CN109851667A - 一种德谷胰岛素前体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物合成及化工领域，特别涉及一种德谷胰岛素前体的纯化方法，本发明将经大肠杆菌发酵得到的包涵体通过变性复性后，经酶切及阳离子交换层析一步纯化，可以制备得到纯度98％以上的德谷胰岛素前体；本发明中变性后的样品不经过阳离子交换层析捕获胰岛素原步骤，直接进行复性；酶切后纯度约30％，经过一步离子交换层析即可直接得到98％以上纯度的德谷胰岛素前体；本发明减少了德谷胰岛素前体制备工序，减少了纯化步骤，降低多工艺步骤导致的损失，简化生产工艺，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成及化工领域，特别涉及一种德谷胰岛素前体的纯化方法。
背景技术
糖尿病是一种常见的代谢内分泌疾病，其已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病常常伴有多种并发症，容易引起多种器官损害、功能性障碍和衰竭，危害很大。目前，中国已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家。
胰岛素为最有效的糖尿病治疗药物之一，而德谷胰岛素前体可与小分子连接形成长效德谷胰岛素，这种独特的结构使得德谷胰岛素形成多六聚体，能够稳定、持久的发挥降糖作用，可大大提高用药安全性。德谷胰岛素前体一般有两种来源，一种为包涵体来源，另一种为分泌蛋白来源。一般包涵体来源的德谷胰岛素前体胰岛素原的捕获方法为阳离子层析纯化，然后经复性、酶切，得到德谷胰岛素前体粗品，再经纯化步骤得到德谷胰岛素前体。分泌蛋白来源的德谷胰岛素前体胰岛素原经前处理(微滤或盐析)，阳离子层析捕获，酶切得到德谷胰岛素前体粗品，再经纯化步骤得到德谷胰岛素前体。
现有技术中，德谷胰岛素前体的纯化方法存在工艺复杂、效率低、成本高等缺陷。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种德谷胰岛素前体的纯化方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
一种德谷胰岛素前体纯化方法，包括以下步骤：
步骤1，大肠杆菌发酵结束后，离心收集菌体，进行破碎，离心收集包涵体沉淀；
步骤2，将所述离心收集包涵体沉淀溶解；
步骤3，将溶解后的包涵体复性；
步骤4，将复性后的德谷胰岛素前体进行酶切转换，得到粗品德谷胰岛素前体；
步骤5，采用阳离子交换层析纯化粗品德谷胰岛素前体，制得德谷胰岛素前体。
优选地，所述步骤1中，菌体按质量体积比1∶10加入破碎缓冲液，所述破碎缓冲液为：25mmol/LTris-HCL+5mmol/LEDTA，pH＝7.5。
优选地，所述步骤2中，所述离心收集包涵体沉淀溶解前采用洗涤缓冲液进行洗涤。
优选地，所述步骤2中，所述包涵体沉淀用包涵体溶解缓冲液按重量体积比1∶10溶解过夜；所述用包涵体溶解缓冲液为：8mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTris-HCL，pH＝7.5。
优选地，所述步骤3的具体步骤为：溶解后的包涵体经离心、超滤去除杂质后，稀释到蛋白浓度0.3mg/ml，在复性缓冲液中，7-10℃复性过夜；所述复性缓冲液为：0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTris-HCL，GSH:GSSG＝1mmol/L:0.3mmol/L，pH＝10。捕获德谷胰岛素前体原为超滤捕获，替代传统阳离子层析捕获的方法，减少制备过程中的纯化步骤。
优选地，所述步骤4的具体步骤为：复性后的德谷胰岛素前体原中加入胰蛋白酶酶切转换，得到粗品德谷胰岛素前体。
优选地，所述步骤4中，胰蛋白酶：德谷胰岛素前体原＝1:500～1:2000；优选为1:1000；酶切温度为15-25℃，酶切时间为3-6小时；优选酶切温度为15℃，酶切时间为6小时。
优选地，所述步骤5中，所述离子交换层析填料为阳离子填料，所述阳离子填料为CaptoS、UniMSP30xS、NanoSP30L中任意一种；优先为UniMSP30xS。
优选地，所述步骤5中，离子交换层析通过通过洗脱液洗脱获得目标产物；所述洗脱液由洗脱缓冲液A与洗脱缓冲液B按照1:3的比例混合形成；
所述缓冲液A为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液中任意一种，所述缓冲液A中还包括：有机相；所述有机相为甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇中任意一种；
所述缓冲液B为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液中任意一种，所述缓冲液B中还包括：有机相和无机盐；所述有机相为甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇中任意一种；所述无机盐为的氯化铵、硫酸铵、氯化钠中任意一种，优选为氯化钠。
优选地，所述缓冲液A为质量分数为10％的正丙醇和20mmol/L乳酸形成的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为10％的正丙醇和20mmol/L乳酸和0.5mol/L氯化钠形成的缓冲液。
优选地，所述无机盐浓度为0.1-1.5mol/L，优选为0.1-0.5mol/L，最优为0.5mol/L。
优选地，所述步骤5中，缓冲液A和缓冲液B的pH为2.0-4.0，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优为3.5。
优选地，所述步骤5中，所用缓冲液A和缓冲液B的流速为：线流速50-150cm/h，优选50-100cm/h，更优选100cm/h。
优选地，所述步骤5中，离子交换层析的载量为5-30mg/ml，优选为5-20mg/ml，最优选为15-20mg/ml。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
(1)本发明中德谷胰岛素前体胰岛素原来源为大肠杆菌发酵得来，德谷胰岛素前体胰岛素原在大肠杆菌体内形成包涵体，经变复性工艺得到德谷胰岛素前体胰岛素原；此方法工艺稳定，并且发酵周期短，产量高。
(2)本发明中德谷胰岛素前体胰岛素原捕获工艺为超滤，与传统工艺中阳离子层析相比，节省时间，以及填料、物料费用。
(3)纯化步骤少，工艺简单，回收率高；仅一步纯化就可达到纯化效果，纯度在98％以上。
附图说明
图1为实施例1-3中德谷胰岛素前体纯化前和纯化后HPLC检测图谱；
图2为德谷胰岛素前体质谱图。
具体实施方式
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所涉及试剂和材料，如无特殊说明，均为商业途径的市售产品。
本发明中，大肠杆菌发酵结束后得到菌体，经高压破碎得到的包涵体经过溶解，超滤后所得样品直接进行复性，复性后样品经过酶切即为实施例1-3中待纯化样品。
具体步骤为：
(1)大肠杆菌发酵结束后，离心收集菌体，按质量体积比1∶10加入破碎缓冲液(25mmol/LTris-HCL+5mmol/LEDTA,，pH7.5)，高压均质机800bar条件下破碎两遍，离心收集包涵体沉淀，包涵体湿重为30g/L发酵液。将沉淀按重量体积比1∶10加入洗涤缓冲液(2mol/L尿素)，室温磁力搅拌1小时，离心收集的沉淀用洗涤缓冲液洗涤两次。(2)再用包涵体溶解缓冲液(8mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTris-HCL，PH7.5)按重量体积比1∶10溶解过夜。(3)溶解后的包涵体经离心、超滤去除杂质后，稀释到蛋白浓度0.3mg/ml，在复性缓冲液(0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTris-HCL，GSH:GSSG＝1mmol/L:0.3mmol/L，pH10)中，7-10℃复性过夜。(4)复性后的德谷胰岛素前体前体按照1：1000加入胰蛋白酶酶切转换，得到粗品德谷胰岛素前体。
步骤(3)中捕获德谷胰岛素前体原为超滤捕获，替代传统阳离子层析捕获的方法，减少制备过程中的纯化步骤。
步骤(4)中所述胰蛋白酶的加入量为：按照质量比，胰蛋白酶：德谷胰岛素前体原＝1:500～1:2000；优选为1:1000；酶切温度为15-25℃，酶切时间为3-6小时；优选酶切温度为15℃，酶切时间为6小时。
实施例1：
离子交换层析
上样样品为上述酶切后样品，用盐酸或氢氧化钠调pH至3.5。
离子交换层析采用NanoSP 30L填料在AKTA中低压层析系统上进行。缓冲液A为质量分数为10％正丙醇+20mmol/L乳酸，缓冲液B为质量分数为10％正丙醇+20mmol/L乳酸+0.5mol/L氯化钠，所有溶液均用盐酸或氢氧化钠调pH至3.5。层析柱柱体积为20ml。线流速为100cm/h。检测波长为280nm。
具体步骤为：
(1)缓冲液A液平衡填料2CV(CV是Column Volumn的缩写，为纯化柱柱床体积)
(2)取约400mg酶切后样品上样，上样后继续用缓冲液A液平衡2CV
(3)采用缓冲液A液和B按照1:3的比例混合后形成洗脱液，洗脱液洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
酶切后样品的上样量约20g/L柱床体积。实验结果为酶切后样品目的蛋白纯度约30％(未去除试剂峰)，含量约400mg；洗脱液洗脱收集目的蛋白纯度约98.5％，含量约280mg。
说明根据实施例1的方法，纯化后德谷胰岛素前体纯度达到98.5％(图1)。
实施例2：
离子交换层析
上样样品同实施例1中样品。
离子交换层析采用Capto S填料在AKTA中低压层析系统上进行。缓冲液A为质量分数为10％正丙醇+20mmol/L乳酸，缓冲液B为质量分数为10％正丙醇+20mmol/L乳酸+0.5mol/L氯化钠，所有溶液均用盐酸或氢氧化钠调pH至3.5。层析柱柱体积为20ml。线流速为100cm/h。检测波长为280nm。
具体步骤为：
(1)缓冲液A液平衡填料2CV(CV是Column Volumn的缩写，为纯化柱柱床体积)
(2)取约400mg酶切后样品上样，上样后继续用缓冲液A液平衡2CV
(3)采用缓冲液A液和B按照1:3的比例混合后形成洗脱液，洗脱液洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
酶切后样品的上样量约20g/L柱床体积。实验结果为酶切后样品目的蛋白纯度约30％(未去除试剂峰)，含量约400mg；洗脱液洗脱收集目的蛋白纯度约98％，含量约300mg。
说明根据实施例2的方法，纯化后德谷胰岛素前体纯度达到98％(图1)。
实施例3：
上样样品同实施例1中样品。
离子交换层析采用UniMSP30xS填料在AKTA中低压层析系统上进行。缓冲液A为质量分数为10％正丙醇+20mmol/L乳酸，缓冲液B为质量分数为10％正丙醇+20mmol/L乳酸+0.5mol/L氯化钠，所有溶液均用盐酸或氢氧化钠调pH至3.5。层析柱柱体积为20ml。线流速为100cm/h。检测波长为280nm。
具体步骤为：
(1)缓冲液A液平衡填料2CV(CV是Column Volumn的缩写，为纯化柱柱床体积)
(2)取约400mg酶切后样品上样，上样后继续用缓冲液A液平衡2CV
(3)采用缓冲液A液和B按照1:3的比例混合后形成洗脱液，洗脱液洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
酶切后样品的上样量约20g/L柱床体积。实验结果为酶切后样品目的蛋白纯度约30％(未去除试剂峰)，含量约400mg；洗脱液洗脱收集目的蛋白纯度约99％，含量约350mg。
说明根据实施例3的方法，纯化后德谷胰岛素前体纯度达到99％(图1)。
实施例中：
缓冲液A为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液中任意一种，所述缓冲液A中还包括：有机相；所述有机相为甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇中任意一种；缓冲液B为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液中任意一种，所述缓冲液B中还包括：有机相和无机盐；所述有机相为甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇中任意一种；所述无机盐为的氯化铵、硫酸铵、氯化钠中任意一种。
所述缓冲液A和缓冲液B的pH为2.0-4.0。
所述洗脱液线流速为50-150cm/h，优选50-100cm/h，更优选100cm/h。
离子交换层析的载量为5-30mg/ml，优选为5-20mg/ml，最优选为15-20mg/ml。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，采用阳离子交换层析，通过洗脱液洗脱得到纯品；所述洗脱液由洗脱缓冲液A与洗脱缓冲液B按照1:3的比例混合形成；
所述缓冲液A为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液中任意一种，所述缓冲液A中还包括：有机相；所述有机相为甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇中任意一种；
所述缓冲液B为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液中任意一种，所述缓冲液B中还包括：有机相和无机盐；所述有机相为甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇中任意一种；所述无机盐为的氯化铵、硫酸铵、氯化钠中任意一种。
2.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述缓冲液A和缓冲液B的pH为2.0-4.0。
3.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述缓冲液A和缓冲液B的pH为3.5。
4.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述缓冲液A为质量分数为10％的正丙醇和20mmol/L乳酸形成的缓冲液；所述缓冲液B为质量分数为10％的正丙醇和20mmol/L乳酸和0.5mol/L氯化钠形成的缓冲液。
5.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析填料为阳离子填料，所述阳离子填料为Capto S、UniMSP30xS、NanoSP30L中任意一种。
6.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析填料为UniMSP30xS。
7.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述洗脱液流速为：线流速50-150cm/h。
8.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述洗脱液流速为：线流速50-100cm/h。
9.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析的载量为5-30mg/ml。
10.如权利要求1所述的德谷胰岛素前体纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析的载量为15-20mg/ml。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190607 |