CN108503705A - 一种重组绒促性素（rhCG）的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化方法，包括亲和层析、疏水层析和阴离子交换层析。经过上述的纯化方法，得到的rhCG纯度大于98％，且能适合大规模纯化rhCG。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化领域，特别是重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化。
背景技术
随着人类文明的不断进步，环境污染也越来越严重，人们在享受物质及精神文明的同时，也不得不收承担环境污染所带来的负面影响。环境受到有害物质的污染，使生物包括人在内的生长繁殖受到有害影响，加之遗传因素的影响，全球患不孕不育的人数越来越多。现今，不孕不育症已成为一种常见的、多发的、严重影响人们生活质量的疾病。防治不孕不育症已成为临床上重要的、紧迫的医疗保健问题之一，日益受人类重视。然而目前市场上针对治疗不孕不育的药物相对缺乏，且产量有限。
哺乳动物细胞表达系统能对蛋白进行正确折叠和复杂的糖基化修饰，适合表达复杂高等真核生物蛋白；hCG是一种由人胎盘合体滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，包括α和β两个非共价键结合的亚基。理论上用哺乳动物细胞来表达生产生殖激素蛋白，其空间结构和糖基化更接近天然产物，可保证其生理活性。
但是，哺乳细胞在表达rhCG的同时也表达并分泌宿主蛋白和一些副产物蛋白。因此，能否有效且经济的将rhCG与其他产物分离开来，已经成为下游纯化工艺迫在眉睫的任务。
发明内容
本发明的目的旨在解决重组hCG，尤其是哺乳动物细胞表达的rhCG的纯化问题，得到纯度高、活性高的hCG精纯品。
本发明的另一目的是提供一种可适应大规模生产的rhCG纯化工艺。
为了达到上述目的，本发明提供了以下的重组hCG纯化步骤：
(0)深层过滤；
(1)亲和层析；
(2)疏水层析；
(3)阴离子交换层析。
其中，各纯化步骤按先后顺序进行。
所述的重组hCG纯化方法中，纯化起始材料为使用哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统表达的发酵液。
所述的重组hCG纯化方法中，在亲和层析步骤之前，为了去除较大颗粒，以免堵塞柱子，最好进行一次深层过滤步骤。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)采用一种有配基的染料亲和介质，特别优选琼脂糖亲和介质，如蓝胶。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，洗脱优选用有弱碱性pH(如在7.5或大约7.5到9.0或大约9.0，或8.0或大约8.0到9.0或大约9.0，最佳8.5或大约8.5)缓冲液。
适合的缓冲液包括Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液。
最优选pH值为8.5或大约为8.5的Tris-HCl。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，Tris-HCl洗脱缓冲液的浓度较佳为10mM或大约为10mM到100mM或大约为100mM的范围内；更佳为15mM或大约为15mM到50mM或大约为50mM；最佳在20mM或大约20mM。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)采用一种苯基琼脂糖凝胶FF。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，洗脱液应该用磷酸盐缓冲液或醋酸钠溶液；特别优选磷酸盐缓冲液。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，磷酸盐缓冲液的pH至为6.0或大约6.0到9.0或大约9.0；优选pH值为6.5或大约6.5到8.5或大约8.5；特别优选pH7.0或大约7.0。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，磷酸盐缓冲液浓度较佳应该为5mM或大约5mM到20mM或大约20mM；优选8mM或大约8mM到15mM或大约15mM；最佳优选10mM或大约10Mm。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)采用一种有二乙基氨基乙基螯合集团的纤维素。优选DEAE琼脂糖凝胶FF。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)中，洗脱应该用磷酸盐或醋酸盐缓冲液，特别优选醋酸盐，如醋酸铵。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)中，洗脱液-醋酸铵缓冲液pH值为7.0或大约7.0到10或大约10；优选pH值8.0或大约8.0到9.0或大约9.0；特别优选pH值8.5或大约8.5。
所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)中，洗脱液-醋酸铵缓冲液浓度较佳应该为0.05M或大约0.05M到0.8M或大约0.8M；更佳为0.08M或大约0.08M到0.3M或大约0.3M；最佳为0.11M或大约为0.11M。
经上述所述的重组hCG纯化方法，得到的含有纯化的rhCG的液态组合物可按原来样子冷冻贮存。所得到的液体产品称为“rhCG原液”。
有益效果：本发明提供了一种重组hCG纯化方法，通过三步层析纯化法，得到rhCG纯度大于98％，且适合大规模纯化。
附图说明
图1所示为rhCG纯化的流程图
图2所示为rhCG在UV280nm检测，在琼脂糖亲和介质上层析的洗脱图及SDS-page电泳图。
图3所示为rhCG在UV280nm检测，在疏水琼脂糖凝胶上层析的洗脱图及SDS-page电泳图。
图4所示为rhCG在UV280nm检测，在DEAE琼脂糖凝胶上层析的洗脱图及SDS-page电泳图。
图5所示为rhCG原液在SEC-HPLC检测纯度的图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种重组hCG的纯化方法，为使本发明的技术方案和效果更清楚、明确，以实施例对本发明进一步详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例提供了从在30L的生物反应器中生产rhCG细胞培养液开始纯化的rhCG。
图1所示为以下详细描述的纯化过程的流程图，所得到的纯化的rhCG即称为“rhCG原液”。
所有的缓冲液pH和电导都基于+25℃；即，电导用一种装配有温度探针的仪器测定，而所得到的值自动地对不同温度进行补偿且基于+25℃。
关于电导测量，相关温度系数始终是设定为2.
实施例1深层过滤rhCG细胞培养液
设备:深层滤器型号：MD0HC05FS10.55m2和MXOHC01FS10.11m2或等同产品；蠕动泵型号：JMCD175TOC2或等同产品
材料：rhCG细胞培养液(起始重量：HPLC法测出的rhCG为10g(30L生物反应器))；氢氧化钠；纯化水
深层过滤过程：所以操作都在冷却条件下进行(4-10℃)。
深层过滤rhCG细胞培养液(19L)在以下条件下过滤：
透过流速：300ml/min
入口压力：1.5-2.0ba
透膜压力：1.5-2.0ba
其中：透膜压力(TMP)＝(入口压力+出口压力)/2
保留物部分用琼脂糖亲和层析的缓冲溶液冲洗；冲洗步骤重复三次，直至流出液为无色为止；
得率：深层过滤后rhCG体积约为22L。此部分贴上如下标签：《rhCG-上清液》,5×0.5ml样品贮存在-20℃进行IPC。测量此部分体积。样品经如下分析：pH、传导性、HPLC法测定rhCG含量。
实施例2重组hCG蛋白在琼脂糖亲和介质上的亲和层析
设备：层析柱GE 200/500；层析系统AKTA pilot；pH计；电导率仪；天平
材料：从深层过滤得到的rhCG上清液；起始量：由HPLC法测出的rhCG为10g；氢氧化钠粒；纯化水；Tris；盐酸；氯化钠
缓冲液：
平衡缓冲液：20mM醋酸钠pH4.5±0.2
洗脱缓冲液：20Mm Tris-HCl,1MNaCl pH8.5±0.1.
清洗溶液：0.5MNaOH
清洗溶液：H2O
贮存溶液：20％乙醇
装柱：按照厂家说明书装好琼脂糖亲和介质。装好的柱尺寸如下：
直径：200mm
柱床高度：200mm±20mm
柱床体积：6L-7L
纯化过程：所有操作在如下条件下进行：
温度：4-10℃
线性流速：80-100cm/小时
柱的清洗：层析柱至少用1个柱床体积(BV)的0.5MNaOH冲洗，然后用3BV的纯化水冲洗。
柱的平衡：层析柱用至少5BV平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为20mM醋酸钠pH4.5±0.2。检测pH，继续洗涤直到层析柱的流出物参数达到如下目标值内：pH4.5±0.2
起始材料制备：从深层过滤得到的rhCG上清液过滤后直接纯化；检测pH,保留样品进行IPC(5×0.5ml)。
上样：将起始材料装入平衡的层析柱。
洗涤：当装样完成后，层析柱用至少3BV的平衡缓冲液冲洗。保留样品进行IPC(5×0.5ml)，并丢弃此洗涤部分。
洗脱：用20Mm Tris-HCl,1MNaCl pH8.5±0.1开始洗脱。rhCG在洗脱开始后0.8-1.0BV开始流出。记录收集体积，并抽取样品进行IPC(5×0.5ml)。此洗脱部分含有半纯化的rhCG。
清洗：用3BV的0.5M NaOH冲洗后用至少3BV的水冲洗层析柱，直至流出液pH中性为止。
贮存：用3BV的贮存溶液(20％乙醇)冲洗层析柱，且贮存至下一次使用。
实施例3重组hCG蛋白在苯基琼脂糖凝胶FF上的疏水层析
设备：层析柱GE 100/500；层析系统：AKTA pilot；pH计；电导率仪；天平
材料：亲和层析后的rhCG；纯化水；氢氧化钠；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；乙醇；氯化钠
缓冲液
平衡缓冲液：50mMTris-HCl,2MNaCl pH7.5±0.1，电导155±5ms/cm。
洗脱缓冲液：10mM磷酸盐缓冲液pH7.0±0.1，电导2.1±0.2ms/cm。
反提取剂：H2O
清洗溶液：0.5M NaOH
贮存溶液：20％乙醇
装柱：按照厂家说明书装好苯基琼脂糖凝胶FF。装好的柱尺寸如下：
直径：100mm
柱床高度：20cm±2cm
柱床体积：1.5L-1.8L
纯化过程：所有操作在如下条件下进行：
温度：4-10℃
线性流速：10-15cm/小时
柱的清洗：层析柱至少用1个柱床体积(BV)的0.5MNaOH冲洗，然后用3BV的纯化水冲洗。
柱的平衡：层析柱用至少5BV平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为50mM Tris-HCl,2MNaCl pH7.5±0.1，电导155±5ms/cm。检测pH，继续洗涤直到层析柱的流出物参数达到如下目标值内：pH7.5±0.1，电导155±5ms/cm
起始材料制备：从亲和层析得到的rhCG调节pH7.5±0.1，电导155±5ms/cm。抽取样品进行IPC(5×0.5ml)。
上样：将起始材料装入平衡的层析柱。
洗涤：当装样完成后，层析柱用至少3BV的平衡缓冲液冲洗。记录收集的体积，并保留样品进行IPC(5×0.5ml)。图3显示的是苯基琼脂糖凝胶FF层析洗脱图。此洗脱部分含有半纯化的rhCG.
柱子再生：洗脱完成后，层析柱用至少3BV的再生缓冲液冲洗。留取样品进行IPC(5×0.5ml)，并丢弃此部分。
清洗：用3BV的0.5M NaOH冲洗后用知道3BV的水冲洗层析柱，直至流出液pH中性为止。
贮存：用3BV的贮存溶液20％乙醇冲洗层析柱，且贮存至下一次使用。
实施例4在DEAE琼脂糖凝胶FF上的阴离子交换层析
设备：层析柱GE 100/500；层析系统AKTA pilot；pH计；电导率仪；天平
材料：疏水层析后的rhCG；纯化水；氢氧化钠；醋酸铵；乙醇；氯化钠
缓冲液：
平衡缓冲液：0.11M醋酸铵pH8.5±0.1，电导10.0±0.5ms/cm
再生溶液：2M NaCl
清洗溶液：0.5M NaOH
贮存溶液：20％乙醇
装柱：按照厂家说明书装好DEAE琼脂糖高速树脂。装好的柱尺寸如下：
直径：100mm
柱床高度：20cm±2cm
柱床体积：1.5L-1.8L
纯化过程：所有操作在如下条件下进行：
温度：4-10℃
线性流速：10-15cm/小时
柱的清洗：层析柱至少用1个柱床体积(BV)的0.5MNaOH冲洗，然后用3BV的纯化水冲洗。
柱的平衡：层析柱用至少5BV平衡缓冲液冲洗，平衡缓冲液为0.11M醋酸铵pH8.5±0.1，电导10.0±0.5ms/cm。检测pH，继续洗涤直到层析柱的流出物参数达到如下目标值内：pH8.5±0.1，电导10.0±0.5ms/cm
起始材料制备：从苯基疏水层析得到的rhCG调节pH到8.5±0.1，电导10.0±0.5ms/cm。抽取样品进行IPC(5×0.5ml)。
装样：将起始材料装入平衡的层析柱。
洗涤：当装样完成后，层析柱用至少3BV的平衡缓冲液冲洗。保留样品进行IPC(5×0.5ml)。图3显示的是DEAE琼脂糖凝胶FF层析洗脱图。此洗脱部分含有纯化的rhCG(即rhCG原液)
柱子再生：洗脱完成后，层析柱用至少3BV的再生缓冲液冲洗。留取样品进行IPC(5×0.5ml)，并丢弃此部分。
清洗：用3BV的0.5M NaOH冲洗后用知道3BV的水冲洗层析柱，直至流出液pH中性为止。
贮存：用3BV的贮存溶液20％乙醇冲洗层析柱，且贮存至下一次使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种重组hCG的纯化方法，其特征在于，所述的纯化工艺使rhCG经受以下步骤：(1)亲和层析；(2)疏水层析；(3)阴离子交换层析。
2.根据权利要求1所述的重组hCG纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述的亲和层析采用一种带有多芳香环的磺化物配基的染料亲和介质(简称蓝胶)。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述重组hCG纯化的方法，其特征在于，步骤(1)所述的亲和层析用琼脂糖亲和介质。
4.根据权利要求1至3中的任一权利要求所述的重组hCG纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述的亲和层析用Tris-HCl缓冲液作为洗脱液，其pH值为8.5或大约为8.5。
5.根据权利要求1所述的重组hCG纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述的疏水作用层析用苯基琼脂糖凝胶FF。
6.根据权利要求1和5所述的重组hCG纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述的疏水层析用浓度为10mM磷酸盐缓冲液作为洗脱液。
7.根据权利要求1所述的重组hCG纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述的阴离子交换层析用一种有弱碱型的二乙基氨基乙基的螯合集团的树脂。
8.根据权利要求1所述的重组hCG纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述的阴离子交换层析用琼脂糖凝胶FF；用醋酸铵作为洗脱液，其pH值为8.5或大约为8.5。
9.一种重组hCG的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括使rhCG经受以下步骤：
(0)深层过滤；
(1)在琼脂糖亲和介质上用20mM或大约20mM的Tris-HCl，1M或大约1M的NaCl，pH值8.5或大约为8.5作为洗脱液进行亲和层析。
(2)将步骤(1)的洗出液在苯基琼脂糖凝胶FF上进行疏水租用层析步骤，以10mM或大约10mM磷酸盐缓冲液，pH值为7.2或大约7.2作为洗脱液。
(3)将步骤(2)的洗出液在DEAE琼脂糖凝胶FF上进行阴离子交换层析步骤，以0.11M或大约0.11M醋酸铵，pH值为8.5或大约为8.5作为洗脱液。
10.一种纯化的rhCG，其特征在于，所述的纯化的rhCG通过权利要求书1至9中的任一权利要求所述的方法得到。
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