格条件下与（d）或（e）限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能多肽的多核苷酸；
（g）与（d）或（e）或（f）或（g）限定的多核苷酸序列有70%同一性且编码具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能多肽的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，为（d）编码的多核苷酸，其基因序列为SEQIDNO.2或SEQIDNO.3中所示序列。
4.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为DNA或RNA。
5.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求2或3所述的多核苷酸。
6.一种重组宿主细胞，其特征在于：转入了权利要求5所述的重组载体。
7.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pET-28a载体的多克隆位点，插入序列表中SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示序列后，得到的重组质粒。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述克隆位点为NdeI酶切位点和XhoI酶切位点。
9.一种苯甲酰甲酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成具有编码催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶的基因，并将其构建在载体上；
（2）将重组载体在宿主细胞中表达；
（3）从表达成功的重组宿主细胞中提取纯化具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶。
10.一种生产1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，选自以下工艺的任一种：
（1）利用权利要求1中（a）～（c）任一项所述的多肽，以甲醛为底物，体外反应产生1,3-二羟基丙酮；
（2）利用权利要求6所述的重组细胞，以甲醛为底物，反应产生1,3-二羟基丙酮。
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