CN105087724A - 酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法 - Google Patents

Abstract

酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法。本发明公开了一种毕赤酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法。具体包括在酵母中高效分泌表达重组人门冬胰岛素原、赖氨酰内肽酶单一酶切获得缺失B30的门冬胰岛素、偶联苏氨酸酯、脱保护、反相纯化及结晶的工艺过程。本发明方法更适合重组门冬胰岛素工业化制备。

Description

酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术下重组蛋白的制备领域。本发明公开了由酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗导致的以高血糖为特征的代谢紊乱病症。目前，中国已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家。糖尿病已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大危害性疾病。糖尿病患者常常伴有多种并发症，容易导致肾脏、眼、心脏和血管等众多器官损害、功能性障碍和衰竭，危害性极大。

由于饭后葡萄糖的峰值与注射胰岛素的峰值到达时间的偏离，给胰岛素注射液的应用带来困难，从而推动了单体胰岛素类似物的产生。上世纪末，人们开发出了速效胰岛素—重组门冬胰岛素，是将人胰岛素B链B28位脯氨酸（Pro）突变为天门冬氨酸（Asp）。此改变，破坏了两个胰岛素单体分子在形成二聚体时重要的范德华力，使其不易形成二聚体。重组门冬胰岛素制剂注射后，其药代动力学接近人胰岛素的生理分泌曲线。与常规人胰岛素相比，其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右，起效时间为10~20分钟，达到峰值时间为40分钟，作用持续时间3~5小时，既有效控制了血糖，也不会造成夜间严重的低血糖事件。

在中国专利CN98813941.3中，公开了一种制备重组胰岛素类似物的方法，该方法在获得正确构象的胰岛素原后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正确构象的Arg(B31)-胰岛素，纯化后再用羧肽酶B去除Arg(B31)-胰岛素C端的Arg，形成正确构象的胰岛素，最后再用HPLC纯化。

在中国专利CN103305581A中，公开了一种制备重组胰岛素的方法，该方法中通过用胰蛋白酶酶切，然后偶联B30的苏氨酸，最后得到普通胰岛素。但其方法不适合门冬胰岛素的制备，因胰蛋白酶无法酶切B28-29为Asp-Lys的Lys的羧基端肽键。

在中国专利CN102159588A中，公开了一种制备门冬胰岛素的方法，该方法中通过构建含有B30苏氨酸的门冬胰岛素原，然后胰蛋白酶和羧肽酶B同时酶切门冬胰岛素原的方法，获得门冬胰岛素。该方法的得率低于70%，且酶用量偏高。

在中国专利CN1589328A中，公开了一种制备门冬胰岛素的方法，该方法中通过选用无色杆菌蛋白酶Ⅰ酶切，酶切完成后直接改变条件转肽，偶联苏氨酸酯。

本发明专利中公开了重组门冬胰岛素的制备方法。该方法通过巴斯德毕赤酵母分泌表达含有三对二硫键正确构象的门冬胰岛素原后，用赖氨酰内肽酶高效单一酶切，得到缺失B30位的门冬胰岛素，然后在赖氨酰内肽酶作用下偶联叔丁醚苏氨酸叔丁酯（苏氨酸酯）；再脱去保护基团，经反相精纯化和结晶，得到重组门冬胰岛素。本发明工艺中，酶切、偶联效率高，且偶联后相关物质的反相色谱中行为差异显著，易于精纯化，更适合工业化制备重组门冬胰岛素。

发明内容

本发明提供了重组门冬胰岛素新的表达途径，以及重组门冬胰岛素原单一酶切和偶联方法，从而提高重组门冬胰岛素的工艺水平和生产能力。

本发明中，重组门冬胰岛素制备工艺具体包括以下步骤：

）通过酵母发酵获得正确构象的门冬胰岛素原；

）金属螯合层析和阳离子交换层析纯化门冬胰岛素原；

）选用赖氨酰内肽酶酶切门冬胰岛素原，获得缺失B30位的门冬胰岛素；

）B30位偶联苏氨酸酯；

）反相纯化步骤样品；

）步骤样品的脱保护及反相精纯化；

）结晶步骤样品。

本发明中，步骤）的重组门冬胰岛素是通过毕赤酵母或酿酒酵母发酵获得，优选巴斯德毕赤酵母。

步骤）中，采用铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析纯化重组门冬胰岛素原。螯合层析用100mM咪唑洗脱，阳离子交换层析用1.0MNaCl洗脱。

步骤）中赖氨酰内肽酶（LysylEndopeptidase,Lys-C），也被称为赖氨酰肽链内切酶酶切重组门冬胰岛素。该酶可以特异性切除赖氨酸残基羧基端肽键，其最适活性pH为9.0~9.5。酶切缓冲可以为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲、硼酸盐缓冲，优选Tris-HCl缓冲盐；其离子强度为20~100mM，优选30~60mM。赖氨酰内肽酶与门冬胰岛素原的质量比介于1:3000~30000，优选1:5000~20000时酶切效率达95%左右。

步骤）中，酶切获得的缺失B30门冬胰岛素偶联苏氨酸酯。具体为反应体系中蛋白浓度为10~30g/L，DMF/EtOH（V/V）体积分数为40-70%，去离子水为10-30%，蛋白与叔丁醚苏氨酸叔丁酯（苏氨酸酯）质量之为1:3~20，pH为5.5~8.5，反应温度为20~37℃；蛋白浓度优选10~20g/L，DMF/EtOH（V/V）为优选50-60%，去离子水含量优选15-20%，蛋白与叔丁醚苏氨酸叔丁酯（苏氨酸酯）质量之为1:5~15，pH优选6.5~8.0，反应温度优选25~30℃。此步骤中B30位苏氨酸偶联率达到85~90%。

步骤）反相纯化步骤样品。样品偶联完成后，补加2倍体积冷乙腈，在WatersSunfireC8反相色谱层析柱中，用含有0.1~0.2M硫酸铵的乙腈缓冲液梯度洗脱，目的蛋白产物的纯度达到98%。

步骤，步骤纯化样品脱保护。选取30~100%TFA的二氯甲烷（DCM），按蛋白含量（mg）与DCM/TFA混合液体积（ml）比为10~50：1补加DCM/TFA混合液，反应温度为10~25℃，反应时间0.5~1.5小时。优选50~100%TFA的DCM，蛋白与TFA/DCM混合液之比优选10~30:1，反应温度优选15~20℃，反应时间优选0.5~1小时。反应完全后，用去离子水稀释30~40倍，补加5%乙腈，在SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱中，按照步骤的方法洗脱样品。精纯化获得重组门冬胰岛素的纯度达到99%。

步骤）结晶，先将步骤样品真空低温冻干，在10~30℃条件下，配置含20~200mM柠檬酸三钠、3.0~10.0g/L重组门冬胰岛素、体积分数为10~30%的乙醇、0.2~0.5%的间甲酚、0.2~1.0M氯化钠结晶液、并调节结晶液pH至6.0~6.5、按锌离子与门冬胰岛素的摩尔比为2~15:1补加锌离子，结晶3~6小时，然后降温至2~8℃静置10~20小时，获得门冬胰岛素结晶。

本发明相对于现有技术具有如下的优点：

（1）赖氨酰内肽酶单一酶切门冬胰岛素原，酶切效率高和错切率极低的优点。

（2）B30位苏氨酸酯的偶联率高。

（3）反相粗纯化和精纯化的分离效果高且具有较高回收率。

附图说明

图1：重组人门冬胰岛素原酶切前后反相色谱图。其中，图a是门冬胰岛素原酶切前的RP-HPLC分析图；图b为门冬胰岛素原酶切后的RP-HPLC分析图。

图2：DesB30-门冬胰岛素偶联苏氨酸酯的RP-HPLC检测图。

图3：DesB30-门冬胰岛素偶联产物反相纯化图。

图4：DesB30-门冬胰岛素偶联产物纯化后RP-HPLC分析图。

图5：DesB30-门冬胰岛素偶联产物脱去保护基团并反相纯化后RP-HPLC分析图。

图6：重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下64倍放大图。

图7：重组门冬胰岛素的质谱。

具体实施方案

以下结合具体实施例来进一步描述本发明。本发明的优点和特点将随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例，不对发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入落入本发明的保护范围内。

实例1.重组门冬胰岛素上游构建与筛选

（1）以重组人门冬胰岛素原氨基酸序列设计其cDNA序列，并在序列后面设计TGA和TAA两个终止密码子序列，在序列3＇端和5＇端分别设计XhoI（CTCGAG）和NtoI（GCGGCCGC）限制性酶切位点。委托大连TAKARA工程有限公司进行全基因合成。

（2）将上述全基因合成的Pro-AspcDNA插入PMD18-T-Pro-Asp质粒。用限制性内切酶分别酶切PMD18-T-Pro-Asp和pPICZαA后回收两个目的片段（Pro-Asp和pPICZαA大片段），经T4链接并转化到P.PastorisX-33宿主菌中，得到工程菌（pPICZαA-Pro-Asp/X-33）。

（3）通过筛选高效表达的工程菌，并优化发酵工艺，获得重组门冬胰岛素原。

SEQIDNO:1（InsulinAspart氨基酸序列1）：

Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-LeuTyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Met-Trp-Lys-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-ThrSer-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQIDNO:2（InsulinAspart氨基酸序列2）：

Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-LeuTyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Glu-Trp-Lys-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-ThrSer-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQIDNO:3（门冬胰岛素的cDNA序列）：

ctcgagaagagagaagaagctgaagctgaagctgaaccaaagtttgttaaccaacatttg60

tgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctac120

actgataaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtac180

caattggaaaactactgtaactgataagcggccgc215

实例2.门冬胰岛素制备

（1）纯化获得门冬胰岛素原和酶切获得缺失B30-门冬胰岛素：巴斯德毕赤酵母发酵液5L，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析获得门冬胰岛素原；然后补加20mMZn离子沉淀门冬胰岛素原，离心，沉淀用100ml50mMTris溶解,蛋白含量为1g，pH调到8.8,按酶与蛋白质量比为1:5000补加赖氨酰内肽酶（Lys-C）0.2mg，30℃搅拌酶切。16小时后，取样RP-HPLC分析，酶切效率达到90%，调pH5.5等电点沉淀。

（2）desB30-门冬胰岛素偶联，得到门冬胰岛素酯：取等电点沉淀desB30-门冬胰岛素离心，用5ml10%冰醋酸溶解，蛋白浓度为80mg/ml,6ml，缓慢补加DMF/EtOH（V/V=1:1）混合液18ml，补加叔丁醚苏氨酸叔丁酯6ml(6g左右)，pH调到8.0，按1:500补加Lys-C1mg，30℃搅拌偶联。

（3）门冬胰岛素酯的纯化及脱酯：偶联反应48小时后，取样RP-HPLC分析，偶联率为85%。补加120ml冷乙腈沉淀门冬胰岛素酯，用400ml20%乙腈溶解沉淀，pH调到2.5。样品用WatersSunfireC8纯化（A液：0.2M硫酸铵，pH2.1；B液：0.1M硫酸铵，40%乙腈）回收门冬胰岛素酯。取纯度95%以上样品低温真空冻干。取300mg门冬胰岛素酯，补加15ml含50%三氟乙酸（TFA）的二氯甲烷（DCM），15℃反应1小时，反应基本完全；样品补加600ml5%乙腈溶液，用SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱纯化，方法同前。

（4）门冬胰岛素结晶：

取SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱回收门冬胰岛素低温真空冻干，约250mg。40ml的0.02M的盐酸溶解，补加4.6g氯化钠，20ml的0.2M柠檬酸三钠，16ml2.5%的间甲酚（用乙醇稀释），充分混匀，调pH至6.0，再补加4ml的0.12M的乙酸锌。室温（15℃）搅拌3小时，4℃静置24小时，取样进行HPLC检测并观察晶体。

实例3.门冬胰岛素制备工艺优化

（1）纯化获得门冬胰岛素原和酶切获得DesB30-门冬胰岛素：巴斯德毕赤酵母发酵液，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析门冬胰岛素原；然后补加Zn沉淀门冬胰岛素原，离心，沉淀用300ml50mMTris溶解,蛋白含量为2.5g，pH调到9.0,按酶与蛋白质量比为1:10000补加赖氨酰内肽酶（Lys-C）0.25mg，37℃搅拌酶切。16小时后，取样RP-HPLC分析，酶切效率达到95%，调pH5.0等电点沉淀。

（2）缺失B30-门冬胰岛素偶联，得到门冬胰岛素酯：取等电点沉淀DesB30-门冬胰岛素离心，用10ml10%冰醋酸溶解，蛋白浓度为100mg/ml,15ml，缓慢补加DMF/EtOH（V/V=1:1）混合液60ml，补加叔丁醚苏氨酸叔丁酯20ml(20g左右)，pH调到7.5，按1:1000补加Lys-C1.5mg，30℃搅拌偶联。

（3）门冬胰岛素酯的纯化及脱酯：偶联反应48小时后，取样RP-HPLC分析，偶联率为88%。补加200ml冷乙腈沉淀门冬胰岛素酯，用800ml20%乙腈溶解沉淀，pH调到2.5。样品用WatersSunfireC8纯化（A液：0.2M硫酸铵，pH2.1；B液：0.1M硫酸铵，40%乙腈）回收门冬胰岛素酯。取纯度95%以上样品低温真空冻干。取800mg门冬胰岛素酯，补加35ml含70%三氟乙酸（TFA）的二氯甲烷（DCM），15℃反应半个小时，反应基本完全；样品补加600ml5%乙腈溶液，用SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱纯化，方法同前。

（4）门冬胰岛素结晶：

取SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱回收门冬胰岛素低温真空冻干，约700mg。100ml的0.02M的盐酸溶解，补加9.3g氯化钠，50ml的0.2M柠檬酸三钠，40ml2.5%的间甲酚（用乙醇稀释），充分混匀，调pH至6.0，再补加10ml的0.12M的乙酸锌。室温（15℃）搅拌3小时，4℃静置24小时，取样进行HPLC检测并观察晶体（图6）。

实例4门冬胰岛素制备工艺优化

（1）纯化获得门冬胰岛素原和酶切获得desB30-门冬胰岛素：巴斯德毕赤酵母发酵液，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析门冬胰岛素原；然后补加Zn沉淀门冬胰岛素原，离心，沉淀用300ml50mMTris溶解,蛋白含量为2.5g，pH调到9.0,按酶与蛋白质量比为1:25000补加赖氨酰内肽酶（Lys-C）0.1mg，37℃搅拌酶切。16小时后，取样RP-HPLC分析，酶切效率达到85%，酶切20小时，酶切率为94%；调pH5.0等电点沉淀。

（2）DesB30-门冬胰岛素偶联，得到门冬胰岛素酯：取等电点沉淀desB30-门冬胰岛素离心，用10ml10%冰醋酸溶解，蛋白浓度为100mg/ml,18ml，缓慢补加DMF/EtOH（V/V=1:1）混合液55ml，补加叔丁醚苏氨酸叔丁酯25ml(20g左右)，pH调到7.5，按1:2000补加Lys-C0.75mg，30℃搅拌偶联。

（3）门冬胰岛素酯的纯化及脱酯：偶联反应48小时后，取样RP-HPLC分析，偶联率为80%；偶联68小时，偶联率为90%。补加200ml冷乙腈沉淀门冬胰岛素酯，用800ml20%乙腈溶解沉淀，pH调到2.5。样品用WatersSunfireC8色谱柱纯化（A液：0.2M硫酸铵，pH2.1；B液：0.1M硫酸铵，40%乙腈）回收门冬胰岛素酯。取纯度95%以上样品低温真空冻干。取820mg门冬胰岛素酯，补加30ml含三氟乙酸（TFA），15℃反应半个小时，反应基本完全；样品补加600ml5%乙腈溶液，用SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱纯化，方法同前。

（4）门冬胰岛素结晶：

取SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱回收门冬胰岛素低温真空冻干，约750mg。100ml的0.02M的盐酸溶解，补加9.3g氯化钠，50ml的0.2M柠檬酸三钠，40ml2.5%的间甲酚（用乙醇稀释），充分混匀，调pH至6.0，再补加10ml的0.12M的乙酸锌。室温（15℃）搅拌3小时，4℃静置24小时，取样进行HPLC检测并观察晶体。

实例5门冬胰岛素制备工艺优化

（1）纯化获得门冬胰岛素原和酶切获得desB30-门冬胰岛素：巴斯德毕赤酵母发酵液，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析门冬胰岛素原；然后补加Zn沉淀门冬胰岛素原，离心，沉淀用2000ml50mMTris溶解,蛋白含量为10g，pH调到9.0,按酶与蛋白质量比为1:25000补加赖氨酰内肽酶（Lys-C）0.4mg，37℃搅拌酶切。16小时后，取样RP-HPLC分析，酶切效率达到80%，酶切24小时，酶切率为94%；调pH5.0等电点沉淀。

（2）desB30-门冬胰岛素偶联，得到门冬胰岛素酯：取等电点沉淀desB30-门冬胰岛素离心，用40ml10%冰醋酸溶解，蛋白浓度为100mg/ml,50ml，稀释到80ml，缓慢补加DMF/EtOH（V/V=1:1）混合液220ml，补加叔丁醚苏氨酸叔丁酯80ml(20g左右)，pH调到7.5，并定容到400ml，按1:2000补加Lys-C2.5mg，30℃搅拌偶联。

（3）门冬胰岛素酯的纯化及脱酯：偶联反应48小时后，取样RP-HPLC分析，偶联率为80%；偶联68小时，偶联率为88%。补加800ml冷乙腈沉淀门冬胰岛素酯，用2L20%乙腈溶解沉淀，pH调到2.5。样品用WatersSunfireC8色谱柱纯化（A液：0.2M硫酸铵，pH2.1；B液：0.1M硫酸铵，40%乙腈）回收门冬胰岛素酯。取纯度95%以上样品低温真空冻干。取4g门冬胰岛素酯，补加100ml含三氟乙酸（TFA），15℃反应半个小时，反应基本完全；样品补加2L5%乙腈溶液，用SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱纯化，方法同前。

（4）门冬胰岛素结晶：

取SP-120-5-C8-BIO（Daisogel）的色谱柱回收门冬胰岛素低温真空冻干，约3.5g。500ml的0.02M的盐酸溶解，补加9.3g氯化钠，250ml的0.2M柠檬酸三钠，200ml2.5%的间甲酚（用乙醇稀释），充分混匀，调pH至6.0，再补加50ml的0.12M的乙酸锌。室温（15℃）搅拌3小时，4℃静置24小时，取样进行HPLC检测并观察晶体。

SEQUENCELISTING

<110>重庆派金生物科技有限公司

<120>酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法

<160>3

<210>SEQIDNO:1

<211>215

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<400>1

ctcgagaagagagaagaagctgaagctgaagctgaaccaaagtttgttaaccaacatttg60

tgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctac120

actgataaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtac180

caattggaaaactactgtaactgataagcggccgc215

<210>SEQIDNO:2

<211>63

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<400>2

GluGluAlaGluAlaGluAlaGluProLysPheValAsnGlnHisLeu

151015

CysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGluArg

202530

GlyPhePheTyrThrAspLysMetTrpLysGlyIleValGluGlnCys

354045

CysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn

505560

<210>SEQIDNO:3

<211>63

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<400>3

GluGluAlaGluAlaGluAlaGluProLysPheValAsnGlnHisLeu

151015

CysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGluArg

202530

GlyPhePheTyrThrAspLysGluTrpLysGlyIleValGluGlnCys

354045

CysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn

505560

Claims (8)

1.一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，具体包括以下步骤：

（1）通过酵母发酵获得正确构象的重组门冬胰岛素原；

（2）金属螯合层析和阳离子交换层析纯化门冬胰岛素原；

（3）赖氨酰内肽酶单一酶切制备缺失B30位苏氨酸的门冬胰岛素；

（4）缺失B30位苏氨酸的门冬胰岛素偶联苏氨酸酯及脱保护；

(5）门冬胰岛素的反相精纯化及结晶。

2.权利要求1所述的重组门冬胰岛素，其所述的化学式为：

10203040

EEAEAEAEPKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKX_aa

5060

WKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

其中，序列第1位至10位为引导肽，11-39为B链肽段，40-42为短C肽肽段，43-63为A链肽段，X_aa为非碱性氨基酸，优选Met或Glu。

3.权利要求1所述的表达宿主菌为酵母细胞，其酵母细胞为巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母，优选巴斯德毕赤酵母。

4.权利要求1所述的门冬胰岛素原赖氨酰内肽酶酶切，其酶切缓冲为20~100mMTris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲，或者硼酸盐缓冲，优选Tris-HCl缓冲盐。

5.权利要求4所述赖氨酰内肽酶酶切，其特征在于赖氨酰内肽酶与门冬胰岛素原的质量比介于1:3000~30000。

6.权利要求1所述缺失B30苏氨酸的门冬胰岛素苏氨酸酯的转肽反应，其特征在于，反应体系中蛋白浓度为10~30g/L，DMF/EtOH（V/V）为40~70%，去离子水含量为10~30%，蛋白与叔丁醚苏氨酸叔丁酯（苏氨酸酯）质量比为1:3~20，pH为5.5~8.5，反应温度为20~37℃。

7.权利要求1所述脱保护，其特征在于取30~100%TFA的二氯甲烷（DCM），按蛋白含量（mg）与DCM/TFA混合液体积（ml）比为10~50：1补加DCM/TFA混合液，反应温度为10~25℃，反应时间0.5~1.5小时。

8.权利要求1所述的结晶方法，其特征在于，重组门冬胰岛素浓度为3.0~10.0g/L，柠檬酸三钠浓度为20~200mM，乙醇体积分数为10~30%，间甲酚体积分数为0.2~0.5%，氯化钠浓度为0.2~1.0M，并pH为6.0~6.5，锌离子与门冬胰岛素的摩尔比为2~15:1，结晶3~6小时，温度为10~30℃，然后降温至2~8℃静置10~20小时，获得门冬胰岛素结晶。