CN105950593B - 一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法 - Google Patents

一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法。该制备方法包括：向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列为序列2的重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；对其进行诱导表达，收集并破碎重组大肠杆菌细胞，得到包含体；然后依次进行变性、复性、激活、纯化，得到重组赖氨酰肽链内肽酶。采用本发明的制备方法制备的重组Lys‑C蛋白酶具有高的酶活力和较高的尿素耐受。本发明的制备方法具有酶、特异性好、无动物来源病毒等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。

Description

一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法。
背景技术
赖氨酰肽链内肽酶Lysyl endopeptidase(EC 3.4.21.50)可以特异性在蛋白底物C端的赖氨酸进行消化，目前报道的Lysyl endopeptidase主要有三种，分别是来源于Achromobacter lyticus的Achromobacter protease I(API)，来源于Lysobacterenzymogenes的lysyl endopeptidase和来源于Pseudomonas aeruginosa的preL。对API(A-LEP)的研究表明，API在表达的时候以酶原的形式表达，其完整序列包括20个氨基酸的信号肽序列，N端185个氨基酸的pro-peptide和C端的180个氨基酸的extension peptide以及由268个氨基酸组成的成熟的API。API比trypsin有更高的活性、更广泛的pH耐受和表面活性剂耐受等特点。这些特点使API成为蛋白序列分析、蛋白组学研究和生物制药工艺的重要工具。
对来源于Lysobacter enzymogenes的赖氨酰肽链内肽酶lysyl endopeptidase(Le-LEP)进行序列分析表明，Le-LEP具有与A-LEP相同的pro-peptide和extensionpeptide组成形式，但是其表达水平非常低。至今尚无基因工程重组表达Le-LEP的成功报道。利用传统菌种筛选方法可以获得高表达菌种，但是仍无法满足工业生产需要。
来源于Pseudomonas aeruginosa的preL的基因构造跟前两种蛋白有所不同，其完整序列包括24个氨基酸的信号肽序列，N端187个氨基酸的pro-peptide和251个氨基酸组成的成熟的preL。虽然三种来源的Lysyl endopeptidase都实现了商品化销售，但因为preL具有更为优越的表面活性剂以及高达8M尿素的耐受能力，因此在蛋白组学研究中越来越受到研究者的重视。但与Le-LEP类似，至今尚无基于原核表达体系进行preL重组表达并进行蛋白复性的成功报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是利用分子生物学技术，采用大肠杆菌作为宿主细胞，构建Lysyl endopeptidase(Lys-C)(preL)的表达载体，并优化蛋白复性和纯化方法，获得均一、高活性、高特异性的重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备重组赖氨酰肽链内肽酶的方法。
本发明所提供的制备重组赖氨酰肽链内肽酶的方法，具体可包括如下步骤：
(1)向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如序列表中序列2所示的重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；
(2)对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包含体；
(3)对所述包含体进行变性，得到变性后的样品；
(4)将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；
(5)将所述复性后的样品进行激活，得到有活性的重组赖氨酰肽链内肽酶粗品；
(6)对所述重组赖氨酰肽链内肽酶粗品进行纯化，得到纯化后的重组赖氨酰肽链内肽酶；
在步骤(4)中，所述复性在复性缓冲液中进行，所述复性缓冲液的pH值为9.0-10.0(如pH值为10)，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、胱氨酸、半胱氨酸和尿素；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为5-50mM，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为0.5-2mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3-5mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为0.4-2M。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述所述复性缓冲液的pH值为10.0，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、胱氨酸、半胱氨酸和尿素；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为20mM，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为1mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为2M。
在步骤(5)中，所述激活为将所述复性后的样品调pH值为5.5-9.5(如7.0-8.0，再如7.5)，于25℃静置1-6小时(如3-6小时，再如6小时)。
在步骤(6)中，所述纯化为将所述重组赖氨酰肽链内肽酶粗品依次进行硫酸铵沉淀、金属离子亲和层析、超滤浓缩和凝胶过滤层析；
所述金属离子亲和层析采用的层析介质为Chelating FF(金属螯合高流速琼脂糖微球)或者Chelating HP(金属螯合高分辨琼脂糖微球)；所述凝胶过滤层析采用的层析介质为Sephacryl S-100(丙烯葡萄糖凝胶S-100)。
其中，在进行所述硫酸铵沉淀前还可包括对所述重组赖氨酰肽链内肽酶粗品进行-20℃冻融12-16h(过夜，具体如14h)的步骤。
在本发明中，所述重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因具体可是如下a)或b)或c)的核酸分子：
a)其编码序列如序列表中序列1所示的DNA分子；
b)其编码序列是将序列表中序列1中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
c)在严格条件下与a)限定的DNA分子杂交且编码序列表中序列2所示的重组赖氨酰肽链内肽酶的DNA分子。
本领域普通技术人员很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对所述重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因序列进行突变，那些经过人工修饰的，与所述重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因序列具有75％或者更高同一性且具有相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明序列1所示的DNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件可为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
在本发明中，序列表中序列1所示的重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因是为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型赖氨酰肽链内肽酶的氨基酸序列的前提下，将其密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子。所述优化还包括对赖氨酰肽链内肽酶的基因序列的其他改造，以适合在大肠杆菌中表达。本发明中使用的术语“偏好的密码子”具有本领域公知的含义，也称为密码子的偏好性(Codon Preference)，是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。
在步骤(1)中，所述重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述受体大肠杆菌细胞中的。更加具体的，所述重组表达载体为将序列表中序列1的第502-1818位所示DNA片段替换pET-32a(+)载体的EcoR I/Xho I的识别序列间的DNA片段后得到的重组质粒。
在本发明中，所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
在所述方法中，所述金属离子亲和层析的洗脱程序具体可如下：1)用平衡液与洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱5个柱体积，在所述5个柱体积内，咪唑在所述混合液中的浓度由0M线性升至0.01M；2)用所述平衡液与所述洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱10个柱体积，在所述10个柱体积内，咪唑在所述混合液中的浓度由0.01M线性升至0.5M。所述平衡液由溶剂和溶质组成；溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris，2M NaCl，pH 7.5。所述洗脱缓冲液由溶剂和溶质组成；溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris，2M NaCl，0.5M咪唑，pH7.5。
在本发明的一个实施例中，进行所述金属离子亲和层析时采用的亲和柱的柱体积为5ml。在进行上柱前还包括采用所述平衡液液对所述层析柱进行平衡的步骤。
在所述方法中，所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内直径比为165：8(如33cm:1.6cm)；所述凝胶过滤层析所采用的洗脱液的pH值为3-4，所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为醋酸和棉籽糖，所述醋酸在所述洗脱液中的浓度为50mM，所述棉籽糖在所述洗脱液中的浓度为6.7mg/mL。
在本发明的一个实施例中，所述凝胶过滤层析所用层析柱具体为GE Healthcare公司生产的“XK 16×40，柱高：33mm”柱子。在进行上柱前还包括采用所述凝胶过滤层析所采用的洗脱液对所述层析柱进行平衡的步骤。进行所述凝胶过滤层析时的上样量为2mL，层析流速3mL/min。
在所述方法中，进行所述金属离子亲和层析和所述凝胶过滤层析时，均是收集采用SDS电泳检测在约28KD的位置上出现目的条带的洗脱峰，进行后续操作。
在所述方法中，所述硫酸铵沉淀的步骤具体可为：1)在所述激活后的样品中加入固体硫酸铵至60％饱和浓度，4℃搅拌直至硫酸铵完全溶解(1小时)，在冰上沉淀蛋白4小时；2)离心收集沉淀蛋白(如4000rpm离心40分钟)。
在所述方法中，在所述硫酸铵沉淀和所述金属离子亲和层析之间还可包括重悬所述沉淀蛋白的步骤；进行所述重悬时使用的重悬缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：20mMTris，150mM NaCl，pH 7.5。
在所述方法中，所述超滤浓缩为采用截留分子量具体为10kD的超滤浓缩。
在所述方法的步骤(2)中，对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达为向培养有所述重组大肠杆菌的培养体系中加入IPTG至其终浓度为0.5-1.5mM，32℃诱导9小时。
更加具体的，所述步骤(2)为：将所述重组大肠杆菌细胞接种到发酵培养基(初始OD600为0.01)中；先在条件1下进行培养，得到发酵液1；再向所述发酵液1中加入补料，在条件2下培养，然后加入IPTG至其终浓度为0.5-1.5mM，32℃诱导9小时，得到发酵液2；从所述发酵液2中收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到所述包含体。
所述条件1具体可为：培养温度为37℃；溶氧量(DO)(相对溶氧量)设定为15％；pH值为7.0；培养至发酵体系的OD600>31。
所述条件2具体可为：培养温度为32℃，溶氧量(DO)(相对溶氧量)设定为15％；pH值为7.0；培养至发酵体系的OD600为100。
所述发酵培养基的组成可如下：每1L所述发酵培养基中含有26-27g甘油、39-41g酵母粉、1.6-2.0g磷酸二氢钾、1.6-2.0g柠檬酸、4.9-5.1mL盐溶液、0.9-1.1mL微量金属盐溶液、0.9-1.1mL消泡剂204，余量为水；pH值为7.2-7.4。其中，所述发酵培养基的pH值可通过30％(体积百分含量)氨水进行控制。
更加具体的，所述发酵培养基的组成如下：每1L所述发酵培养基中含有26.7g甘油、40g酵母粉、1.8g磷酸二氢钾、1.8g柠檬酸、5mL盐溶液、1mL微量金属盐溶液、1mL消泡剂204，余量为水；pH值为7.2。
其中，所述盐溶液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为：250g/L MgCl2·6H2O、100g/L CaCl2·2H2O、100g/L KCl、2M柠檬酸(Citric acid)。所述微量金属盐溶液的组成如下：每1L所述微量金属盐溶液中含有6.80g ZnCl2、54.00g FeCl3·6H2O、16.20gMnCl2·4H2O、2.20g CuSO4·5H2O、4.80g CoCl2·6H2O、0.024g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.20g KI和119mL37％(体积百分比浓度)的浓盐酸，余量为水。
所述补料由水和溶质组成，所述溶质及其浓度可为：270-280g/L甘油和220-230g/L酵母粉，具体可为275g/L甘油和225g/L酵母粉。
收集所述重组大肠杆菌细胞的方法可为离心或过滤中至少一种，具体可为离心收集；破碎所述重组大肠杆菌细胞方法可为高压匀浆、冻融或超声破碎中至少一种，具体可为高压匀浆破碎。
在步骤(3)中，对所述包含体进行变性是在变性缓冲液中进行。所述变性缓冲液的pH值为10.0；所述变性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素和二硫苏糖醇；所述三羟甲基氨基甲烷在所述变性缓冲液中的浓度为5-100mM；所述尿素在所述变性缓冲液中的浓度为6-8M；所述二硫苏糖醇在所述变性缓冲液中的浓度为10-100mM。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述变性缓冲液的pH值为10.0；所述变性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素和二硫苏糖醇；所述三羟甲基氨基甲烷在所述变性缓冲液中的浓度为20mM；所述尿素在所述变性缓冲液中的浓度为8M；所述二硫苏糖醇在所述变性缓冲液中的浓度为20mM。
所述变性的温度为20-30℃(室温)，时间为3-4h。变性后离心收集上清液，得到所述变性后的样品。
进行所述变性时，所述包含体与所述变性缓冲液的比例具体可为1g:40mL
在步骤(4)中，将所述变性后的样品进行复性时，所述变性后的样品与所述复性缓冲液的比例具体可为1:20(体积比)。
所述复性的温度为25℃，时间为12-16h(过夜)，如14h。
利用所述方法制备得到的重组赖氨酰肽链内肽酶也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种用于制备重组赖氨酰肽链内肽酶的成套试剂和试剂盒。
本发明所提供的用于制备重组赖氨酰肽链内肽酶的成套试剂，由所述复性缓冲液、进行所述金属离子亲和层析时采用的所述平衡液和所述洗脱缓冲液、进行所述凝胶过滤层析时采用的所述洗脱液组成。
本发明所提供的用于制备重组赖氨酰肽链内肽酶的试剂盒，含所述成套试剂，以及如下中全部或部分：大肠杆菌感受态细胞、能够表达氨基酸序列如序列表中序列2所示的重组赖氨酰肽链内肽酶的原核表达载体、IPTG、Chelating FF或者Chelating HP、Sephacryl S-100。
所述试剂盒中还含有记载有前文所述的制备重组赖氨酰肽链内肽酶的方法的可读性载体。
下述生物材料中的任一种也属于本发明的保护范围：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)序列表中序列1所示的DNA分子；
(a3)将序列表中序列1中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
(a4)含有序列表中序列1所示的DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物、重组病毒、转基因植物细胞系或转基因动物细胞系。
其中，所述转基因植物细胞系和所述转基因动物细胞系均为非繁殖材料。
下述应用中的任一种也属于本发明的保护范围：
I)所述方法在制备重组赖氨酰肽链内肽酶中的应用；
II)所述成套试剂在制备重组赖氨酰肽链内肽酶中的应用；
III)所述试剂盒在制备重组赖氨酰肽链内肽酶中的应用；
IV)所述生物材料在制备重组赖氨酰肽链内肽酶中的应用。
在本发明中，所述重组赖氨酰肽链内肽酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
实验证明，采用本发明的制备方法制备的重组Lys-C蛋白酶具有高的酶活力和较高的尿素耐受。本发明的制备方法具有酶切特异性好、无动物来源病毒等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。
附图说明
图1为大肠杆菌发酵与表达鉴定。其中，A为大肠杆菌发酵的生长曲线，标注31的检测点对应的OD600为加入IPTG诱导时发酵液的OD600值，标注100的代表菌体收集时发酵液的OD600值。B为对BL21-Lys-C菌株的诱导后的全菌蛋白、上清和包含体进行15％SDS-PAGE电泳检测结果。C为包含体经8M尿素溶解后的质谱分析结果。
图2为复性蛋白的激活条件优化。其中，A为不同pH对复性蛋白的激活结果比较，箭头所示条带为激活蛋白条带。B为pH 7.5条件下，不同激活时间对蛋白激活的影响，箭头所示条带为激活蛋白条带。
图3为蛋白纯化以及相应蛋白分析结果。其中，A为亲和层析的色谱图，亲和洗脱收集的色谱峰为虚线包括范围。B为凝胶层析的色谱图，凝胶层析收集的洗脱峰为虚线包括范围。C为纯化各步骤的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析结果(分子筛峰1为图3中B的凝胶层析色谱峰的30-45mL组分，分子筛主峰为图3中B的凝胶层析色谱峰的45-55mL对应组分，即虚线部分)。D为分子筛主峰的液质连用(LC/MS)分析的结果。
图4为纯化蛋白的活性分析结果。其中，A为纯化Lys-C对大肠杆菌全蛋白在不同尿素浓度下对底物蛋白的酶切比较结果。B为纯化Lys-C对大肠杆菌全蛋白在2M尿素浓度下对底物蛋白在不同酶切比例条件下的酶切比较结果。C为纯化Lys-C对大肠杆菌全蛋白在2M尿素浓度下，按照1:50比例进行酶切样品的质谱分析的离子峰。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pET-32a(+)载体：Novagen公司产品，产品目录号为69030-3。
高密度基础发酵培养基：每1L所述发酵培养基中含有26.7g甘油、40g酵母粉、1.8g磷酸二氢钾、1.8g柠檬酸、5mL盐溶液、1mL微量金属盐溶液、1mL消泡剂204，余量为水；pH值为7.2。
其中，所述盐溶液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为：250g/L MgCl2·6H2O、100g/L CaCl2·2H2O、100g/L KCl、2M柠檬酸(Citric acid)。所述微量金属盐溶液的组成如下：每1L所述微量金属盐溶液中含有6.80g ZnCl2、54.00g FeCl3·6H2O、16.20gMnCl2·4H2O、2.20g CuSO4·5H2O、4.80g CoCl2·6H2O、0.024g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.20g KI和119mL37％(体积百分比浓度)的浓盐酸，余量为水。
补料：由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为：275g/L甘油和225g/L酵母粉。
包含体洗涤缓冲液：由溶剂和溶质组成，溶剂为pH值为7.2-7.5的10mM的PBS缓冲液，溶质及其浓度为：2M尿素。
变性缓冲液：由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、8M尿素(urea)和20mM二硫苏糖醇(DTT)；pH值为10.0。
复性缓冲液：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2M尿素(Urea)、1mM胱氨酸(Cystine)和3mM半胱氨酸(Cysteine)；pH值为10.0。
硫酸铵沉淀所采用的复溶缓冲液：由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5。
亲和层析所采用的平衡液：由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris，2M NaCl，pH 7.5。
亲和层析所采用的洗脱缓冲液：由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris，2M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.5。
超滤稀释缓冲液：由溶剂和溶质组成。溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM Tris，8M尿素，pH 8.5。
凝胶过滤层析所采用的洗脱液：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：50mM醋酸(HAC)、6.7mg/mL棉籽糖(Raffinose)；pH值为3-4。
实施例1、重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)的制备与鉴定
本实施例将采用大肠杆菌原核表达系统表达重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)，并对其进行鉴定。
一、表达重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)重组大肠杆菌的制备
1、赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)编码基因的优化
将绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的Lys-C的编码基因(GenBank号:AY062882.1的第73-1389位，GI:17978564)，在不改变野生型赖氨酰肽链内肽酶的氨基酸序列(序列2的第169-606位)的前提下，将其密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子。所述优化还包括对赖氨酰肽链内肽酶的基因序列的其他改造，以适合在大肠杆菌中表达，并在优化好的序列前加入起始密码子ATG，最终获得优化后的Lys-C的编码基因序列如序列表中序列1的第502-1818位所示。
2、重组表达载体的构建
将pET-32a(+)载体的EcoR I和Xho I识别位点(识别序列)间的DNA序列替换为序列表中序列1的第502-1818位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到重组表达载体pET-32a(+)-Lys-C。并进一步经DNA测序验证表明载体构建正确。
重组表达载体pET-32a(+)-Lys-C，其编码的蛋白序列(序列2)除Lys-C酶原的完整序列以外，还包括了N端的载体TRX标签序列，C端的6xHis序列等。表达蛋白的完整分子量(理论)为64888.53Da。如果第一个甲硫氨酸在表达后去除，其完整分子量(理论)为64757.33Da。
3、化学转化
通过化学转化法，将步骤2构建的pET-32a(+)-Lys-C导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到含有重组Lys-C基因的重组菌株，将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-Lys-C(下文中简称BL21-Lys-C菌株)。
二、重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)的制备
1、BL21-Lys-C菌株的发酵与包含体收集及初步鉴定
将步骤一制备的BL21-Lys-C菌株在固体LB/Amp平板上活化，获得BL21-Lys-C菌株的单克隆。将单克隆接种于50mL LB液体培养基中(卡那霉素的浓度为100μg/mL)，37℃摇床震荡培养。当LB液体培养体系的OD600为1.5-2.0时(以LB液体培养基为空白对照)，得到一级种子。将一级种子单独接种到经121℃湿热法高压灭菌的装有2.5L高密度发酵基础培养基5L发酵罐(Applikon Biotechnology公司)中，接种后的培养体系的OD600为0.01(以高密度发酵基础培养基为空白对照)。初始发酵参数：培养温度为37℃，搅拌速度为400rpm，空气流量为6L/min，pH值为7.0。发酵培养基的pH值通过30％氨水(体积百分比浓度)控制。当溶氧(DO)(相对溶氧量)<15％时与转速联动，最高转速1200rpm。当初始发酵体系的OD600>31(以高密度发酵基础培养基为空白对照)时，获得菌株发酵液1。向菌株发酵液1中补料，补料速度控制在16-18mL/h，降低温度至32℃，并加IPTG至终浓度为1mM，诱导培养9h。诱导培养参数为：培养温度为32℃，搅拌速度为400rpm，空气流量为6L/min，pH值为7.0，发酵培养基的pH值通过30％氨水(体积百分比浓度)控制。溶氧量和转速控制同上，培养至发酵体系的OD600为100，得到发酵液2。
采用水平转子对BL21-Lys-C菌株的发酵液2在4000rpm条件下离心30min收集菌体，得到BL21-Lys-C菌株。在菌体中按照1g:10mL(w/v)的比例加入浓度为10mM的PBS缓冲液，用高速组织剪切机混合均匀，并采用高压匀浆法破碎。高压匀浆压力设定800bar，连续破碎3次后采用水平转子在4000rpm条件下离心30min，获得BL21-Lys-C菌株的包含体(记为包含体1)，共70g。用PBS+2M尿素对包含体1进行洗涤并离心收集包含体(记为包含体2)，共48g。
大肠杆菌发酵的生长曲线如图1中A所示。对BL21-Lys-C菌株的诱导后的全菌蛋白、上清和包含体进行15％SDS-PAGE电泳检测，结果如图1中B所示。BL21-Lys-C菌株在诱导后的全菌蛋白和洗涤后的包含体中含有大小约为65kD的目的蛋白。电泳结果显示诱导的目的蛋白主要以包含体形式表达(图1中B)。
本发明的发明人进一步对包含体用8M尿素溶解后进行质谱分析。结果显示分子量为64758.44Da(图1中C)，该分子量与步骤一2中分析的Lys-C蛋白的理论分子量大小相符。
2、包含体蛋白变性
将包含体按照1:40(质量体积比，g/ml)的比例溶解到变性缓冲液中并室温(25℃)变性3-4小时，13000rpm离心收集上清液，即为变性后的样品。
3、蛋白复性
将上述步骤2获得的变性后的样品按照1:20(体积比)的比例加入到复性缓冲液中，25℃复性过夜(14小时)中，即得复性后的样品。
4、蛋白激活
按照如下进行蛋白激活条件的优化：
将步骤3获得的复性后的样品分别调pH值为：9.5、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、5.5，并将不同pH值样品分别置于25℃激活6小时，并对激活样品进行SDS电泳分析(图2中A)。将步骤3获得的复性后的样品调pH值为7.5并将样品分别置于25℃激活6小时，每隔1小时取样并对激活样品进行SDS电泳分析(图2中B)。
由图2可见，在pH 7.0-8.0之间时，在分子量约28KD位置，有一个明显的条带产生，证明蛋白已经被成功激活。
5、激活蛋白的纯化
(1)硫酸铵沉淀及重悬
硫酸铵沉淀，具体操作如下：①向在pH 7.0条件下激活的蛋白样品中加入固体硫酸铵至60％饱和浓度并4℃搅拌直至硫酸铵完全溶解，冰上沉淀蛋白4小时。②4000rpm离心30min并收集沉淀蛋白。
重悬：将沉淀蛋白样品用重悬缓冲液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为20mM Tris,150mM NaCl,pH 7.5)溶解后并12000rpm离心30min，收集上清蛋白。
(2)金属离子亲和层析纯化
将步骤(1)重悬后所得上清蛋白进行金属离子亲和层析纯化，层析介质为Chelating FF(也可以以Chelating HP(GE)替代)，层析柱体积为5mL。亲和层析的具体操作如下：
平衡：先用平衡液平衡亲和层析柱5个柱体积，使得流出液的基线平稳。
上洋：将步骤(1)所得上清蛋白直接上样。
洗脱：上样结束后用平衡液平衡5个柱体积，再按照如下洗脱程序进行洗脱：①用平衡液与洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱5个柱体积，在这5个柱体积内，洗脱缓冲液在混合液中的体积含量由0％线性变化至2％，即咪唑在洗脱液中的浓度由0M线性升至0.01M。②用平衡液与洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱10个柱体积，在这10个柱体积内，洗脱缓冲液在混合液中的体积含量由2％线性变化至100％，即咪唑在洗脱液中的浓度由0.01M线性升至0.5M。收集洗脱峰，并进行SDS电泳检测。
亲和层析的色谱图如图3中A所示。SDS电泳结果如图3中C所示，在约28KD的位置上出现目的条带。
(3)亲和洗脱样品的超滤浓缩
将步骤(2)收集的经SDS-PAGE鉴定产生约28KD目的条带的洗脱峰用超滤稀释缓冲液稀释一倍并进行超滤浓缩，超滤管为Merck-Millipore公司的10kDa CentrifugalFilter Unit。
超滤后的样品进行SDS-PAGE，结果如图3中C所示，在约28KD的位置上出现目的条带，且杂带明显减少。
(4)凝胶层析纯化
将步骤(3)所得超滤浓缩后样品通过凝胶过滤层析进行最终纯化，所用层析柱为XK 16×40column柱高：33mm，GE Healthcare,USA”，层析介质为SephacrylTM S-100。具体操作如下：
平衡：用平衡缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：50mM HAC，6.7mg/mLRaffinose)，平衡2个柱体积。
上洋：将步骤(3)所得超滤浓缩后样品直接上样，上样量为2mL。
洗脱：用洗脱液进行洗脱，基于体积进行连续收集，每个收集组分为2mL，流速为3mL/min，并对收集组分进行电泳分析，对电泳纯度较好的组分进行合并并进行后续活性分析。
样品的凝胶过滤层析图谱如图3中B所示，将所收集的洗脱峰进行SDS-PAGE，结果如图3中C所示(其中，分子筛峰1为图3中B的凝胶层析色谱峰的30-45mL组分，分子筛主峰为图3中B的凝胶层析色谱峰的45-55mL对应组分，即虚线部分)，在约28KD的位置上出现目的条带，已经基本没有任何杂带产生。
基于图3中色谱图和电泳结果表明，在虚线标注的色谱峰之前的蛋白峰，除了含有目的蛋白外，在低分子量部分含有大量的降解条带，这个结果表明，蛋白降解产物可能有非常强的相互作用。
另外，有图3中C所示的将复性激活但未经硫酸铵沉淀的蛋白样品、经硫酸铵沉淀复溶后的蛋白样品、以及经不同纯化方法获得的蛋白样品一同进行SDS凝胶电泳检测的结果，可见：经过激活后(未经硫酸铵沉淀)的蛋白是一个混合物，在分子量约28kD处有一个明显条带；经过硫酸铵沉淀和亲和纯化后，蛋白纯度没有明显提高，但蛋白得到有效浓缩；经过进一步的超滤浓缩和凝胶过滤层析，蛋白纯度有明显提高，在分子量约28kD处有一条主要条带产生而且有一条约18kD的蛋白产生。该结果与Lee S.Engel，1998(Protease IV,aUnique Extracellular Protease and Virulence Factor from Pseudomonasaeruginosa,the journal of biological chemistry,1998)的报道一致。这进一步说明18kD的蛋白不是杂蛋白，而可能是Lys-C蛋白的降解产物。
三、重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)的质谱鉴定
对凝胶过滤层析后获得的蛋白纯品进行LC-MS/MS分析。结果如图3中D所示，经凝胶过滤层析获得的蛋白纯品的实际测量分子量为27431.28kD，与理论分子量27431.11kD相符。该结果进一步证明，Lys-C蛋白表达完全正确。
四、重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)回收率计算
根据纯化各步骤以及对图3中C的电泳结果进行灰度值扫描定量，计算Lys-C蛋白整体回收率，如表1所示。可见，基于该高密度大肠杆菌发酵体系，Lys-C蛋白的最终蛋白回收率约为36.61mg/L，即每1L发酵体系中可获得36.61mg的Lys-C蛋白纯品。
表1Lys-C蛋白整体回收率
实施例2、重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)的活性测定
一、制备大肠杆菌全蛋白
将大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen,Germany)PBS重悬后进行超声破碎并离心获得菌体总蛋白，并按照1:9的比例用预冷丙酮进行蛋白沉淀，然后用重悬缓冲液(配方：溶剂为水；溶质及浓度为50mM NH4HCO3和8M的尿素)进行重悬，蛋白浓度为4mg/ml。加入DTT至终浓度20mM，并37℃变性45min，将样品冷却至常温后加入碘化乙酰胺至终浓度40mM并黑暗中进行烷基化，烷基化时间为30min。烷基化结束后，用10kD超滤管换液以去除DTT和碘化乙酰胺。采用缓冲液(配方：溶剂为水；溶质及浓度为50mM NH4HCO3和不同浓度的尿素)对其进行稀释，得到4份大肠杆菌全蛋白样品，使4份大肠杆菌全蛋白样品中蛋白浓度均为1mg/ml，NH4HCO3浓度均为50mM，尿素浓度分别为2M、4M、6M、8M，备用。
二、利用重组Lys-C蛋白酶切大肠杆菌全蛋白样品
利用实施例1制备的重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)纯品酶切步骤一制得的大肠杆菌全蛋白样品。具体进行了如下实验：
1.将实施例1制备的重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)纯品按照1:20(质量比)的比例加入到步骤一制得的酵母全蛋白样品(尿素浓度分别为2M、4M、6M、8M)中，37℃酶切4小时，酶切结束后进行SDS电泳检测。
结果如图4中A所示。基于电泳结果，该蛋白酶在2-8M尿素条件下均实现对大肠杆菌全蛋白的完全酶切。
2.将实施例1制备的重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)纯品按照1:(50-1000)(质量比)的比例加入到步骤一制得的大肠杆菌全蛋白样品(尿素浓度为2M)中，37℃酶切过夜(14小时)，酶切结束后进行SDS电泳检测。
结果如图4中B所示。基于电泳结果，在进行分析的酶切条件中，大肠杆菌的全蛋白均被完全酶切，只有在1:1000条件下，有少量蛋白蛋白残留。
3.将实施例1制备的重组赖氨酰肽链内肽酶(Lys-C)纯品按照1:50(质量比)的比例加入到步骤一制得的大肠杆菌全蛋白样品(尿素浓度为2M)中，37℃酶切过夜(14小时)，体系中酵母全蛋白的总量为2μg。酶切结束后,将溶液酶切样品进行真空干燥后进行C18zip-tip脱盐用于质谱分析。
C18zip-tip脱盐柱的预处理与脱盐
1)脱盐柱处理：向脱盐柱中加入20μL甲醇，静置2-3mins，用注射器将甲醇压出，注意不要压太干；继续加入20μL buffer B(配方：溶剂为水，溶质及浓度如下：80％ACN，0.5％乙酸，19.5％ddH2O，％表示体积百分含量)，静置2-3mins，用注射器将甲醇压出，注意不要压太干；
2)加入20μL buffer A(配方溶剂为水，溶质及浓度如下：98％ddH2O，1％CAN，1％TFA，％表示体积百分含量)，静置2-3mins用注射器将甲醇压出，注意不要压太干；重复上述平衡步骤1-2次；
3)向3中已干燥样品中加入10μL buffer A，轻弹涡旋已充分溶解样品，离心(6000rpm，5mins)；将样品加到已平衡好的Ziptip柱子中，轻弹，将液体轻甩至柱底部，保留装过样品的PCR管；用注射器分别将样品压至相应的样品PCR管中，瞬离样品至管底部；
4)重复上述3步骤，最后将样品分别压入新的PCR管中(记为Ft)；
5)平衡：向脱盐柱中加入20μL buffer A，轻弹，将液体轻甩至柱底部，轻弹，将液体轻甩至柱底部，将样品分别压入新的PCR管中(记为Wash)；
6)洗脱：用装有ddH2O的洗瓶冲洗脱盐柱的外壁；向脱盐柱中加入20μL buffer B，用注射器将样品分别压入新的PCR管中；重复该步骤1次，分别将脱盐柱的液体压入相对应的PCR管中，(记为Et)；
(注意：所有试验中PCR样品管样品全部保留，将所有Ft,Wash,Et样品全部离心，真空冷冻干燥；将蒸干的Ft,Wash及脱盐柱于冰箱冷冻保存。)
7)向标记有Et的样品中加入4μL质谱上样Loading buffer，轻弹充分溶解样品，离心，取3μL用于质谱检测。
4.酶切样品的质谱分析
质谱型号与参数：液相系统UPLC system(nanoAcquity Ultra Performance LC,Waters)；色谱柱(5μm i.d.×15cm fused-silica capillary column,C18resins,3μm)；流速0.3μL/min；质谱系统Orbitrap mass spectrometer(Thermo Scientific,SanJose,CA,USA)。质量范围：300-1600，Obritrap质量分析其的分辨率为30000，选择离子丰度在前20的离子在LTQ(线性离子肼)中进行CID(碰撞诱导碎裂)碎裂。每一次扫描，在25ms时间内积累的最大离子数为5000。母离子离子的动态排除时间为30s。
对获得质谱数据利用MaxQuant(v1.5.3.8)进行数据分析。
质谱结果见图4中C和表2。结果表明，在鉴定的肽段中，以赖氨酸为C端肽段所占比例为全部肽段的96％以上。说明本发明实施例1制备的重组Lys-C蛋白的酶切特异性非常高。可以用来进行蛋白组学的样品制备。
表2基于大肠杆菌全蛋白检测重组蛋白酶的特异性
对比例1.Lys-C优化基因的构建与表达方式对照试验1
将实施例1中优化后的Lys-C基因序列(序列1的第502-1818位)替换为优化前序列(GenBank号:AY062882.1的第73-1389位)，其余操作均同实施例1和2。结果证实本对比例蛋白的复性收效率非常低，几乎无法拿到有活性的Lys-C蛋白酶。
对比例2.Lys-C优化基因的构建与表达方式对照试验2
将实施例1中优化后的Lys-C基因序列(序列1的第502-1818位)采用实施例1相同的酶切位点连接到pET-30a(+)中，其余操作均同实施例1和2。结果证实本对比例蛋白表达量很低，经SDS-PAGE检测无法看到明显的蛋白表达，表达蛋白可以复性，但回收效率特别低。分析其原因可能在于：pET-32a(+)载体的N端存在TRX标签序列，其与序列1的第502-1818位融合后表达的重组蛋白才能取得实施例中令人满意的效果，本对比例中目的蛋白的回收效果不甚理想正是由于pET-30a(+)载体缺少TRX标签序列所致。
对比例3.Lys-C优化基因的构建与表达方式对照试验3
将实施例1中优化后的Lys-C基因序列(序列1的第502-1818位)中编码成熟蛋白的序列(序列1的第1068-1818位)采用实施例1相同的酶切位点连接到pET-32a(+)中，其余操作均同实施例1和2。结果证实本对比例蛋白表达量与实施例相当，但是表达蛋白无法复性。
对比例4.Lys-C优化基因的构建与表达方式对照试验4
将实施例1中优化后的Lys-C基因序列(序列1)采用实施例1相同的酶切位点连接到Pgex-4T-1载体中，其余操作均同实施例1和2。结果证实本对比例蛋白表达量适中，表达蛋白可以复性，但激活过程中蛋白降解速度快于实施例，同等条件下无法获得激活蛋白。
对比例5.不同复性方法的对照试验
变性样品的制备及之前的所有步骤同实施例1。将变性样品平均分成两份，按照1:40(体积比)的比例分别加入到本发明实施例1中的复性缓冲液(记为①)和对照复性缓冲液(记为②)中，4℃复性过夜(14小时)，即得复性样品。将复性样品调pH值为7.5，置于25℃激活5小时，取样并进行电泳分析(具体方法参见实施例1)。
复性缓冲液①：20mM Tris，1mM胱氨酸，3mM半胱氨酸，2M尿素，pH 9.5；
对照复性缓冲液②：20mM Tris，10mM CaCl2，2M尿素，0.05％SDS，pH 7.5。
结果显示：4℃条件下复性后激活条件①激活，但效果不及实施例中25℃条件下的复性效果；而条件②未激活。
对比例6.不同纯化方法的对照试验1
复性后的样品的制备及之前的所有步骤同实施例1。将复性后的样品平均分为两份A、B。其中A样品直接调pH值为7.5，B份稀释4倍后调pH值为7.5。将两份样品分别置于25℃激活5小时。
分别取激活样品置于-20℃冻存过夜(14h)，然后参照实施例1进行硫酸铵沉淀和重悬，获得上清蛋白。将所得上清蛋白脱盐至缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：50mMHAC，6.7mg/ml Raffinose)或缓冲液2(溶剂为水，溶质及浓度如下：1mM HCl)中然后进行电泳分析，然后对大肠杆菌全蛋白的切割活性验证(具体方法参见实施例2)。
结果显示：A/B两份样品在激活后的蛋白是混合物，在分子量约28kD处有一个明显条带；但经-20℃冻融后纯度均明显提高，在铵盐沉淀复溶以及脱盐后样品A的纯度再次提高且酶切大肠杆菌全蛋白有活性，但B样品却纯度下降且混合杂质特别多。该对比例说明，冻融和铵盐沉淀能够起到蛋白浓缩和提高纯度的作用，但是复性样品稀释后冻融对蛋白的激活和纯度提高帮助不大。
对比例7.不同纯化方法的对照试验2
蛋白复性、硫酸铵沉淀和重悬，以及之前的所有步骤同实施例1，经硫酸铵沉淀和重悬后获得上清蛋白。
将所得上清蛋白进行亲和层析纯化(层析柱体积5ml)。亲和层析的具体操作：先用平衡液(buffer A：20mM hepes，0.3M NaCl，pH 7.5)平衡亲和层析柱5个柱体积，使基线平稳；将以上所得上清蛋白直接上样，体积为20ml；上样结束后用平衡液平衡5个柱体积后，再按照如下洗脱程序进行洗脱：①用平衡液与洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱5个柱体积，在这5个柱体积内，洗脱缓冲液在混合液中的体积含量由0％线性变化至2％，即咪唑在洗脱液中的浓度由0M线性升至0.01M。②用平衡液与洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱10个柱体积，在这10个柱体积内，洗脱缓冲液在混合液中的体积含量由2％线性变化至100％，即咪唑在洗脱液中的浓度由0.01M线性升至0.5M。③用洗脱缓冲液洗脱3个柱体积。收集洗脱峰取样并进行电泳检测(具体操作参见实施例1)。其中，洗脱缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：20mM hepes，0.3M NaCl，0.5M咪唑；pH 7.5。
结果显示：在经亲和层析后得到相对纯度较高的激活蛋白。但蛋白回收率很低，说明激活Lys-C蛋白的稳定性较差，在蛋白纯化过程中降解明显。

Claims (8)

1.一种制备重组赖氨酰肽链内肽酶的方法，包括如下步骤：
（1）向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如序列表中序列2所示的重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；
所述重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述受体大肠杆菌细胞中的；所述重组表达载体为将序列表中序列1的第502-1818位所示DNA片段替换pET-32a(+)载体的酶切位点EcoR I和Xho I的识别序列间的DNA片段后得到的重组质粒；
（2）对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包含体；
（3）对所述包含体进行变性，得到变性后的样品；
（4）将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；
（5）将所述复性后的样品进行激活，得到有活性的重组赖氨酰肽链内肽酶粗品；
（6）对所述重组赖氨酰肽链内肽酶粗品进行纯化，得到纯化后的重组赖氨酰肽链内肽酶；
在步骤（4）中，所述复性在复性缓冲液中进行，所述复性缓冲液的pH值为10.0，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、胱氨酸、半胱氨酸和尿素；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为20mM，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为1mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为2M；
在步骤（5）中，所述激活为将所述复性后的样品调pH值为7.5，于25℃静置6小时；
在步骤（6）中，所述纯化为将所述重组赖氨酰肽链内肽酶粗品依次进行硫酸铵沉淀、金属离子亲和层析、超滤浓缩和凝胶过滤层析；
所述金属离子亲和层析采用的层析介质为金属螯合高流速琼脂糖微球或者金属螯合高分辨琼脂糖微球；所述凝胶过滤层析采用的层析介质为丙烯葡萄糖凝胶S-100；
所述金属离子亲和层析的洗脱程序如下：1）用平衡液与洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱5个柱体积，在所述5个柱体积内，咪唑在所述混合液中的浓度由0M线性升至0.01M；2）用所述平衡液与所述洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱10个柱体积，在所述10个柱体积内，咪唑在所述混合液中的浓度由0.01M线性升至0.5M；
所述平衡液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和NaCl，所述三羟甲基氨基甲烷在所述平衡液中的浓度为20 mM Tris，所述NaCl在所述平衡液中的浓度为2 M，所述平衡液的pH值为7.5；
所述洗脱缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、NaCl和咪唑，所述三羟甲基氨基甲烷在所述洗脱缓冲液中的浓度为20 mM Tris，所述NaCl在所述洗脱缓冲液中的浓度为2 M，所述咪唑在所述洗脱缓冲液中的浓度为0.5 M咪唑，所述洗脱缓冲液的pH值为7.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内直径比为165：8；所述凝胶过滤层析所采用的洗脱液的pH值为3-4，所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为醋酸和棉籽糖，所述醋酸在所述洗脱液中的浓度为50 mM，所述棉籽糖在所述洗脱液中的浓度为6.7mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述硫酸铵沉淀的步骤为：1）在所述激活后的样品中加入固体硫酸铵至60%饱和浓度，4℃搅拌直至硫酸铵完全溶解，沉淀蛋白4小时；2）离心收集沉淀蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超滤浓缩为采用截留分子量为10 kD的超滤浓缩。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（2）中，对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达为向培养有所述重组大肠杆菌的培养体系中加入IPTG至其终浓度为0.5-1.5mM，32℃诱导9小时。
6.成套试剂，其特征在于：所述成套试剂为用于制备重组赖氨酰肽链内肽酶的成套试剂，由复性缓冲液、进行金属离子亲和层析时采用的平衡液和洗脱缓冲液、进行凝胶过滤层析时采用的洗脱液组成；
所述复性缓冲液的pH值为10.0，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、胱氨酸、半胱氨酸和尿素；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为20mM，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为1mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为2M；
进行金属离子亲和层析时采用的所述平衡液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和NaCl，所述三羟甲基氨基甲烷在所述平衡液中的浓度为20 mMTris，所述NaCl在所述平衡液中的浓度为2 M，所述平衡液的pH值为7.5；
进行金属离子亲和层析时采用的所述洗脱缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、NaCl和咪唑，所述三羟甲基氨基甲烷在所述洗脱缓冲液中的浓度为20 mM Tris，所述NaCl在所述洗脱缓冲液中的浓度为2 M，所述咪唑在所述洗脱缓冲液中的浓度为0.5 M咪唑，所述洗脱缓冲液的pH值为7.5；
进行凝胶过滤层析时采用的所述洗脱液的pH值为3-4，所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为醋酸和棉籽糖，所述醋酸在所述洗脱液中的浓度为50 mM，所述棉籽糖在所述洗脱液中的浓度为6.7mg/mL。
7.试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为用于制备重组赖氨酰肽链内肽酶的试剂盒，含有权利要求6所述成套试剂，以及如下中全部或部分：大肠杆菌感受态细胞、能够表达氨基酸序列如序列表中序列2所示的重组赖氨酰肽链内肽酶的原核表达载体、IPTG、金属螯合高流速琼脂糖微球或者金属螯合高分辨琼脂糖微球、丙烯葡萄糖凝胶S-100。
8.下述应用中的任一种：
I）权利要求1-5中任一所述的方法在制备重组赖氨酰肽链内肽酶中的应用；
II）权利要求6所述的成套试剂在制备重组赖氨酰肽链内肽酶中的应用；
III）权利要求7所述的试剂盒在制备重组赖氨酰肽链内肽酶中的应用。
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