CN103130868A - 一种蛋白质或多肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质或多肽的纯化方法。本发明方法是通过离子交换层析柱，从包含蛋白质或多肽以及杂质的混合物中，分离得到所述的蛋白质或多肽的。本发明的方法具有以下优点：对层析树脂的再生效果好，可提高层析树脂的使用寿命，降低生产成本；分离精度高，操作步骤简单，可通过简单的阶段洗脱达到梯度洗脱的效果，便于工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体而言，涉及蛋白质或多肽的纯化方法。
背景技术
蛋白质的分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之中分离纯化出所需目的蛋白质的方法，在生物化学研究应用中使用广泛，是当代生物产业的核心技术。
蛋白质的分离纯化既要利用不同蛋白间内在的相似性，又要利用其差异，其中，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，以及利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物中提取出来。但是，目前蛋白质的分离纯化面临的技术问题在于：其技术难度高、成本高。例如，一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
离子交换层析是蛋白质分离纯化中经常采用的一种技术，其利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。离子交换层析是在以离子交换填料为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换填料是由基质、电荷基团和反离子构成的，带有正电荷的称之阴离子交换树脂，阳离子交换树脂结合带有正电荷的蛋白质；而带有负电荷的称之阳离子树脂，阴离子交换树脂结合带有负电荷的蛋白质。离子交换层析的基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。离子交换填料与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换填料上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。洗脱方式可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组分分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。更好的洗脱方法是连续梯度洗脱，但在实际生物医药工业化生产中，由于连续梯度洗脱对设备精度和操作人员技能依赖较高，会导致设备的初期投入较大，另外不同批次的纯化结果会受到操作人员主观判断的影响，因此不同批次间的重复性较差。因此，单纯的采用上述方法往往难以应对蛋白质分离纯化中各种复杂的情况。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种使离子交换层析填料同时具备离子交换层析和疏水层析的功能，进而高效纯化蛋白质或多肽的方法。
具体而言，本发明提供了一种基于离子交换层析的蛋白质分离纯化技术，其特点在于通过调节蛋白溶液的pH达到使目标蛋白与离子交换树脂相结合的目的，然后通过改变洗脱溶液中的有机相含量和离子浓度的方式将目标蛋白与杂质分别洗脱，本专利在使用离子交换树脂进行分离纯化的基础上，突破了离子交换层析的局限性，通过使用含有不同种类和浓度的有机相的缓冲液，使离子交换层析兼具离子交换层析和疏水层析的功能，从而简化的通过缓冲液的变化达到国外昂贵的新型层析填料才具有的复合层析分离效果。
众所周知，离子交换层析所使用的固定相表面应具有尽可能高的亲水性，以消除因疏水性对蛋白产生的非特异性吸附。在这种情况下，离子交换层析通常是采用改变洗脱溶液中离子浓度的方式将与离子交换固定相表面相结合的蛋白洗脱下来，对洗脱溶液中离子浓度的改变分为阶段洗脱和梯度洗脱两种方式；在某些情况下也会采用改变洗脱溶液pH的方式将与离子交换固定相表面相结合的蛋白洗脱下来，这种方式要求对洗脱溶液的pH控制精度较高，应用于大规模商业化生产有一定难度。另外，单纯采用上述方法往往难以应对蛋白质分离纯化中各种复杂的情况。本发明的独到之处在于不改变现有成熟的离子交换树脂，而对离子交换层析本身的洗脱方式进行改进，从而达到同时利用不同蛋白质特异的等电点和疏水性来对目标蛋白分离的目的。
因此，本发明提供了一种从包含目标蛋白质或多肽以及杂质的混合组分中提取出目标蛋白或多肽的方法，该方法包括依次进行的下列步骤：1）用与上样液一致或相似pH及电导率的缓冲液作为平衡液对离子交换填料进行平衡，使离子交换填料达到与上样液一致的pH与电导率，为上样做准备；2）调整待纯化蛋白溶液的pH，作为上样缓冲液，使目标蛋白可以被离子交换填料所吸附；3）用含有或/和不含有有机溶剂的第一缓冲液作为洗涤缓冲液，洗涤离子交换填料，从而从离子交换填料上洗脱下污染物；4）用含有有机溶剂的第二缓冲液作为洗脱缓冲液，洗涤离子交换填料，从而从离子交换填料上洗脱下目标蛋白。用含高盐浓度组分的缓冲液对吸附在离子交换填料的杂质蛋白进行洗脱，对离子交换填料进行再生。
具体地，本发明人通过大量试验研究，最终获得了如下实现发明目的的技术方案：
一种蛋白质或多肽的纯化方法，所述方法是通过离子交换层析柱，从包含目标蛋白质或多肽以及杂质的混合物中，分离得到所述的目标蛋白质或多肽的，该方法包括：
1）提供离子交换填料以及所述混合物；
2）调节所述离子交换填料和/或所述混合物的pH和电导率，以使得所述混合物中的所述目标蛋白质或多肽能够被所述离子交换填料吸附；
3）将步骤2）得到的混合物与步骤2）得到的离子交换填料相接触，从而使该离子交换填料吸附所述目标蛋白质或多肽；
4）采用含有或/和不含有有机溶剂的第一缓冲液作为洗涤液，洗涤一次或多次，并且每次所用的所述洗涤液相同或不同，从而使所述的杂质从步骤3）得到的离子交换填料上洗涤下来；
5）采用含有有机溶剂的第二缓冲液作为洗脱液，使所述目标蛋白质或多肽从步骤4）得到的离子交换填料上洗脱下来，从而得到分离的所述目标蛋白质或多肽。
优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，步骤4）中采用洗涤液洗涤多次，并且每次所用的所述洗涤液不同，其中包括：所述第一缓冲液的种类或/和浓度相同或不同，并且/或者所述有机溶剂的种类或/和浓度相同或不同。
优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，其中所述第一缓冲液中含有有机溶剂，该含有有机溶剂的第一缓冲液能使所述的目标蛋白质或多肽与离子交换填料之间形成疏水相互作用，以及使所述的杂质从步骤3）得到的离子交换填料上洗涤下来。
进一步优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，其中所述第一缓冲液含有与第二缓冲液中相同的有机溶剂。
再进一步优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、醋酸甲酯、醋酸乙酯、丙酮以及乙腈中的一种或几种。从成本、环保和安全角度考虑，优选的有机溶剂为异丙醇。
优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，在所述的洗涤液中，所述的有机溶剂的浓度为10-50%（V/V）。
进一步优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，其中第一缓冲液的电导和/或有机溶剂浓度低于第二缓冲液的电导和/或有机溶剂浓度。
优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，当所述混合物中的所述目标蛋白质或多肽带正电荷时，所述的离子交换填料为阳离子交换树脂；并且在步骤2）中调节所述离子交换填料的pH，使得该pH低于所述目标蛋白质或多肽的等电点。
优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，当所述混合物中的所述目标蛋白质或多肽带负电荷时，所述的离子交换填料为阴离子交换树脂；并且在步骤2）中调节所述离子交换填料的pH，使得该pH高于所述目标蛋白质或多肽的等电点。
优选地，上述蛋白质或多肽的纯化方法，其中所述目标蛋白质或多肽为胰岛素、胰岛素类似物、生长激素或干扰素。
在本发明的步骤1）中，本领域技术人员可以根据需要对离子交换填料进行选择，在离子交换填料的选择上：若被分离物质带正电荷，例如多粘菌素（polymyxin）、细胞色素C（cytochrome C）这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定、亲和力强，故采用阳离子交换填料；其它酸性类物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换填料；如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。以胰岛素为例，它的等电点为pH 5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用阳离子交换填料，在pH>5.3的碱性溶液中，使用阴离子交换填料。已知等电点的物质，在高于等电点的pH条件下，因带有负电荷，应采用阴离子交换，在低于等电点的pH下，则采用阳离子交换。
本发明中涉及的实验是在GE填料系统中完成的，因此涉及的阴阳离子交换填料主要为GE的强阳离子交换填料SP，弱阳离子交换填料CM，强阴离子交换填料Q，弱阴离子交换填料DEAE；但基于相同的层析原理，其他厂家生产的离子交换类型层析填料也适用于本专利中涉及的层析方法。
在本发明的步骤2）中，可以用缓冲液调节所述离子交换填料的pH和电导调节通常被称为预平衡，和/或待纯化所述混合物的pH和电导率调节通常被称为上样液准备。
首先，离子交换填料的pH调节和混合物的pH调节通常是使两者的pH保持一致，即通过调节pH使离子交换填料的pH和待纯化混合物的pH完全相同。其次，该pH的确定与步骤1）的离子交换填料选择是相辅相成的，先要确定目标蛋白的最适pH范围，在此pH范围中，目标蛋白应最稳定，不易变性、降解或产生其他化学变化。当该最适pH范围确定后，根据步骤1）的原理可进行离子交换填料的选择，当离子交换填料确定后，离子交换填料和待纯化混合物的pH也随之被确定。
电导率调节：待纯化混合物的电导率应调节至不高于离子交换填料的电导率。待纯化混合物和离子交换填料的电导率原则上应越低越好。当目标蛋白的等电点与待纯化混合物的pH相差较大时，出于减少杂蛋白与离子交换填料吸附的考虑，可以适当提高待纯化混合物的电导，使杂蛋白流穿。
在本发明的步骤4）和步骤5）中，在含有有机溶剂的缓冲液配制过程中，应注意有机溶剂与水的相容性问题，如两者未经过充分的混合，容易导致实验重复性差、波动大的现象发生。
本领域技术人员可以根据需要对离子交换和缓冲液进行选择。例如，本领域公知的是，离子交换的选择应保持欲分离物质的生物活性，以及在不同pH值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱。
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换填料时要选用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的pH值要高于该物质的等电点；用阳离子交换填料时要选用高于pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物等电点的pH值。
缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么嘧啶等会吸收UV的物质就不适用。
当混合物中的目标蛋白质或多肽带正电荷时，离子交换填料为阳离子交换树脂；并且在步骤2）中调节离子交换填料的pH，使得该pH低于目标蛋白质或多肽的等电点。在步骤2）中，也可以调节所述的混合物的pH，使所述的混合物的pH低于所述的蛋白质或多肽的等电点。一般情况下缓冲液pH与目标蛋白等电点的差异不应小于1，且缓冲液一般使用3-10的pH，pH过高或过低会导致目标蛋白受损。当混合物中的目标蛋白质或多肽带负电荷时，离子交换填料为阴离子交换树脂；并且在步骤2）中调节所述离子交换填料的pH，使得该pH高于所述目标蛋白质或多肽的等电点。在步骤2）中，也可以调节所述的混合物的pH，使所述的混合物的pH高于所述的蛋白质或多肽的等电点。
优选地，在步骤1）至步骤5）中，各缓冲液pH应保持稳定，最高pH与最低pH差值不宜超过2。
在本发明方法中，洗脱步骤可以采用梯度洗脱或阶段洗脱。当然，在实际生物医药工业化生产中，由于梯度洗脱对设备精度和操作人员技能依赖较高，会导致设备的初期投入较大，另外不同批次的纯化结果会受到操作人员主观判断的影响，因此不同批次间的重复性较差。
本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明的方法能够在不改变现有成熟的离子交换树脂的情况下，对离子交换层析本身的洗脱方式进行改进，从而达到同时利用不同蛋白质特异的等电点和疏水性来对目标蛋白分离的目的。本发明的方法具有以下优点：对层析树脂的再生效果好，可提高层析树脂的使用寿命，降低生产成本；分离精度高，操作步骤简单，可通过简单的阶段洗脱达到梯度洗脱的效果，便于工业化应用。
附图说明
图1为胰岛素上样液HPLC纯度检测结果。
图2为对照例收集组分HPLC纯度检测结果。
图3为实施例1收集组分HPLC纯度检测结果。
图4为实施例2收集组分HPLC纯度检测结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本原则，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
众所周知，离子交换层析所使用的固定相表面应具有尽可能高的亲水性，以消除因疏水性对蛋白产生的非特异性吸附。在这种情况下，离子交换层析通常是采用改变洗脱溶液中离子浓度的方式将与离子交换固定相表面相结合的蛋白洗脱下来，对洗脱溶液中离子浓度的改变分为阶段洗脱和梯度洗脱两种方式；在某些情况下也会采用改变洗脱溶液pH的方式将与离子交换固定相表面相结合的蛋白洗脱下来，这种方式要求对洗脱溶液的pH控制精度较高，应用于大规模商业化生产有一定难度。然而单纯的采用上述方法往往难以应对蛋白质分离纯化中各种复杂的情况，而国外已有成功的研发案例是通过改变层析填料的特性，使其兼具离子交换层析和疏水层析的能力，从而开发出复合层析填料，因此研发同时具有离子交换特性和疏水特性的复合树脂成为一个新的研发方向。而本发明的独到之处在于不改变现有成熟的离子交换树脂，而对离子交换层析本身的洗脱方式和缓冲液组分进行改进，从而达到同时利用不同蛋白质特异的等电点和疏水性来对目标蛋白分离的目的。
本发明的目的是提供一种从含有目标蛋白和多种污染物的混合物中纯化目标蛋白的方法。该混合物通常是蛋白重组生产得到的，但也可以是天然来源的目标蛋白混合物。为此，本发明提供了一种在离子交换层析的基础上用含有有机溶剂的溶液进行洗脱，进而对目标蛋白进行纯化的方法。所述方法可以以离子交换填料为固定相，调节目标蛋白溶液的pH和电导率使目标蛋白与离子交换填料吸附，然后依据吸附蛋白与离子交换填料上的平衡离子结合力大小的差别改变有机相与离子浓度对吸附的目标蛋白和杂质蛋白进行分步洗脱，来达到纯化目标蛋白的目的。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。
以下试验例1和实施例1-2将以重组人源胰岛素的纯化为例，对本发明的方法加以描述，但是本发明不限于此。
试验例1 制备胰岛素粗产物
重组人源胰岛素为由重组技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质。其分子式：C257H383N65O77S6，分子量：5807.69。外观为白色或类白色的结晶性粉末。
以下实施例1-2中所用的重组人胰岛素基因工程宿主菌为大肠杆菌(E.coli BL21)，表达载体为有卡那霉素抗性的pET24。
重组人胰岛素基因工程宿主菌进行发酵后将所得的工程菌用高压均质机对菌体破碎，再进行包涵体洗涤，得到胰岛素前体的包涵体。对包涵体进行常规复性，得到具有正确空间结构的胰岛素前体。用Trypsin和CPB两种酶对胰岛素前体进行双酶切，得到含有大量杂质的胰岛素混合物，作为待纯化混合物。经HPLC检测，该待纯化混合物中胰岛素的纯度为41.84%（保留时间为15.017的组分），HPLC检测图谱参见图1，对应检测数据参见表1。通过检测图谱可以看出该混合组分中的主要杂质位于25.363分钟和35.942分钟，含量分别为20.24%和15.46%，而且由于杂质过多，导致HPLC的基线很不平整。
表1胰岛素上样液HPLC纯度统计
| 响应时间（分钟） | 响应面积 | 面积百分比（%） | 峰高（μAu） | |
| 1 | 10.774 | 158782 | 1.58 | 9033 |
| 2 | 15.017 | 4192964 | 41.84 | 141823 |
| 3 | 16.335 | 177502 | 1.77 | 8408 |
| 4 | 17.564 | 211827 | 2.11 | 12130 |
| 5 | 18.892 | 351654 | 3.51 | 9966 |
| 6 | 22.793 | 151363 | 1.51 | 7935 |
| 7 | 23.362 | 519752 | 5.19 | 13504 |
| 8 | 25.363 | 2028215 | 20.24 | 47538 |
| 9 | 26.813 | 464757 | 4.64 | 13349 |
| 10 | 28.912 | 100125 | 1 | 3904 |
| 11 | 34.053 | 114543 | 1.14 | 4052 |
| 12 | 35.942 | 1549482 | 15.46 | 64784 |
对照例
步骤1：取试验例1得到的待纯化胰岛素混合物5L，用1M NaOH调pH至8.5±0.2，电导率应≤10 mS/cm，作为胰岛素上样液。
步骤2：DEAE层析柱（BPG柱）直径100 mm、长度500 mm，填料装填高度为150 mm，床层体积（CV）约为1.2 L。DEAE填料为GE公司凝胶产品DEAE sepharose-Fastflow。蛋白纯化系统为GE公司的AKTA-explore，提供最大流量100 ml/min。层析柱和纯化系统准备完毕后，以含20 mmol/L的Na2HPO4、50 mmol/L的NaCl的水溶液作为平衡液，平衡液的pH为8.5±0.2，电导率约为7.0 mS/cm。将约2个柱体积，2.5L的平衡液以100 mL/min的流速对层析柱进行平衡。
步骤3：将胰岛素上样液以80 mL/min的流速上样至层析柱，柱压控制小于0.3MPa。
步骤4：用约2个柱体积、2.5L的平衡液以100 mL/min的流速对层析柱再次进行平衡。洗掉不与层析柱结合的杂质蛋白。
步骤5：准备含20 mmol/L的Na2HPO4、1.0 mol/L的NaCl水溶液作为洗脱液，洗脱液的pH为8.5±0.2。将平衡液作为A液，洗脱液作为B液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱梯度为0-100% B 15个柱体积，即以100mL/min的流速用180分钟将B液的浓度由0%提高到100%。
步骤6：当洗脱液达到34%时，目标蛋白被洗脱出来，此时进行收集。
步骤7：收集结束后用0.5 mol/L的NaCl水溶液对层析柱进行再生。
经HPLC检测，纯化后目标蛋白胰岛素的纯度由41.84%提高至69.26%（保留时间为15.135的组分），参见表2。该对照例是比较常用的离子交换层析方法，从图2可以看出该方法对位于25.363分钟和35.942分钟均有有效去除，由于系统漂移，上样液中25.363分钟的杂质本次出峰时间为25.417,分钟，含量仅为0.22%，而35.942分钟的杂质本次出峰时间为35.977分钟，含量为1.47%。另外对于保留时间靠后的杂质也有一定的去除效果，但可以看到对于保留时间与目标蛋白接近的杂质去除效果较差，尤其是对紧挨着主峰的杂质峰并无明显作用，反而有所富集，而且由于目标峰附近的杂质仍然较多，HPLC图谱中5到30分钟的基线仍不平整，其中隐藏着一些无法被明确分辨的杂质。
表2对照例收集组分HPLC纯度统计
| 响应时间（分钟） | 响应面积 | 面积百分比（%） | 峰高（μAu） | |
| 1 | 7.038 | 294825 | 0.73 | 12950 |
| 2 | 7.998 | 155920 | 0.39 | 7676 |
| 3 | 9.133 | 114159 | 0.28 | 4690 |
| 4 | 10.802 | 1119948 | 2.78 | 69369 |
| 5 | 12.595 | 200736 | 0.5 | 5752 |
| 6 | 15.135 | 27937946 | 69.26 | 565178 |
| 7 | 16.319 | 4488142 | 11.13 | 148822 |
| 8 | 17.578 | 3384236 | 8.39 | 97591 |
| 9 | 20.142 | 472709 | 1.17 | 14215 |
| 10 | 21.158 | 143939 | 0.36 | 4987 |
| 11 | 21.986 | 197176 | 0.49 | 5941 |
| 12 | 22.871 | 800627 | 1.98 | 23602 |
| 13 | 24.259 | 344408 | 0.85 | 16595 |
| 14 | 25.417 | 88351 | 0.22 | 3212 |
| 15 | 35.977 | 592876 | 1.47 | 19045 |
实施例1
步骤1：取试验例1得到的待纯化胰岛素混合物5L，用1M NaOH调pH至8.5±0.2，电导率应≤10 mS/cm，作为胰岛素上样液。
步骤2：DEAE层析柱（BPG柱）直径100 mm、长度500 mm，填料装填高度为150 mm，床层体积（CV）约为1.2 L。DEAE填料为GE公司凝胶产品DEAE sepharose-Fastflow。蛋白纯化系统为GE公司的AKTA-explore，提供最大流量100 ml/min。层析柱和纯化系统准备完毕后，以含20 mmol/L的Na2HPO4、50 mmol/L的NaCl的水溶液作为平衡液，平衡液的pH为8.5±0.2，电导率约为7.0 mS/cm。将约2个柱体积，2.5L的平衡液以100 mL/min的流速对层析柱进行平衡。
步骤3：将胰岛素上样液以80 mL/min的流速上样至层析柱，柱压控制小于0.3MPa。
步骤4：用约2个柱体积、2.5L的平衡液以100 mL/min的流速对层析柱再次进行平衡。洗掉不与层析柱结合的杂质蛋白。
步骤5：准备含20 mmol/L的Na2HPO4、0.20 mol/L的NaCl、50%异丙醇的水溶液作为洗脱液，洗脱液的pH为8.5±0.2。将平衡液作为A液，洗脱液作为B液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱梯度为0-100% B 15个柱体积，即以100mL/min的流速用180分钟将B液的浓度由0%提高到100%。
步骤6：当洗脱液达到55%时，目标蛋白被洗脱出来，此时进行收集。
步骤7：收集结束后用0.5 mol/L的NaCl水溶液对层析柱进行再生。
经HPLC检测，纯化后目标蛋白胰岛素的纯度由41.84%提高至74.03%（保留时间为15.143的组分）。参见表3。本实施例通过有机相的加入使离子交换层析兼具了疏水层析的部分功效，因而使得目标峰相邻的杂质峰有所减少，尤其是位于目标蛋白峰之后的两个杂质峰比对照例中有了明显的下降。同时可以看到由于相关杂质的减少，HPLC图谱的基线改善明显，一些含量很少的杂质能够被明确辨识。参见附图3。但本实施例与对照例一样，要求层析设备具有精确地梯度控制系统，并要求员工能够准确把握目标峰的出峰收集时间和结束收集时间。
表3 实施例1收集组分HPLC纯度统计
| 响应时间（分钟） | 响应面积 | 面积百分比（%） | 峰高（μAu） | |
| 1 | 7.144 | 214737 | 0.43 | 13371 |
| 2 | 7.630 | 129994 | 0.26 | 7676 |
| 3 | 9.274 | 642298 | 1.27 | 31855 |
| 4 | 11.003 | 1223749 | 2.43 | 75264 |
| 5 | 12.753 | 239958 | 0.48 | 14765 |
| 6 | 14.565 | 92659 | 0.18 | 6245 |
| 7 | 15.143 | 37312018 | 74.03 | 1167257 |
| 8 | 16.590 | 2670560 | 5.3 | 94724 |
| 9 | 17.835 | 3908195 | 7.75 | 113604 |
| 10 | 19.243 | 263866 | 0.52 | 8657 |
| 11 | 20.151 | 666835 | 1.32 | 16051 |
| 12 | 21.438 | 292295 | 0.58 | 8194 |
| 13 | 22.252 | 322946 | 0.64 | 11803 |
| 14 | 23.154 | 834403 | 1.66 | 34610 |
| 15 | 23.758 | 410118 | 0.81 | 14585 |
| 16 | 24.614 | 257077 | 0.51 | 11656 |
| 17 | 25.742 | 176965 | 0.35 | 6479 |
| 18 | 27.051 | 13162 | 0.03 | 1071 |
| 19 | 28.151 | 52807 | 0.1 | 2012 |
| 20 | 35.956 | 675007 | 1.34 | 25052 |
实施例2
为提高工艺可控性，改善分离效果，利用离子交换色谱具有部分疏水色谱的特质对实施例2进行进一步的改进。
步骤1-4同实施例1。
步骤5：准备含20 mmol/L的Na2HPO4、100 mmol/L的NaCl的水溶液作为洗涤液1，以100 mL/min的流速用约3个柱体积、3.5L的洗涤液1对层析柱进行洗涤，去除杂质组分。
步骤6：准备含20 mmol/L的Na2HPO4、30%异丙醇的水溶液作为洗涤液2，以100 mL/min的流速用约3个柱体积、3.5L的洗涤液2对层析柱进行洗涤，去除杂质组分。
步骤7：准备含20 mmol/L的Na2HPO4、100 mmol/L的NaCl、30%异丙醇的水溶液作为洗脱液，以100 mL/min的流速对层析柱进行洗脱，此时所得到的蛋白峰为目标蛋白，进行收集。
步骤8：收集结束后用0.5 mol/L的NaCl水溶液对层析柱进行再生。
经HPLC检测，纯化后目标蛋白的纯度由41.84%提高至79.72%（保留时间为15.211的组分），且纯度比实施例1有较大提高，不但有效的降低了和目标峰相邻的两个个主要杂质峰，而且其他杂质蛋白的比例也明显降低，参见图4。本实施例不但纯化效果更好，对设备和人员要求也更低，具有成本低廉、可控性号、便于工业化运用的特点。
从本实施例可以进一步看出在离子交换层析中运用有机溶剂对纯化效果的影响，在洗脱液中单独加入100 mmol/L的NaCl或30%异丙醇均不能使目标蛋白被洗脱出，只有在同时提高盐浓度和有机相的比例才导致目标蛋白被洗脱出。
表4 实施例2收集组分HPLC纯度统计
| 响应时间（分钟） | 响应面积 | 面积百分比（%） | 峰高（μAu） | |
| 1 | 8.081 | 91447 | 0.21 | 6127 |
| 2 | 9.265 | 881470 | 2.04 | 43483 |
| 3 | 9.780 | 74073 | 0.17 | 4379 |
| 4 | 11.097 | 968531 | 2.24 | 50834 |
| 5 | 12.850 | 496094 | 1.15 | 26795 |
| 6 | 13.553 | 36537 | 0.08 | 1490 |
| 7 | 15.211 | 34442457 | 79.72 | 1393155 |
| 8 | 16.319 | 1696647 | 3.93 | 50077 |
| 9 | 17.662 | 1299107 | 3.01 | 42168 |
| 10 | 19.347 | 650997 | 1.51 | 17532 |
| 11 | 20.200 | 473260 | 1.1 | 11933 |
| 12 | 21.426 | 195191 | 0.45 | 6054 |
| 13 | 22.382 | 182172 | 0.42 | 7376 |
| 14 | 23.256 | 615428 | 1.42 | 27015 |
| 15 | 23.833 | 280708 | 0.65 | 11435 |
| 16 | 24.644 | 175985 | 0.41 | 6504 |
| 17 | 25.838 | 161473 | 0.37 | 5951 |
| 18 | 27.187 | 35847 | 0.08 | 1515 |
| 19 | 36.044 | 449474 | 1.04 | 16020 |
附：HPLC检测方法：
1.溶液准备：
1.1 流动相A：
0.05mol/L NaH2PO4 ，0.125mol/L NaClO4(pH2.5)
配制方法：
称取下列试剂至1L烧杯中：
磷酸二氢钠，二水 7.8g
高氯酸钠 15.3g，
加0.85L超纯水溶解后加水至1L，用37%的浓盐酸溶液调节pH至2.5,用0.45μm的滤膜过滤并脱气。
1.2流动相B：
0.05mol/L NaH2PO4 (pH2.5)-乙腈（V：V= 1:1）
配制方法：
1）取二水NaH2PO4 15.6g加0.85L超纯水溶解后加水至1L，用37%浓盐酸溶液调节pH至2.5,用0.45μm的滤膜过滤。
2）取等体积的上述溶液和乙腈混匀，超声脱气。
2. 色谱条件
2.1检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；柱温为40℃；
2.2以流动相A：流动相B（36:64）平衡色谱柱基线稳定后，进行梯度洗脱；
| 时间（min） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0 | 36 | 64 |
| 5 | 36 | 64 |
| 32 | 24 | 76 |
| 33 | 0 | 100 |
| 40 | 0 | 100 |
| 41 | 36 | 64 |
| 50 | 36 | 64 |
3. 结果计算
纯度 —— 按面积归一化法计算，公式如下：
纯度（%）= A供除以A总面积乘以100%
式中，A供为供试品溶液目标峰的峰面积；
A总面积为所有峰的总面积。
Claims (10)
1.一种蛋白质或多肽的纯化方法，所述方法是通过离子交换层析柱，从包含目标蛋白质或多肽以及杂质的混合物中，分离得到所述的目标蛋白质或多肽的，该方法包括：
1）提供离子交换填料以及所述混合物；
2）调节所述离子交换填料和/或所述混合物的pH和电导率，以使得所述混合物中的所述目标蛋白质或多肽能够被所述离子交换填料吸附；
3）将步骤2）得到的混合物与步骤2）得到的离子交换填料相接触，从而使该离子交换填料吸附所述目标蛋白质或多肽；
4）采用含有或/和不含有有机溶剂的第一缓冲液作为洗涤液，洗涤一次或多次，并且每次所用的所述洗涤液相同或不同，从而使所述的杂质从步骤3）得到的离子交换填料上洗涤下来；
5）采用含有有机溶剂的第二缓冲液作为洗脱液，使所述目标蛋白质或多肽从步骤4）得到的离子交换填料上洗脱下来，从而得到分离的所述目标蛋白质或多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中采用洗涤液洗涤多次，并且每次所用的所述洗涤液不同，其中包括：所述第一缓冲液的种类或/和浓度相同或不同，并且/或者所述有机溶剂的种类或/和浓度相同或不同。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一缓冲液中含有有机溶剂，该含有有机溶剂的第一缓冲液能使所述的目标蛋白质或多肽与离子交换填料之间形成疏水相互作用，以及使所述的杂质从步骤3）得到的离子交换填料上洗涤下来。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第一缓冲液含有与第二缓冲液中相同的有机溶剂。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、醋酸甲酯、醋酸乙酯、丙酮以及乙腈中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述的洗涤液中，所述的有机溶剂的浓度为10-50%（V/V）。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：第一缓冲液的电导和/或有机溶剂浓度低于第二缓冲液的电导和/或有机溶剂浓度。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当所述混合物中的所述目标蛋白质或多肽带正电荷时，所述的离子交换填料为阳离子交换树脂；并且在步骤2）中调节所述离子交换填料的pH，使得该pH低于所述目标蛋白质或多肽的等电点。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当所述混合物中的所述目标蛋白质或多肽带负电荷时，所述的离子交换填料为阴离子交换树脂；并且在步骤2）中调节所述离子交换填料的pH，使得该pH高于所述目标蛋白质或多肽的等电点。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于：所述目标蛋白质或多肽为胰岛素、胰岛素类似物、生长激素或干扰素。
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