CN108097336A - 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法 - Google Patents

两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108097336A
CN108097336A CN201711010305.0A CN201711010305A CN108097336A CN 108097336 A CN108097336 A CN 108097336A CN 201711010305 A CN201711010305 A CN 201711010305A CN 108097336 A CN108097336 A CN 108097336A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sexes
separating medium
dissociation
group
isoelectric point
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711010305.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108097336B (zh
Inventor
廖飞
龙高波
谢燕玲
黄铭通
谢万军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Bo Lan Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Chongqing Bo Lan Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Bo Lan Biotechnology Co Ltd filed Critical Chongqing Bo Lan Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201711010305.0A priority Critical patent/CN108097336B/zh
Publication of CN108097336A publication Critical patent/CN108097336A/zh
Priority to PCT/CN2018/111536 priority patent/WO2019080851A1/zh
Priority to EP18871772.2A priority patent/EP3546066B1/en
Priority to JP2019530832A priority patent/JP7111373B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of CN108097336B publication Critical patent/CN108097336B/zh
Priority to US16/435,515 priority patent/US20190291095A1/en
Priority to US16/902,564 priority patent/US11358136B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J43/00—Amphoteric ion-exchange, i.e. using ion-exchangers having cationic and anionic groups; Use of material as amphoteric ion-exchangers; Treatment of material for improving their amphoteric ion-exchange properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J47/00—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor
    • B01J47/014—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor in which the adsorbent properties of the ion-exchanger are involved, e.g. recovery of proteins or other high-molecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4005—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G01N21/80—Indicating pH value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4005—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane
    • G01N2001/4011—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane being a ion-exchange membrane

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

本发明提供一种两性解离离子交换分离介质，其表面为两性解离共价修饰层；环境pH值低于两性解离共价修饰层等电点时，两性解离共价修饰层的表面净电荷为正，具有阴离子交换剂属性；环境pH值高于两性解离共价修饰层等电点时，两性解离共价修饰层的表面净电荷为负，具有阳离子交换剂属性；本发明的分离介质在等电点两侧分别具有阴离子交换剂属性和阳离子交换剂属性，调节洗脱液pH使分离介质表面和目标物质净电荷相同而产生静电排斥能释放目标物质，既增强了洗脱效力也避免了用高浓度无机离子的后续问题，是分离容量高、温和条件下被吸附离子洗脱效力高、能够准确标定分离容量、对疏水小分子非特异吸附低、温和条件下再生效力高的新型离子交换介质。

Description

两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法
技术领域
本发明涉及一种分离生物活性物质的离子交换分离介质，具体涉及一种两性解离离子交换介质、及其应用方法和其分离容量标定方法。
背景技术
离子交换分离介质适合对蛋白/核酸等生物分子的快速分离再分析，蛋白/核酸纯化制备，可解离带电物质色谱定量分析；这些应用要求离子交换分离介质同时有吸附容量高、温和条件下被吸附物质洗脱效力高、分离容量准确标定、对有干扰物质非特异吸附低、温和条件下再生效力高等特点。现有离子交换分离介质无法同时满足上述要求；设计尽可能同步满足这些要求的新型离子交换分离介质就是本发明拟解决的问题。
在设定pH下分离介质表面基团解离并与小体积反离子形成静电吸引离子对，再基于静电吸引和竞争结合吸附带相反电荷目标物质实现对目标物质的在线色谱分析，或进一步用NaCl、 KCl等高浓度单价中性无机盐提供竞争离子基于静电吸引和竞争结合洗脱所吸附的目标物质，称为离子交换，所需分离介质称为离子交换剂。
离子交换分离生物分子时所用pH常在5.0到8.0间，一般需限制在3.0到11.0间。经典离子交换纯化/提取目标物质再分析时，在吸附及洗脱两个环节都依赖于目标物质、分离介质表面带电基团、溶液中离子间的静电吸引和竞争结合。经典离子交换分离介质表面可电离基团通常只有一类，在pH 3.0到11.0间其表面净电荷仅有两种类型：其表面净电荷为正或零但不出现带负电荷状态称阴离子交换剂；其表面净电荷为负或零但不出现带正电荷状态称阳离子交换剂。经典离子交换剂用于生物分子的纯化制备、提取浓缩再分析及色谱分析时，性能都存在一定缺陷。首先，经典离子交换剂表面为了亲水性而有大量羟基、酰胺类成氢键基团，但会与目标物质形成数量庞大氢键而产生非特异吸附，这降低了经典离子交换剂所吸附蛋白/核酸洗脱效力、分离选择性、分离容量及再生效力，对于色谱分析则分辨率低且色谱柱寿命短。其次，用高浓度单价中性无机盐竞争结合促进目标物质释放时需要高浓度无机盐才有较好洗脱效果，而后续再分析/处理则需脱盐而降低了效率又增加了成本。所以，需建立离子交换分离介质设计的新原理，显著降低其非特异吸附而且同步提高被吸附目标物质的洗脱效力。
经典离子交换因洗脱效力低而无法应用于核酸提取浓缩再分析。核酸作为遗传物质是当前临床检验确诊传染病感染、法医物证检验、基因分型、食品安全检测、药用原料来源确认等生物医药分析的核心和焦点。生物样品中核酸含量低，通常需PCR扩增后检测。但样品中常有大量非核酸物质干扰对核酸的PCR扩增。快速提取样品中核酸并同步去除大多数干扰物质后再PCR扩增分析是必须策略。核酸有磷酸二酯键，其在pH 2.0以上解离成净电荷为负的多阴离子，阴离子交换理论上能用于核酸提取浓缩再分析；常规阴离子交换剂对核酸吸附容量很高，但如何洗脱所吸附的核酸却是技术挑战。用高浓度单价中性无机盐能增加所吸附核酸阴离子洗脱效力，而大量无机盐抑制后续PCR扩增。目前，快速提取样品中核酸再分析主要用硅醇为基团成氢键结合以保障温和条件下的洗脱效力。为提高核酸提取结果的重现性以保障核酸分析结果重现性，目前普遍用微米磁珠进行快速吸附分离再洗脱。但硅醇结合核酸容量低且对核酸选择性也低，使得硅醇磁珠用量大而使用成本高；硅醇磁珠表面有较高非特异吸附，其提取核酸中有较多杂质会抑制PCR反应，妨碍核酸的高灵敏度检测。离子交换也是蛋白质纯化常规手段，但应用中即使用高浓度易溶单价中性无机盐洗脱目标蛋白得率也低；后续操作或分析需通过透析或超滤除去无机盐，这也降低了操作效率而增加了成本。所以，对核酸和蛋白快速提取/纯化制备，都需新型离子交换剂，以提高用低离子强度缓冲液对被吸附物质的洗脱效力。
目标物质基于静电吸引吸附在离子交换介质表面后，用pH显著不同的洗脱液使离子交换介质表面净电荷为零能增强目标物质洗脱效力，但目标物质与离子交换介质间的大量氢键仍妨碍洗脱，而常用离子交换介质对干扰性小分子的非特异吸附会造成对后续分析的干扰。在被吸附目标物质和离子交换介质间产生静电排斥作用肯定能促进被吸附目标物质洗脱和分离介质再生。用与吸附缓冲液pH显著不同的洗脱液有望在目标物质与分离介质表面之间产生静电排斥。但是，经典离子交换剂表面仅有一类解离基团，改变pH无法使分离介质表面净电荷和目标物质净电荷之间从相反转变到相同而产生静电排斥作用。
因此，为了解决经典离子交换分离介质在生物分子分离应用中的缺陷，需要研制出一种同时具备吸附容量高、温和条件下被吸附离子洗脱效力高、分离容量能够准确标定、对非目标物质的非特异吸附低、温和条件下再生效力高等优点的新型离子交换介质。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种同时具备高效吸附和洗脱能力，并且吸附容量高、温和条件下被吸附离子就能高效力洗脱、分离容量能够准确标定、对非目标物质的非特异吸附低、温和条件下再生效力高等优点的新型离子交换介质。
本发明提供的是两性解离离子交换分离介质，所述两性解离离子交换分离介质表面为两性解离共价修饰层；所述两性解离共价修饰层具有等电点并用pIm表示，所述等电点为两性解离离子交换分离介质表面净电荷为零时的环境pH值；在pH值低于所述等电点pIm的环境中，两性解离共价修饰层表面的净电荷为正，具有阴离子交换剂属性；在pH值高于所述等电点pIm 时，两性解离共价修饰层表面的净电荷为负，具有阳离子交换剂属性。
进一步，在环境pH值低于所述等电点pIm时，随着差值的扩大，两性解离共价修饰层的表面正电荷数量逐渐增加；在环境pH值高于于所述等电点时，随着差值的扩大，两性解离共价修饰层的表面负电荷数量逐渐增加；所述环境pH值均位于拟分离目标物质和所述两性解离离子交换分离介质都能耐受的范围内。
进一步，所述两性解离离子交换分离介质表面的两性解离共价修饰层中，同时含有在pH 值低于所述等电点pIm时解离产生正电荷的基团和在pH值高于于所述等电点pIm时解离产生负电荷的基团；所述解离产生负电荷的基团为脂肪族羧基，解离产生正电荷的基团为脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基之一或多种共存。
进一步，所述两性解离共价修饰层来自两性解离基团前体对分离介质基体表面共价修饰；
所述分离介质基体为表面不含长度超过9个原子的线性长直链，但含有活泼基团用于与两性解离基团前体发生共价连接反应生成所述两性解离共价修饰层，所述活泼基团是下述的任一类：脂肪族伯和/或仲胺基、脂肪族羧基和巯基反应基团；其中，巯基反应基团含有被巯基取代而离开分离介质基体表面的小体积基团；
所述两性解离基团前体为亲水、分子量小于500道尔顿、无超过连续5个碳原子烃链或烃环的物质，并且都含烷基硫醇基或脂肪族伯胺基为共价连接基团，以及含有脂肪族羧基作为解离产生负电荷的基团和/或含有脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基之一或多种共存作为解离产生正电荷的基团；所述两性解离基团前体包括A类前体、B类前体和C类前体，其中A类前体为除了含所述共价连接基团外，仅含所述解离产生负电荷的基团的两性解离基团前体，B类前体为除了含所述共价连接基团外，仅含所述解离产生正电荷的基团的两性解离基团前体，C类前体为除了含所述共价连接基团外，同时含有所述解离产生负电荷的基团及解离产生正电荷的基团的两性解离基团前体；
所述两性解离基团前体用于共价修饰分离介质基体时，用下列修饰方式中的一种：
a.C类前体单独使用或混合使用；在混合使用时，由多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
b.由一种或多种A类前体与一种或多种B类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
c.仅由一种或多种A类前体与一种或多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
d.仅由一种或多种B类前体与一种或多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团。
进一步，对分离介质基体进行共价修饰时，所用两性解离基团前体中,脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基的摩尔总量对脂肪族羧基的摩尔总量的比例限制在1:6到6:1之间。
进一步，当所用两性解离基团前体中含有脂肪族仲胺和/或叔胺作为解离产生正电荷的基团时，所述脂肪族仲胺和叔胺摩尔总量合计不超过脂肪族伯胺及咪唑基合计摩尔总量的30％。
进一步，所述两性解离离子交换分离介质，在pH为3时其表面正电荷数量不低于最大值的90％，在pH为11时其表面负电荷数量不低于最大值的90％；
本发明还公开了一种所述的两性解离离子交换分离介质的应用方法，应用所述两性解离离子交换分离介质吸附并分离目标物质时，目标物质释放氢离子的解离常数的常用对数为pIs或者目标物质的等电点为pIs，应用过程有以下特征：
a.选两性解离离子交换分离介质，使其等电点pIm和目标物质的pIs之间相差不小于1.0；
b.吸附目标物质时，选择位于目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm 之间且与目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的pIm相差都大于0.3的环境pH，使离子交换分离介质表面净电荷与目标物质净电荷相反，基于静电吸引而吸附目标物质；
c.洗脱目标物质时，洗脱液pH低于两性解离离子交换分离介质等电点pIm时，洗脱液pH 比目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm中最低的还低至少0.30；洗脱液 pH高于两性解离离子交换分离介质等电点pIm时，洗脱液pH比目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm中最高的还高至少0.30；使两性解离离子交换分离介质表面净电荷与目标物质净电荷相同而基于静电排斥而洗脱目标物质，加水溶单价中性无机盐促进洗脱。
本发明公开了一种所述的两性解离离子交换分离介质的标定方法：
a.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时，用解离常数或等电点为pKa、分子量小于600Dalton、对可见光吸收系数大于14mM-1.cm-1、在pH 3.0到11.0间溶解度都不低于 5.0μmol/L且在pH 3.0到11.0间解离后净电荷为正或负的有色有机物为显色探针；
b.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时具有以下情况：
b1两性解离离子交换分离介质的等电点pIm在4.0到6.0间，用解离常数或等电点pKa 比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少大2.0的阳离子探针,或解离常数或等电点pKa 比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少小2.0的阴离子探针；
b2两性解离离子交换分离介质的等电点pIm在6.0到10.0间，用用解离常数或等电点pKa 比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少小2.0的阴离子探针；
c.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时，吸附时，选位于解离常数或等电点 pKa和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm之间且与两性解离离子交换分离介质的等电点 pIm相差不少于1.3而与显色探针的解离常数或等电点pKa相差不少于0.5的环境pH对应缓冲液，使两性解离离子交换分离介质基于静电吸引吸附显色探针；洗脱时，选比显色探针解离常数或等电点pKa和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm中最高者都高或最低者都低至少 1.3的环境pH对应缓冲液，使两性解离离子交换分离介质表面净电荷与显色探针净电荷相同基于静电排斥洗脱显色探针；测定洗脱液中显色探针的吸收，换算出对显色探针的分离容量；
测定pH对两性解离离子交换分离介质分离显色探针容量的影响，对解离后净电荷为负的显色探针分离容量达到零的最小pH、对解离后净电荷为正的显色探针分离容量达到零的最大 pH，为两性解离离子交换分离介质的等电点pIm的近似值。
本发明的有益效果：本发明提供的两性解离离子交换分离介质，采用共价修饰在介质表面形成两性解离共价修饰层的结构，并且根据修饰的结构或者所用两性解离基团前体比例不同，形成特定的等电点pIm，并以等电点pIm为界在设定的不同环境pH下具有为阴离子交换剂属性和阳离子交换剂属性的特殊分离功能；通过在等电点pIm两侧的pH转换，能使两性解离离子交换分离介质的离子交换属性反转，对带电物质的吸附分离功能随pH跨越等电点pIm改变而显著不同；应用本发明制得的两性解离离子交换分离介质，通过调节缓冲液pH使得分离介质表面净电荷和目标物质净电荷相同而产生静电排斥以释放目标物质，既增强了洗脱效力也避免了用高浓度无机离子的后续问题，尤其洗脱速度更快，分离介质易于再生；在洗脱这个环节，不再依赖于离子间的竞争结合，但仍可利用离子间的竞争结合促进洗脱。综合而言，本发明所得两性解离离子交换分离介质同时具备基于静电作用的吸附和基于静电作用的洗脱功能，并且分离容量高、温和条件下被吸附离子洗脱效力高、分离容量能够准确标定、对非目标物质的非特异吸附低、温和条件下再生效力高等优点。另外，本发明通过两性解离基团前体对分离介质基体进行共价修饰的方式生成所需两性解离共价修饰层，从而使所得分离介质表面具有两性解离性质，这种方式的有益效果体现在如下几个方面。首先，这种策略更易于调整解离生成阴离子基团对解离生成阳离子基团的摩尔比例，以获得不同的pIm而适用于不同的生物分子，这显然比通过调节聚合反应条件直接制备表面具有两性解离基团分离介质更简单实用，且效率也更高。其次，这种方式制备两性解离离子交换分离介质适用于纤维素类天然聚合物分离介质作为基体，但目前还没有任何工业技术能通过聚合制备纤维素，更别提通过聚合反应直接制备获得表面带两性解离基团的纤维素。再有，这种方式便于选择满足特定要求的分离介质作为基体进行共价修饰获得两性解离表面，有利于避免聚合时带电基团之间的位阻而降低表面两性解离基团的覆盖度，从而保障表面亲水基团的高覆盖率而降低疏水小分子的非特异吸附。也就是说，这种方式同时发挥了两种作用，既在表面生成所需的两性解离基团，又降低表面对疏水物质的非特异吸附，使得本发明所述的两性解离离子交换分离介质具有更好的应用效果。
本发明还公开了一种两性解离离子交换分离介质的应用方法和分离容量的标定方法，使用方法简单，仅需有特定pKa的显色探针；标定分离容量的测量过程简便快速，吸收测定易于标准化且重现性好，适合用于产品质量定标和溯源，以及表征所述两性解离离子交换分离介质的两性解离属性，能够快速简便高精度标定离子交换分离介质的分离容量及表征其属性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
图1.FBD-MSP-ZEW表面净电荷随pH的变化演示图；
图2.FBD-MSP-FCOOH转化成活泼酯的过程示意图；
图3.从FBD-MSP-FCOOH活泼酯通过成酰胺键生成两性解离共价修饰层的示意图；
图4.从FBD-MSP-FCOOH活泼酯转变成巯基反应基团并生成两性解离修饰层的示意图；
图5.酸性红13在pH 8.3的消光系数测定；
图6.吸附分离酸性红13量对反应体系FBD-MSP-ZEWA用量的响应；
图7.吸附分离酸性红13量对反应体系酸性红13浓度的响应；
图8.吸附反应pH对三种两性解离磁珠分离酸性红13容量的影响及其pIm的估算；
图9.吸附反应体系质粒量对磁珠分离所得质粒量的影响；
图10.质粒过量时分离所得质粒量对磁珠用量的响应；
图11.不过量质粒用磁珠分离回收后进行PCR的效力的半定量比较；
图12.FBD-MSP-ZEWB纯化季也蒙毕赤酵母尿酸酶RMGU效果的SDS-PAGE分析
M：蛋白分子量Marker；1：天然MGU三次DEAE-纤维素吸附去杂蛋白纯化，上样5μg；2：细胞裂解液，总蛋白上样量5μg；3:用0.20ml粗酶第二次洗脱液冻干，上样5μg；4:用1.0ml粗酶获得的第二次洗脱液冻干，上样5μg；5.用4.0ml粗酶获得的第二次洗脱液冻干，上样5μg；6：粗酶，总蛋白上样量15μg；7:粗酶，总蛋白上样量45μg
图13.检测比较空白磁珠干扰的荧光实时定量PCR测定过程(质粒样品见应用实施例7)；
图14.检测比较磁珠提取质粒的荧光实时定量PCR测定过程(质粒样品见应用实施例7)；
图15.荧光实时定量PCR测定MGU表达质粒的响应曲线。
具体实施方式
本实施例提供的两性解离离子交换分离介质，其表面为两性解离共价修饰层；所述两性解离共价修饰层具有等电点并用pIm表示，所述等电点为两性解离离子交换分离介质表面净电荷为零时的环境pH值；在环境pH值低于所述等电点pIm时，两性解离共价修饰层表面的净电荷为正，具有阴离子交换剂属性；在pH值高于所述等电点pIm时，两性解离共价修饰层表面的净电荷为负，具有阳离子交换剂属性；同时含解离生成负电荷和正电荷基团的物质称为两性解离物质，用pH有显著差异的吸附和洗脱缓冲液，可将表面为两性解离修饰层分离介质和目标物质间的静电吸引反转为静电排斥，实现基于静电排斥的高效洗脱；在目标物质和分离介质都能耐受的pH范围内，调节pH改变分离介质表面净电荷性质而使目标物质净电荷性质不变，或改变目标物质净电荷性质而使分离介质净电荷性质不变，就能实现这种全新的基于静电排斥的洗脱方式。生物活性物质能耐受的pH范围有限，除非目标物质是两性解离物质，其所带电荷无法反转，无法使其与分离介质表面的静电作用从相互吸引反转成相互排斥；为对两性解离目标物质和非两性解离目标物质都适用，需在有限范围内调节pH就能改变净电荷性质的新型离子交换分离介质，即表面是两性解离修饰层的离子交换分离介质(图1)。
两性解离物质带电属性常用其净电荷为零的pH即等电点pI表征，非两性解离物质带电属性常用其解离常数pIs表征；为了方便，将两性解离目标物质等电点也称为pIs，将离子交换分离介质表面净电荷为零的pH即其等电点称为pIm；离子交换分离介质表面亲水性越强，对绝大多数物质尤其对不带电疏水物质的非特异吸附就会越低，这有利于提高此类分离介质的再生效力和分离选择性，以提高后续分析的灵敏度。但是，要通过改变pH实现目标物质在分离介质表面基于静电吸引高效吸附反转到基于静电排斥而高效洗脱，所述两性解离离子交换分离介质的pIm还需满足如下条件：在目标物质和分离介质都能耐受的pH范围内，用较低pH使分离介质表面净电荷为正而用较高pH使其表面净电荷反转为负，即其pIm需位于目标物质和分离介质都能耐受pH范围的中部；对于两性解离目标物质，还要求适合的离子交换分离介质pIm与目标物质pIs有足够大差距。满足这些条件后，选择吸附缓冲液pH使目标物质和离子交换分离介质表面净电荷相反而产生静电吸附，用吸附缓冲液洗涤吸附目标物质的分离介质以尽可能降低干扰性物质的非特异吸附，再用合适pH缓冲液使分离介质和目标物质净电荷相同以产生静电排斥而高效洗脱目标物质，并可加入水溶单价中性无机盐促进洗脱。这种离子交换分离介质用于带电目标物质提取浓缩优势最明显，用作离子交换色谱柱填料则寿命更长且分离效力更高，用于目标物质制备则分离介质再生效力更高、分离过程简单快速且目标物质的得率也更高。
用离子交换分离介质通过调节pH实现目标物质在其表面的吸附和洗脱，其在洗脱环节原理与经典离子交换原理明显不同。应用此类离子交换分离介质，通过调节pH使得分离介质表面和目标物质净电荷相同而产生静电排斥以释放目标物质，既增强了洗脱效力也避免了用高浓度无机离子的后续问题，尤其洗脱速度更快；在洗脱这个环节，不再依赖于离子间的竞争结合但仍可利用离子间的竞争结合促进洗脱。所述两性解离离子交换分离介质对带电物质的吸附分离功能随pH跨越pIm两侧而显著不同：在pH低于 pIm时吸附阴离子故属于阴离子交换剂，在pH高于pIm后吸附阳离子而属于阳离子交换剂。显然，经典离子交换剂对带电物质的吸附功能不会随着pH改变而发生反转。
在环境pH值低于所述两性解离离子交换分离介质的等电点pIm时，随着环境pH与pIm之间差值的扩大，两性解离共价修饰层的表面正电荷数量逐渐增加；在环境pH值高于所述等电点时，随着环境pH与pIm之间差值的扩大，两性解离共价修饰层的表面负电荷数量逐渐增加；所述环境pH值均位于拟分离目标物质和所述两性解离离子交换分离介质都能耐受的范围内。
本实施例中，所述两性解离离子交换分离介质表面的两性解离共价修饰层中，同时含有在 pH值低于所述等电点pIm时解离产生正电荷的基团和在pH值高于所述等电点pIm时解离产生负电荷的基团；所述解离产生负电荷的基团为脂肪族羧基，解离产生正电荷的基团为脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基之一或多种共存。
本实施例中，所述两性解离共价修饰层来自两性解离基团前体对分离介质基体共价修饰；
所述分离介质基体为表面不含长度超过9个原子线性长链的任意大小颗粒或者任一厚度薄膜，但是含以下任一类基团为活泼基团用于与两性解离基团前体发生共价连接反应生成所述两性解离共价修饰层：脂肪族伯和/或仲胺基、脂肪族羧基和巯基反应基团；其中，巯基反应基团含有被巯基取代而离开分离介质基体表面的小体积基团；
所述两性解离基团前体为亲水、分子量小于500道尔顿、无超过连续5个碳原子烃链或烃环的物质，并且都含烷基硫醇基或脂肪族伯胺基为共价连接基团，以及含有脂肪族羧基作为解离产生负电荷的基团和/或含有脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基之一或多种共存作为解离产生正电荷的基团；所述两性解离基团前体中，包括A类前体、B类前体和C类前体，其中A类前体为除了含所述共价连接基团外，仅含所述解离产生负电荷的基团的两性解离基团前体，B类前体为除了含所述共价连接基团外，仅含所述解离产生正电荷的基团的两性解离基团前体，C 类前体为除了含所述共价连接基团外，同时含有所述解离产生负电荷的基团及解离产生正电荷的基团的两性解离基团前体；其中，C类前体包括赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、N,N-二羧甲基乙二胺，半胱氨酸、3-巯基组氨酸、3-巯基赖氨酸、3-巯基谷氨酸等；A类前体包括谷氨酸、3-巯基-1,5-戊二酸、巯基乙酸、三-(羧甲基)-氨基甲烷；B类前体包括巯基乙胺、3-巯基-2-羟基丙胺、2-巯基咪唑、二乙基三胺、N,N-二甲胺基乙二胺、四-(氨甲基)-甲烷；这些物质可以单独使用，也可以两种及更多种共混使用，以调整解离产生正电荷的基团和解离产生负电荷的基团之间的比例，从而获得有不同 pIm的两性解离离子交换分离介质。
所述两性解离基团前体用于共价修饰分离介质基体时，采用下列修饰方式中的一种：
a.C类前体单独使用或混合使用；在混合使用时，由多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
b.由一种或多种A类前体与一种或多种B类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
c.仅由一种或多种A类前体与一种或多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
d.仅由一种或多种B类前体与一种或多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
对分离介质基体进行共价修饰时，所用两性解离基团前体中,脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基的摩尔总量对脂肪族羧基的摩尔总量的比例限制在1:6到6:1之间；当所用两性解离基团前体中含有脂肪族仲胺和/或叔胺作为解离产生正电荷的基团时，所述脂肪族仲胺和叔胺摩尔总量合计不超过脂肪族伯胺及咪唑基合计摩尔总量的30％；
共价连接反应有两种：脂肪族胺基与脂肪族羧基成酰胺、烷基硫醇对离去基团的取代；
分离介质基体表面无两性解离共价修饰层，也无超过9个原子的长直链基团；无两性解离共价修饰层分离介质作为基体，其表面所含活泼基团为脂肪族羧基、脂肪族伯和/或仲胺基、巯基反应基团之一；所述巯基反应基团含易被巯基亲核取代而脱离分离介质表面的小体积离去基团，这类小体积离去基团包括卤素离子、对甲苯磺酸根、三氟乙酸根；无两性解离共价修饰层分离介质表面缺乏上述活泼基团时，经过恰当的衍生反应获得上述活泼基团成为分离介质基体，再通过用两性解离基团前体进行修饰转变成所述两性解离离子交换分离介质；纤维素、表面含羟基的亲水大孔树脂作为分离介质，经过用丁二酸酐或氯乙酸酐衍生修饰，获得所需活泼基团就适合作为基体再用于生成两性解离共价修饰层；
无两性解离共价修饰层分离介质作为基体，其表面以脂肪族伯和/或仲胺基为共价连接的活泼基团时，其胺基与卤代乙酸酐或卤代乙酸活泼酯反应再与含巯基两性解离基团前体反应，或与溴或碘乙酸中卤素进行取代反应生成取代甘氨酸，或用丁二酸酐或其与乙酸酐混合物在酸酐总摩尔量不过量条件下与分离介质表面胺基反应，生成两性解离基团组成的共价修饰层。
本实施例中，所述两性解离离子交换分离介质，在pH为3时其表面正电荷数量不低于最大值的90％，在pH为11时其表面负电荷数量不低于最大值的90％。
用离子交换分离介质通过调节pH吸附和洗脱目标物质，此类离子交换介质表面需为两性解离修饰层，这和经典离子交换介质表面结构明显不同；只有在目标物质和分离介质都能耐受pH范围两侧边界使离子交换分离介质表面正电荷和负电荷数量分别接近最大化，才能使其分离性能最大化。离子交换分离介质表面净电荷数量不低于最大值90％时，其分离性能接近最大化。亲水基团才适合制备所述两性解离离子交换分离介质；芳香性物质就不适合作为两性解离基团前体。电离产生负电荷常用基团包括磷酸单酯及磷酸二酯、有机磺酸及脂肪族羧酸。磷酸单酯、磷酸二酯及有机磺酸pIs小于1.7；孤立羧基，如乙酸，其羧基pIs接近4.8。咪唑pIs接近6.0且亲水；有亲水取代基孤立伯胺如三羟甲基氨基甲烷pIs接近8.0，甲胺和二甲胺pIs接近10.7而三甲胺pIs接近10.0，乙胺、二乙胺和三乙胺pIs都接近11.0。另一方面，两性解离修饰层中解离基团空间相邻对各自解离常数又有显著影响。例如，乙酸pIs接近4.8而乙胺pIs接近11.0；三羟甲基氨基甲烷中有中性基团与胺基相邻而其pIs接近8.0，远小于乙胺的11.0；甘氨酸、丙氨酸含等摩尔比相邻脂肪族羧基和伯胺基，其pIs接近6.0而远小于乙胺和乙酸pIs中间值 7.8。但是，EDTA及EGTA中相同羧基的pIs相差很大，乙二胺中两个胺基pIs也相差很大。如两性解离共价修饰层中解离产生正电荷基团和解离产生负电荷基团随机均匀间隔分布，则两类解离基团pIs会比孤立状态明显降低，否则应相当；如果解离产生正电荷基团或解离产生负电荷基团都成簇团聚分布，则其全电离对应表观pIs会更高。解离产生正电荷基团在pH比pIs高1.0个单位时、解离产生负电荷基团在环境pH比其pIs低1.0个单位时，解离度都低于10％。制备本发明所述两性解离离子交换分离介质通用且最简单策略，是使用在pH 4.0时电离度尽可能低于10％的解离产生负电荷基团及在pH 10.0时电离度尽可能低于10％的解离产生正电荷基团；这样，在pH 3.0到11.0之间就能使其分离性能最大化。基于此，解离产生负电荷基团pIs需尽可能大于4.0，也就只能为脂肪族羧酸且最好有空间相邻的多个羧基以使得其全电离所对应的表观pIs更高些；解离产生正电荷基团pIs需尽可能小于9.0，只有咪唑基及有空间相邻解离成负电荷或中性亲水取代基的脂肪族伯胺基能满足要求，而且这些脂肪族伯胺需要尽可能被脂肪族羧基间隔分开以降低其pIs。乙基及更大烷基取代仲胺和叔胺的pIs过高且疏水性强而不合适；即使为调节pIm而使用甲基取代脂肪族仲胺及叔胺，其相对脂肪族伯胺及咪唑基总摩尔量的占比应尽可能低。用上述两性解离基团组成表面共价修饰层，理论上在pH在3.0到11.0间能使其分离性能最大化。
显然，解离产生负电荷基团与解离产生正电荷基团的摩尔比，既决定了在pH 11.0时带正电荷脂肪族伯胺/咪唑基相对于已接近完全电离脂肪族羧基的占比，也决定在pH3.0时带负电荷脂肪族羧基相对已接近完全电离脂肪族伯胺/咪唑基的占比，即在此pH范围的边界时分离介质表面净电荷是否接近最大化而使其分离性能最大化。这显然需要优化本发明所述两性解离分离介质表面两类解离基团的比例。pH 比酸性解离基团pIs小三个pH单位或比碱性解离基团pIs大3个pH单位后，此类基团解离度/电离度都低于0.1％。有理由假定，空间相邻脂肪族羧基和脂肪族伯胺基的pIs间相差仍远大于2.5。当pH比上述解离产生正电荷基团pIs高1.0单位时，脂肪族羧基产生负电荷解离度会超过99％而解离产生正电荷基团电离度低于10％；当pH比解离产生负电荷基团pIs低1.0单位，脂肪族羧基产生负电荷解离度低于10％而上述解离产生正电荷基团解离度会超过99％。假定在pH 3.0时本发明所述两性解离分离介质表面的脂肪族羧基因表观pIs接近4.8而解离成负电荷基团的电离度低于2％，在pH 11.0时因有亲水脂肪族取代基的伯胺pIs小于9.0且脂肪族仲胺/叔胺含量可忽略故解离成正电荷基团的电离度低于1％，只要脂肪族羧基相对脂肪族伯胺基加咪唑基的摩尔占比不超过3:1但大于1:6，在pH 3.0到11.0之间其分离性能就接近最大化。鉴于表面脂肪族羧基密度较高时更多羧基相邻会使羧基pIs增高而羧基与胺基相邻会降低胺基的pIs，本发明将所述两性解离离子交换分离介质表面共价修饰层中的脂肪族伯胺基(仲胺/叔胺合计占所有解离成正电荷基团的比例不超过30％)对脂肪族羧基的比例限制在1:6到6:1之间，使其分离性能在pH 3.0到11.0之间能够达到最大化，这种比例的控制可在进行修饰时使用含所述解离产生正电荷的基团和解离产生负电荷的基团的两类前体混合物，或者精心设计C类前体。
实践中，在产生静电吸引的pH下，分离介质表面的净电荷越多则对目标物质的吸附容量越大；在产生静电排斥的pH下，只要分离介质表面的净电荷与目标物质净电荷相同且数量足够多，就能高效洗脱被吸附物质。理论上，对表面无两性解离共价修饰层分离介质作为基体进行表面修饰时，因待修饰介质表面活泼基团的数量/密度有限，通过共价修饰能在表面生成的解离产生负电荷基团与解离产生正电荷基团的总摩尔量是有限的；解离产生负电荷基团与解离产生正电荷基团的摩尔比不同，则对应两性解离分离介质的pIm不同。针对不同目标物质，需有不同pIm的两性解离离子交换分离介质才能使其分离性能最大化且目标物质得率最大化。相应地，吸附带负电荷目标物质的两性解离离子交换分离介质其表面的脂肪族羧基适宜更少以便其正电荷的绝对值更大；吸附带正电荷目标物质的两性解离离子交换分离介质表面的脂肪族伯胺基/咪唑基适宜更少以便其负电荷的绝对值更大。所以，两性解离离子交换分离介质表面的脂肪族伯胺基/咪唑基总摩尔量对脂肪族羧基的摩尔量的比值范围可以更宽，对应两性解离离子交换分离介质pIm范围也更宽；两性解离离子交换分离介质，用于分离阴离子要求其在pH 3.0时其表面正电荷数量不低于最大值的90％，用于分离阳离子要求其在pH 11.0时表面负电荷数量不低于最大值的90％。
制备所述两性解离离子交换分离介质的通用方法，是用表面有活泼基团的无两性解离修饰层分离介质作为基体，与带有对应所需共价连接基团的两性解离基团前体，发生直接或者间接的共价连接反应生成所需两性解离共价修饰层。对提取需要PCR扩增检测的核酸，所用两性解离离子交换分离介质需要对小分子物质的非特异吸附足够低以减少所提取核酸中抑制PCR的干扰杂质含量。聚乙二醇是中性亲水聚合物，也是常用的抗蛋白非特异吸附的修饰剂。但是，聚乙二醇实际上是表面活性剂，其在氯仿中的溶解度非常高，对疏水小分子物质的非特异吸附很强。用聚乙二醇衍生物修饰或聚合直接制备的分离介质，也就不适合作为制备本发明所述两性解离离子交换介质的基体，对应聚乙二醇的羧基及伯胺基衍生物也都不适合作为本发明所述的两性解离基团前体。尤其，聚乙二醇分子为线性直链，相互之间的体积排阻很强，不利于提高两性解离基团的修饰度，也就难以提高所得两性解离分离介质的分离容量，也无法通过保障修饰度以降低对疏水小分子的非特异吸附；用聚乙二醇衍生物直接聚合制备表面有两性解离基团的离子交换分离介质，或者聚乙二醇衍生物修饰所得有两性解离基团的离子交换分离介质，也就不适合提取核酸和分离蛋白。所以，本发明所述共价修饰制备两性解离离子交换分离介质的策略，就不适用于表面有线性大分子聚合物但缺乏两性解离基团的分离介质基体；用线性大分子聚合所得分离介质，即使表面在pH 3.0～11.0间有两性解离基团，也不属于本发明所述两性解离离子交换分离介质。
显然，为生成高密度两性解离修饰层以降低疏水小分子的非特异吸附且同时增大分离容量，需用小分子两性解离基团前体及室温下收率尽可能高的连接反应。为获得高密度修饰层降低对疏水物质的非特异吸附，用于修饰的两性解离基团前体的分子量控制在500Dalton以内且无疏水大体积取代基。成酰胺反应和巯基取代反应无需无氧无水类严苛反应条件，是修饰所需的合适连接反应。在无两性解离修饰层分离介质作为基体的表面生成两性解离修饰层时，就适合利用待修饰分离介质基体表面的脂肪族羧基、脂肪族伯/仲胺基、巯基反应基团作为活泼基团，而两性解离基团前体相应需有脂肪族伯胺、脂肪族巯基作为共价连接基团。综合而言，无两性解离共价修饰层分离介质作为基体，其表面所含活泼基团为脂肪族羧基、脂肪族伯和/或仲胺基、巯基反应基团之一，其中巯基反应基团含易被巯基亲核取代而脱离分离介质表面的小体积离去基团，这类小体积离去基团含卤素离子、对甲苯磺酸根；无两性解离共价修饰层分离介质表面缺乏活泼基团时，经衍生反应获得上述活泼基团再作为基体用于共价修饰。
通过表面用季胺及磺酸构成的兼性离子对修饰制备表面亲水分离介质的专利技术(中国发明专利 ZL201610963764.X)获得的产品FBD-MSP-FCOOH是一种微米磁珠，其表面除用于偶联其它物质的脂肪族羧基作为官能团，其余是由季胺和相邻磺酸构成的在pH 2.0到13.0间不出现两性解离故净电荷为零的兼性离子对修饰基团，其表面对疏水物质和蛋白质的非特异吸附都很低，是制备本发明所述两性解离离子交换分离介质所需的无两性解离修饰层分离介质基体。相应地，对此分离介质表面的脂肪族羧基活化(图 2)，然后进一步衍生，制备了系列有不同pIm的两性解离离子交换微米磁珠(图3、图4)；这些离子交换分离介质在弱酸性pH下能基于表面正电荷对目标物质的静电吸引而吸附核酸，在弱碱性pH下能基于静电排斥高效释放被吸附核酸；或者，在恰当中性及偏碱的pH下吸附碱性蛋白而在弱酸或强碱条件下释放所吸附的蛋白，这对于难溶解的蛋白是一种更合适的离子交换纯化方法。这种新型离子交换分离介质对核酸有更高选择性，对核酸的分离容量超过热电公司Dynabeads Myone Silane硅醇磁珠10倍，其分离选择性更高故所提取核酸中抑制性杂质更少，作为PCR模板效力比硅醇磁珠所得核酸效力更高。此类微米磁珠也适合快速纯化pIs接近9.0但中性时难溶的季也蒙毕赤酵母尿酸酶，结合酶活性洗脱率接近80％，远非经典阳离子交换剂可比。但两性解离离子交换分离介质用于分离蛋白时，饱和吸附蛋白会妨碍分离介质表面两性解离基团解离状态对洗脱液pH的响应，就需用较多的洗脱液分批洗脱才能保障洗脱效力。
另外，两性解离离子交换分离介质生产过程中需精确标定产品分离容量进行产品质控；标定此类离子交换分离介质对核酸类目标物质的分离容量是其用于核酸提取浓缩后进行高灵敏度分析时保障测试重现性的必要前提；为证实本发明所述两性解离离子交换分离介质的属性即其pIm，需要简便方法测定其对带电目标物质的分离容量及洗脱效力随吸附pH的变化。定量测定该类产品吸附分离所得核酸是标定其吸附分离容量的最直接方法；定量核酸需荧光定量PCR即qPCR，其测定达到设定信号的最小循环次数对模板核酸量的对数成反比，但测量精度低、成本高、分析耗时，不适合生产过程的质控，也不方便用于表征本发明所述新型离子交换分离介质的pIm等特性。光度法测量简便快速，吸收测定易于标准化且重现性好，适合用于产品质量定标和溯源，以及用于表征本发明所述两性解离离子交换分离介质的两性解离属性。核酸有强紫外吸收，但通常洗脱吸附核酸过程中各种杂质对测定紫外吸收有干扰，而核酸作为探针的成本高且稳定性低。易于光度法测定的稳定带电有色小分子有机物为显色探针，适合快速简便标定离子交换分离介质的分离容量及表征其pIm属性。本发明用对可见光有强吸收且易解离的水溶性芳香有机物为显色探针，室温下通过调节pH高效吸附和洗脱探针，基于洗脱液中探针对可见光强吸收快速高精度标定离子交换分离介质的吸附分离容量，并用于产品质控，以及表征本发明所述两性解离离子交换分离介质的pIm属性(表1)，证实所得两性解离离子交换分离介质的特殊两性解离属性及洗脱效力。
本发明还公开了一种两性解离离子交换分离介质的应用方法，应用所述两性解离离子交换分离介质吸附并分离目标物质时，目标物质释放氢离子的解离常数常用对数为pIs或者目标物质的等电点为pIs，应用过程有以下特征：
a.选两性解离离子交换分离介质，使其等电点pIm和目标物质的pIs之间相差不小于1.0；
b.吸附目标物质时，选择位于目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm 之间且与目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的pIm相差都大于0.3的环境pH，使离子交换分离介质表面净电荷与目标物质净电荷相反，基于静电吸引而吸附目标物质；
c.洗脱目标物质时，洗脱液(环境)pH低于等电点pIm时，选择环境pH比目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm中最低者还低至少0.30；洗脱环境高于等电点 pIm时，选择洗脱液(环境)pH比目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm 中最高者还要高至少0.30；使两性解离离子交换分离介质表面净电荷与目标物质净电荷相同而基于静电排斥而洗脱目标物质，加水溶单价中性无机盐促进洗脱。
本发明还公开了一种两性解离离子交换分离介质的分离容量的标定方法：
a.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时，用解离常数或等电点为pKa、分子量小于600Dalton、可见光吸收峰下吸收系数大于14mM-1.cm-1、在pH 3.0到11.0间溶解度都不低于5.0μmol/L且在pH 3.0到11.0间解离后净电荷为正或负的有色有机物为显色探针；
b.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时具有以下情况：
b1两性解离离子交换分离介质的等电点pIm在4.0到6.0间，用解离常数或等电点pKa 比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少大2.0的阳离子探针,或解离常数或等电点pKa 比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少小2.0的阴离子探针；
b2两性解离离子交换分离介质的等电点pIm在6.0到10.0间，用用解离常数或等电点pKa 比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少小2.0的阴离子探针；
c.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时，吸附时，选位于解离常数或等电点 pKa和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm之间且与两性解离离子交换分离介质的等电点 pIm相差不少于1.3而与显色探针的解离常数或等电点pKa相差不少于0.5的环境pH对应缓冲液，使两性解离离子交换分离介质基于静电吸引吸附显色探针；洗脱时，选比显色探针解离常数或等电点pKa和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm种最高者都还高或最低者都还低至少1.3的洗脱液pH，使两性解离离子交换分离介质表面净电荷与显色探针净电荷相同基于静电排斥洗脱显色探针；测定洗脱液中显色探针的吸收，换算出对显色探针的分离容量；
测定pH对两性解离离子交换分离介质分离显色探针容量的影响，对解离后净电荷为负的显色探针分离容量达到零的最小pH、对解离后净电荷为正的显色探针分离容量达到零的最大 pH，为两性解离离子交换分离介质的等电点pIm的近似值。
即测定两性解离离子交换分离介质对显色探针分离容量随pH的变化，对解离生成负离子显色探针分离容量达到零的最小pH、对解离生成正离子显色探针分离容量达到零的最大pH，即其pIm。
测定吸附显色探针后剩余的显色探针量，可估算吸附的显色探针量；再测定洗脱液中的显色探针量，可比较洗脱液pH对洗脱效力的影响，从而明确本发明所述静电排斥洗脱带电物质的效能。
季胺型阳离子显色探针较少，但磺酸型阴离子显色探针很多；酸性红13作为阴离子染料，是标定/ 表征本发明所述两性解离离子交换分离介质分离容量及测定pIm的显色探针代表。
以下为应用实施例，实施例中所用试剂及材料如下。
硅醇微米磁珠：THermo-FisHer(热电)公司，Dynabeads Myone Silane硅醇磁珠(货号37002D)；
磁分离架：江苏无锡百运纳米科技有限公司提供，八孔磁分离架；
常规PCR仪：Biorad T100热循环仪；
荧光实时定量PCR仪：Biorad CFX Connect；
羧基磁珠FBD-MSP-FCOOH：按中国发明专利(ZL 201610963764.X)制备表面含季胺及磺酸离子对修饰层故在pH 2.0到12.0之间为中性的羧基磁珠FBD-MSP-FCOOH；
季也蒙毕赤酵母尿酸酶RMGU表达质粒：序列见Genbank登录号KY706244，等电点8.9；全合成编码序列与表达载体pDE1连接获得无标签表达质粒，该质粒及其蛋白称RMGU；
酸性红13储备液：用蒸馏水溶解到200mM，0.22μm微孔滤膜过滤4℃储存，临用前稀释；
核酸吸附缓冲液：0.20m乙酸-乙酸钠缓冲液，pH从3.6到5.8；20mMmES,pH 6.0～6.8；20mMHEPES, pH 7.0～8.0；如未说明，用pH 3.6核酸吸附缓冲液；
核酸洗脱缓冲液：25mM Tris-HCl,pH 8.0～9.0；如未说明，用pH 8.9的核酸洗脱缓冲液；
磁珠洗涤缓冲液：pH 3.6，0.20m乙酸-乙酸钠缓冲液；
核酸定量：如未说明，用Nanodrop测定260nm吸收定量；
核酸电泳：预混溴乙啶琼脂糖凝胶电泳，核酸蛋白成像仪记录；检测限约80ng；
尿酸酶活性测定液：0.20m硼砂pH 9.2，0.10mM尿酸；每分钟消耗1.0微摩尔底物为1单位；
细胞裂解液1：裂解重组表达RMGU的大肠杆菌细胞，20mM HEPES，pH 7.6；
蛋白洗脱液1：pH 10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；
蛋白电泳：常规SDS-PAGE；如未说明，上样总蛋白量5g；
蛋白浓度测定：用Bradford的染料结合法，或者Nanodrop测定280nm吸收；
所需要的化学试剂采购于Tansoo平台和阿拉丁试剂网；纯度在95％以上。
以下为具体实施例：
实施例1：制备代表性结构形式的两性解离离子交换分离介质
第一步，准备如下溶液(过滤用0.22um滤膜以同时除菌):
(1)赖氨酸溶液：100mM赖氨酸用50mM盐酸到pH6.0，水稀释到30mM，过滤备用；
(2)组氨酸溶液：50mM组氨酸溶液，用用10mM盐酸调到pH6.0，稀释到30mM；
(3)甘氨酸溶液：100mM甘氨酸溶液用稀碳酸氢钠调到pH 6.0，用水稀释到30mM，过滤备用；
(4)N,N-二甲基乙二胺溶液：10mM N,N-二甲基乙二胺用0.10m盐酸调到pH 6.0，稀释到10mM；
(5)半胱氨酸溶液：50mM半胱氨酸水溶液，用10mM碳酸氢钠调到pH6.0，稀释到10mM，过滤备用(配制后在30min内使用)；
(6)巯基乙胺溶液：20mM巯基乙胺水溶液，用10mM盐酸调到pH6.0，稀释到10mM(配制后在30min内使用)；
(7)巯基乙酸溶液：20mM巯基乙酸水溶液，用10mM碳酸氢钠调到pH6.0，稀释到10mM(配制后在30min内使用)；
(8)2-巯基咪唑溶液：20mM 2-巯基咪唑溶液，用10mM碳酸氢钠调到pH6.0，稀释到10mM(配制后在30min内使用)；
第二步，FBD-MSP-FCOOH的羧基活化成活泼酯：将FBD-MSP-FCOOH用干燥的N,N-二甲基甲酰胺即DMF反复洗涤，再将FBD-MSP-FCOOH用干燥DMF悬浮到10g/L；以FBD-MSP-FCOOH质量为基准，加入3倍质量的二环己基碳二亚胺DCC1.5倍质量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS-OH)，搅拌混匀；28～35摄氏度持续混合反应～12H；以每次每克FBD-MSP-FCOOH加100ml DMF量洗涤活化后磁珠3次，得FBD-MSP-FCOOH磁珠的NHS活泼酯，缩写为FBD-MSP-FCONHS(图2)。
第三步，与活泼酯成酰胺连接进行共价修饰，得两性解离离子交换分离介质(图3)：
(1)每克FBD-MSP-FCONHS悬浮于70ml赖氨酸溶液加30ml甘氨酸溶液混合物进行修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEWA；
(2)每克FBD-MSP-FCONHS悬浮于100ml赖氨酸溶液中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEWB；
(3)每克FBD-MSP-FCONHS悬浮于70ml赖氨酸溶液加30ml N,N-二甲基乙二胺溶液的混合物中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应～13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEWC；
(4)每克FBD-MSP-FCONHS悬浮于100ml组氨酸溶液中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应～13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEWD；
(5)每克FBD-MSP-FCONHS悬浮于100ml N,N-二甲基乙二胺溶液中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEWE。
第四步，与巯基反应基团连接进行共价修饰，得两性解离离子交换分离介质(图4)：
(1)每克FBD-MSP-FCONHS悬浮于100ml二甲基甲酰胺中，加单氯乙酰乙二胺0.5g，室温震荡反应4H，得以氯乙酰为巯基反应基团的待修饰分离介质并缩写为FBD-MSP-FCOCH2Cl；
(2)每克FBD-MSP-FCOCH2Cl悬浮于70ml半胱氨酸溶液加30ml巯基乙酸溶液混合物进行修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应～13h；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEW1；
(3)每克FBD-MSP-FCOCH2Cl悬浮于100ml半胱氨酸溶液中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应～13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEW2；
(4)每克FBD-MSP-FCOCH2Cl悬浮于70ml半胱氨酸溶液加30ml巯基乙胺溶液的混合物中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应～13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEW3；
(5)每克FBD-MSP-FCOCH2Cl悬浮于50ml巯基乙酸溶液与50ml 2-巯基咪唑溶液的混合物中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应～13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEW4；
(6)每克FBD-MSP-FCOCH2Cl悬浮于100ml巯基乙胺溶液中进行共价修饰；上述修饰体系在室温下中速搅拌反应～13H；每克磁珠用100ml蒸馏水洗三次，得对应两性解离离子交换微米磁珠，缩写为FBD-MSP-ZEW5。
(7)当然，本制备实施例所制备的产品仅为说明如何制备两性解离离子交换分离介质，将材料替换成前述的其他的所述解离产生负电荷的脂肪族羧基，解离产生正电荷的脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基之一或多种共存，均能实线本发明的目的。
实施例2：测定两性解离离子交换介质对酸性红13吸附分离容量的操作流程
第一步，测定pH对酸性红13消光系数的影响；结果见图5。酸性红13在pH 4.0到8.9之间消光系数无变化，都为18.0(mM)-1.cm-1；以下酸性红13都采用此消光系数。
第二步，两性解离离子交换分离介质用pH 3.6的缓冲液3次，重悬在此缓冲液中；
第三步，将酸性红13用吸附缓冲液稀释到不低于5.0mM；
第四步，取所需量离子交换分离介质，去水相，重悬于0.80ml吸附缓冲液中，加入稀释酸性红13溶液不超过50μl到所需终浓度，四维混合仪室温持续温和混匀5～10min；
第五步，磁力分离结合酸性红13，用0.80ml洗涤缓冲液洗磁珠2次；磁珠悬于0.80ml 洗脱缓冲液，四维混合仪旋摇5～10min；磁力去磁珠，取上清液0.70ml测506nm吸收；
第六步，据两性解离离子交换分离介质对酸性红13分离容量随pH的变化，近似确定分离容量达到零的最大pH，作为所测试两性解离离子交换分离介质的pIm；
第七步，以在pH3.6吸附缓冲液中对酸性红13的分离容量表示两性解离离子交换分离介质的分离容量，并用于对各种表面为两性解离离子交换基团的磁珠进行计量。
实施例3.吸附及洗脱条件对两性解离分离介质分离容量的影响(操作按实施例2)。
第一步，在pH 3.6吸附，酸性红13为60M，测定洗脱液pH效应见表1。
洗脱液pH从8.0到8.9，仅对FBD-MSP-ZEWC及FBD-MSP-ZEW3分离酸性红13的容量有较强影响，但在pH>8.9后也不再显著增加；以下如未说明，对吸附的酸性红13或者核酸，都用 pH 8.9洗脱液。以吸附前的酸性红13量为总量；在所用洗涤条件下，酸性红13出现在洗涤液中比例及洗涤丢失率低于2％。以上清液中酸性红13的减少量为被吸附的总量，在pH8.9时吸附对所测试的代表性两性解离离子交换磁珠所吸附酸性红13的洗脱率，除了FBD-MSP-ZEWE及FBD-MSP-ZEW5，都大于95％；对于FBD-MSP-ZEWE及FBD-MSP-ZEW5，即使到pH 8.9的洗脱率也低于2％。这些结果支持调节pH使表面净电荷反转而促进带电物质的洗脱。
表1洗脱液pH对两类两性解离吸附分离磁珠所吸附酸性红13洗脱得率的影响
*pH 8.9洗脱效率太低；据吸附酸性红13后上清液减少量估算分离容量，用于估计其pIm。
第二步，在pH 3.6吸附，pH 8.9洗脱，吸附缓冲液中酸性红13终浓度为60μM，测定吸附分离量的量效关系。结果表明，洗脱液中分离所得酸性红13量对160μg以内FBD-MSP-ZEWB 量成线性响应(图6)。而且，对FBD-MSP-ZEWA为0.10mg时，吸附反应体系用不同浓度酸性红 13，所得洗脱液中酸性红13量对吸附反应体系有限范围内酸性红13量接近线性响应(图7)。这些结果表明用酸性红13为显色探针适合标定方法这类两性解离分离介质的分离容量，也支持用本发明所设计的两性解离离子交换剂适合用于染织废液中水溶性染料的高效回收再用，方便其再利用同时也能降低对环境的污染。
第三步，吸附反应pH对两性解离离子交换分离介质所得分离容量也有显著影响(表1)，代表数据见图8。pH在大于4.0后所得磁珠对酸性红3的分离容量都降低，表明其正电荷持续减少；要达到最大分离容量，吸附反应体系的pH需在pH 3.6～4.0之间。对酸性红13分离容量接近于零的最小pH就是其pIm，可见三种示例磁珠的pIm明显不同(图8)。在pH 8.0时，图8 中三种磁珠对酸性红13的吸附容量都接近于零，说明此时三种磁珠表面净电荷都为负。据此推算出所制备的两性解离离子交换分离介质的pIm；这些pIm差距也支持洗脱液的pH效应，进一步支持本发明的设计思想和所得离子交换剂的应用(表1)。
第四步，用0.10mg FBD-MSP-ZEWA和60μM酸性红13，吸附体系0.80ml pH 3.6，洗脱液pH 8.9共0.80ml，独立稀释FBD-MSP-ZEWA，重复测定对酸性红13分离容量为(55±2)μmole/g 磁珠(n＝5)。可见此方法有很高的精度，适合标定本发明所述两性解离离子交换分离介质的分离容量。以下实施例均以pH 3.6时对酸性红13分离量对磁珠计量。
实施例4(应用).用FBD-MSP-ZEWB和FBD-MSP-ZEWA提取质粒DNA
第一步：用RMGU质粒为模型；放大培养大肠杆菌细胞后，用天根生化的离心柱质粒提取试剂盒，基于碱裂解大肠杆菌细胞和离心柱结合提取质粒为核酸样品。
第二步：以下如未另作说明，所有磁珠结合质粒pH为3.6，洗脱pH为8.9。
第三步：热电硅醇磁珠0.40mg，FBD-MSP-ZEWA为5.5nmol(0.10mg)；吸附体系共0.20ml，洗脱液40μl；nanodrop测定A260定核酸量；分离所得核酸量对吸附反应体系过量核酸量响应曲线见图9。可见，在核酸过量情况下，FBD-MSP-ZEWA分离核酸容量显著高于热电硅醇磁珠的4倍。以吸附反应体系核酸总量减去吸附反应后上清剩余核酸量为磁珠吸附核酸最大量计算洗脱效力，FBD-MSP-ZEWA吸附核酸在pH 8.9洗脱效力大于85％，而热电硅醇磁珠吸附核酸洗脱效力小于30％；此结果支持本发明的设计思想。
第四步：吸附体系共0.20ml含质粒5.0μg，洗脱液40μl；所得核酸量对磁珠用量的响应曲线如图10。可见，FBD-MSP-ZEWB分离核酸的效价可能超过热电硅醇磁珠9倍；FBD-MSP-ZEWB 对核酸分离容量显著高于FBD-MSP-ZEWA，与二者分离酸性红13容量差距一致；这种差距也支持本发明的设计思想及所设计离子交换剂的实用性。
第五步：吸附体系共0.20ml含质粒0.40μg；用50nmol FBD-MSP-ZEWB(～0.15mg)、1.0mg 热电硅醇磁珠及Biomiga试剂盒中硅醇磁珠1.0mg分离，洗脱液40μl；所得核酸提取液取2.5 μl到50μl PCR反应体系，经不同循环/扩增次数后琼脂糖电泳检测PCR产物见图11其中标注如下：M:核酸分子量参考；1、4、7、10、13、16：用0.15mg FBD-MSP-ZEWB提取质粒；2、5、8、11、14、17：用热电硅醇磁珠1.0mg提取质粒；3、6、9、12、15、18：Biomiga所用硅醇磁珠(试剂盒中硅醇磁珠来源未知)1.0mg提取质粒；1、2、3：共10个PCR循环；4、5、6：共13个PCR循环；7、8、9：共16个PCR循环；10、11、12：共19个PCR循环；13、14、15：共22个PCR循环；16、17、18：共25个PCR循环；
50nmol FBD-MSP-ZEWB提取核酸作为模板效力，显著高于用热电硅醇磁珠1.0mg、Biomiga 所用硅醇磁珠(试剂盒中硅醇磁珠来源未知)1.0mg所得核酸作为模板效力。FBD-MSP-ZEWB更适合提取核酸用于PCR，支持所述离子交换剂的应用。
实施例5(应用).FBD-MSP-ZEWB离子交换纯化微量的重组表达RMGU蛋白
MGU在羧甲基或磷酸化纤维素、Toyopear系列的磺酸亲水大孔树脂类阳离子交换介质上吸附都很强，但即使用10倍与胶体积的洗脱液液无法洗脱所吸附的MGU(Protein J(2016) 35:318–329及此文所引用文献)。为提高两性解离离子交换剂的分离容量和保障RMGU稳定性，选用pIm接近6.6的FBD-MSP-ZEWB，与RMGU的pIs相差超过2.0个pH单位，以便选择位于二者之间且接近于中性pH的缓冲液裂解细胞，过0.22μm微孔滤膜就可直接用于吸附分离。
第一步：诱导表达RMGU，细胞裂解液1中超声裂解；12000rpm离心上清液过滤后为重组表达的RMGU的粗酶样品；蛋白浓度3.25g/L，活性3.27kU/L，比活性1.01kU/g。
第二步：3.0μmol磁珠FBD-MSP-ZEWB用细胞裂解液洗三次；加不同量粗酶样品，室温混合10min；磁分离并用细胞裂解液1洗涤磁珠；加蛋白洗脱液1室温混合30min得洗脱液；收集洗脱液后，加所述量的洗脱液重新再洗脱30min；重复多次洗脱。Nanodrop测定280nm吸收(蛋白浓度)。结果如表2.可见，FBD-MSP-ZEWB能高效纯化RMGU，所得酶的比活性超过通过三次DEAE-纤维素吸附杂质纯化的比活性(Protein J(2016)35:318–329)；被吸附RMGU按照活性计算最高洗脱效力接近80％，而此前经典阳离子交换介质吸附的MGU都无法洗脱。而且，用洗脱液分批洗脱表明，第二次洗脱才获得最高活性浓度的RMGU；将第二次洗脱液(各80μl) 冷冻干燥，直接用SDS-PAGE上样缓冲液25μl加热溶解，上相同蛋白量进行SDS-PAGE分析；结果表明，FBD-MSP-ZEWB一次离子交换纯化的RMGU纯度已非常高，显著优于三次DEAE-纤维素纯化(图12；与文献所述比较Protein J(2016)35:318–329)。
表2用FBD-MSP-ZEWB共3.0μmol快速分离RMGU(ND：蛋白浓度太低无法测)
实施例6.FBD-MSP-ZEWB提取RMGU质粒用于定量PCR
第一步：大肠杆菌细胞转化RMGU后放大培养；收集细胞用碱裂解后离心柱法提取质粒，作为初步纯化的质粒；将初步纯化质粒用0.20m乙酸调pH 3.6，再用于后续纯化；
第二步：用FBD-MSP-ZEWB进一步纯化上述质粒；所得洗脱液再用0.20m乙酸调pH3.6，再用 FBD-MSP-ZEWB再纯化一次，得到质粒标准品；稀释到第六步所述恰当浓度；
第三步：分别用50nmol FBD-MSP-ZEWB、1.0mg Dynabeadsmyone Silane、1.0mgBiomiga试剂盒磁珠，直接用洗脱液(25mM Tris-HCl,pH 8.9)共40μl洗脱，得来自磁珠的杂质；
第四步：在来自磁珠的杂质中加相同量质粒标准品作为磁珠空白，用于荧光实时定量PCR(qPCR)，比较不同磁珠所提取核酸中对qPCR有抑制作用的杂质的含量；
第五步：取离心柱纯化质粒稀释后20μl共0.40μg，加45μl 0.20m乙酸钠、235μl0.20m乙酸调节到pH～3.6；分别用50nmol(0.15mg)FBD-MSP-ZEWB、1.0mg DynabeadsmyoneSilane、1.0mg Biomiga 试剂盒所用磁珠提取，洗脱40μl(25mM Tris-HCl,pH 8.9)，为磁珠提取核酸测试液；
第六步：用于qPCR的样品如下：
1质粒标准品：RMGU质粒用离心柱法纯化一次，再用FBD-MSP-ZEWB纯化两次，测A260得质粒浓度26.9mg/L，用洗脱液稀释1125倍后为质粒的标准品应用液；将质粒的标准品应用液用洗脱液再稀释4、16、64、256、1024倍用于qPCR；
2FBD-MSP-ZEWB空白：50nmol单独磁珠洗脱液20μl+标准品应用液稀释64倍后20μl；
3Dynabeads Myone Silane空白：1.0mg单独磁珠洗脱液20μl+标准品应用液稀释64倍后20μl；
4Biomiga磁珠空白：1.0mg单独磁珠洗脱液20μl+标准品应用液稀释64倍后20μl；
5FBD-MSP-ZEWB测试：用50nmol磁珠提取0.40g质粒，洗脱液再稀释360倍；
6Dynabeads Myone Silane测试：用1.0mg磁珠提取0.40g质粒，洗脱液再稀释360倍；
7Biomiga磁珠测试：用1.0mg磁珠提取0.40g质粒，洗脱液再稀释360倍；
第七步：荧光实时定量PCR：用Biorad CFX96，标准流程；荧光染料为Sybrgreen；PCR 反应体系共25μl，含酶、三核苷酸、引物(控制产物为150bp)、Sybrlgreen及2.5μl模板；跟踪磁珠空白的过程如图13、跟踪磁珠测试的过程如图14、响应曲线见图15。设定质粒的标准品应用液中质粒浓度为24pg/L，响应曲线中每个反应体系的质粒的总量梯度依次为：60，15，3.75，0.94，0.24，0.06pg，取其自然对数为横坐标得到负响应曲线，详见图15。
第八步：据表3可见，FBD-MSP-ZEWB中杂质对PCR抑制作用最少，而两种硅醇磁珠提取核酸中杂质对PCR抑制都更强，尤其Biomiga所用磁珠中抑制性杂质更多；对痕量质粒，考虑磁珠用量(质量)和qPCR 测定的模板量，FBD-MSP-ZEWB提取核酸用于qPCR的效力超过Dynabeadsmyone Silane的10倍；Biomiga 所用磁珠中对qPCR有抑制的杂质明显较多，qPCR所得模板量也最低。
表3荧光实时定量PCR测定磁珠提取质粒量及不同磁珠提取物中干扰杂质
上述应用实施例证实本发明的两性解离离子交换分离介质实用性；这些介质对酸性红13 类染料的吸附和洗脱能力都很强，既能用于所述离子交换分离介质的表征，也能用于印染废液中酸性红系列水溶性染料的回收再用；基于对此类离子交换分离介质结合酸性红13的洗脱和测量，能方便表征所制备的两性解离离子交换分离介质的pIm、洗脱效率的pH效应；用有恰当 pIm两性解离离子交换分离介质，能高效力快速纯化蛋白，能高效力提取核酸且所得核酸更适合PCR，且荧光实时定量PCR表明，所述两性解离离子交换分离介质提取核酸用于PCR的效力，按照微米磁珠的质量计，接近Thermo-Fisher Dynabeads MyoneSilane硅醇磁珠的10倍。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制；本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种两性解离离子交换分离介质，其特征在于：所述两性解离离子交换分离介质表面为两性解离共价修饰层；所述两性解离共价修饰层具有等电点并用pIm表示，所述等电点为两性解离离子交换分离介质表面净电荷为零时的环境pH值；在环境pH值低于所述等电点pIm时，两性解离共价修饰层表面的净电荷为正，具有阴离子交换剂属性；在环境pH值高于所述等电点pIm时，两性解离共价修饰层表面的净电荷为负，具有阳离子交换剂属性。
2.根据权利要求1所述的两性解离离子交换分离介质，其特征在于：在环境pH值低于所述等电点pIm时，随着pIm和环境pH之间差值的扩大，两性解离共价修饰层的表面正电荷数量逐渐增加；在环境pH值高于所述等电点pIm时，随着pIm和环境pH之间差值的扩大，两性解离共价修饰层的表面负电荷数量逐渐增加；所述环境pH值均位于拟分离目标物质和所述两性解离离子交换分离介质都能耐受的范围内。
3.根据权利要求1所述的两性解离离子交换分离介质，其特征在于：所述两性解离离子交换分离介质表面的两性解离共价修饰层中，同时含有在pH值低于所述等电点pIm时解离产生正电荷的基团和在pH值高于所述等电点pIm时解离产生负电荷的基团；所述解离产生负电荷的基团为脂肪族羧基，解离产生正电荷的基团为脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基之一或多种共存。
4.根据权利要求3所述的两性解离离子交换分离介质，其特征在于：
所述两性解离共价修饰层来自由两性解离基团前体对分离介质基体表面的共价修饰；
所述分离介质基体为表面不含长度超过9个原子的线性长直链，但含有活泼基团用于与两性解离基团前体发生共价连接反应生成所述两性解离共价修饰层，所述活泼基团是下述的任一类：脂肪族伯和/或仲胺基、脂肪族羧基和巯基反应基团；其中，巯基反应基团含有被巯基取代而离开分离介质基体表面的小体积基团；
所述两性解离基团前体为亲水、分子量小于500道尔顿、无超过连续5个碳原子烃链或烃环的物质，并且都含烷基硫醇基或脂肪族伯胺基为共价连接基团，且含有脂肪族羧基作为解离产生负电荷的基团和/或含有脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基之一或多种共存作为解离产生正电荷的基团；所述两性解离基团前体包括A类前体、B类前体和C类前体，其中A类前体为除了含所述共价连接基团外，仅含所述解离产生负电荷的基团的两性解离基团前体，B类前体为除了含所述共价连接基团外，仅含所述解离产生正电荷的基团的两性解离基团前体，C类前体为除了含所述共价连接基团外，同时含有所述解离产生负电荷的基团及解离产生正电荷的基团的两性解离基团前体；
所述两性解离基团前体用于共价修饰分离介质基体时，用下列方式之一使用进行修饰：
a.C类前体单独使用或混合使用；在混合使用时，由多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
b.由一种或多种A类前体与一种或多种B类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
c.仅由一种或多种A类前体与一种或多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团；
c.仅由一种或多种B类前体与一种或多种C类前体按设定比例混合使用，且混合使用的前体都含有相同的共价连接基团。
5.根据权利要求4所述的两性解离离子交换分离介质，其特征在于：对分离介质基体进行共价修饰时，所用两性解离基团前体中,脂肪族伯、仲、叔胺基及咪唑基的摩尔总量对脂肪族羧基的摩尔总量的比例限制在1:6到6:1之间。
6.根据权利要求3所述的两性解离离子交换分离介质，其特征在于：当所用两性解离基团前体中含有脂肪族仲胺和/或叔胺作为解离产生正电荷的基团时，所述脂肪族仲胺和叔胺摩尔总量合计不超过所用各种前体中脂肪族伯胺及咪唑基合计摩尔总量的30％。
7.根据权利要求5所述的两性解离离子交换分离介质，其特征在于：所述两性解离离子交换分离介质，在pH为3时其表面正电荷数量不低于最大值的90％，在pH为11时其表面负电荷数量不低于最大值的90％。
8.一种权利要求1至7任一权利要求所述的两性解离离子交换分离介质的应用方法，其特征在于：应用所述两性解离离子交换分离介质分离目标物质时，目标物质释放氢离子的解离常数的常用对数为pIs或者目标物质的等电点为pIs，应用过程有以下特征：
a.选两性解离离子交换分离介质，使其pIm和目标物质的pIs之间相差不小于1.0；
b.吸附目标物质时，选择位于目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm之间且与目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的pIm相差都大于0.3的环境pH，使离子交换分离介质表面净电荷与目标物质净电荷相反，基于静电吸引而吸附目标物质；
c.洗脱目标物质时，洗脱液pH低于两性解离离子交换分离介质的等电点pIm时，洗脱液pH比目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm中最低的还低至少0.30；洗脱液pH高于两性解离离子交换分离介质的等电点pIm时，洗脱液pH比目标物质的pIs和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm中最高的还高至少0.30；在上述洗脱液环境下，两性解离离子交换分离介质表面净电荷与目标物质净电荷相同，基于静电排斥而洗脱目标物质；在洗脱液中加水溶单价中性无机盐，促进目标物质的洗脱。
9.一种权利要求1至7任一权利要求所述的两性解离离子交换分离介质的分离容量标定方法，其特征在于：
a.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时，用解离常数或等电点为pKa、分子量小于600Dalton、对可见光吸收系数大于14mM-1.cm-1、在pH 3.0到11.0间溶解度不低于5.0μmol/L且在pH 3.0到11.0间解离后净电荷为正或负的有色有机物为显色探针；
b.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时具有以下情况：
b1两性解离离子交换分离介质的等电点pIm在4.0到6.0间，用解离常数或等电点pKa比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少大2.0的阳离子探针,或解离常数或等电点pKa比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少小2.0的阴离子探针；
b2两性解离离子交换分离介质的等电点pIm在6.0到10.0间，用用解离常数或等电点pKa比两性解离离子交换分离介质的等电点pIm至少小2.0的阴离子探针；
c.标定所述两性解离离子交换分离介质的分离容量时，吸附时，选位于显色探针解离常数或等电点pKa和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm之间且与两性解离离子交换分离介质的等电点pIm相差不少于1.3而与显色探针的解离常数或等电点pKa相差不少于0.5的环境pH对应缓冲液，使两性解离离子交换分离介质基于静电吸引吸附显色探针；洗脱时，选比显色探针解离常数或等电点pKa和两性解离离子交换分离介质的等电点pIm中最高者都还高或最低者都还低至少1.3的环境pH对应缓冲液，使两性解离离子交换分离介质表面净电荷与显色探针净电荷相同基于静电排斥洗脱显色探针；测定洗脱液中显色探针的吸收，换算出对显色探针的分离容量；
测定pH对两性解离离子交换分离介质分离显色探针容量的影响，对解离后净电荷为负的显色探针分离容量达到零的最小pH、对解离后净电荷为正的显色探针分离容量达到零的最大pH，为两性解离离子交换分离介质的等电点pIm的近似值。
CN201711010305.0A 2017-10-25 2017-10-25 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法 Active CN108097336B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711010305.0A CN108097336B (zh) 2017-10-25 2017-10-25 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法
PCT/CN2018/111536 WO2019080851A1 (zh) 2017-10-25 2018-10-24 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法
EP18871772.2A EP3546066B1 (en) 2017-10-25 2018-10-24 Amphoteric dissociation ion exchange medium, its use, and separation capacity calibration method
JP2019530832A JP7111373B2 (ja) 2017-10-25 2018-10-24 両性解離型イオン交換媒体、並びに使用方法及び分離容量のキャリブレーション方法
US16/435,515 US20190291095A1 (en) 2017-10-25 2019-06-09 Amphoteric dissociation ion exchange medium and uses thereof and method for calibrating separation capacity thereof
US16/902,564 US11358136B2 (en) 2017-10-25 2020-06-16 Amphoteric dissociation ion exchange medium and uses thereof and method for calibrating separation capacity thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711010305.0A CN108097336B (zh) 2017-10-25 2017-10-25 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108097336A true CN108097336A (zh) 2018-06-01
CN108097336B CN108097336B (zh) 2019-02-26

Family

ID=62206255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711010305.0A Active CN108097336B (zh) 2017-10-25 2017-10-25 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20190291095A1 (zh)
EP (1) EP3546066B1 (zh)
JP (1) JP7111373B2 (zh)
CN (1) CN108097336B (zh)
WO (1) WO2019080851A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019080851A1 (zh) * 2017-10-25 2019-05-02 重庆博蓝鹰生物技术有限公司 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法
CN113817718A (zh) * 2021-09-16 2021-12-21 上海市刑事科学技术研究院 一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7481620B2 (ja) * 2020-04-28 2024-05-13 東亜ディーケーケー株式会社 溶離液およびスラッジ水の分析方法
CN116143354B (zh) * 2023-04-19 2023-06-16 成都之和环保科技有限公司 一种提高工艺稳定性和水质的纯水的制备工艺

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070241056A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-18 Reinhold Klipper Amphoteric ion exchangers for the adsorption of oxo anions
CN101417248A (zh) * 2007-10-24 2009-04-29 朗盛德国有限责任公司 两性离子交换剂
CN102181069A (zh) * 2011-04-12 2011-09-14 北京大学 两性离子交换膜的制备方法
CN102993229A (zh) * 2012-12-19 2013-03-27 宁波工程学院 两性电解质修饰的杂化硅胶材料及其固相萃取方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5247755B2 (zh) * 1973-10-05 1977-12-05
JPS5876145A (ja) * 1981-10-30 1983-05-09 Toyo Soda Mfg Co Ltd 両性イオン交換体及びその製造法
CH678789A5 (de) * 1989-03-29 1991-11-15 Marigen S.A. Ein mittel zur stabilisierung des ph-wertes in hydroponischen loesungen, sowie zur absorbierung und pufferung von urin und wundsekreten.
CN1051245C (zh) * 1995-01-20 2000-04-12 清华大学 制备型等电点电泳分离方法及设备
AU3645899A (en) 1998-04-15 1999-11-01 Reilly Industries, Inc. Separations using ampholytic base polymers
US6310199B1 (en) * 1999-05-14 2001-10-30 Promega Corporation pH dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids
CA2308614C (en) 2000-02-12 2004-05-04 Sang-Jun Lee Heating pot for decocting chinese herbs
JP4735933B2 (ja) * 2004-09-03 2011-07-27 独立行政法人産業技術総合研究所 ｐＨ応答性両性イオン微粒子状ポリマー及びその用途
KR100647306B1 (ko) 2004-12-23 2006-11-23 삼성전자주식회사 아미노기와 카르복실기를 포함하고 제1 ｐＨ에서 양전하를띠는 물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법
JP5068981B2 (ja) 2006-11-17 2012-11-07 古河スカイ株式会社 アルミニウム合金クラッド材
US8487729B2 (en) 2009-02-02 2013-07-16 Northrop Grumman Guidance & Electronics Magnetic solenoid for generating a substantially uniform magnetic field
CN107561164A (zh) * 2016-07-01 2018-01-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种尿液蛋白质组学样品预处理方法及应用
CN108097336B (zh) * 2017-10-25 2019-02-26 重庆博蓝鹰生物技术有限公司 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070241056A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-18 Reinhold Klipper Amphoteric ion exchangers for the adsorption of oxo anions
CN101417248A (zh) * 2007-10-24 2009-04-29 朗盛德国有限责任公司 两性离子交换剂
CN102181069A (zh) * 2011-04-12 2011-09-14 北京大学 两性离子交换膜的制备方法
CN102993229A (zh) * 2012-12-19 2013-03-27 宁波工程学院 两性电解质修饰的杂化硅胶材料及其固相萃取方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019080851A1 (zh) * 2017-10-25 2019-05-02 重庆博蓝鹰生物技术有限公司 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法
CN113817718A (zh) * 2021-09-16 2021-12-21 上海市刑事科学技术研究院 一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液
CN113817718B (zh) * 2021-09-16 2023-10-24 上海市刑事科学技术研究院 一种利用低共熔溶剂裂解细胞并直接用于聚合酶链式扩增反应的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3546066B1 (en) 2021-01-20
US11358136B2 (en) 2022-06-14
US20200376480A1 (en) 2020-12-03
JP2020501879A (ja) 2020-01-23
EP3546066A1 (en) 2019-10-02
CN108097336B (zh) 2019-02-26
EP3546066A4 (en) 2020-03-04
US20190291095A1 (en) 2019-09-26
WO2019080851A1 (zh) 2019-05-02
JP7111373B2 (ja) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108097336B (zh) 两性解离离子交换介质、应用方法和分离容量标定方法
Daniels et al. Chemical analysis
Rosenberg et al. Fractionation of the protein components of human erythrocyte membranes
Bruce et al. Exosome isolation and purification via hydrophobic interaction chromatography using a polyester, capillary‐channeled polymer fiber phase
Qiao et al. Simultaneous extraction of enrofloxacin and ciprofloxacin from chicken tissue by molecularly imprinted matrix solid-phase dispersion
Lata et al. Synthesis and application of cephalexin imprinted polymer for solid phase extraction in milk
Li et al. Zirconia coated stir bar sorptive extraction combined with large volume sample stacking capillary electrophoresis-indirect ultraviolet detection for the determination of chemical warfare agent degradation products in water samples
Peterson et al. Ion-exchange displacement chromatography of proteins, using narrow-range carboxymethyldextrans and a new index of affinity
Hoshi et al. The spectrophotometric determination of trace molybdenum (VI) after collection and elution as molybdate ion on protonated chitin
Tiselius Adsorption analysis of amino acid mixtures
WO2017041013A1 (en) Small-molecule mediated size selection of nucleic acids
Forcic et al. Purification of genomic DNA by short monolithic columns
Giri [31] Chromatofocusing
Rickwood et al. The modification of nuclear proteins by ADP‐ribosylation
Chi et al. Online specific recognition of mycotoxins using aptamer-grafted ionic affinity monolith with mixed-mode mechanism
Riehl et al. Crosslinking of N‐Acetyl‐phenylalanyl [s4U] tRNAPhe to Protein S10 in the Ribosomal P Site
Kang et al. Effects of ionic strength and pH on endotoxin removal efficiency and protein recovery in an affinity chromatography
Turnbull Integral glycan sequencing of heparan sulfate and heparin saccharides
Taniai et al. On-line preconcentration of phosphate onto molybdate form anion exchange column
US20110152510A1 (en) Simple load and elute process for purification of genomic dna
Syrén et al. Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and a multi-channel peristaltic pump
Tam et al. Use of capillary electrophoresis in the analysis of aerosol and bulk/dry deposition collected on a daily basis
CN117866038B (zh) 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法
Rivas et al. A single-step method to concentrate and desalt proteins which is also useful for determination of detergent binding to membrane proteins
Brishammar et al. Purification and propeties of a non-specific hemagglutination inhibitor from human serum against picornaviruses

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant