CN114349844B - 一种兽用重组绒促性素的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质纯化技术领域，具体公开一种兽用重组绒促性素的纯化方法。本发明提供的纯化方法包括，MMC复合层析、离子交换层析和疏水层析。经过上述的纯化方法，得到的重组hCG纯度高(98％以上)、比活高(20900IU/mg)，并且纯化得率高(65％以上)。整个生产过程不涉及污染环境有机溶剂、更环保、成本更低，可适用于兽用rhCG大规模纯化。

Description

一种兽用重组绒促性素的纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域，特别是兽用重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化。

背景技术

人绒毛膜促性激素(hCG)是一种由人胎盘合体滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，可以促进雌性动物卵巢卵泡成熟，诱导排卵，以及促进雌激素的合成和分泌。在人临床上，hCG常用于辅助生殖治疗，治疗不孕不育等。在动保行业，hCG常用于母畜，包括猪、牛、羊等的同期发情和超数排卵。在水产行业，hCG常用于鱼类的人工催熟催产、排卵产精，是鱼类人工繁殖的首选催产剂之一。

商品化hCG最初是从孕妇尿中提取纯化的提取物，但大规模收集孕妇尿难度大、成本高，纯化得到的hCG产品批次差异大，且存在尿液供体带来的安全风险。Merck Serono研发了重组hCG，以用于人辅助生殖，连续使用五步色谱层析，最终获得效价为25000IU/mg的高纯度、高活性重组hCG产品(CN 100482679C)，但是纯化过程复杂、得率低，纯化成本高。目前国内已公开数据显示，经纯化后的rhCG单位效价大多都≤10000IU/mg，如发明专利CN102485752B、CN111303274A、CN105968185A等。但在纯化过程中均不同程度的使用了污染环境或有害试剂如异丙醇、二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇等，存在环境污染的风险。

本发明提供了一种兽用重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化方法，仅需3步常规层析步骤，无层析柱装柱技术特别要求，操作简便，不会因此增加工艺放大困难系数。纯化纯度在98％以上，得率高，得率至少65％，纯化原液比活达20000IU/mg。比活高，成本低，满足低附加值的畜牧和水产生产。另外，整个生产过程不涉及有机溶剂，环境友好、更环保。

发明内容

本发明的目的是解决重组hCG，尤其是哺乳动物细胞表达的rhCG的纯化问题，得到纯度高、活性高的兽用重组hCG精纯品。

本发明的另一目的是提供一种可适用于大规模生产的重组hCG纯化工艺。

为了达到上述目的，本发明提供了以下的重组hCG纯化步骤：

(0)深层过滤；

(1)MMC复合层析；

(2)离子交换层析；

(3)疏水层析。

其中，各纯化步骤按先后顺序进行。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，纯化起始材料为使用哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统表达的细胞培养上清液，也适用其他表达系统，包括但不限于大肠杆菌、酵母细胞，表达获得的培养上清液。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，在复合层析步骤之前，为了去除较大颗粒，以免堵塞柱子，最好进行一次深层过滤步骤。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)采用一种偶联复合型阳离子配基MMC复合层析介质。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，洗脱优选弱酸性缓冲液。适合的缓冲液包括NaAC/HAC缓冲液、Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液。最优选pH5.5的NaAC/HAC缓冲液。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，NaAC/HAC洗脱缓冲液的浓度在10～100mM；优选50mM。

本发明提供的纯化方法中，采用混合模式层析作为第一步层析，混合模式层析(Mixed-Mode Chromatography，MMC)是一种基于蛋白质与层析配基分子间多种相互作用的层析技术。混合模式层析旨在从经过澄清的细胞上清液中直接捕获中度纯化的目的蛋白hCG，与传统色谱相比，具有高分离度，高选择性，高样品负载量，高速度等优点。

在本发明中MMC层析发挥了高重组hCG载量，低单位成本的作用，本发明提供的MMC层析通过对缓冲体系、平衡液盐含量、平衡液pH等条件不断优化，进行改进，使得层析柱对重组hCG具备更高的载量，并且本发明中MMC层析采用pH为5.5的NaAC/HAC缓冲液，完成重组hCG的洗脱；更进一步的，本发明提供的洗脱液中含有Arg(精氨酸)，Arg能够促进目的蛋白与层析配基分子间的解离且防止目的蛋白自身聚集，使得洗脱得到更高性能的重组hCG，能够更好的保持重组hCG的稳定性。对于维持目的蛋白重组hCG的活性具有重要意义。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)层析介质采用单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物基球。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，洗脱液为Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液；优选Tris-HCl缓冲液。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，Tris-HCl缓冲液的pH为5.5。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，Tris-HCl缓冲液浓度在5～20mM；优选8～15mM；最佳优选10mM。

本发明选择聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物基球的离子交换层析，作为第二步层析。并且本发明通过调节平衡液盐离子强度，确保离子交换层析获得更高的重组hCG载量的同时，能够维持重组hCG的稳定。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)采用一种偶联苯基疏水基团的疏水交换层析介质。旨在对上述步骤所得重组hCG蛋白进一步的提纯。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)中，选用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，特别优选Tris-HCl缓冲液。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)中，Tris-HCl缓冲液pH值在6.0～10；优选pH6.0～9.0；特别优选pH值7.5。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)所述的疏水交换层析采用目的蛋白流穿模式。

作为本发明的一个具体实施例方式，在本发明所述的重组hCG纯化方法中，重组hCG经受以下步骤：

(0)深层过滤；

(1)在MMC复合层析介质上用10～100mM的NaAC/HAC，0.3～0.4M的NaCl，0.3～0.4MArg，pH值为5.5的缓冲液作为洗脱液，进行洗脱；

(2)将步骤(1)的洗出液在以单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物基球为支撑的填料介质上进行阳离子交换层析，以5～20mM Tris-HC缓冲液，0.4～0.6M的NaCl，pH值5～5.5作为洗脱液；

(3)采用目的蛋白流穿模式，将步骤(2)的洗出液在偶联苯基的疏水层析介质上进行纯化，所用缓冲液为pH值7.5的Tris-HCl缓冲液。

经上述所述的重组hCG纯化方法，得到的含有纯化的重组hCG的液态组合物可按已有物理形态冷冻贮存。所得到的高纯度纯化产品称为“重组hCG原液”。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的重组hCG纯化方法中，通过三步层析纯化法，得到重组hCG原液纯度大于98％，比活约20000IU/mg，纯化得率至少65％，可用于大规模纯化生产。

附图说明

图1为本发明rhCG纯化的流程图。

图2为本发明rhCG蛋白MMC复合层析图谱及SDS-PAGE电泳图。

图3为本发明rhCG蛋白离子交换层析图谱及SDS-PAGE电泳图。

图4为本发明rhCG蛋白疏水交换层析图谱及SDS-PAGE电泳图。

图5为本发明rhCG原液SEC-HPLC检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种兽用重组hCG的纯化方法，为使本发明的技术方案和效果更清楚、明确，以实施例对本发明进一步详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例提供了在30L生物反应器中生产表达rhCG的重组细胞获得的上清液。

图1所示为以下详细描述的纯化过程的流程图，所得到的纯化的重组hCG即称为“rhCG原液”。

所有的缓冲液pH和电导都基于+25℃；即，电导用一种装配有温度探针的仪器测定，而所得到的值自动地对不同温度进行补偿且基于+25℃。

关于电导测量，相关温度系数始终是设定为2。

实施例1深层过滤重组hCG细胞培养液

设备:深层滤器型号：MD0HC05FS10.55m²和MXOHC01FS10.11m²或等同产品；蠕动泵型号：JMCD175TOC2或等同产品。

材料：重组hCG细胞培养液(起始重量：基于HPLC法测出rhCG目的蛋白为30g(30L生物反应器))；氢氧化钠；纯化水。

深层过滤过程：所有操作均在冷却条件下进行(4-10℃)。

深层过滤重组hCG细胞培养液(19L)在以下条件下过滤：

透过流速：300mL/min；

入口压力：1.5-2.0ba；

透膜压力：1.5-2.0ba；

其中：透膜压力(TMP)＝(入口压力+出口压力)/2；

保留物部分用复合层析的平衡缓冲液冲洗；冲洗步骤重复三次，直至流出液为无色为止。

得率：深层过滤后rhCG体积约为22L。此部分贴上如下标签：《rhCG-上清液》，5×0.5mL样品贮存在-20℃进行IPC。测量此部分体积。样品经如下分析：pH、传导性、HPLC法含量测定。

实施例2重组hCG蛋白在离子交换和疏水作用的复合模式填料上的MMC复合层析

设备：层析柱GE 150/500；层析系统AKTA pilot；pH计；电导率仪；天平。

材料：从深层过滤得到的rhCG上清液；起始量：由HPLC法测出的rhCG为30g；醋酸钠、醋酸、精氨酸、氢氧化钠粒；纯化水；盐酸；氯化钠；乙醇。

缓冲液：

平衡缓冲液：50mM NaAC/HAC，0.08M NaCl，pH5.5；

洗杂液缓冲液：50mM NaAC/HAC，0.28M NaCl，0.06M Arg，pH5.5；

洗脱液缓冲液：50mM NaAC/HAC，0.3M NaCl，0.3M Arg，pH5.5；

再生溶液：1M NaCl；

清洗溶液：0.5M NaOH；

清洗溶液：H₂O；

贮存溶液：20％乙醇。

装柱：按照厂家说明书装柱。装好的柱尺寸如下：

直径：150mm；

柱床高度：100±10mm；

柱床体积：1.6-2L。

纯化过程：所有操作在如下条件下进行：

温度：4-10℃；

线性流速：50-70cm/小时。

柱的清洗：层析柱至少用1.5个柱床体积(BV)的0.5M NaOH冲洗，然后用3BV的纯化水冲洗。

柱的平衡：层析柱用至少5BV平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为50mM NaAC/HAC，0.08M NaCl，pH5.5。检测pH，继续洗涤直到层析柱的流出物参数达到如下目标值内：pH5.5±0.1。

起始材料制备：从深层过滤得到的rhCG上清液过滤后直接纯化；检测pH，保留样品进行IPC(5×0.5mL)。

上样：将起始材料装入平衡的层析柱。

洗涤：当装样完成后，层析柱用至少3BV的平衡缓冲液冲洗。保留样品进行IPC(5×0.5mL)，并丢弃此洗涤部分。

洗杂：待洗涤完成后，用5BV的洗杂缓冲液50mM NaAC/HAC，0.28M NaCl，0.06MArg，pH5.5冲洗层析柱。保留样品进行IPC(5×0.5mL)，并丢弃此洗涤部分。

洗脱：用50mM NaAC/HAC，0.3M NaCl，0.3M Arg，pH5.5洗脱。rhCG在洗脱开始后2-3BV开始流出。记录收集体积，并抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。重组hCG蛋白MMC复合层析图谱及SDS-PAGE电泳图见图2，此洗脱部分含有半纯化的rhCG。

柱子再生：洗脱完成后，层析柱用至少3BV的再生缓冲液冲洗。留取样品进行IPC(5×0.5mL)，并丢弃此部分。

清洗：依次用3BV的水、0.5M NaOH冲洗后用3BV的水冲洗层析柱，直至流出液pH中性为止。

贮存：用3BV的贮存溶液(20％乙醇)冲洗层析柱，且贮存至下一次使用。

实施例3重组hCG蛋白在基于单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物基球的离子交换层析

设备：层析柱GE 100/500；层析系统：AKTApilot；pH计；电导率仪；天平。

材料：复合层析后的rhCG；纯化水；氢氧化钠；Tris；盐酸；乙醇；氯化钠。

缓冲液：

平衡缓冲液：10mM Tris-HCl，0.12M NaCl，pH 5.0；

洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl，0.4M NaCl，pH 5.5；

再生溶液：1M NaCl；

清洗溶液：0.5M NaOH；

清洗溶液：H₂O；

贮存溶液：20％乙醇。

装柱：按照厂家说明书装柱。装好的柱尺寸如下：

直径：100mm；

柱床高度：12±2cm；

柱床体积：0.8-1.2L。

纯化过程：所有操作在如下条件下进行：

温度：4-10℃；

线性流速：60-90cm/小时。

柱的清洗：层析柱至少用1.5个柱床体积(BV)的0.5M NaOH冲洗，然后用3BV的纯化水冲洗。

柱的平衡：层析柱用至少5BV平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为10mM Tris-HCl,0.12M NaCl，pH 5.0，电导13.54±0.5ms/cm。检测pH，继续洗涤直到层析柱的流出物参数达到如下目标值内：pH5.5±0.1，13.54±0.5ms/cm。

起始材料制备：从复合层析得到的rhCG调节pH5.0±0.1，电导13.54±0.5ms/cm。抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。

上样：将起始材料装入平衡的层析柱。

洗涤：当装样完成后，层析柱用至少3BV的平衡缓冲液冲洗。记录收集的体积，并保留样品进行IPC(5×0.5mL)。此洗脱部分含有半纯化的rhCG。

洗脱：10mM Tris-HCl，0.4M NaCl，pH 5.5。记录收集体积，并抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。重组hCG蛋白离子交换层析图谱及SDS-PAGE电泳图见图3，此洗脱部分含有半纯化的rhCG。

柱子再生：洗脱完成后，层析柱用至少3BV的再生缓冲液冲洗。留取样品进行IPC(5×0.5mL)，并丢弃此部分。

清洗：依次用3BV的水、0.5M NaOH冲洗后用3BV的水冲洗层析柱，直至流出液pH中性为止。

贮存：用3BV的贮存溶液20％乙醇冲洗层析柱，且贮存至下一次使用。

实施例4重组hCG蛋白在偶联苯基疏水基团的疏水交换层析

设备：层析柱GE 100/500；层析系统AKTA pilot；pH计；电导率仪；天平。

材料：离子交换层析后的rhCG；纯化水；氢氧化钠；甘氨酸；盐酸；乙醇；氯化钠。

缓冲液：

平衡缓冲液：10mM Tris-HCl,1.2M NaCl，pH 7.5；

反提取剂：H₂O；

清洗溶液：0.5M NaOH；

贮存溶液：20％乙醇。

装柱：按照厂家说明书装好柱子。柱尺寸如下：

直径：100mm；

柱床高度：28±2cm；

柱床体积：2-2.4L。

纯化过程：所有操作在如下条件下进行：

温度：4-10℃；

线性流速：150-180cm/小时。

柱的清洗：层析柱至少用1.5个柱床体积(BV)的0.5M NaOH冲洗，然后用3BV的纯化水冲洗。

柱的平衡：层析柱用至少5BV平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为10mM Tris-HCl,1.2MNaCl，pH 7.5。检测pH，继续洗涤直到层析柱的流出物参数达到如下目标值内：pH7.5±0.1。

起始材料制备：从离子交换层析得到的rhCG调节pH到7.5±0.1，电导13.12±0.5ms/cm。抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。

装样：将起始材料装入平衡的层析柱。收集流穿部分并记录收集体积，抽取样品进行IPC(5×0.5mL)。此洗脱部分含有纯化的rhCG(即rhCG原液)。保留样品进行IPC(5×0.5mL)。

洗涤：当装样完成后，层析柱用至少3BV的平衡缓冲液冲洗。

清洗：至少用3BV的反提取剂冲洗层析柱，留取样品进行IPC(5×0.5mL)，并丢弃此部分。用3BV的0.5M NaOH冲洗后用3BV的水冲洗层析柱，直至流出液pH中性为止。

贮存：用3BV的贮存溶液20％乙醇冲洗层析柱，且贮存至下一次使用。重组hCG蛋白疏水交换层析图谱及SDS-PAGE电泳图，见图4。

实施例5重组hCG蛋白的活性检测

重组hCG原液SEC-HPLC检测结果，见图5。通过测定rhCG对未成年小鼠子宫增重的作用，确定重组hCG原液的活性。参照中国兽药药典“绒促性素生物检定法”，方法如下：分别将hCG标准品和重组hCG样品(预估活性为22000IU/mg)配制成0.625IU/mL、0.375IU/mL、0.225IU/mL高、中、低三个剂量。

选取健康合格、出生17-23日、体重9-13g、同一来源的雌性幼小鼠，按体重随机分为6组，每组15只。每日于大致相同时间分别给每鼠皮下注射相应浓度的标准品或重组hCG0.2mL，每日一次，连续注射3次，于最后一次注射24h后将动物处死，称体重，解剖，摘出子宫，剥离附着的组织，去除卵巢，压干子宫内液，直接称重并换算成每10g体重的子宫重，参照生物检定法中的量反应平行线测定法计算得出本发明所提供纯化方法纯化后重组hCG效价为20900IU/mg，是兽药典规定的尿源hCG(uhCG)效价4500IU/mg的4.6倍。

对比例1采用其他层析方法对重组hCG进行纯化

本对比例提供一种重组hCG纯化方法，包括：深度过滤、亲和层析、疏水层析和阴离子交换层析。本对比例采用的纯化方法具体步骤参见已公开的中国专利CN108503705A。

采用实施例5中的方法，针对本对比例纯化后得到的重组hCG进行效价检测，结果表明，本对比例得到的重组hCG效价仅约为10000IU/mg，显著低于本发明所提供纯化方法纯化后的重组hCG效价。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种重组hCG的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法中，使重组hCG经受以下步骤：

（0）深层过滤；

（1）在MMC复合层析介质上用50mM的NaAC/HAC，0.3 M的NaCl，0.3 M精氨酸，pH值为5.5的缓冲液作为洗脱液，进行洗脱，所用温度为4-10℃，所用线性流速为50-70cm/小时；

（2）将步骤（1）的洗出液在以单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物基球为支撑的填料介质上进行阳离子交换层析；所用洗脱缓冲液为10mM Tris-HCl，0.4M NaCl，pH5.5，所用温度为4-10℃，所用线性流速为60-90cm/小时；

（3）采用目的蛋白流穿模式，将步骤（2）的洗出液在偶联苯基的疏水层析介质上进行纯化，所用平衡缓冲液为10mM Tris-HCl,1.2M NaCl，pH7.5，所用温度为4-10℃，所用线性流速为150-180cm/小时，获得效价为20900IU/mg的重组hCG。

2.一种重组hCG原液，其特征在于，所述重组hCG原液通过权利要求1所述的纯化方法纯化后得到；所述重组hCG原液的效价为20900IU/mg。