CN117624335A - 一种门冬胰岛素晶体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种门冬胰岛素晶体的制备方法。具体地，所述方法包括以下步骤：首先提供结晶液，其中所述结晶液由门冬胰岛素、酚类物质、盐类物质、pH调节剂和溶剂组成；然后将所述结晶液与锌盐物质混合，结晶得到所述门冬胰岛素晶体。本发明的方法可以以门冬胰岛素制备过程中的含有乙腈的层析收集液为原料直接进行结晶，且结晶过程中无需添加甘氨酸或其他蛋白，使门冬胰岛素晶体生产工艺更简约，且得到的门冬胰岛素具有沉降体积小、晶体稳定的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，更具体地，涉及一种门冬胰岛素晶体的制备方法。
背景技术
糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。随着人民生活水平的提高、生活方式的改变以及老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急、慢性并发症，尤其是慢性并发症累及多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
糖尿病患者一般都存在相对或绝对的胰岛素分泌不足，故胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世纪70年代，人们通过基因工程技术开发出了重组人胰岛素。后来，为了获得速效或长效等不同作用时间曲线的药物，人们又相继开发出了一系列的胰岛素类似物(胰岛素类似物是指增加、删除或改变胰岛素序列中的一个或多个氨基酸后所得到的胰岛素类产品)。目前己知的胰岛素类似物有赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、谷赖胰岛素。
中国专利CN 103342746 B提供了一种门冬胰岛素的结晶方法：在10～30℃条件下，配制含0.2～1.5mol/L甘氨酸，3.0～10.0g/L门冬胰岛素，体积分数含量为10％～30％有机溶剂(乙腈、乙醇、异丙醇、丙酮)，体积分数含量为0.2％～0.4％的酚类物质(苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、间苯二酚或对羟基苯甲酸甲酯)、0.2～0.5mol/L盐(氯化钠、氯化钙、氯化铵、氯化钾、氯化镁、溴化钾、碘化钾或硫氰酸钾)的结晶溶液，并调节结晶液pH至6.0～6.5，按照锌离子与门冬胰岛素摩尔比(2～15):1加入锌离子(乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌或硫酸锌)，结晶3～6小时，然后降温至2～8℃静置12～18小时，获得稳定的门冬胰岛素晶体。然而其在甘氨酸体系下得到的是单斜晶体，且使用甘氨酸价格昂贵。
现有结晶方法中都需要使用甘氨酸或其他蛋白进行结晶，大大增加成本，因此本领域需要一种操作方便、成本低、回收率高、晶体稳定性高的一种结晶体系。
发明内容
本发明的目的就是提供一种操作方便、成本低、回收率高、晶体稳定性高的一种结晶体系。
在本发明的第一方面，提供了一种门冬胰岛素晶体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(s1)提供结晶液，其中所述结晶液由门冬胰岛素、酚类物质、盐类物质、pH调节剂和溶剂组成；
所述门冬胰岛素以门冬胰岛素层析收集液的形式加入所述结晶液中；所述门冬胰岛素层析收集液中包括乙腈；
(s2)将所述结晶液与锌盐混合，结晶得到所述门冬胰岛素晶体。
应当理解，本发明中门冬胰岛素晶体的制备方法的步骤并不限于上述步骤，在步骤(s1)之前，步骤(s1)和(s2)之间，步骤(s2)之后还可以包括其他额外的步骤，且均在本发明的保护范围之内。
在另一优选例中，所述结晶液包括酚类物质溶液、盐类物质溶液和pH调节剂溶液；所述酚类物质溶液包括酚类物质和第一溶剂；所述盐类物质溶液包括盐类物质和第二溶剂；所述pH调节剂溶液包括pH调节剂和第三溶剂；
所述第一溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇，或其组合。
所述第二溶剂和第三溶剂为水。
在另一优选例中，所述结晶液由门冬胰岛素、酚类物质溶液、盐类物质溶液、pH调节剂溶液和任选地补充溶剂组成。
在另一优选例中，所述结晶液的配制过程如下：向门冬胰岛素中依次加入盐类物质溶液、酚类物质溶液、pH调节剂和任选地补充溶剂，得到结晶液。
在另一优选例中，所述结晶液在12～28℃配制，优选16～25℃。
在另一优选例中，所述门冬胰岛素层析收集液为制备门冬胰岛素过程中得到的纯化收集液。
在另一优选例中，所述门冬胰岛素层析收集液中包括门冬胰岛素、乙腈、柠檬酸三铵和少量的杂质。
在另一优选例中，所述门冬胰岛素层析收集液由门冬胰岛素、乙腈、柠檬酸三铵、水和少量的杂质组成。
在另一优选例中，所述门冬胰岛素层析收集液中，所述门冬胰岛素的浓度为4-15mg/mL，优选4～8mg/mL。
在另一优选例中，所述门冬胰岛素层析收集液中，乙腈的体积分数为10％～50％，优选20％～30％，更优选25％～27％。
在另一优选例中，所述门冬胰岛素层析收集液中，柠檬酸三铵的含量为10～30mol/L，优选20～30mol/L，更优选21～23mol/L。
在另一优选例中，当门冬胰岛素以含有门冬胰岛素和乙腈的层析收集液的形式加入所述结晶液中时，无需补加乙腈。
在另一优选例中，所述步骤(s1)还包括：将所述门冬胰岛素层析收集液浓缩或稀释，再加入所述结晶液中。
在另一优选例中，所述补充溶剂为水，优选纯化水。
在另一优选例中，所述结晶液中，溶剂包括水和乙腈。
在另一优选例中，所述结晶液包括一个或多个选自下组的特征：
(a)所述酚类物质选自下组：苯酚、邻苯甲酚、间苯甲酚、对苯甲酚、间乙基苯酚，或其组合；
(b)所述盐类物质选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸铵、乙酸钠、柠檬酸铵、柠檬酸钠，或其组合；
(c)所述结晶液的pH为6～8，优选6.5～7.5，例如6.7、6.8、7.2、7.4。
在另一优选例中，所述酚类物质选自下组：苯酚、间苯甲酚，或其组合，优选苯酚。
在另一优选例中，所述第一溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇，或其组合。
在另一优选例中，所述酚类物质在酚类物质溶液中的浓度为30％～80％(g/ml)，优选50％～60％(g/ml)。
在另一优选例中，所述盐类物质为氯化钠。
在另一优选例中，所述盐类物质在盐类物质溶液中的浓度为1～8mol/L，优选3～6mol/L，例如4mol/L、5mol/L。
在另一优选例中，在结晶液中加入pH调节剂以调节结晶液的pH。
在另一优选例中，所述pH调节剂可为碱性调节剂或酸性调节剂，其中所述碱性调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水，所述酸性调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸。
在另一优选例中，所述结晶液包括一个或多个选自下组的特征：
(a)所述门冬胰岛素在所述结晶液的浓度为1～8g/L，优选2～6g/L，例如2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4.8g/L、5.0g/L、6.0g/L；
(b)所述酚类物质占所述结晶液的质量体积分数为0.1％～1％，优选0.2％～0.7％，例如0.4％、0.5％、0.6％；
(c)所述盐类物质在所述结晶液的浓度为0.1～1mol/L，优选0.2～0.6mol/L，例如0.5mol/L；
(d)乙腈占所述结晶液的体积分数为15％～30％，优选15％～20％。
在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述锌盐选自下组：氯化锌、乙酸锌、氧化锌、溴化锌、碘化锌、硫酸锌，或其组合。
在另一优选例中，所述锌盐为无机锌盐。
在另一优选例中，所述锌盐为氯化锌。
在另一优选例中，所述步骤(s2)包括：将所述结晶液与锌盐溶液混合，结晶得到门冬胰岛素晶体。
在另一优选例中，所述锌盐溶液中，锌盐物质的浓度为0.5～5mol/L，优选1～3mol/L。
在另一优选例中，在步骤(s2)中，所述锌盐与所述门冬胰岛素的摩尔比为(2～20):1，优选(10～20):1。
在另一优选例中，所述结晶在0～10℃，优选2～8℃下进行。
在另一优选例中，所述结晶的时间为6～25h，优选15～25h。
在另一优选例中，所述结晶为搅拌结晶和/或静置结晶，优选静置结晶。
在另一优选例中，所述结晶液包括1～8g/L门冬胰岛素、0.1％-1％g/ml酚类物质、0.1～1mol/L盐类物质；所述结晶液中含有15％～30％(mL/mL)乙腈，且锌盐与门冬胰岛素摩尔比(2～20)：1，调节pH至6～8，然后降温至2～8℃静置结晶6～25小时，制得门冬胰岛素晶体。
在另一优选例中，所述结晶液包括一个或多个选自下组的特征：
(a)所述门冬胰岛素在所述结晶液的浓度为2～6g/L；
(b)所述酚类物质为苯酚；
(c)所述盐类物质为氯化钠；
(d)所述锌盐与所述门冬胰岛素的摩尔比为(10～20):1；
(e)所述锌盐为氯化锌；
(f)结晶条件为：在2～8℃下静置结晶15～25h。
在另一优选例中，所述方法还包括以下后处理步骤：对得到的门冬胰岛素溶液浓缩、洗涤、冻干，得到所述门冬胰岛素晶体，其中所述洗涤剂为水。
在另一优选例中，所述浓缩后的门冬胰岛素浓溶液与洗涤剂的体积比为1：(5～15)，优选1：(7～10)，更优选1:9。
在另一优选例中，所述洗涤为门冬胰岛素浓溶液与洗涤剂混合，2～8℃静置6h，抽去上清。
在另一优选例中，所述洗涤为洗涤1、2、3、4次。
在另一优选例中，所述冻干时间为24～70h。优选的，所述冷冻干燥时间为50-70h。
在本发明的第二方面，提供了一种门冬胰岛素晶体，所述门冬胰岛素由如本发明第一方面所述的方法制备得到；
优选的，所述门冬胰岛素晶体为六面体状晶体，所述晶体中门冬胰岛素的含量超过95％。
优选的，所述门冬胰岛素晶体为六面体状晶体，所述晶体中门冬胰岛素的含量超过98％。
在另一优选例中，所述门冬胰岛素晶体具有选自下组的一个或多个特征：
(i)所述晶体的炽灼残渣小于5％，优选小于3％，更优选小于2％；
(ii)所述晶体的有机溶剂残留小于300ppm，优选小于100ppm；
(iii)所述晶体的酚类物质残留小于2000ppm；
(iv)所述晶体的尺寸为10～100μm。
本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的门冬胰岛素晶体的制备方法和第二方面所述的门冬胰岛素晶体在糖尿病领域的应用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了对比例1中晶体放大640倍的显微镜照片。
图2显示了对比例2中晶体放大160倍的显微镜照片。
图3显示了实施例2中晶体放大160倍的显微镜照片。
图4显示了实施例3中晶体放大160倍的显微镜照片。
图5显示了实施例4中晶体放大64倍的显微镜照片。
图6显示了实施例4中晶体放大160倍的显微镜照片。
图7显示了实施例4中晶体放大640倍的显微镜照片。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了一种制备门冬胰岛素晶体的方法。该方法直接使用门冬胰岛素制备过程中的洗脱液作为原料，省去了浓缩纯化的过程，却在含有杂质的洗脱液中间体中结晶出形状规则的六面体状晶体，且回收率极高(超过97.5％)。本发明的结晶方法无需加入昂贵的甘氨酸或鱼精蛋白等原料，不需要补加乙腈，大大降低成本，操作简单易行，回收率高，可放大生产。在此基础上完成了本发明。
门冬胰岛素晶体
本发明提供了一种门冬胰岛素晶体，为六面体状晶体。
门冬胰岛素晶体是门冬胰岛素六聚体规则排列而形成的聚晶，其中六聚体形成是一个关键阶段。本发明利用简单廉价的助剂(例如氯化钠、氯化锌、苯酚)即可得到稳定的门冬胰岛素六聚体，最终生长成为形貌规则、尺寸均一的六面体门冬胰岛素晶体。
门冬胰岛素层析收集液
门冬胰岛素层析收集液是在制备门冬胰岛素过程中的纯化中间体，尚未经过浓缩、沉淀和再溶解。
优选地，门冬胰岛素反相层析收集液中含有门冬胰岛素、乙腈、柠檬酸三铵、水和少量杂质。
更优选地，门冬胰岛素反相层析收集液由门冬胰岛素、乙腈、柠檬酸三铵、水和少量杂质组成。
所述门冬胰岛素层析收集液中，门冬胰岛素的浓度为5-15mg/mL，优选4-8mg/mL；乙腈的体积分数为10％～50％，优选20％～30％；柠檬酸三铵的含量为10-30mol/L，优选20-30mol/L。
所述门冬胰岛素层析收集液中，门冬胰岛素的纯度大于95％，优选大于97％，更优选大于99％，例如99.2％、99.5％。
本发明的结晶方法
本发明提供了一种结晶方法，所述方法包括以下步骤：(s1)提供结晶液，其中所述结晶液由门冬胰岛素、酚类物质溶液、盐类物质溶液、pH调节剂溶液和溶剂组成；
所述门冬胰岛素以门冬胰岛素层析收集液的形式加入所述结晶液中；所述门冬胰岛素层析收集液中包括乙腈；
(s2)将所述结晶液与锌盐混合，结晶得到所述门冬胰岛素晶体。
具体的，在12～28℃条件下，配制结晶液：门冬胰岛素浓度1～8g/L、酚类物质体积分数0.1％～1％(g/ml)、盐类物质浓度0.1～1mol/L、有机溶剂10％～30％(ml/ml)，调节结晶液pH至6.5～8，在搅拌状态下加入锌离子溶液(锌盐)控制锌离子与门冬胰岛素摩尔比(2～20):1，然后降温至2～8℃结晶6～25小时，制得门冬胰岛素晶体。
所述的门冬胰岛素可以通过化学合成或者生物合成方法制得。
在结晶液配制阶段，合适的温度有利于增加门冬胰岛素的溶解度，不易于形成沉淀。所述的结晶液配制的温度12～28℃，较优选的温度为16～25℃。
所述的结晶液中门冬胰岛素浓度为1～8g/L，较优选的浓度为2～6g/L。
由于门冬胰岛素晶体是门冬胰岛素六聚体有规则排列而形成的规则体，其中六聚体形成是一个关键阶段。门冬胰岛素六聚体有3种构象：T6、T3R3、R6，其中R6构象最稳定。R6构象中有6个疏水区域可结合6个酚类物质。除此之外，稳定的六聚体构象还需要正离子、负离子参与。
所述结晶液酚类物质为苯酚、邻苯甲酚、间苯甲酚、对苯甲酚，较优选酚类物质为苯酚和间甲酚；酚类物质的浓度为0.1％～1％(g/ml)，较优选的为0.2％～0.7％(g/ml)，更优选的为0.4％～0.6％(g/ml)。
所述的盐类物质为氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸铵、乙酸钠、柠檬酸铵、柠檬酸钠，较优选的为氯化钠；盐类物质浓度为0.1～1mol/L，较优选的为0.2～0.6mol/L，更优选的为0.4～0.6mol/L。
所述的有机溶剂为乙腈、乙醇、异丙醇的一种或任意两种的混合物或三种的混合物，较优选的为乙腈；有机溶剂浓度为10％～30％(ml/ml)，较优选的为15％～20％(ml/ml)，更优选的为14％～18％(ml/ml)。
锌离子是以锌盐溶液的形式加入，在加入的过程中会出现结晶液pH下降，所以在加入锌离子前需要调节pH，才能使制备的门冬胰岛素晶体形态均一。pH调节使用本领域技术人员公知的试剂进行调节，优选使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、盐酸、乙酸、柠檬酸，更优的选用氢氧化钠和盐酸；所述的pH6～8，较优选的pH 6.5～7.5。
所述的锌离子是以锌盐的形式加入的；所述的锌盐为：氯化锌、乙酸锌、氧化锌、溴化锌、碘化锌、硫酸锌，较优选的为氯化锌；所述的锌离子与门冬胰岛素摩尔比(2～20):1，较高的摩尔比有利于降低结晶上清液门冬胰岛素的含量，即增加摩尔比可提高结晶回收率，较优选的摩尔比为(10～20):1。
在低温、长时间条件下，可使小晶核逐渐长大，形成规则的、可沉降至结晶液下部的晶体。所述的2～8℃结晶6～25小时，较优选的为2～8℃结晶15～25小时。
本方法样品来源为层析收集液。本方法用到有机溶剂，与门冬胰岛素精细纯化(精细纯化多为反相层析，乙腈、异丙醇、乙醇为常用有机溶剂)工艺有很好的衔接，不用特意添加或去除有机溶剂。本发明制备的门冬胰岛素晶体自然沉降时间短、体积小，用纯化水即可将各种试剂残留控制在原料药限度要求内，同时晶体状态的原料药与其它状态相比，大大缩短了冻干时间，且质量稳定性更好，非常适用于商业化生产。
本发明的主要优点包括：
1)本发明所述的结晶方法无需添加甘氨酸，一方面避免了新杂质的引入，另一方面，使门冬胰岛素晶体生产工艺更简约，节约结晶成本。
2)本发明可直接利用精细纯化的收集液作为结晶的初始溶液，既可与上一步工艺无缝衔接，无需沉淀和再溶解的步骤，又不需要在结晶过程中特意新添加乙醇、乙腈等有机溶剂来辅助结晶。
3)本发明在晶体洗涤时直接用纯化水洗涤即可将各种试剂残留控制在原料药限度要求内，既节约成本，又避免了新杂质的引入。
4)本发明所述的结晶方法的回收率高(可高达98.5％)。
5)本发明的方法得到的门冬胰岛素晶体具有沉降体积小、晶体稳定且更节能的优点，适合门冬胰岛素原料药的商业化生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
对比例1
取乙腈含量25％(ml/ml)的反相层析乙腈洗脱液100ml，含有门冬胰岛素0.6g，依次加入10.9ml的4mol/L NaCl溶液、0.75ml的50％(g/ml)苯酚溶液、12.7g甘氨酸、11.4ml注射用水，控制门冬胰岛素浓度4.8mg/ml、NaCl 0.35mol/L、苯酚0.3％(g/ml)、乙腈20％(ml/ml)、pH6.3，加入1ml的1mol/L氯化锌溶液控制锌离子与门冬胰岛素摩尔比10：1，终体积125ml。结晶5小时，然后2～8℃结晶16小时。
结果：在结晶过程中加入甘氨酸后，HPLC检测结晶上清液门冬胰岛素含量0.72mg/ml，结晶回收率85％。通过镜检，可看到棒状晶体，但是也有团聚现象。晶体结构如图1所示。
对比例2
取含有门冬胰岛素1.1g的干燥粉末，依次加入4mol/L氯化钠水溶液55ml、50％(g/ml)苯酚乙醇溶液2.2ml、乙醇44ml、0.5mol/L氢氧化钠水溶液0.6ml、纯化水118ml，控制门冬胰岛素浓度5g/L、NaCl 1.0mol/L、苯酚0.5％、乙醇20％、pH7.4，之后加入1mol/L氯化锌溶液0.57ml，控制锌离子与门冬胰岛素摩尔比3:1，终体积220ml。2～8℃搅拌结晶3小时后静置结晶16小时。
结果：当体系中的溶剂为水和乙醇时，HPLC检测结晶上清液门冬胰岛素含量0.63mg/ml，结晶回收率87.4％。混合均匀后使用显微镜(品牌：LIOO)进行镜检，球状聚集晶体偏多，少量规则六面体晶体。晶体结构如图2所示。
实施例1
将含有门冬胰岛素的溶液(门冬胰岛素纯度96％)通过泵上样至C8反相层析色谱柱，用流动相A(30mM柠檬酸三铵(里面的溶剂是水)、pH6.0)和流动相B(乙腈)进行洗脱，收集得到含有门冬胰岛素、乙腈的层析收集液。该层析收集液中门冬胰岛素纯度大于99.5％，门冬岛素浓度为4-8mg/ml，乙腈含量25％～27％(ml/ml)，柠檬酸三铵浓度为21～23mol/L，及少量杂质。
实施例2
取实施例1制备的反相层析洗脱液150ml，含有门冬胰岛素0.736g，依次加入51ml的4mol/L NaCl溶液、2ml的50％(g/ml)苯酚乙醇溶液、0.5ml的0.5mol/L氢氧化钠溶液，控制门冬胰岛素浓度3.6mg/ml、NaCl 1.0mol/L、苯酚0.5％(g/ml)、乙腈15％(ml/ml)、pH6.7，加入0.13ml的1mol/L氯化锌溶液控制锌离子与门冬胰岛素摩尔比2.5：1，终体积204ml。在2～8℃结晶23小时。
结果：HPLC检测结晶上清液门冬胰岛素含量0.364mg/ml，结晶回收率89.9％。通过镜检，可看到六面体晶体。晶体结构如图3所示。
实施例3
取实施例1制备的反相层析洗脱液230ml，含有门冬胰岛素1.43g，依次加入4mol/LNaCl溶液37.5ml、50％(g/ml)苯酚乙醇溶液3ml、0.5mol/L氢氧化钠溶液0.6ml、纯化水29ml，控制门冬胰岛素浓度4.8mg/ml、NaCl 0.5mol/L、苯酚0.5％(g/ml)、乙腈20％(ml/ml)、pH7.2，加入1mol/L氯化锌溶液0.13ml控制锌离子与门冬胰岛素摩尔比10：1，终体积300ml，在2～8℃静置结晶15h。
结果：HPLC检测结晶上清液门冬胰岛素含量0.106mg/ml，结晶回收率97.8％。通过镜检，可看到均匀六面体晶体结构，晶体结构如图4所示。
实施例4
取实施例1制备的反相层析洗脱液627ml，含有门冬胰岛素3.66g，依次加入4mol/LNaCl溶液126.5ml、50％(g/ml)苯酚乙醇溶液10.1ml、0.5mol/L氢氧化钠溶液2.1ml、纯化水245.7ml控制门冬胰岛素浓度3.5mg/ml、NaCl 0.5mol/L、苯酚0.5％(g/ml)、乙腈15％(ml/ml)、pH6.8，加入1mol/L氯化锌溶液0.63ml控制锌离子与门冬胰岛素摩尔比13：1，终体积1012ml。在2～8℃静置结晶20h。
结果：HPLC检测结晶上清液门冬胰岛素含量0.052mg/ml，结晶回收率98.5％。通过镜检，可看到均匀六面体结构，晶体结构如图5、图6、图7所示。
实施例5
将实施例4中结晶液上清抽去，得到含有门冬胰岛素晶体的溶液46ml，上清液966ml，HPLC检测结晶上清液门冬胰岛素含量0.041mg/ml，损失39.6mg门冬胰岛素。
向含有门冬胰岛素晶体的浓溶液中加入414ml纯化水溶液，于2～8℃静置6h，抽去上清420ml，HPLC检测门冬胰岛含量0.046mg/ml，损失19.3mg门冬胰岛素。
再向含有晶体的浓溶液中加入360ml纯化水溶液，于2～8℃静置6h，抽去上清362ml，HPLC检测门冬胰岛含量0.032mg/ml，损失11.6mg门冬胰岛素。
再向含有晶体的浓溶液中加入342ml纯化水溶液，于2～8℃静置6h，抽去上清360ml，HPLC检测门冬胰岛含量0.037mg/ml，损失13.3mg门冬胰岛素。
损失门冬胰岛素总量：39.6+19.3+11.6+13.3mg＝83.8mg，结晶+洗涤回收率＝(1-83.8/3660)*100％＝97.7％。
实施例6
将实施例5中第三次洗涤得到的含有门冬胰岛素晶体的溶液进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为59h，得到门冬胰岛素冻干粉，检测结果：炽灼残渣1.2％(g/g)，乙腈残留21ppm(低于ICH限度要求的410ppm)，苯酚残留1286ppm(低于ICH限度要求的5000ppm)。
结果表明，本发明方法得到的晶体只需使用纯化水洗涤，即可将各种试剂残留控制在原料药限度要求内。
讨论
本申请中的门冬胰岛素原料可直接以层析洗脱液的形式加入结晶液中，却意外地得到了回收率极高的门冬胰岛素晶体。本申请的结晶方法中的溶剂也为乙腈，可以直接与层析洗脱液中的乙腈溶剂在工艺上进行衔接，而且还无需补加乙腈来辅助结晶。
此外，本发明的结晶液体系非常简单，不含有昂贵的甘氨酸、鱼精蛋白等试剂，只使用最常见的有机试剂即可得到高收率的形状规则的六面体门冬胰岛素晶体。
现有技术中多数以精制后的门冬胰岛素粉末为原料，或将洗脱液在锌盐溶液中的沉淀作为原料，结晶体系中需额外加入乙腈、乙醇、异丙醇等溶剂，还需添加甘氨酸来稳定结晶，或加入鱼精蛋白以溶胀，但得到的回收率不如本发明(最高为大于95％)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种门冬胰岛素晶体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(s1)提供结晶液，其中所述结晶液由门冬胰岛素、酚类物质、盐类物质、pH调节剂和溶剂组成；
所述门冬胰岛素以门冬胰岛素层析收集液的形式加入所述结晶液中；所述门冬胰岛素层析收集液中包括乙腈；
(s2)将所述结晶液与锌盐混合，结晶得到所述门冬胰岛素晶体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液包括酚类物质溶液、盐类物质溶液、pH调节剂溶液和任选地补充溶剂，所述酚类物质溶液包括酚类物质和第一溶剂；所述盐类物质溶液包括盐类物质和第二溶剂；所述pH调节剂溶液包括pH调节剂和第三溶剂；
所述第一溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇，或其组合；
所述第二溶剂和第三溶剂为水。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述门冬胰岛素层析收集液中包括门冬胰岛素、乙腈、柠檬酸三铵和少量的杂质。
4.如权利要求3中所述的制备方法，其特征在于，所述门冬胰岛素层析收集液包括选自下组的一个或多个特征：
(a)所述门冬胰岛素层析收集液中，所述门冬胰岛素的浓度为4～15mg/mL，优选4～8mg/mL；
(b)所述门冬胰岛素层析收集液中，乙腈的体积分数为10％～50％，优选20％～30％；
(c)所述门冬胰岛素层析收集液中，柠檬酸三铵的含量为10～30mol/L，优选20～30mol/L。
5.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液包括一个或多个选自下组的特征：
(a)所述酚类物质选自下组：苯酚、邻苯甲酚、间苯甲酚、对苯甲酚、间乙基苯酚，或其组合；
(b)所述盐类物质选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸铵、乙酸钠、柠檬酸铵、柠檬酸钠，或其组合；
(c)所述结晶液的pH为6～8，优选6.5～7.5，更优选6.8～7.2。
6.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液包括一个或多个选自下组的特征：
(a)所述门冬胰岛素在所述结晶液中的浓度为1～8g/L；
(b)所述酚类物质占所述结晶液的质量体积分数为0.1％～1％，优选0.2％～0.7％；
(c)所述盐类物质在所述结晶液的浓度为0.1～1mol/L，优选0.2～0.6mol/L；
(d)乙腈占所述结晶液的体积分数为15％～30％，优选15％～20％。
7.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(s2)中包括选自下组的一个或多个特征：
(a)所述锌盐选自下组：氯化锌、乙酸锌、氧化锌、溴化锌、碘化锌、硫酸锌，或其组合；
(b)所述锌盐与所述门冬胰岛素的摩尔比为(2～20):1。
8.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液包括一个或多个选自下组的特征：
(a)所述门冬胰岛素在所述结晶液的浓度为2～6g/L；
(b)所述酚类物质为苯酚；
(c)所述盐类物质为氯化钠；
(d)所述锌盐与所述德谷胰岛素的摩尔比为(10～20):1；
(e)所述锌盐为氯化锌；
(f)结晶条件为：在2～8℃下静置结晶15～25h。
9.一种门冬胰岛素晶体，其特征在于，所述晶体由权利要求1所述的方法制备得到；
优选的，所述门冬胰岛素晶体为六面体状晶体，所述门冬胰岛素晶体中门冬胰岛素的含量超过95％。
10.如权利要求9所述的门冬胰岛素晶体，其特征在于，所述门冬胰岛素晶体具有选自下组的一个或多个特征：
(i)所述晶体的炽灼残渣小于5％，优选小于3％；
(ii)所述晶体的有机溶剂残留小于300ppm，优选小于100ppm；
(iii)所述晶体的酚类物质残留小于2000ppm；
(iv)所述晶体的尺寸为10～100μm。
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|---|---|---|---|---|
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